CN103524615B

CN103524615B - 一种抗兔病毒性出血症病毒rhdv卵黄抗体的制备方法

Info

Publication number: CN103524615B
Application number: CN201310483217.8A
Authority: CN
Inventors: 张智; 李再新; 谢万如; 胡卫东; 李天有; 邹晓阳; 李丙超; 陆仕海
Original assignee: Sichuan University of Science and Engineering
Current assignee: Sichuan University of Science and Engineering
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-10-16
Also published as: CN103524615A

Abstract

本发明公开了一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，通过基因工程菌在体外大量表达和纯化兔病毒性出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60抗原，将纯化的VP60抗原与适宜的佐剂制备成疫苗免疫产蛋鸡，并从鸡蛋中提取高效价抗RHDV的卵黄抗体，最后制备成可直接注射使用的抗体制剂。本发明建立的方法，是一种新的、安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的卵黄抗体制备方法，所制得的抗体用生理盐水溶解后，可直接通过耳缘静脉或皮下注射达到预防和治疗的作用，其紧急预防RHDV感染的作用达到100%，而早期治疗效率可达到95%。

Description

一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗兔病毒性出血症病毒卵黄抗体的制备，属于生物工程与畜病防治技术领域。

背景技术

兔病毒性出血症(俗称兔瘟)是由兔病毒性出血症病毒( rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV) 引起的兔的一种烈性传染病，具有高度致死性、传染性特点。自1984年在中国首先发现以来，本病在世界范围内广泛流行，给养兔业带来巨大的经济损失和威胁，而且严重威胁濒临灭绝的野兔品种。目前该病尚无有效治疗药物，针对RHDV只能采取疫苗预防，疫苗接种7-10天后才能产生足够抗体，不能及时有效保护。由于RHDV目前无法在体外细胞系中得到病毒扩增，因此均采用将RHDV毒株感染家兔后，处死家兔，取其被病毒感染的组织，灭活后制备成组织灭活疫苗，在整个这个过程中存在病毒散毒的危险，且不符合动物福利的要求。

卵黄抗体（immunoglobulin yolk, IgY）技术简称IgY技术，即产蛋鸡经特定抗原免疫后，产生相应特异性抗体，并转运、储存于卵黄中，形成卵黄抗体。IgY是鸡蛋卵黄中的多克隆抗体，生物学特性除了具有其他动物源性IgG抗体的高度特异性、敏感性之外，其还具有更强的抗原亲和力、耐热、耐酸碱、制备成本低等突出优点。由于IgY生产成本低，产量高，特异性强，是一种非常好的可以替代其它动物血清治疗的抗体药物，目前在人和动物被动免疫治疗和诊断方面表现出了良好的临床效果。关于IgY的作用机制，主要是通过与病原体细菌或病毒直接结合，抑制病原体的生长和繁殖，阻断其对人和动物正常细胞的粘附和感染作用。

经对现有的专利、技术文献检索发现，张宏伟等人2007年在其中国农业科学院的硕士论文“抗兔病毒性出血症卵黄抗体的制备与应用”中，将兔病毒性出血症组织灭活疫苗免疫普通产蛋鸡；采用辛酸-硫酸氨二步盐析法-离子层析交换法，从卵黄液中提取高效价的兔病毒性出血症卵黄抗体，且其对攻毒兔的治疗率达100%。王治方等人在《中国养兔杂志》2007年第4期上发表的“抗兔瘟精制卵黄抗体的研制”一文中，将兔病毒性出血症组织灭活疫苗免疫产蛋鸡；采用3.5%-4.0%的聚乙二醇6000和超滤的方法提取到兔病毒性出血症卵黄抗体，且其对攻毒兔的早期治疗率达80%。两论文中，由于RHDV目前无法在体外细胞系中得到病毒扩增，因此均采用各自分离的RHDV毒株，感染家兔后，处死家兔制备成组织灭活疫苗免疫产蛋鸡，但在整个这个过程中存在散毒的危险，且不符合动物福利的要求。采用辛酸-硫酸氨二步盐析法-离子层析交换法提取卵黄抗体，过程较为复杂，成本高；而采用聚乙二醇的方法，张小莺等在2011年出版的《卵黄抗体技术》书中，总结前人的研究结果表明，用PEG的方法提取卵黄抗体得率较水稀释和超滤法等低，在王治方等人的论文中未见其卵黄抗体的产率报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足和缺陷，提供一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法。采用基因工程技术实现在体外大量表达兔RHDV的VP60抗原，将纯化的VP60抗原经适宜的佐剂乳化后免疫产蛋鸡，并从鸡蛋中提取和纯化出高滴度的抗兔RHDV卵黄抗体，最后经冷冻干燥制备成抗体干粉，于-20℃或-80℃。经无菌检验合格后，用生理盐水溶解该卵黄抗体干粉，适用于兔病毒性出血症RHDV的早期治疗和紧急预防使用，是一种新的安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的抗体制备方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法,包括以下步骤：

（1）免疫原的制备：通过PCR扩增技术获得RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N，并实现其在基因工程菌中的表达，通过分离纯化获得VP60-N重组抗原；

（2）免疫产蛋鸡及提取卵黄抗体：将纯化的VP60-N抗原蛋白经佐剂乳化免疫产蛋鸡，检测抗体的纯度、特异性及滴度后，大量提取纯化IgY卵黄抗体，冷冻干燥后将抗体干粉冻存；

（3）制剂的制得：检测步骤（2）中得到的IgY卵黄抗体干粉，经无菌检验合格后，与生理盐水制备成安全的皮下或静脉注射用抗体制剂，或冷冻干燥形成干粉制剂后保存。

所述的RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N如下：

SEQ ID NO.1: GKARAAPQGE AAGTATTASV PGTTTDGMDP GVVATTSVIT AENSSASIAT AGIGGPPQQV DQQETWRTNF YYNDVFTWSV ADAPGSILYT VQHSPQNNPF TAVLSQMYAG WAGGMQFRFI VAGSGVFGGR LVRAVIPPGI EIGPGLEVRQ FPHVVIDARS LEPVTITMPD LRPNMYHPTG DPGLVPTLVL SVYNNLINPF GGSTSAIQVT VETRPSEDFE FVMIRAPSSK TVDSISPAGL LTTPVLTGVG。

所述PCR扩增的引物为：

上游引物：5’- CCGGAATTCEcoR I ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’，

下游引物：5’- CCGCTCGAGXho I ATTGCCAACACCAGTGA-3’；

PCR退火温度为52-55℃。

步骤（1）中免疫原的制备具体为：分析和选择兔RHDV病毒VP60的主要抗原表位决定簇肽段，即N端1-250aa肽段（VP60-N）作为免疫原；采用PCR的方法，以VP60全长基因序列为模板扩增VP60-N片段；通过基因工程技术，将该片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上，转化基因工程菌BL21（DE3），完成VP60-N重组抗原蛋白的原核诱导表达；最后纯化重组的VP60-N抗原蛋白。

PCR扩增后的产物，经EcoR I 和Xho I酶切回收后，与同样经过双酶切处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接和转化，形成重组质粒pET28a-VP60-N；将重组质粒pET28a-VP60-N转化E.coli BL21(DE3)，次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按1：200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导，温度为22℃-30℃；诱导8-12 h后，12000 rpm离心收集菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清，SDS-PAGE检测确定VP60-N重组蛋白以可溶形式表达后，使用Ni-NTA树脂纯化VP60-N重组蛋白抗原。

步骤（2）中免疫产蛋鸡的方法为将纯化的VP60-N重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，之后2-3点肌肉注射免疫产蛋鸡；第一免疫后每隔一个月加强免疫一次，共加强免疫2次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋；检测蛋黄中VP60-N特异性的抗体滴度达到1:20000以上时为合格；采用水稀释法-超滤法从鸡蛋蛋黄中分离纯化出RHDV特异性的卵黄抗体IgY。

检测抗体的纯度、特异性及滴度的方法是SDS-PAGE、Western blot、ELISA和Dot blot。

免疫产蛋鸡是通过肌肉或皮下多点注射免疫未免疫的产蛋鸡，初免剂量为300ug/只；每隔一个月加强免疫一次，共两次，免疫剂量调整为150ug/只，第三次免疫后一周开始收集鸡蛋；此后当卵黄抗体滴度低于10⁴时可进行强化免疫，免疫剂量为100ug/只。

所述水稀释法-超滤法从蛋黄中分离纯化出RHDV特异性的卵黄抗体IgY即用超纯水按体积比1:8稀释蛋黄液，用HCL调节pH至5.2，4℃静置6-8小时，离心去脂，再用10%和30%分步沉淀卵黄抗体，最后应用超滤法（截留分子量为100kD）进一步脱盐、纯化和浓缩卵黄抗体，其得率10-12mg/ml蛋黄液，纯度达到90%以上，抗体滴度达1: 10⁴以上。

步骤（3）中所述冻干粉的使用为：用生理盐水溶解，浓度为5mg/mL, 从兔耳缘静脉进行静脉注射，剂量为5-20mg/kg。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明建立的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法在制备疫苗过程中，采用基因工程技术在体外大量表达可溶性重组VP60-N抗原，具有效益高、成本低、场地需求小、环保等特点，同时，避免了传统卵黄抗体制备过程中使用RHDV灭活组织疫苗所带来的潜在散毒风险，且符合动物福利的要求。该方法是一种新的、安全、成本低、高效预防和治疗兔病毒性出血症的抗体制备方法，所制得的制剂可直接通过耳静脉或皮下注射达到治疗的作用。该发明制备的抗体针对RHDV感染的紧急预防作用效果可达到100%，早期治疗率亦可达到95%（注射剂量10mg/kg）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例1

本实施例为抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法：

抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备工艺流程为VP60序列保守性分析、VP60-N的PCR引物设计与扩增、原核表达载体的构建、重组VP60-N抗原蛋白表达与纯化、免疫产蛋鸡、鸡蛋收集与分离卵黄抗体、冷冻干燥、卵黄抗体成品。具体步骤如下：

1、VP60-N重组抗原的制备

根据VP60基因序列保守性，设计一对VP60-N的PCR扩增引物，上游引物 (5’- CCGGAATTCEcoR I ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’) 和下游引物 (5’- CCGCTCGAGXho I ATTGCCAACACCAGTGA-3’)。以VP60全长基因作为模板，退火温度设为52℃-55℃进行PCR扩增。回收PCR产物经EcoR I 和Xho I酶切回收，与同样经过双酶切处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接、转化。按常规方法对重组质粒进行鉴定，重组质粒命名为pET28a-VP60-N。将鉴定正确的重组质粒pET28a-VP60-N转化E.coli BL21(DE3)。次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按1：200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导（同时设不加IPTG诱导或空载体相关对照），诱导温度为22℃-30℃。诱导8-12 h后，12000 rpm离心收集菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集等量上清。SDS-PAGE检测确定VP60-N重组蛋白以可溶形式表达后，按Invitrogen公司Ni-NTA树脂说明书进行VP60-N重组蛋白的纯化；并应用Bradford法对纯化的VP60-N蛋白进行定量分析。

2、抗RHDV卵黄抗体的制备

（1）对产蛋鸡的免疫

A．初免：调整VP60-N重组抗原蛋白浓度，将其与完全弗氏佐剂等体积混匀并充分乳化后，于胸部肌肉注射免疫SPF级的产蛋鸡，免疫剂量为300μg/只。

B．加强免疫：初免1个月后，按150μg/只剂量与不完全弗氏佐剂等体积混匀并充分乳化后，进行加强免疫，隔月一次，共两次加强免疫；于两周后开始收集鸡蛋，4℃储存备用。加强免疫以后，待抗体滴度低于1:10⁴时，给予强化免疫，免疫剂量为100μg/只即可。

（2）抗RHDV卵黄抗体的提取与纯化

用蒸馏水漂洗卵黄，按卵黄：水体积比为1:8对卵黄进行稀释；振荡器混匀，用稀HCL调节pH至5.2，4℃静置6-8h；次日4℃下12000rpm离心15min。收集上清液（即为水粗提液WSF），缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为10%），4℃静置2h，12000rpm低温离心15min，去沉淀；上清中缓缓加入(NH₄)₂SO₄（终浓度为30%），4℃静置2h；12000rpm低温离心15min，收集沉淀，用PBS溶解，并于超滤管进一步纯化和浓缩（截留分子量为100KD）。收集卵黄抗体溶液，进行冷冻干燥，即为纯化的IgY抗体干粉；取样并按Bradford法进行蛋白定量，同时进行无菌检测。

实施例2

本实施例为抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的检测：

（1）卵黄抗体纯度分析

取10ug纯化的IgY抗体，分别加入含或不含还原剂β-巯基乙醇的蛋白电泳上样缓冲液（参见2002年分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁斯著，美国），通过12% SDS-PAGE电泳检测实施例1中得到的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的纯度；恒流12mA，凝胶用考马斯亮蓝染色。结果：如果样品中加入的是含有β-巯基乙醇还原剂的上样缓冲液，显示65 KD和25KD两条主要带，说明抗体纯度高；如果样品中加入的是不含有β-巯基乙醇还原剂的上样缓冲液，显示180 KD一条主带，说明抗体纯度高。

（2）卵黄抗体浓度测定

用Bradford蛋白浓度测定法测定实施例1中得到的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的浓度，并按每毫升卵黄计算抗体产量。

（3）抗体滴度和特异性检测

A：ELISA间接酶联免疫实验

将纯化的VP60-N重组蛋白用包被液稀释至10 ug/mL，ELISA板每孔包被100μL，4℃过夜；PBST洗板后加入100μL终浓度为5%的BSA，室温封闭2 h；PBST洗板后加入不同稀释倍数的纯化IgY（1∶100～1∶10000），室温孵育2 h；PBST 洗板，加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP) 标记的羊抗鸡IgY（100μL孔），37 ℃湿盒孵育2 h；PBST洗板加TMB（100μL/孔）显色，37℃避光作用10 min；加2 mol/L H₂SO₄终止液（50μL/孔）终止反应; 酶标自动分析仪450nm波长测定其光吸收值（OD₄₅₀nm）。实验中设不相关的带His标签蛋白为对照，吸光度OD值2倍以上为阳性标准，测定抗体滴度。

B：蛋白免疫印迹实验

将VP60-N重组蛋白进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳，利用蛋白电转移系统将蛋白转至NC膜，5% BSA室温摇床上封闭2h，加上述纯化的IgY抗体作一抗（1∶1000），室温作用2h或4℃过夜，PBST洗涤3次，每次10min，加入1∶5000稀释的二抗（HRP标记的羊抗鸡IgY），室温作用90min，PBST洗涤4次，每次10min，DAB显色。试验中设不相关的带His标签蛋白为对照。结果显示为单一条带，表明制备的卵黄抗体能特异性免疫识别VP60-N抗原蛋白。

C：Dot blot点杂交实验

将包含有RHDV病毒颗粒的肝组织裂解液（由四川华派生物制药有限公司提供，病毒株为RHDV LQ毒株），按1:10到1:1000稀释；取病毒稀释液1ul点于NC膜上，37℃放置2h；5% BSA室温摇床上封闭2h，后续操作同上述蛋白免疫印迹实验。结果表明，将病毒液稀释1000倍以上，制备的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体能明显的识别RHDV病毒颗粒，而对照为阴性。

结果表明，本发明制备的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体，抗体滴度可达1:20000以上，且能特异性识别RHDV病毒颗粒。

实施例3

本实施例为动物实验：

家兔攻毒和治疗实验：取80只3月龄未免疫家兔，随机分成四组，即生理盐水组、阴性卵黄抗体对照组、抗RHDV卵黄抗体治疗组和抗RHDV卵黄抗体预防组。应用RHDV LQ毒株，按照10倍LD₅₀通过皮下注射进行攻毒实验。卵黄抗体处理剂量为10 mg/kg，均通过耳缘静脉进行静脉注射；对于治疗组，采用RHDV攻毒后12h开始卵黄抗体处理治疗，1天1次，共5天；对于预防组，攻毒前12h将抗RHDV卵黄抗体按耳缘静脉进行静脉注射，然后进行皮下注射攻毒，之后1天1次耳缘静脉进行静脉注射该卵黄抗体，共5天；对照组每天静脉注射等体积的PBS或阴性卵黄抗体。每天观察两次，记录家兔发病和死亡状况。

实验结果显示，对照组家兔在攻毒后24-48h全部死亡；而抗RHDV卵黄抗体预防组均未表现出临床病症症状且无死亡，治疗组12h-24h后才开始表现出临床症状，但2日后开始逐渐减轻和治愈，且仅一只家兔死亡。因此本发明制备的抗RHDV卵黄抗体，针对家兔病毒性出血症的预防率可达100%，而早期治疗率亦可达到95%。

综上所述，本发明中所建立的抗RHDV卵黄抗体制备方法是一种新的安全、成本低、高效的预防和治疗兔病毒性出血症的抗体制备方法，所制得的抗体干粉于生理盐水溶解后，可直接通过耳静脉或皮下注射达到治疗的作用，同时该抗体亦可达到显著的紧急预防RHDV感染的作用。

序列表

<110> 四川理工学院

<120>一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.1

<210> 1

<211>250

<213> 氨基酸

<220>

<222> （1）…（250）

<400> 1

Gly Lys Ala Arg Ala Ala Pro Gln Gly Glu Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ser Val

5 10 15 20

Pro Gly Thr Thr Thr Asp Gly Met Asp Pro Gly Val Val Ala Thr Thr Ser Val Ile Thr

25 30 35 40

Ala Glu Asn Ser Ser Ala Ser Ile Ala Thr Ala Gly Ile Gly Gly Pro Pro Gln Gln Val

45 50 55 60

Asp Gln Gln Glu Thr Trp Arg Thr Asn Phe Tyr Tyr Asn Asp Val Phe Thr Trp Ser Val

65 70 75 80

Ala Asp Ala Pro Gly Ser Ile Leu Tyr Thr Val Gln His Ser Pro Gln Asn Asn Pro Phe

85 90 95 100

Thr Ala Val Leu Ser Gln Met Tyr Ala Gly Trp Ala Gly Gly Met Gln Phe Arg Phe Ile

105 110 115 120

Val Ala Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Arg Leu Val Arg Val Val Ile Pro Pro Gly Ile

125 130 135 140

Glu Ile Gly Arg Gly Leu Glu Val Arg Gln Phe Pro His Val Val Ile Asp Ala Arg Ser

145 150 155 160

Leu Glu Pro Val Thr Ile Thr Met Pro Asp Leu Arg Pro Asn Met Tyr His Pro Thr Gly

165 170 175 180

Asp Pro Gly Leu Val Pro Thr Leu Val Leu Ser Val Tyr Asn Asn Leu Ile Asn Pro Glu

185 190 195 200

Gly Gly Ser Thr Ser Ala Ile Gln Val Thr Val Glu Thr Arg Pro Ser Glu Asp Phe Glu

205 210 215 220

Phe Val Mer Ile Arg Ala Pro Ser Ser Lys Thr Val Asp Ser Ile Ser Pro Ala Gly Leu

225 230 235 240

Leu Thr Thr Pro Val Leu Thr Gly Val Gly

245 250

Claims

1.一种抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法, 其特征在于包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的RHDV的结构蛋白VP60的N端250个氨基酸序列VP60-N如下：

3. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物为：

上游引物：5’- CCGGAATTCEcoR I ATGGAGGGCAAAGCCCGCA-3’，

下游引物：5’- CCGCTCGAGXho I ATTGCCAACACCAGTGA-3’；

PCR退火温度为52-55℃。

4. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中免疫原的制备具体为：分析和选择兔RHDV病毒VP60的主要抗原表位决定簇肽段，即N端1-250aa肽段（VP60-N）作为免疫原；采用PCR的方法，以VP60全长基因序列为模板扩增VP60-N片段；通过基因工程技术，将该片段克隆到原核表达载体pET28a(+)上，转化基因工程菌BL21（DE3），完成VP60-N重组抗原蛋白的原核诱导表达；最后纯化重组的VP60-N抗原蛋白。

5. 根据权利要求4所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：PCR扩增后的产物，经EcoR I 和Xho I酶切回收后，与同样经过双酶切处理的pET28a(+)原核表达载体进行连接和转化，形成重组质粒pET28a-VP60-N；将重组质粒pET28a-VP60-N转化E.coli BL21(DE3)，次日挑取单菌落接种于3 ml含卡那霉素的LB液体培养基，于37℃，150 rpm振荡培养；过夜培养后，按1：200接种扩大培养，待菌液OD 600值为0.6-0.8时加入终浓度为0.5 mM IPTG诱导，温度为22℃-30℃；诱导8-12 h后，12000 rpm离心收集菌体，加入终浓度为10 mg/ml的溶菌酶，冰浴1h，采用4次反复冻融法裂解菌体，12000 rpm离心15 min，收集上清，SDS-PAGE检测确定VP60-N重组蛋白以可溶形式表达后，使用Ni-NTA树脂纯化VP60-N重组蛋白抗原。

6. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（2）中免疫产蛋鸡的方法为将纯化的VP60-N重组抗原与弗氏佐剂按1:1混合乳化3-5h，之后2-3点肌肉注射免疫产蛋鸡；第一免疫后每隔一个月加强免疫一次，共加强免疫2次，第三次免疫后的第二周开始收集鸡蛋；检测蛋黄中VP60-N特异性的抗体滴度达到1:20000以上时为合格；采用水稀释法-超滤法从鸡蛋蛋黄中分离纯化出RHDV特异性的卵黄抗体IgY。

7. 根据权利要求6所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：检测抗体的纯度、特异性及滴度的方法是SDS-PAGE、Western blot、ELISA和Dot blot。

8. 根据权利要求6所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：免疫产蛋鸡是通过肌肉或皮下多点注射免疫未免疫的产蛋鸡，初免剂量为300ug/只；每隔一个月加强免疫一次，共两次，免疫剂量调整为150ug/只，第三次免疫后一周开始收集鸡蛋；此后当卵黄抗体滴度低于10⁴时可进行强化免疫，免疫剂量为100ug/只。

9. 根据权利要求6所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述水稀释法-超滤法从蛋黄中分离纯化出RHDV特异性的卵黄抗体IgY即用超纯水按体积比1:8稀释蛋黄液，用HCL调节pH至5.2，4℃静置6-8小时，离心去脂，再用10%和30%分步沉淀卵黄抗体，最后应用超滤法进一步脱盐、纯化和浓缩卵黄抗体，其得率10-12mg/ml蛋黄液，纯度达到90%以上，抗体滴度达1: 10⁴以上，所述超滤法截留分子量为100kD。

10. 根据权利要求1所述的抗兔病毒性出血症病毒RHDV卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述冻干粉的使用为：用生理盐水溶解，浓度为5mg/mL, 从兔耳缘静脉进行静脉注射，剂量为5-20mg/kg。