CN101519447A - 抗兔出血症病毒vp60蛋白单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白单克隆抗体，属于生物技术领域。取SP2/0骨髓瘤细胞与用RHDV重组VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行细胞融合，用HAT培养基进行选择性培养后，用重组VP60蛋白和RHDV进行双重ELISA筛选，分别对细胞培养上清进行检测、筛选获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，测得A3C腹水ELISA效价为1∶327600，经鉴定该单克隆抗体既可与表达的重组VP60蛋白特异性结合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。

Description

抗兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体

技术领域

本发明涉及抗兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白单克隆抗体，属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体为抗兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白单克隆抗体。

背景技术

兔出血症(RHD)，又称兔瘟，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，感染兔通常48～72h死亡，主要特征为传染性极强、呼吸系统出血、肝坏死、脏器水肿、淤血和出血等变化，给全世界养兔业造成了巨大的经济损失。国际兽医局将该病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫病。

RHDV属杯状病毒，病毒粒子呈球型，为二十面体对称，无囊膜。病毒含有一条单股正链RNA，由7437个核苷酸组成，与一般的杯状病毒不同，RHDV只有2个开放阅读框架(ORF)，ORFI位于基因组5′端，从核苷酸10延伸至核苷酸7041，约占整个基因组的94％。RHDV的ORFI基因序列为：NH₂-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C样蛋白酶-3D聚合酶-衣壳蛋白-COOH。衣壳蛋白是RHDV唯一的结构蛋白，称为VP60，其基因片段长度为1740bp，共编码580个氨基酸，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。用纯化的RHDV病毒作为免疫原制备单克隆抗体的效价通常偏低，不利于RHDV单克隆抗体的应用。利用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60重组蛋白制备的单克隆抗体可为VP60蛋白研究和RHDV免疫学方法建立提供必要的试剂和技术手段，对探索VP60蛋白的生物学功能区域和建立RHDV特异、敏感的检测方法等具有重要意义。

发明内容

技术问题 本发明的目的是提供抗兔出血症病毒VP60蛋白单克隆抗体。本发明的单克隆抗体是用杆状病毒表达系统表达的重组VP60蛋白为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术制备获得的，能特异识别RHDV衣壳蛋白。兔出血症病毒重组VP60蛋白是将RHDV VP60基因克隆于杆状病毒表达系统的穿梭载体并通过转染在昆虫细胞中表达的蛋白。

技术方案

一种抗兔出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株A3C产生的，杂交瘤细胞株A3C于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC—C200921。制备方法包括：

1)RHDV重组VP60蛋白的制备根据RHDV VP60序列设计一对引物，用RT-PCR方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因，通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重组病毒rAcV-Bac-VP60，用此重组病毒感染Sf9昆虫细胞，经免疫荧光法、Western-blotting、血凝实验鉴定重组VP60蛋白表达，获得免疫用重组VP60蛋白；

2)小鼠免疫 用血凝效价为13 log 2的RHDV重组VP60蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫程序为：皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200μL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫；

3)细胞融合

取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1,000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50％ PEG-40001mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的DMEM不完全培养基，室温静置10min，1,000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS和HAT的DMEM培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％ CO2培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT的DMEM培养基换出1/2培养基；14d后，改用含20％FCS和HT的DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测；

4)杂交瘤筛选

用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13log2的兔出血症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达的血凝效价为13log 2VP60蛋白进行倍比稀释，用稀释至1：2⁷的液体包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1∶100稀释的阳性参考血清和1∶100稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用90min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD₄₅₀值，当阴性参考血清的OD₄₅₀值≦0.1，阳性参考血清的OD₄₅₀值与阴性参考血清的OD₄₅₀值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≧2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N<2.1的检测孔判为可疑，P/N<1.5的检测孔判为阴性；

5)有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆

首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％ CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDVVP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C；

6)抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备

将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞株A3C用0.01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷个细胞，0.2mL，5～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。

有益效果 本发明的特点和优点如下：

1、本发明提供的RHDV重组蛋白VP60抗原制备方法简便可行；

2、本发明提供的抗RHDV衣壳蛋白VP60的单克隆抗体特异性强，制备方法简单；

3、本发明提供的特异性单克隆抗体可用于VP60蛋白的研究和RHDV免疫学检测方法的建立。

4、获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，测得A3C腹水ELISA效价为1:327600，经鉴定该单克隆抗体既可与表达的重组VP60蛋白特异性结合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。

附图说明

图1重组转移载体的酶切鉴定，图中1是限制性内切酶(Sal I/Xho I酶切)消化重组转移载体，2是DNA分子量标准(DL-2 000)，3是DNA分子量标准(DL-15 000)。

图2重组Bacmid的PCR鉴定，图中1是DNA分子量标准(DL-15 000)，2是DNA分子量标准(DL-2 000)，3是用pUC/M13上、下游引物对重组Bacmid PCR鉴定，4是用pUC/M13上游引物与特异性VP60基因下游引物对重组Bacmid PCR鉴定，5是用pUC/M13上、下游引物对Bacmid PCR鉴定。

图3表达蛋白的免疫荧光鉴定，在感染重组病毒的细胞内有强烈的荧光反应。

杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC—C200921。

具体实施方式

(一)表达重组VP60蛋白表达载体的构建

参照GenBank中中国吉林株RHDV基因组序列(AY523410)，利用Primer 5.0软件自行设计一对引物。上游引物P1：5’-ATA GTCGAC ATG GAG GGC AAA G-3’；下游引物P2：5’-GCC TCG AGT CAG ACA TAA GM AAG CCA-3’。在上游引物的5’端加入Sal I酶切位点，下游引物的5’端引入Xho I酶切位点。用RT-PCR方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387)，经酶切消化后连接到供体质粒pFastBac^TM1(购买于Invitrogen公司)上，转化DH5α感受态细胞，提取质粒用Sal I和Xho I酶切，经鉴定得到重组转移载体pFastBac^TM1-VP60(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387)(图2)，然后用此质粒转化含有穿梭载体Bacmid(购买于Invitrogen公司)的E.coli DH10Bac(购买于Invitrogen公司)感受态细胞，提取质粒，以通用pUCM13上游引物(购买于Invitrogen公司)和特异性VP60下游引物进行PCR鉴定。同时设立未插入外源基因片段的DH10Bacmid质粒(购买于Invitrogen公司)对照组，以pUCM13上、下游引物(购买于Invitrogen公司)进行PCR鉴定。经筛选得到重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-VP60(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387)(图3)。

(二)重组VP60蛋白的表达

1、昆虫细胞转染

以Lipofectamin^TM2000为共转染试剂，用重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-VP60(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387)转染Sf9(购买于Invitrogen公司)单层细胞。转染后每12h观察一次，直到细胞病变明显时，收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液4℃保存。将含目的基因VP60的重组杆状病毒命名为rAcV-Bac-VP60(王芳等，兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果，畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387)。

2、间接免疫荧光检测(IFA)鉴定

用此重组病毒感染于24孔细胞培养板上培养的对数生长期Sf9昆虫细胞，培养至发生病变时，用间接免疫荧光法(IFA)检测重组蛋白的表达，结果显示，重组杆状病毒感染的Sf9细胞具有很强的特异性荧光(图4)，说明VP60蛋白得到表达。

3、Western-blotting鉴定

将重组病毒以1％的体积比感染Sf9细胞，96h后收集病变细胞及培养液，分装于1.5mL离心管中，3000rpm/min，离心5min，培养上清保留，细胞用PBS重悬细胞洗涤2次后，溶于500μL PBS，反复冻融3次后，超声裂解，3000rpm/min，离心5min，取上清，加入上样缓冲液，煮沸5分钟，11000g，离心1min，取上清20μL进行蛋白质电泳(SDS-PAGE)，同时以感染野生Bacmid的Sf9细胞裂解产物和Sf9细胞裂解产物作为对照样品。采用半干转印法，取下凝胶，0.65mA/cm²，转印1.5h后，将其转印于硝酸纤维膜(NC膜)上，应用RHDV高免血清按常规方法进行Western-blotting反应，电泳和转印结果显示：VP60基因在昆虫细胞中表达了大小约为60kD的特异性条带，而对照样品感染野生Bacmid的Sf9细胞裂解产物和Sf9细胞裂解产物均未显示相应的条带。免疫印迹与电泳的目的条带位置相符，说明目的蛋白得到表达。

4、血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定

分别取感染重组病毒的细胞裂解上清和细胞培养上清50μL于圆底大孔血凝板以生理盐水作2倍比稀释后，加入等体积1％人“O”型红细胞悬液，振荡均匀后，置于4℃作用45分钟后观察结果。同时以其他重组杆状病毒感染细胞产物作为阴性对照，以RHDV病兔肝脏1：5匀浆上清作为阳性对照。结果显示，感染细胞裂解上清和细胞培养上清血凝效价均可达2¹²以上，而其他重组杆状病毒感染细胞产物无血凝反应。

于圆底大孔血凝板加入50μL RHDV血清，以生理盐水作2倍比稀释后，加入4个血凝单位的表达蛋白于每孔，将血凝板置37℃，作用30分钟后，每孔加1％人“O”型红细胞悬液50μL，立即摇匀，置4℃作用45分钟。结果显示，表达的VP60蛋白的血凝特性可被RHDV高免血清所抑制，表明表达的VP60蛋白具有与RHDV相似的生物学活性。

(三)杂交瘤细胞株的建立

1、小鼠免疫

用血凝效价为13 log 2 RHDV重组VP60蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫程序为：皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200μL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫。

2、细胞融合

按常规方法进行(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第1版)[M].合肥：安徽科学技术出版社，1994：18～30.)。取SP2/0骨髓瘤细胞与VP60蛋白免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1,000rpm离心10min，弃上清。用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热。用1mL吸管在45s内加完预热至40℃ 50％ PEG-40001mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的DMEM(购买于Invitrogen公司)不完全培养基，室温静置10min，1,000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％FCS(小牛血清，购买于上海慧人生物科技工程研究所)和HAT(购买于Invitrogen公司)DMEM培养基重悬。分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％CO2培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT(购买于Invitrogen公司)的DMEM培养基换出1/2培养基。14d后，改用含20％FCS和HT的DMEM培养基培养，当融合细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。

3、杂交瘤筛选

用重组VP60蛋白和RHDV包被进行双重间接ELISA，分别对细胞培养上清进行检测，筛选出对RHDV和VP60重组蛋白呈为阳性的杂交瘤细胞。用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13 log 2的兔出血症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达血凝效价为13 log 2的VP60蛋白进行倍比稀释，用稀释至1：2⁷的液体包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1∶100稀释的阳性参考血清和1∶100稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用90min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD₄₅₀值，当阴性参考血清的OD₄₅₀值≦0.1，阳性参考血清的OD₄₅₀值与阴性参考血清的OD₄₅₀值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≧2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N<2.1的检测孔判为可疑，P/N<1.5的检测孔判为阴性。

4、有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆

对于筛选所得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法(刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用(第1版)[M].合肥：安徽科学技术出版社，1994：35-36.)进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基(注：首次亚克隆应加HT)稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％ CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C。杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC—C200921。

(四)抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备

将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞用0.01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷，0.2mL，5～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。

(五)抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的腹水效价测定

用PBS缓冲液1:100稀释单克隆抗体腹水，然后进行倍比稀释，加入用杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白包被的酶标板，100μL/孔，37℃，孵育90min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，孵育60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450值。以阴性OD450值小于0.2，检测孔与阴性OD450值的比值大于2.1判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示，A3C细胞株腹水间接ELISA效价为1:327600。

(六)抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体与重组蛋白和RHDV反应原性与特异性鉴定

用Western-blotting(冯仁青，郭振泉.现代抗体技术及其应用(第1版)[M].北京：北京大学出版社，2006：199～206.)鉴定所得单克隆抗体腹水的反应原性与特异性。用表达的重组蛋白和RHDV在12％分离胶，5％浓缩胶中进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶在Tris-Gly缓冲系统中转印到硝酸纤维膜(NC膜)上，0.65mA/cm²，转印100分钟，5％脱脂奶封闭，以单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色试剂盒显色。结果显示，该单克隆抗体既可与表达的重组蛋白特异性结合，又可与RHDV特异性结合，均出现单一一条反应条带，证明抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体是RHDV衣壳蛋白VP60特异性抗体。

Claims (2)

1、一种抗兔出血症病毒RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体是杂交瘤细胞株A3C产生的，杂交瘤细胞株A3C于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC—C200921。

2、根据权利要求1所述的一种抗RHDV衣壳蛋白VP60单克隆抗体，其特征在于，是由以下方法制备而获得的：

1)RHDV重组VP60蛋白的制备

根据RHDV VP60序列设计一对引物，用RT-PCR方法扩增RHDV衣壳蛋白VP60基因，通过克隆、转化得到重组穿梭载体Bacmid-VP60，用此质粒转染Sf9昆虫细胞，得到重组病毒rAcV-Bac-VP60，用此重组病毒感染Sf9昆虫细胞，经免疫荧光法、Western-blotting、血凝实验鉴定重组VP60蛋白表达，获得免疫用重组VP60蛋白；

2)小鼠免疫

血凝效价为13log2的RHDV重组VP60蛋白免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，免疫程序为：皮下注射弗氏完全佐剂乳化的抗原200μL/只，2周后皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，间隔2周后，再皮下注射弗氏不完全佐剂乳化的等量抗原，融合前3天腹腔注射等量不加佐剂的抗原加强免疫；

3)细胞融合

取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c小鼠脾细胞按1∶5～1∶10的比例混合于50mL离心管中，充分混匀，1,000rpm离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40℃水浴预热，用1mL吸管在45s内加完预热至40℃的50％PEG-40001mL，边加边轻轻振荡，然后在90s内加入30mL预热至37℃的DMEM不完全培养基，室温静置10min，1,000rpm离心10min，弃上清，加入20mL含20％ FCS和HAT的DMEM培养基重悬；分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％ CO2培养箱培养，7d后，观察细胞的生长状况，用含有20％FCS和HT的DMEM培养基换出1/2培养基；14d后，改用含20％ FCS和HT的DMEM培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测；

4)杂交瘤筛选

用包被液为0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液对起始血凝效价为13 log 2的兔出血症肝病料上清液和杆状病毒表达系统表达的血凝效价为13 log 2的VP60结构蛋白进行稀释，用稀释至1：2⁷的液体包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将细胞上清、1∶100稀释的阳性参考血清和1∶100稀释的阴性参考血清，加入相应孔内，100μL/孔，37℃作用90min；PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1∶2000稀释的酶标羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗涤5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸终止反应；经酶标仪测定OD450nm值：以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为阴性参考血清的OD₄₅₀值，当阴性参考血清的OD₄₅₀值≦0.1，阳性参考血清的OD₄₅₀值与阴性参考血清的OD₄₅₀值的比值≧2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N≧2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N<2.1的检测孔判为可疑，P/N<1.5的检测孔判为阴性；

5)有限稀释法对杂交瘤细胞亚克隆

首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用DMEM完全培养基稀释成100个细胞/15mL培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15mL，37℃，5％ CO₂培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行ELISA检测；选择阳性的单克隆细胞再进行同样的亚克隆3次以上，直至亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性孔、且各孔检测OD值较接近；将多次亚克隆培养后的阳性孔细胞扩大培养，并冻存，获得稳定分泌抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株A3C，杂交瘤细胞株A3C，于2009年3月24日宝藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉武汉大学邮编：430072，保藏编号为CCTCC—C200921；

6)抗RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备

将石蜡油注射成年BALB/c小鼠，0.5mL/只，致敏7天后，将阳性杂交瘤细胞株A3C用0.01MPBS稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射5×10⁶～1×10⁷个细胞，0.2mL，5～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，11000g，离心5min，收集上清，小量分装，-70℃保存。

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