CN108486064A - 杂交瘤细胞株Anti-CLasMcAb1及其分泌的单克隆抗体与应用 - Google Patents

杂交瘤细胞株Anti-CLasMcAb1及其分泌的单克隆抗体与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株Anti‑CLas McAb1，其为小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)Anti‑CLas McAb1，其保藏编号为CCTCC NO：C2017219。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株的制备方法及由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体。本发明还提供了重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的应用，包括检测试剂盒以及免疫胶体金检测试纸条，均利用重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的特异性。具有特异性好、抗干扰性强、成本低、应用广泛的优点，能快速有效地检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。

Description

杂交瘤细胞株Anti-CLasMcAb1及其分泌的单克隆抗体与应用
技术领域
本发明涉及一种杂交瘤细胞株及单克隆抗体，尤其涉及杂交瘤细胞株 Anti-CLasMcAb1及其分泌的单克隆抗体与应用。
背景技术
柑橘黄龙病是柑橘生产上防治最难、危害最重、威胁最大的一种毁灭性病害，被人们称作柑橘上的“艾滋病”，广泛分布在我国几乎所有的柑橘主产区。作为一种毁灭性病害，柑橘染病植株往往在2～3年内丧失结果能力或死亡，甚至造成毁园。柑橘黄龙病的猖獗危害和蔓延扩散，对柑橘产业的稳定和发展造成了严重的威胁，已经成为柑橘产业发展的重大障碍。
目前对柑橘黄龙病尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗性品种，因此综合防治是当前该病害防治的主要方法。其中，严格的植物检疫是保护无病区和新区柑橘的前提，建立无病毒苗圃、培育和种植无病毒苗木是预防黄龙病的基础，及时消灭传病木虱和彻底挖除病树是防止病害流行的关键措施。然而，这些工作的开展都必须建立在明确柑橘材料内是否存在黄龙病菌的基础之上。因此，对黄龙病菌快速准确地检测和诊断是当前该病害综合防控的重要前提。
现有对柑橘黄龙病的检测和诊断，已经发展了多种方法和技术，如田间诊断、指示植物鉴定、显微镜观察、血清学检测、核酸杂交检测及PCR检测等。虽然这些方法促进了人们对柑橘黄龙病认识的加深，然而在柑橘实际生产应用中却表现出不同程度的局限性。如在田间诊断过程中，由于病害症状复杂多变，且易与缺素、病毒病害和药害等症状相混淆，因此常导致诊断错误；而嫁接成功率不高和稳定性差等问题影响了通过指示植物进行鉴定的效率，且该方法耗时较长(往往要经过几个月甚至更长的时间才能得知鉴定结果)；通过显微镜、血清学等方法鉴定则需要特定的仪器设备和专业的实验技能；核酸杂交和各种 PCR技术虽然可以快速准确地检测黄龙病，但与显微镜、血清学等方法一样，需要昂贵的仪器设备、试剂材料和熟练的实验技能。因此，迫切需要开发一种应用于柑橘生产实践中的新技术或新产品，实现对黄龙病菌快速、准确地检测和诊断。
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma) 抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。对比文件1：专利号为“CN102212134A”，名称为“柑橘黄龙病菌外膜蛋白多克隆抗体及其制备方法和应用”的专利，公开了抗柑橘黄龙病菌外膜蛋白的多克隆抗体。所制备的多克隆抗体可用于田间感染柑橘黄龙病菌样品的检测。该专利公开的为多克隆抗体，因多克隆抗体自身存在无法避免的特异性较差的弊端，且柑橘黄龙病菌的外膜蛋白有很多种，以哪种外膜蛋白作为抗原制作单克隆抗体检测柑橘黄龙病菌的效果最好未见报道，且目前还尚未有针对黄龙病菌特异蛋白的单克隆抗体方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1及CLas McAb1单克隆抗体，针对CLas McAb1的单克隆抗体具有特异性好、抗干扰性强、成本低、应用广泛的优点，能快速有效地检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1，其为小鼠杂交瘤细胞(Mus musculus Hybridoma)Anti-CLas McAb1，其保藏编号为CCTCC NO： C2017219。
本发明的目的之二在于提供重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体，其为针对重组黄龙病菌CLas McAb1蛋白的特异性单克隆抗体，所述重组黄龙病菌 CLas McAb1的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1 或其传代细胞株分泌产生。
本发明的目的之三在于提供一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株Anti-CLasMcAb1的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、扩增黄龙病菌CLas McAb1编码区基因，通过特异性接头装入原核表达载体pET-102，得到重组表达质粒p102-McAb1；
步骤2、将重组表达质粒p102-McAb1转化至大肠杆菌Rosetta菌株，加入诱导剂诱导CLas McAb1蛋白的表达，得到诱导后菌体；
步骤3、收集并破碎诱导后菌体，再通过免疫实验动物、免疫后动物脾脏细胞与骨髓瘤融合，得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株通过差异性ELISA筛选法得到只分泌针对CLasMcAb1蛋白抗体的阳性细胞株。
本发明的目的之四在于提供重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的应用，通过间接ELISA法利用所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体检测柑橘黄龙病菌。
本发明的目的之五在于提供一种黄龙病菌的ELISA检测试剂盒，包括以上任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体。
本发明的目的之六在于提供一种黄龙病菌的免疫胶体金检测试纸条，包括以上任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体。
本发明具有的有益效果是：具有特异性好、抗干扰性强、成本低、应用广泛的优点，能快速有效地检测柑橘材料中存在的黄龙病菌。
其中，本发明的杂交瘤细胞株的保藏日期为2017年10月11日，保藏编号为CCTCCNO：C2017219。命名为杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1，其来源种属的拉丁文学名Musmusculus，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的制备流程图；
图2为本发明实施例1提供的载体pET-102的质粒图谱；
图3为本发明实施例1提供的SDS-PAGE检测纯化后的CLas McAb1蛋白；
图4为本发明实施2提供的SDS-PAGE检测纯化后的腹水重组黄龙病菌 CLas McAb1的单克隆抗体；
图5为本发明实施3提供的Western-blot实验验证腹水重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的特异性。
具体实施方式
实施例1杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1的建立
一、准备实验材料及试剂
操作前将下表所需的各种已灭菌的耗材放置超净台中照射杀菌。各种规格移液器及配套的枪头、匀浆器、剪刀及镊子、玻璃平皿、泡沫垫、针头，细胞筛网，滤纸，96孔细胞培养板(无菌)。
表1
二、实验方法
1、重组表达质粒p102-McAb1的制备
先设计针对黄龙病菌McAb1(重组黄龙病菌CLas McAb1蛋白的核苷酸序列如SEQID NO：1所示)的特异性引物，根据载体特异结构设计扩增黄龙病菌CLas McAb1编码区基因的上下引物分别为5′ -CACCCCAGCCGTCTTTACCAGTCT-3′(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)和5′-GTTGGTGGGTCTTTGGAA AA-3′(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)，运用PCR技术从黄龙病菌基因组中扩增McAb1编码区基因(高保真酶)，扩增产物回收纯化后直接装入载体pET-102，得到重组表达质粒p102-McAb1，将该质粒通过热激转化法转入TOP10菌株扩繁，经测序验证无误后，将重组质粒p102-McAb1转入Rosetta表达菌株。
空白对照组：不含McAb1基因的空载体质粒pET-102。图2为载体质粒 pET-102的图谱。
2、免疫抗原的制备
(1)菌液活化：重组表达质粒p102-McAb1接种液体培养基摇菌，取20ul 菌液于2ml含Kan+和Cap+的LB培养基活化(37℃，16h)；空白对照组：不含McAb1基因的空载体质粒pET-102做相同的处理。
(2)诱导表达测试：挑取单菌落到含有Kan+和Cap+的LB培养基中，摇菌至OD600＝0.6时，0.8mM IPTG诱导表达(37℃，4h)。同时以未诱导表达的 McAb1/Rosseta作对比。诱导后离心12000rpm，1min，收集菌体沉淀，PBS重新悬浮后，加入等体积的2×SDS-PAGEloading buffer煮样制样，12％SDS-PAGE 分析表达情况，根据SDS-PAGE结果判断，McAb1/Rosseta正常表达。空白对照组：不含McAb1基因的空载体质粒pET-102做相同的诱导处理。
(3)取活化的菌液扩大培养，OD600＝0.6时，加入0.2mM IPTG诱导(20℃， 16h)，收集菌体。超声波破菌15min，功率390W，工作2s，停4s，9000rpm，离心10min。收集上清，并以变性缓冲液重悬沉淀，分别制样，12％SDS-PAGE 检测分析其表达状态。空白对照组：不含McAb1基因的空载体质粒pET-102做相同的扩培处理。根据SDS-PAGE结果结合其体积判断，主要表达在沉淀[包涵体]中。
(4)蛋白纯化：取溶解于变性缓冲液的包涵体，通过葡聚糖凝胶分离、离子交换等方法纯化目的蛋白，纯化之后的蛋白通过缓冲液置换，溶解在PBS溶液中，如图3所示，SDS-PAGE检测可知得到纯度高的CLas McAb1蛋白。其中，纯化的蛋白溶液中buffer的主要成分及浓度如下表2。空白对照组：不含McAb1 基因的空载体质粒pET-102做相同的纯化处理。
表2
成分 Na2HPO4 NaH2PO4 NaCl KCl
浓度(mmol/L) 8 1.47 137 2.7
3、小鼠的免疫
选择4～6周龄的行动敏捷的纯系BALB/C雌小鼠10只，分成两组，即实验组和对照组各5只，分别采取皮下多点注射首次免疫小鼠，对照组每只小鼠的免疫剂量为10ul/只，实验组进行4次免疫，每次免疫间隔时间为7-15天。
表3
序号 时间 工作节点 工作内容
1 2016.6.17 免疫前采阴性血 阴性血清≥10ul/只
2 2016.6.17 第一次免疫 免疫抗原100ug/只
3 2016.7.2 第二次免疫 免疫抗原100ug/只
4 2016.7.16 第三次免疫 免疫抗原100ug/只
5 2016.7.30 第四次免疫 尾静脉100ug/只
4、细胞的融合
具体步骤如下：尾静脉第四次免疫3d后，采集少量血液，分离血清-20℃冻存，作为筛选时的阳性对照。按生物安全方法处死免疫鼠，75％酒精浸泡消毒 5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW4000) 作用下融合，用Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，融合好的细胞及饲养细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板，置37℃、6％CO2培养箱中培养。5d 后加入新鲜HAT培养基，10d后改用HAT完全培养基进行培养，定期观察、换液和检测。
5、特异性阳性细胞株的筛选
(1)细胞融合10天后，用显微镜观察，可以看到杂交细胞形成小集落。换液，HAT完全培养基，100μl/孔。对长有杂交瘤细胞的孔，采用ELISA检测间接酶联免疫吸附法，利用用pET-102与p102-McAb1细菌诱导后裂解物作为检测抗原进行阳性筛选，待筛选的细胞孔上清液同时分别与其反应，只与 p102-McAb1细菌诱导后裂解物包被孔反应的，也就是与CLasMcAb1蛋白特异性反应的定为候选菌株。上清液的OD450值与空白对照孔的OD450值之比大于2.1的即判断为阳性孔，其中的杂交瘤细胞即可称为阳性细胞株。通过此原理特异性筛选可以得到只针对CLas McAb1蛋白抗体的细胞株，从而可以通过该方法得到细胞培养上清液或者腹水。ELISA检测间接酶联免疫吸附法测得该单克隆抗体的OD值为2.914。
(2)ELISA检测间接酶联免疫吸附法的具体操作步骤：
a、包被：McAb1抗原(即重组黄龙病菌CLas McAb1蛋白)按1ug/ml包被，100ul/孔，4℃过夜；
b、封闭：拍干酶标板中液体，加入封闭液(5％脱脂奶粉in TBST)150ul/ 孔，37℃孵育60min；
c、一抗：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，加入待检测细胞上清100ul/孔，37℃孵育60min；
d、二抗：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，加入HRP 羊抗小鼠(1:3000封闭液稀释)100ul/孔，37℃孵育60min；
e、显色：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，加入单底物TMB100ul/孔，显色3-5min；
f、终止：加入终止液50ul/孔，OD450读数；
g、结果及选择：初步检测，选取数值较高的，加液HT完全培养基(20％胎牛血清+1％双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HT(50×)+DMEM)100ul/ 孔。第二天用抗原包被的与未用抗原包被的同时复检；
ELISA检测间接酶联免疫吸附法测得该单克隆抗体的OD值为2.914。
6、亚克隆筛选
采用有限稀释法对步骤6中筛选到的3种阳性细胞株分别进行亚克隆，连续两次亚克隆之后剔除掉假阳性细胞株，最终获得分别分泌只针对CLas McAb1 蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养后液氮冻存，即为本发明提供的的杂交瘤细胞株，其保藏日期为2017年10月11日，保藏编号为CCTCCNO：C2017219。命名为杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1，其来源种属的拉丁文学名Musmusculus，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉市武汉大学，邮编：430072。
实施例2：单克隆抗体的制备
1、腹水制备
(1)取6周龄以上的BALB/c小鼠腹腔注射福氏不完全佐剂，0.5ml/只；
(2)三天后，腹腔接种用PBS或不完全培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1-5×106/0.5ml；
(3)间隔3天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用10ml针头采集腹水；
(4)将腹水离心(12000rpm离心10min)，收集上清，将上清冻存于-20℃冰箱。
2、腹水抗体纯化
(1)血清预处理:0.22孔径滤器过滤血清，与等体积PBS(pH7.4)混合，调至pH7.8，此时亲和挂柱效果较好；
(2)平衡亲和柱:用10倍体积的PBS(pH7.4)清洗柱子，同时将柱子下端与核酸蛋白检测仪进液口连接固定；
(3)上样：PBS平衡柱体时，调节核酸蛋白检测仪数值稳定在0左右，将样品加入上样柱床，核酸蛋白检测仪上数值慢慢升高，收集液体(此液体简称流穿液，流穿液中可能还会有未被柱子捕获的抗体，所以暂时收集以再次过柱纯化使用)；
(4)上样完毕后，用PBS(pH7.2)洗杂蛋白，当核酸蛋白检测仪的数值下降到平衡数值，不再下降时，停止收集流穿液；
(5)抗体洗脱：当核酸蛋白检测仪的数值保持较低数值并稳定时，待柱床液面快流干时，轻轻在柱床上加入洗脱液(0.1M Gly-HCl，pH2.7)，尽量不要冲起柱床；当核酸蛋白检测仪上数值迅速升高时，迅速顺次分管承接洗脱的液体，并迅速用中和液(0.5M Tris-Cl，pH8.0)中和，承接时宜多管顺次接取，并记录顺序；
(6)洗脱完毕后，当数值变低并不再变动时，用至少5倍柱床体积的PBS 以2～4ml/min流速清洗平衡柱子；
(7)柱床用保存液(含20％乙醇的PBS)保存，并封闭柱子上下两端，4℃保存；
(8)抗体对PBS(pH7.2)透析3次，每次4h以上；
(9)测抗体浓度，抗体浓度为2mg/ml，并通过SDS-PAGE分析抗体纯度。
如图4所示。其中图4中第一道为Marker,第二道及第三道为BSA的阴性对照，第四道为本发明提供的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1的亚克隆分泌的针对CLas McAb1的单克隆抗体。
实施例3单克隆抗体的特性检测
1、单克隆抗体效价检测
(1)包被：McAb1抗原按1ug/ml包被，100ul/孔，4℃过夜；
(2)封闭：拍干酶标板中液体，加入封闭液(1％BSAin TBST)150ul/孔， 37℃孵育60min；
(3)一抗：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，将实施例2中纯化后的抗体以1:3000和3倍的倍比稀释(1％BSA稀释),100ul/孔，37℃孵育60min；
(4)二抗：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，加入 HRP羊抗小鼠(1:3000封闭液稀释)100ul/孔，37℃孵育60min；
(5)显色：拍干酶标板中液体，350ul/孔/次，TBST洗3次，拍干，加入单底物TMB100ul/孔，显色3-5min；
(6)终止：加入终止液50ul/孔，OD450读数；
实验显示，重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的效价为1：7.29×105。
2、单抗特异性的鉴定
将目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，将阴性血清作为阴性对照组。电泳结束后，进行Western-blot实验，采用湿转法将蛋白转印到NC膜上，然后经过脱脂奶粉封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤后，进行曝光显色。
如图5所示，图中1泳道为阴性对照，泳道2中为阳性反应，其中35KD 的条带为阳性带(CLas McAb1蛋白的大小为35KD)，结果显示所制备的单克隆抗体能与黄龙病阳性柑橘叶片中目的蛋白特异性结合，而不与对健康柑橘叶片对照反应。
实施例4重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的应用
1、制得的重组黄龙病菌McAb1单克隆抗体应用于制备ELISA试剂盒/免疫胶体金检测试纸条、免疫荧光、免疫比浊、化学发光等各种形式的产品。
(1)重组黄龙病菌McAb1的ELISA试剂盒，选自以下任一：
a、盒体、设在盒体内的酶标板和存放在盒体内的试剂，所示试剂包括重组黄龙病菌McAb1的单克隆抗体、标准品即纯化的重组黄龙病菌McAb1蛋白、检测抗体或竞争标记物；
b、盒体、设在盒体内的包被有重组黄龙病菌McAb1的单克隆抗体的酶标板和存放在盒体内的试剂，所示试剂包括标准品即纯化的重组黄龙病菌McAb1 蛋白、检测抗体或竞争标记物。
(2)黄龙病菌的免疫胶体金检测试纸条，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的样品垫和所述的金标垫紧密相连，所述的金标垫和所述的硝酸纤维素膜紧密相连，所述的硝酸纤维素膜和所述的吸水垫紧密相连，在所述的硝酸纤维素膜上设置有检测线，所述的检测线接近所述的金标垫，所述的检测线远离所述的金标垫的一侧的硝酸纤维素膜上设置有质控线，其中，由保藏号为CCTCC NO：C2017219的杂交瘤细胞株产生的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体和胶体金结合后形成金标抗体，所述的金标抗体喷涂于结合垫上形成金标垫，由保藏号为CCTCC NO：C2017219的杂交瘤细胞株产生的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体作为检测抗体，所述的检测抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成检测线。
2、通过间接ELISA方法，利用所制备的抗体或检测试剂盒检测植物材料中的柑橘黄龙病菌，操作步骤如下：
(1)取待检测成熟的柑橘枝条，叶片中脉、叶柄或根部，用锋利一次性刀片对待检测样本进行横切，同时处理健康的柑橘叶片和感染黄龙病的柑橘叶片分别作为阴性对照和阳性对照，将横切面平衡均一的转印到硝酸纤维素膜上，约8-12秒；
(2)将转印后的硝酸纤维素膜在SuperBlock封闭液中于室温下封闭2小时；
(3)加入按照恰当比例稀释的所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体，37℃120rpm孵育1.5小时；
(4)PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；
(5)加入按照恰当比例稀释的酶标记的二抗抗体，37℃120rpm孵育1.0 小时；
(6)PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；
(7)加入底物，避光显色30分钟；
(8)观察并记录颜色反应，有颜色即为阳性反应(感染黄龙病菌)，无颜色即为阴性反应(未感染黄龙病菌)。
该方法可快速检测柑橘黄龙病菌，简便、经济；快速、灵敏；无需特许仪器设备；无需专门的培训，一般果农可以操作。
a、Anti-CLas McAb1单克隆抗体检测柑橘黄龙病样品的灵敏度
田间采集椪柑、本地早、槾桔、甜橙等柑橘品种的叶片，以及通过嫁接感染柑橘黄龙病菌的长春花及健康长春花的叶片，每个品种10个样本，通过上述间接ELISA方法，分别用对比文件1中的外膜蛋白多克隆抗体与本发明的制得的重组黄龙病菌McAb1单克隆抗体作为一抗进行检测。结果见下表4，本发明的制得的重组黄龙病菌McAb1单克隆抗体的检出率大大高于对比文件1中的外膜蛋白多克隆抗体。
表4本发明单克隆抗体与对比文件1中多克隆抗体检出率比较
b、Anti-CLas McAb1单克隆抗体检测柑橘黄龙病样品的特异性
某些缺素、病毒病等引起的柑橘叶片的症状类似于柑橘黄龙病病害症状，导致人们在田间识别时将两者混淆，因此本实验利用所制备的单克隆抗体对这类症状叶片进行检测，以确定该单克隆抗体只能特异性检测柑橘黄龙病。田间采集缺锌、缺锰、缺镁等症状叶片，以及感染柑橘碎叶病毒和衰退病毒的叶片，用包被缓冲液研磨后包被酶标板，利用所制备的抗体进行间接ELISA实验。结果见表5，可以看出所制备的抗体只特异性检测柑橘黄龙病菌，而与缺锌、缺镁、缺锰及柑橘碎叶病、衰退病等样品不发生阳性反应。
表5 Anti-CLas McAb1单克隆抗体检测特异性鉴定
注：“+”表示有特异性反应，“-”表示无特异性反应
c、Anti-CLas McAb1单克隆抗体对不同地区来源的柑橘黄龙病菌分离物的检测
采集江西、福建、广东、广西、湖南、云南、海南等地感染柑橘黄龙病的样品，用包被缓冲液研磨后包被酶标板，利用所制备的Anti-CLas McAb1单克隆抗体进行间接ELISA试验，结果表明Anti-CLas McAb1单克隆抗体可以特异性识别我国不同地理来源的柑橘黄龙病样品中的病菌，均具有较好的检测效果 (见表6)。
表6 Anti-CLas McAb1单克隆抗体对不同地区柑橘黄龙病菌分离物的检测结果
注：“+”表示有特异性反应，“-”表示无特异性反应
以上所述的载体质粒pET-102全称为pET-102/D-TOPO；p102-McAb1全称为pET102-McAb1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1及其分泌的单克隆抗体及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 747
<212> DNA
<213> 柑橘黄龙病菌(liberibacter)
<400> 1
ccagccgtct ttaccagtct tattgatatc cccaaaatac tgtccccctc cagaaatagt 60
tatacttttc gcaacatcaa acttatatcc agcaaaaaca gaatatttag acttatcata 120
gtacgaatta tcaccactag cccacacggc accacaatca agagtaccag cgcgactaac 180
aggagaagaa atattagcac gtatagctac attgttagta cctgcatcat agccacctgt 240
cactgtagaa cgtatttttc caatagcata agaagccata tatcctattc ccaaaacttg 300
ctttagacca tctttttgca aaagatctgt agaaagacct gctttgagta gaccaaaaga 360
atgccgataa gaaagagaca tcatcttatc taaacctcgg gcatcattat aaagagtagt 420
cggagagtaa acaggattaa cttcatcact ccaagactta taataaccca accgtgctcc 480
tttcatgcta agagacaact cttctacaga aagcttacta gatggtacag taaatgccaa 540
agccctaaca tccgattcag caaactgcat cgataagaca tcatcaacag ctaatttcaa 600
tttggcgaca cctgtaacat cccctgcatt agcattgact tcaagatttc cttttacagg 660
tatatcatat gcaagactat taaattcatt gttcccgttt agtttgtggt accgagcctg 720
caaacttttt tccaaagacc caccaac 747
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccccagcc gtctttacca gtct 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttggtgggt ctttggaaaa 20

Claims (10)

1.杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1，其特征在于，其为小鼠杂交瘤细胞(Mus musculusHybridoma)Anti-CLas McAb1，其保藏编号为CCTCC NO：C2017219。
2.一种权利要求1所述的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、扩增黄龙病菌CLas McAb1编码区基因，通过特异性接头装入原核表达载体pET-102，得到重组表达质粒p102-McAb1；
步骤2、将重组表达质粒p102-McAb1转化至大肠杆菌Rosetta菌株，加入诱导剂诱导CLas McAb1蛋白的表达，得到诱导后菌体；
步骤3、收集并破碎诱导后菌体，再通过免疫实验动物、免疫后动物脾脏细胞与骨髓瘤融合，得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株通过差异性ELISA筛选法得到只分泌针对CLasMcAb1蛋白抗体的阳性细胞株。
3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1的制备方法，其特征在于，所述步骤1中扩增黄龙病菌CLas McAb1编码区基因的上下引物分别为
5′-CACCCCAGCCGTCTTTACCAGTCT-3′
和5′-GTTGGTGGGTCTTTGGAAAA-3′。
4.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的差异性ELISA筛选法为将含重组质粒p102-McAb1和空载体质粒pET-102的诱导菌体裂解物包被固相载体，分别与待筛选的单克隆抗体细胞株所分泌的抗体反应，只与含重组质粒p102-McAb1的诱导裂解物反应，而不与空载体质粒pET-102的诱导裂解物反应的细胞株确定为阳性，从而筛选得到只分泌针对CLas McAb1蛋白抗体的阳性细胞株。
5.重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体，其特征在于，所述重组黄龙病菌CLasMcAb1的单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Anti-CLas McAb1或其传代细胞株分泌产生。
6.如权利要求5所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体，其特征在于，其制备过程如下：所述杂交瘤细胞株培养或者注入实验动物体内得到含有特异性针对CLas McAb1蛋白抗体的细胞腹水或者上清液，进一步分离纯化得到重组黄龙病菌CLas McAb1蛋白的特异性单克隆抗体。
7.重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的应用，其特征在于，通过间接ELISA法利用权利要求5-6任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体检测柑橘黄龙病菌。
8.如权利要求7所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体的应用，其特征在于，其检测柑橘黄龙病菌步骤如下：
(1)取待检测成熟的柑橘枝条，叶片中脉、叶柄或根部，用锋利一次性刀片对待检测样本进行横切，将横切面平衡均一的转印到硝酸纤维素膜上，约8-12秒；
(2)将转印后的硝酸纤维素膜在SuperBlock封闭液中于室温下封闭2小时；
(3)加入按照恰当比例稀释的权利要求5-6任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体，37℃ 120rpm孵育1.5小时；
(4)PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；
(5)加入按照恰当比例稀释的酶标记的二抗抗体，37℃ 120rpm孵育1.0小时；
(6)PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟；
(7)加入底物，避光显色30分钟；
(8)观察并记录颜色反应，有颜色信号即为阳性，代表含有柑橘黄龙病菌。
9.一种黄龙病菌的ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求5-6任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体。
10.一种黄龙病菌的免疫胶体金检测试纸条，其特征在于，包括权利要求5-6任一所述的重组黄龙病菌CLas McAb1的单克隆抗体。
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