CN103290020A - 抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体及应用。所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株4C8分泌得到，杂交瘤细胞株4C8于2012年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCC2012156。所述多克隆抗体的制备方法如下：克隆猪Foxp3基因片段，构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得到蛋白质；以所得的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。利用上述单克隆抗体和多克隆抗体建立猪Foxp3间接夹心ELISA试剂盒，其最低检测浓度为0.458ng/mL。用此试剂盒对临床样品进行初步的应用，结果显示有病组猪与无病组猪间差异显著。该试剂盒的建立为进一步探索猪Foxp3和nTreg奠定了坚实的基础。

Description

抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪Foxp3蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，及两者在检测猪Foxp3蛋白中的应用。 

背景技术

T细胞在免疫网络中扮演着重要的角色。根据对抗原刺激的应答，初始CD4⁺T细胞可分化为效应细胞的两个亚群——Th1细胞和Th2细胞。产生1型促炎细胞因子（如IFN-γ、IL-2、TNF-β）的Th1细胞调节细胞免疫应答；产生2型抗炎细胞因子（IL-4、IL-5、IL-10）的Th2细胞参与体液免疫应答。像CD4⁺T细胞一样，CD8⁺T细胞也能分化为两个亚群：产生1型细胞因子的Tc1细胞和产生2型细胞因子的Tc2细胞。这些细胞在免疫应答中各司其职，并相互促进或相互拮抗，而在T细胞中，还存在着一类不同于以上各类细胞的具有负调节功能的T细胞群体，被称作“调节性T细胞”（regulatory T cells, Treg）。此类细胞在抗移植、抗肿瘤、抗感染等免疫反应中发挥着重要的调节作用，已成了近年来免疫学研究领域的重要内容。 

具有明显免疫抑制作用的Treg可根据其起源分为两类：天然调节性T细胞（natural Treg, nTreg）和诱导性调节性T细胞（induced Treg, iTreg）。后者是由静息T细胞在特定条件下诱导分化而成的，主要分为Tr1细胞（T regulatory 1）、Th3细胞和适应性Treg（adaptive Treg, aTreg）。而与iTreg不同，nTreg在胸腺内分化、发育和成熟，然后释放至外周血发挥调节作用，占外周CD4⁺T细胞总数的10%。由于其在维持免疫系统稳态中发挥重要作用，而成为免疫学研究领域的热点。 

CD4⁺CD25⁺T细胞又称作天然调节性T细胞（natural regulatory T cell, nTreg），可限制效应应答的强度，另一方面，也可限制由过强抗感染免疫应答所带来的组织损伤。因此，nTreg的表达水平是一个较好地反映细胞免疫功能的参考指标，可以用于临床免疫功能的监测，也可以用于某些疾病进展和预后的判断。疾病过程中nTreg数量的变化常伴随着效应性免疫应答强度的改变，监测nTreg有望成为评价动物体内细胞免疫状态和了解疾病进展的有效细胞免疫指标。传统的nTreg鉴定方法主要是通过标记CD4⁺和CD25⁺进行检测。然而，感染免疫应答后被活化的 T 细胞也表达CD25，从而使得区分调节性T细胞和活化T细胞变得十分困难。因此，有必要利用一种唯一性的调节性T细胞标记物。新近的研究显示，转录因子叉头框P3（forkhead box P3, Foxp3）被鉴定为nTreg发育和功能的主要调节器，也是nTreg迄今最特异的标志。因此，建立检测猪Foxp3快速、特异的方法对于猪体内nTreg水平的监测极为重要。 

目前，科研中检测猪Foxp3的免疫学方法主要应用抗人/鼠Foxp3的抗体，由于抗人/鼠Foxp3的抗体对猪Foxp3有交叉反应性，抗人/鼠Foxp3的抗体对于检测猪Foxp3是相对特异的，并非如抗猪Foxp3的抗体一样是完全特异的，因此，制备特异性高的抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体对于评价养殖猪体内细胞免疫状态和了解疾病进展具有重要的意义。 

发明内容

本发明的一个目的在于根据猪Foxp3基因和大肠杆菌的密码子偏爱性，优化猪Foxp3基因，从而提高目的序列在大肠杆菌中的异源表达水平。 

本发明的另一个目的是利用上述优化基因制备抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。 

本发明的另一个目的是提供分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

本发明的目的通过如下技术方案实现： 

密码子优化的猪Foxp3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种分泌抗猪Foxp3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C8，于2012年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION），地址：中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2012156。 

一种抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC NO：C2012156的杂交瘤细胞株4C8产生。 

所述单克隆抗体为IgG1,κ型。 

所述单克隆抗体由一个49.5KDa的重链和一个26.9KDa的轻链组成。 

一种抗猪Foxp3蛋白的多克隆抗体，由以下步骤制备得到： 

（1）克隆SEQ ID NO:1所示的核苷酸片段；

（2）利用步骤（1）所得的核苷酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得到蛋白质；

（3）以步骤（2）所得的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。

用于检测猪Foxp3蛋白的试剂盒，含有上述的抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。 

用于检测猪Foxp3蛋白的试剂盒，含有上述的抗猪Foxp3蛋白的多克隆抗体。 

一种猪Foxp3蛋白的间接夹心ELISA检测试剂盒，包括猪Foxp3标准蛋白、洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液、包被权利要求3所述单克隆抗体的ELISA板、检测抗体、酶标抗体；所述检测抗体为权利要求6所述的多克隆抗体，酶标抗体为HRP标记的羊抗兔IgG。 

本发明的有益效果在于：

（1）本发明根据猪Foxp3基因和大肠杆菌的密码子偏爱性，优化了猪Foxp3基因，GC含量被调整到57.58%，不利基因表达的区域被优化以延长mRNA的半衰期；影响核糖体连接和mRNA稳定性的茎环结构被改造；并依据大肠杆菌的密码子使用偏性，使密码子适应指数从0.60上升到0.88，从而提高了目的序列在大肠杆菌中的异源表达水平。重组菌诱导表达的目的蛋白占蛋白总量的34.6%，并以沉淀形式存在，将其进行纯化可得到纯度高达99.0%的目的蛋白。

（2）本发明筛选得到的杂交瘤细胞株4C8，能稳定地培养并分泌抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。所得单克隆抗体的Ig型为IgG1,κ，腹水和上清的ELISA效价分别为1:1280000和1:4000，能特异性地识别靶蛋白。 

（3）利用本发明的单克隆抗体建立的猪Foxp3间接夹心ELISA检测试剂盒，其最低检测浓度为0.458 ng/mL。量效曲线的线性范围为117.19-7.32 ng/mL。用最小二乘法证明OD值与Foxp3浓度间的简单线性相关性，关系为OD = 0.0106 [Foxp3]＋0.1387，决定系数为0.9981。试验中各反应成分不存在交叉反应。批内和批间变异系数分别为4.89%和14.26%。用此方法对临床样品进行初步的应用，结果显示有病组与无病组间差异显著。此ELISA的研制成功为以后进一步探索猪Foxp3和nTreg奠定了坚实的基础。 

附图说明

图1为Foxp3基因的PCR产物(M：DL5000 marker；1：PCR product)； 

图2为重组质粒的酶切分析（M：DL15000 marker；1：pET-28a-Foxp3/NcoⅠ＋XhoⅠ）；

图3为融合蛋白电泳图（M：Marker；1：没有诱导的pET-28a-Foxp3；2：IPTG诱导的pET-28a-Foxp3；3：诱导后pET-28a-Foxp3的破碎上清；4：诱导后pET-28a-Foxp3的破碎沉淀；5：纯化蛋白）；

图4为用PBMC免疫印迹分析单克隆抗体的特异性（M：Marker；1：4C8）；

图5为用纯化的融合蛋白免疫印迹分析单克隆抗体的特异性（M：Maker；1：4C8）；

图6为Protein G纯化腹水的SDS-PAGE分析（M：Marker；1：纯化的单克隆抗体）；

图7为免疫前后兔血清的抗体滴度；

图8为用纯化的融合蛋白免疫印迹分析血清的特异性（M：Marker；1：多克隆抗体）；

图9为Protein G纯化血清的SDS-PAGE分析（M：Marker；1：纯化的多克隆抗体）；

图10为本发明ELISA试剂盒各反应成分间的交叉反应结果；

图11为本发明间接夹心ELISA的校准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 

实施例1 猪Foxp3基因片段的克隆与原核表达

根据猪Foxp3基因和大肠杆菌的密码子偏爱性，优化并合成基因序列。在靶序列中，GC含量被调整到57.58%，不利基因表达的结构被去除，密码子适应指数从0.60上升到0.88，靶序列的异源表达水平被提升。PCR扩增的靶序列被克隆到原核表达载体pET-28a(+)后，将产物转化入宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）。通过限制性酶切和测序，阳性克隆的质粒被鉴定并且与所需序列相一致。约48KDa的融合蛋白被IPTG诱导表达后，得到高纯度的蛋白。

具体操作如下： 

1 材料

1.1 菌株与质粒

表达载体pET-28a(+)和E.coli BL21由南京农业大学动物医学院微生物与免疫学学科组保存。

1.2 主要酶与试剂 

Nco I、Xho I、T4 DNA连接酶均为Takara宝生物工程（大连）有限公司产品；核酸凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均为台湾Geneaid公司产品；2×Taq MasterMix为南京博尔迪公司产品；Ni-NTA Agarose为美津生物技术有限公司产品。

1.3 主要仪器设备 

生物安全柜（AIRTECH，苏净安泰），PCR仪（Biometra，华粤行仪器有限公司），移液器（Eppendorf），高速冷冻离心机（Eppendorf，centrifuge 5415 R），大型高速冷冻离心机（Themo，上海宝诚），多功能连接仪（Eppendorf），核酸电泳仪（Bei Jing Jun Yi-Dong Fang electrophoresis equipment company），蛋白电泳仪及凝胶成像系统（BIO-RAD），超声破碎仪（浙江宁波），恒温振荡培养箱（HALIDA，华利达），二氧化碳培养箱（HIRASAWA WORKS JANPA，WL-6D）。

2、方法 

2.1 目的基因的合成、扩增与回收

2.1.1 目的基因的优化与合成

下载GeneBank公布的猪Foxp3基因的编码序列（GenBank: AM999538.1），根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成基因序列。优化后的序列如SEQ ID NO:1所示，基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

2.1.2 引物设计与合成 

根据优化后的猪Foxp3基因序列，应用引物设计软件Primer 5.0设计出1对引物，如下：

Foxp3上游引物（f31）：5'-CATGCCATGGTACCGAATCCGCGTCCGGC-3'（SEQ ID NO:2）

Foxp3下游引物（f32）：5'-CCGCTCGAGCGGACCCGGCGTCGGATT-3'(SEQ ID NO:3)

引物f31的5’端加上酶切位点Nco I及保护性碱基，去除目的基因序列的起始密码子ATG，在Nco I后加入TA防止移码。引物f32的5’端加上酶切位点Xho I及保护性碱基，去除目的基因序列的终止密码子TAA，使其与His标签相连。

此对引物由上海英骏生物技术公司合成。稀释成浓度为10 pmol/μL溶液，-20℃保存。 

2.1.3 PCR扩增体系与条件 

以合成的基因序列为反应模板、f31/f32为引物扩增目的片段。反应体系如下：

ddH₂O           10μL

2×PCR mix      12.5μL

引物f31         1.0μL

引物f32         1.0μL

DNA模板       0.5μL

混合并离心后立即进行PCR反应，其程序为：

温度      时间    循环数

预变性   94℃     5 min     1

变性     94℃     45 sec     

退火     56.8℃    45 sec    30

延伸     72℃      85 sec 

延伸     72℃     10 min   1

2.1.4 PCR产物的胶回收

PCR反应产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳（含Goldview 0.05 μL/mL）后，用凝胶成像系统迅速观察，获得1308bp大小与预期一致的目的片段（如图1所示）。拍照并准确切胶。按Geneaid胶回收试剂盒说明书进行回收，测定基因片段浓度，-20℃保存。

2.2重组质粒的构建 

2.2.1质粒的提取

含有表达载体pET-28a(+)的Top10冻存菌经复苏后，扩大培养。参照Geneaid质粒小提试剂盒中说明书提取空载体质粒，－20℃保存。

2.2.2 PCR扩增产物和质粒的双酶切 

将PCR扩增产物和pET-28a(+)质粒用相应的限制性内切酶进行双酶切，在1.5 mL的离心管中依次加入下列反应物：

Nco I             1μL

Xho I             1μL

10×K Buffer         4μL

PCR产物/质粒     20μL

ddH₂O             14μL

充分混匀，37℃水浴反应4 h，加入8 μL 6×Loading Buffer终止反应，1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。

2.2.3连接 

将酶切后带有粘性末端的目的片段与用相同酶双酶切后的pET-28a(+)质粒连接，得到重组质粒pET-28a-Foxp3。连接体系如下：

质粒                       2μL

目的片段                     6μL

T4 DNALigase               1μL

10×T4 DNALigase Buffer     1μL

充分混匀，16℃连接过夜。

2.3重组菌的构建 

2.3.1感受态细胞的制备

参照《分子克隆试验指南》的方法，制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞。

2.3.2 连接产物的转化 

参照《分子克隆试验指南》中的热激法，将重组质粒pET-28a-Foxp3转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。

2.3.3重组菌的鉴定 

经抗性筛选后，随机挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基内，37℃振荡培养6~8 h，直接取菌液进行PCR反应，初步筛选阳性克隆。经PCR鉴定为阳性的克隆菌落，扩增培养，抽提质粒并通过双酶切和测序进一步筛选和鉴定。重组质粒pET-28a-Foxp3双酶切之后的产物进行凝胶电泳，显示出两条明显的条带，大小与预期相符合（如图2所示）。对转化后阳性克隆的质粒进行测序和分析，结果显示其与预期的基因序列相一致，没有发生突变。

2.4融合蛋白的诱导表达和纯化 

2.4.1 融合蛋白的诱导表达

将阳性克隆菌落过夜培养物按1:100的比例分别接种于LB液体培养基（含卡那青霉素35μg/mL）中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约0.4~0.6时，取出1 mL菌液，剩余加入IPTG至终浓度1.0 mM/L。37℃180 rpm继续振荡培养，于5 h后取1 mL菌液置于离心管中。

所得样品均8000 rpm离心5 min，弃上清，PBS重悬菌体后，加入适量的5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸10 min。通过SDS-PAGE电泳观察结果。 

2.4.2 融合蛋白的纯化与复性 

按诱导表达条件大量诱导表达重组菌，4℃、8000 rpm离心5 min，弃上清，用高压灭菌的PBS洗涤菌体，重复一次。菌体用1/20菌液体积的PBS重悬，置冰上进行超声波破碎（功率400 W，工作5 s，间隔10 s）80次。超声后的悬液4℃、8000 rpm离心5 min，分别收集上清和沉淀，作SDS-PAGE电泳分析，观察目的蛋白在上清和沉淀中的含量，以此判定该蛋白以可溶形式还是包涵体形式表达。

表达的融合蛋白含有6个连续的组氨酸（His）残基，依靠His与固定树脂上的Ni2⁺结合，使用镍柱亲和层析纯化。待确定融合蛋白主要以包涵体的形式表达后，将沉淀用pH8.0的纯化液重悬，4℃溶解过夜或者30℃水浴1 h，12000 rpm离心15 min，然后进行纯化。纯化方法如下： 

用QIAGEN公司的Ni-NTA Agarose柱料装柱，依次用几个柱体积的去离子水和pH8.0的纯化液平衡柱料；

将溶有沉淀的纯化液离心，上清加入平衡好的柱上，控制流速，使重组蛋白与柱料特异结合。

用pH8.0的纯化液洗三次； 

用pH6.3 的纯化液洗至OD₂₈₀小于0.02；

用pH5.9的纯化液洗4-5个柱体积；

用pH4.5 的纯化液洗4-5个柱体积，并收集纯化的蛋白；

用pH3.0的纯化液洗柱料。

包涵体在纯化过程中，采用高浓度变性剂（8.0 M/L脲）来溶解。使蛋白的高级结构破坏，需通过缓慢去除变性剂使目的蛋白恢复到正常的折叠结构。 

将透析带剪成适当长度； 

将透析带一端用透析夹夹紧，用移液器将蛋白液移入透析带中后，袋的另一端也用透析带夹紧。

将其依次放入大于10倍蛋白体积、含有4 M、2 M、1 M、0.75 M脲的PBS中分别进行脲梯度透析，可以放在磁力搅拌器中搅拌（每个浓度透析4 h）或者4℃冰箱（每个浓度透析8 h）。 

将透析去除脲的蛋白液12000 rpm离心15 min，收集上清，用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，-20℃保存。并作SDS-PAGE电泳，然后用BandScan 5.0分析其纯度。 

将诱导前后的重组菌、诱后重组菌的破碎上清和沉淀及纯化的蛋白一起进行SDS-PAGE，结果显示：重组菌诱导表达的目的蛋白占蛋白总量的34.6%，并以沉淀形式存在，将其进行纯化可得到纯度高达99.0%的目的蛋白（如图3所示）。 

实施例2 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及单克隆抗体的制备

用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠后，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。杂交瘤上清用间接ELISA筛检特异性抗体。获得杂交瘤细胞株4C8，于2012年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C2012156。其能稳定地培养并分泌抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。所得单克隆抗体的Ig型为IgG1,k。腹水和上清的ELISA效价分别为1:1280000和1:4000。

具体操作步骤如下： 

1 材料

1.1 细胞、试验动物及试剂

骨髓瘤细胞SP2/0为本实验室保存；6~8周龄的BALB/c雌鼠和2Kg的雄兔购自南方医科大学实验动物中心；弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、二甲基亚砜、选择试剂HAT、HT、聚乙二醇融合剂（PEG4000）购自Sigma公司；DMEM细胞培养液为Gibco产品；优级胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司；ELISA底物显色液和DAB底物显色液试剂盒为南京天根公司产品；双色预染宽分子量蛋白质Marker(10-170kD)为南京天为生物科技有限公司产品；人淋巴细胞分离液购自鼎国公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备 

纯水仪和CO₂恒温培养箱购自Thermo；垂直电泳仪和酶标仪购自BIO-RAD；倒置显微镜购自Nikon；低温台式高速离心机和超净台购自Heraeus。

2方法 

2.1 杂交瘤细胞株的建立

2.1.1 免疫动物

选择6～8周龄雌性BALB/c小鼠5只，采集血液分离血清。首次免疫采用弗氏完全佐剂与等体积抗原液乳化经腹腔注射，抗原量为0.5 mg/Kg体重；14 d后采用弗氏不完全佐剂与等体积抗原液乳化进行第二次免疫，抗原量为0.5 mg/Kg体重；再过14 d后用抗原腹腔注射进行第三次免疫，0.5 mg/Kg体重；第三次免疫10 d后，选择血清效价高者，在进行细胞融合前3~5 d用抗原再次加强免疫。

2.1.2饲养细胞的制备 

将BALB/c小鼠眼球采血，引颈处死，体表酒精消毒。腹部向上固定后，无菌剪开腹部皮肤，镊子剥离皮肤，露出腹膜，用无菌注射器吸取8 mL HAT完全培养基注入腹腔，用酒精棉球轻轻按压腹腔数次，吸出培养基，置于细胞培养瓶中，计数后补加HAT完全培养基，使细胞密度为2×10⁵个/mL，在融合前一夜每孔两滴（约100μL）加入96孔细胞培养板。

2.1.3 SP2/0骨髓瘤细胞的培养 

用含20%胎牛血清的DMEM培养液培养SP2/0。细胞最适生长密度在4~5×10⁵个/mL，形态浑圆透亮、大小均一、排列整齐。

2.1.4细胞融合 

已免疫的BALB/c小鼠眼球采血，引颈处死，收集血清作为阳性对照。将处死的小鼠置75%酒精中浸泡20 min，于超净台中剖开左侧腹部皮肤，无菌取其脾脏，制备免疫脾细胞，与对数生长期的SP2/0细胞按1:5~1:10的比例混合于50 mL离心管中，充分混匀。1000 rpm离心10 min，弃上清。用手掌轻击离心瓶底，使沉淀的细胞打散。将离心瓶底部40~41℃水浴，边旋转边加入融合用的PEG4000 1mL，在1 min内加完，继续旋转同时加入无血清DMEM培养液15 mL，在90 s内加完，由慢到快，前5 s加1 mL。室温静置10 min后，1000 rpm离心5 min，弃上清，将HAT选择培养液加入到细胞融合物中，悬浮细胞，分配到已有饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的温箱中培养。

2.1.5 筛选 

以棋盘法确定间接ELISA检测方法的最适试验条件。以猪Foxp3包被96孔板，含0.5%BSA的PBST封闭，HRP-羊抗鼠IgG作为酶标二抗，待融合细胞生长到培养孔面积的1/4时，用间接ELISA法筛选融合细胞培养上清液，以阳性血清和阴性血清作为对照。

2.1.6杂交瘤细胞的克隆化 

对于筛选所得的阳性杂交瘤细胞4C8，应及时采用有限稀释法进行亚克隆。首先将阳性孔活细胞准确计数，用DMEM培养液（首次亚克隆应加HT）10倍比稀释成20个细胞/mL培养液，加入到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，使每孔理论上有1个细胞，置于37℃、5%CO₂的温箱中培养。选择连续2次检测皆为阳性的杂交瘤细胞孔，用有限稀释法连续克隆2~3次，直到检测结果为100%阳性为止。

2.1.7杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性 

将获得的杂交瘤细胞株体外培养连续传代3个月后，用间接ELISA测定上清液中抗体效价；并将细胞株冻存3个月后复苏，检测上清液中抗体效价为1:4000。

2.2单克隆抗体的大量制备及鉴定 

2.2.1 腹水的诱导

选8~10周龄的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，一周后腹腔注射杂交瘤细胞（1×10⁶~6×10⁶细胞/只），在小鼠腹部明显增大时抽取腹水，然后3000rpm离心10min，取上清液，－20℃冻存备用。

2.2.2培养上清/腹水效价的测定 

用间接ELISA法测定培养上清/腹水的效价。

包被：将纯化好的目的蛋白用包被液稀释到1μg/mL，并按100μL/孔加入稀释液，4℃孵育过夜； 

洗涤：甩干孔中液体，用200μL/孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

封闭：每孔加入稀释液200μL，37℃封闭1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL/孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

培养上清/腹水：以1：1000作为起始稀释度，进行2倍稀释，按100μL/孔加液，37℃孵育1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL/孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

酶标抗体：各孔中加入按1：2000稀释的酶标二抗，37℃孵育1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL/孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

显色：每孔加入底物液100μL，，37℃孵育10min；

终止：每孔加入终止液50μL终止显色；

读数：用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀，并作图分析抗体效价。

结果表明，本发明杂交瘤细胞株4C8所产生的单克隆抗体的上清效价为1:4000，腹水效价为1:1280000。 

2.2.3 亚类测定 

按检测抗体类型试剂盒说明书操作。结果表明，本发明单抗的Ig型为IgG1,κ。

2.2.4单克隆抗体特异性的测定 

用间接ELISA法（如上）和免疫印迹（如下）测定单克隆抗体的特异性。

蛋白经SDS-PAGE后转印至NC膜上，进行免疫杂交。具体步骤如下： 

SDS-PAGE电泳结束后，取出凝胶，裁剪与胶尺寸相符的NC膜以及两块商品化厚滤纸。凝胶用转印缓冲液洗涤3次，每次5 min。厚滤纸放入转印缓冲液浸透平衡膜15 min，NC膜经甲醛激活后置转印缓冲液浸透平衡15 min。在转印槽内依次放入厚滤纸、NC膜、凝胶、滤纸，边缘对齐，排除气泡。盖上转印仪的负极，接通电源，电流设置按照胶的面积计算：0.8 mA/cm²计算，转印2 h。转印完毕，关闭电源。取出转印膜，将转印膜放入含5%脱脂乳、0.5%吐温-20的TBS封闭液中，4℃过夜。弃封闭液，含0.5%吐温-20的TBS洗涤液洗涤3次，每次5 min。将膜转移至装有10 mL含5%脱脂乳、0.2%吐温-20、一抗的TBS的封口袋中，37℃ 60rpm孵育1.5 h，每半小时翻转封口袋1次。取出膜用洗涤液洗3次，每次5 min。将膜转移至装有10 mL含酶标二抗封闭液的封口袋中，37℃ 60 rpm孵育1 h，每半小时翻转封口袋1次。用洗涤液洗1次5 min。将膜浸入HRP-DAB底物显色溶液中，反应5-30 min，待出现目的条带时，终止反应。

单抗分别对猪PBMC和纯化的蛋白进行WB，结果分析显示，本发明的单克隆抗体能与猪PBMC和纯化的蛋白特异性反应，说明本发明的单克隆抗体是特异性针对猪Foxp3的（如图4和图 5所示）。 

2.2.5 腹水的纯化、浓缩和纯度测定 

Protein G空柱固定好后，将1mL混匀的Protein G Resin加入柱中，待柱内液体流尽再加入5mL Binding/Wash Buffer以平衡柱料，并以1mL/min的流速流尽。

以1:1的比例用Binding/Wash Buffer稀释样品。 

将处理后的样品加入柱中，并以1mL/min的流速流尽。用30mL Binding/Wash Buffer洗柱，以2mL/min的流速流尽。用10mL Elution Buffer洗脱，以1mL/min的流速流尽。收集的洗脱液迅速用Elution Buffer 1/10体积的Neutralization Buffer中和至pH 7.4。 

将洗脱液用PBS透析过夜，并用PEG20000进行浓缩。浓缩后的样品测定浓度并分装，－20℃冻存备用。 

对浓缩后的样品进行SDS-PAGE检测纯度。结果表明获得的单抗纯度较高，鼠抗Foxp3的IgG重链和轻链的分子量分别约为49.5和26.9KDa（如图6所示）。 

实施例3 多克隆抗体的制备

1制备方法

选2Kg的雄性新西兰白兔两只，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化纯化的融合蛋白，抗原量为0.5 mg/Kg体重，皮下多点注射；10d后用弗氏不完全佐剂乳化抗原量减半的抗原，皮下多点注射；10d后按二免剂量进行三免；10d后按二免剂量进行加强免疫；7d后心脏采血，分离血清，冻存于-20℃备用。

2 多抗血清效价的测定 

方法同单克隆抗体的方法。兔子免疫前后的血清检测效价显示，免后的多抗效价为1：64000（见图7）。

3 多抗血清特异性的测定 

方法同单克隆抗体的方法。

以纯化的融合蛋白作为包被抗原，用间接ELISA检测多抗，结果显示多抗能产生很好的OD值。多抗对纯化的融合蛋白进行WB，结果分析显示，多抗能与Foxp3产生特异性反应（见图 8）。 

4 多抗血清的纯化、浓缩和纯度测定 

方法同单克隆抗体的方法。

血清经Protein G纯化后，SDS-PAGE检测表明获得的多抗纯度较高，兔抗Foxp3的IgG重链和轻链的分子量分别约为49.5和26.9KDa（见图 9）。 

5外周血淋巴细胞的提取 

取新鲜抗凝血1mL，与Hank’s液1:1混匀后，小心加于2mL细胞分离液的液面上，以1500转/min离心15min。此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层：为血浆或组织匀浆液层。第二层：为环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层。第三层：为透明分离液层。第四层：为红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至第二层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白色层细胞，置于含Hank’s液4-5mL新离心管中。尽量少吸取分离液。充分混匀后，以1500-2000转/min 离心10min。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

实施例4 猪Foxp3间接夹心ELISA试剂盒的建立及初步应用

1 材料

包被液、洗涤液、封闭液、终止液；可溶性TMB底物显色液为南京天根公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG均购自武汉博士德生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。96孔ELISA板为JET BIOFIL公司产品。

2 试验仪器 

Model 680型酶标仪购自Bio-Rad公司；微量震荡器购自宏华仪器厂；纯水仪；恒温摇床；台式高速离心机；恒温水浴锅；电热恒温培养箱；微量移液器。 

3 间接夹心ELISA试剂盒的操作程序 

包被：将实施例2制备得到的抗猪Foxp3蛋白单抗用包被液稀释至浓度为1.25μg/mL，按100μL/孔加入96孔ELISA板中，4℃放置过夜；

洗涤：次日甩干后用200μL/孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

封闭：每孔加入稀释液200μL，37℃封闭1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL /孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

待检样品和标准蛋白：将稀释后的待检样品与标准蛋白分别按100μL /孔加入各孔中，37℃孵育1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL /孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

检测抗体：将实施例3制备得到的抗猪Foxp3蛋白多克隆抗体用稀释液稀释至0.9375 μg /mL，按100μL /孔加入各孔中，37℃孵育1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL /孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

酶标抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG按1/6000比例稀释后，按100μL /孔加入各孔中，37℃孵育1h；

洗涤：甩干孔中液体，用200μL /孔的洗涤液洗3次，最后一次甩干后，在纸上反复拍打干净；

显色：每孔加入底物液100μL，，37℃孵育10min；

终止：每孔加入终止液50μL终止显色；

读数：用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀。

4 检测各反应成分间的交叉反应程度 

ELISA操作流程见步骤3和表1，每组做4个重复。“＋”表示加入相应的试剂；“－”表示加入稀释液。利用单因素方差分析，评价各处理组间的统计学差异。

利用SPSS 20中的单因素方差分析评价各处理组间的统计学差异。组1与其它处理组间的差异极显著（p＜0.01），而其它各组间无显著差异（见图10），说明各反应成分间没有交叉反应。 

  

5敏感度和工作范围的确定

使用上面的夹心ELISA测定不同浓度的抗原，对量效曲线进行研究。每个抗原浓度的OD值与相应浓度对应作图，并用最小二乘法确定两者之间的线性关系。每个浓度的抗原做3个重复。

试验的敏感度，即最低检测浓度，被定义为空白的均值与3倍标准差的和，等于0.458 ng/mL。 

使用上面的夹心ELISA测定不同浓度的抗原对量效曲线进行研究（见图11）。量效曲线的线性范围确定为117.19-7.32 ng/mL。每个抗原浓度的OD值与相应浓度对应作图，并用最小二乘法确定两者之间的线性关系。关系为OD= 0.0106[Foxp3] + 0.1387，R²(coefficient of determinant决定系数)= 0.9981。 

6重复性试验 

用同一批ELISA材料，每份样品重复8孔，进行ELISA检测，计算批内的变异系数。

用不同批ELISA材料，每份样品重复8孔，进行ELISA检测，计算批间的变异系数。 

根据统计学分析，间接夹心ELISA批内和批间重复性试验的变异系数分别为4.89%和14.26%，这表明构建的间接夹心ELISA具有较好的重复性。 

7临床应用 

根据临床症状分别获得病猪17头，健康猪27头，归为有病组和无病组，分别收集全血进行检测。

样品处理步骤：抗凝血3000r/min离心8min→弃上清→加入5 mL红细胞裂解液，混匀→3000r/min离心8min→弃上清→加入5 mL红细胞裂解液，混匀→3000r/min离心8min→弃上清→加入5 mL红细胞裂解液，混匀→3000r/min离心8min→弃上清→加入500μL ELISA封闭液→超声破碎5 min（40%功率，工作4s，停4s）→用所构建的ELISA试剂盒测定样品。 

读取各检测样品的OD₄₅₀值，所得数据用单因素方差分析进行统计处理。 

根据统计学分析，两组都是正态分布，有病组的平均值为108.82，标准差为85.77；无病组的平均值为167.54，标准差为89.97。单因素方差分析显示两组差异显著（p＜0.05）。 

<110>  广东海大畜牧兽医研究院有限公司

 

<120>  抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体、多克隆抗体及应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1296

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgccgaatc cgcgtccggc gaaaccgctg gctccgtcat ccgtcctgtc accgagtccg       60

 

ggcgcttcac cgagttggcg tgctgttccg aaaacctcag atcagcaagg tgcaaaaggt      120

 

ccgggtgcag catttcaggg tcgtgaactg cgcggcggtg cacatgctag ctctagttcc      180

 

ctgaacccga tgccgccatc tcagctgcaa ctgccgaccg tgccgctggt catggtggct      240

 

ccgagcggtg cacgtctggg tccgtctccg catctgcagg cgctgctgca agatcgcccg      300

 

cattttgtcc accagctgag caccgtggac gcacacgcac gtacgccggt gctgcaagtt      360

 

cgtccgctgg atagcccggc tatgattagc ctgccgccgc cgaccgcagc tacgggtgtg      420

 

tttagcctga aagcacgtcc gggtctgccg ccgggtatca acgttgccag tctggaatgg      480

 

gtctcccgtg aaccggcact gctgtgcacc ttcccgtcgc cgggtgttcc gcgtaaagat      540

 

agtaccctgt ccacggtccc gcagggtagc tattctctgc tggcgaatgg cgtgtgcaaa      600

 

tggccgggtt gtgaaaaagt ttttgaagaa ccggaagact tcctgaaaca ttgccaggct      660

 

gatcacctgc tggacgaaaa aggccgtgcg cagtgtctgc tgcaacgcga agtggttcag      720

 

agtctggaac agcaactggt gctggaaaaa gaaaaactgg gcgcaatgca agctcatctg      780

 

gcgggtaaaa tgccgtcacc gaaagcaccg tcggcagcct catcggataa aggtagctgc      840

 

tgtattgtcg caaccggcac gccgggtacc gcagtgccgg catggccggg tccgcaggaa      900

 

gctccggacg gtctgtttgc ggttcgtcgc catctgtggg gctcacacgg taattcgacg      960

 

ttcccggatt tctttcataa catggactac ttcaaattcc acaatatgcg tccgccgttt     1020

 

acctacgcca cgctgattcg ctgggccatc ctggaagcac cggaaaaaca gcgcaccctg     1080

 

aacgaaattt accattggtt tacgcgtatg ttcgcgtttt tccgcaatca cccggccacc     1140

 

tggaaaaacg caatccgtca taatctgagt ctgcacaaat gttttgttcg cgtcgaatcc     1200

 

gaaaaaggtg ctgtgtggac ggcggatgaa tttgaatttc gcaaaaaacg tagccaacgc     1260

 

ccgagccgct gttccaatcc gacgccgggt ccgtaa                               1296

 

 

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

catgccatgg taccgaatcc gcgtccggc                                         29

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ccgctcgagc ggacccggcg tcggatt                                           27

Claims (9)

1.密码子优化的猪Foxp3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种分泌抗猪Foxp3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C8，于2012年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2012156。

3.一种抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体，是由权利要求2所述的保藏号为CCTCC NO：C2012156的杂交瘤细胞株产生。

4.根据权利要求3所述的抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG1,κ型。

5.根据权利要求3所述的抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由一个49.5KDa的重链和一个26.9KDa的轻链组成。

6.一种抗猪Foxp3蛋白的多克隆抗体，由以下步骤制备得到：

（1）克隆SEQ ID NO:1所示的核苷酸片段；

（2）利用步骤（1）所得的核苷酸片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得到蛋白质；

（3）以步骤（2）所得的蛋白质为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，即得。

7.用于检测猪Foxp3蛋白的试剂盒，其特征在于，含有权利要求3所述的抗猪Foxp3蛋白的单克隆抗体。

8.用于检测猪Foxp3蛋白的试剂盒，其特征在于，含有权利要求6所述的抗猪Foxp3蛋白的多克隆抗体。

9.一种猪Foxp3蛋白的间接夹心ELISA检测试剂盒，包括猪Foxp3标准蛋白、洗涤液、封闭液、底物显色液、终止液、包被权利要求3所述单克隆抗体的ELISA板、检测抗体、酶标抗体；所述检测抗体为权利要求6所述的多克隆抗体，酶标抗体为HRP标记的羊抗兔IgG。

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