CN112646810A - 一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用，本发明对EqHV的NS3蛋白进行原核表达，同时制备EqHV NS3蛋白的多克隆抗体，为马群中EqHV的检测方法提供技术储备。

Description

一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用。

背景技术

马丙型肝炎病毒(Equine Hepacivirus，EqHV)为Hepacivirus属病毒，是最近发现的马源类丙型感染病毒。EqHV最早在2012年美国的马群中发现。EqHV感染呈现典型的肝脏噬性，并对马属动物具有潜在致病风险。

目前，在越来越多的国家检测到EqHV的存在，但国内一直缺乏检测马匹中EqHV抗体的方法，目前检测马血清中EqHV抗体的方法只有针对HCV或类HCV蛋白的方法(LIPS及ELISA)。

NS3蛋白是黄病毒中最为保守的蛋白，在检测新发马黄病毒的研究中，多以NS3基因作为目的基因来进行检测，因此，以NS3基因构建原核表达系统，为后续构建检测马血清中EqHV抗体的WB方法提供一种新的解决方案。

所以，本发明要解决的技术问题是：如何构建一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及其在EqHV多克隆抗体制备领域的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种EqHV毒株的NS3基因PCR扩增引物组。

本发明的又一目的在于提供一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3。

本发明的再一目的在于提供一种含有重组表达载体pMAL-c5x-NS3的宿主细胞。

本发明的再一目的在于提供一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3的构建方法。

本发明的再一目的在于提供一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法。

本发明的再一目的在于提供一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在EqHV NS3蛋白的多克隆抗体制备领域的应用。

本发明的技术方案为：

一种EqHV毒株的NS3基因PCR扩增引物组，所述引物组的核苷酸序列中含有Sac I和Bam I酶切位点、保护性碱基和防止移码的碱基，以及下游引物中的3个6*His及终止子，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

上游引物Sac I 1893F：

5’ATCGAGCTC GATGTCACCTATTACAGCCACTGTCACT 3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物Bam I 1893R：

5’CGCGGATCCCTATCATTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGCGTTTGGGTGTCAATCTCGGCCTCCAT 3’(SEQ ID NO：2)。

一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3，所述重组表达载体包含上述的EqHV毒株的NS3基因PCR扩增产物。

进一步地，所述EqHV毒株的NS3基因PCR扩增产物插入到表达载体pMAL-c5x的酶切位点Sac I和Bam I之间。

一种含有上述的重组表达载体pMAL-c5x-NS3的宿主细胞，所述宿主细胞为表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)。

一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据EqHV毒株的NS3基因设计引物Sac I 1893F和Bam I 1893R，以GD18毒株(EqHV广东省毒株)的反转录产物作为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)用限制性内切酶Sac I和Bam I对PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行双酶切；

(3)将酶切后的PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行连接，得连接产物；

(4)将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得阳性菌，提取质粒获得重组表达载体pMAL-c5x-NS3。

一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法，所述表达方法包括上述重组表达载体pMAL-c5x-NS3的构建方法所述的步骤，并进一步包括以下步骤：

(5)将重组表达载体pMAL-c5x-NS3转化入表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)，得到含有重组表达载体pMAL-c5x-NS3的重组表达菌；

(6)将重组表达菌接入氨苄LB培养基中并加入诱导剂IPTG进行诱导表达；

(7)取诱导后的菌液离心，加入结合缓冲液，超声破碎后离心，取上清液；

(8)将上清液加入镍柱中洗脱获得纯化后的重组NS3蛋白。

进一步地，上述步骤(6)中所述诱导表达的诱导温度为37℃。

进一步地，上述步骤(6)中所述诱导表达的诱导时间为6h。

一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在EqHV NS3蛋白的多克隆抗体制备领域的应用，包括以下步骤：

①将纯化后的重组NS3蛋白与Gel 01ST水溶性佐剂按比例溶解后皮下注射新西兰大白兔进行首次免疫；

②将纯化后的重组NS3蛋白与弗氏不完全佐剂按比例乳化，于首次免疫后的第7d、14d、28d、35d皮下注射新西兰大白兔进行加强免疫；

③免疫完成后于兔耳缘静脉采血分离血清，测定EqHV多克隆抗体效价和特异性；

④实验结果符合预期后，于免疫兔心脏采血获得含有EqHV多克隆抗体的血清并纯化。

本发明的有益效果如下：

1、多聚组氨酸标签(Polyhistidine-tags，His-tags)是一种融合标签，分子质量小，不影响重组蛋白空间结构从而能最大程度保持重组蛋白的抗原特性，它可与多种蛋白形成重组蛋白，基于组氨酸的咪唑环与金属离子(如镍离子)起化学作用而生成螯合的原理，在原核表达系统中，使用带多聚组氨酸标签的表达载体pMAL-c5x构建重组质粒，使目的蛋白与其一起表达以便对重组蛋白通过亲和层析纯化；

2、本发明表达载体pMAL-c5x上还带有麦芽糖结合蛋白标签(Maltose-bindingprotein-tags，MBP-tags)，MBP-tags与目的蛋白组成的重组蛋白，除了可以增加在细菌中过量表达的重组蛋白的溶解性外，还可以使重组蛋白具有良好的抗原活性，本发明利用原核表达系统获得了大量表达的重组NS3蛋白；

3、本发明在试验初期选用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞与表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)作为表达宿主菌，对比两者的重组蛋白表达量，事实证明表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)相对大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞来说，能表达较多的重组蛋白，因此选用表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)作为表达宿主菌株；

4、在多克隆抗体制备实验中，大多数研究者多使用费氏佐剂，该佐剂与蛋白间的乳化是能否成功免疫的关键，需要反复进行挤压才能获得较好的乳化效果，在本发明中使用的是Gel01ST水溶性佐剂，该佐剂含有分子量较大的丙烯酸，能过促进对淋巴细胞的刺激，具有较好的稳定性，所制备获得的抗体经检测具有较好的灵敏性和特异性，EqHV NS3蛋白的多克隆抗体的制备能为后续实验室对中国马群中EqHV的检测方法提供技术储备。

附图说明

附图1为实施例1中NS3基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，图中，M为Marker，1为NS3基因PCR扩增产物；

附图2为实施例1中重组表达载体pMAL-c5x-NS3的PCR鉴定结果图，图中，M为DNAMarker，1为重组表达载体pMAL-c5x-NS3，2为pMAL-c5x空载体；

附图3为实施例1中重组表达载体pMAL-c5x-NS3的图谱；

附图4为实施例2中重组NS3蛋白的可溶性鉴定结果图，图中，M为蛋白Marker，1为破碎后的诱导菌液上清，2为破碎后的诱导菌液沉淀；

附图5为实施例2中重组NS3蛋白的纯化结果图，图中，M为蛋白Marker，1～4分别为第一次、第二次、第三次和第四次的蛋白洗脱液，5～6分别为第一次和第二次的蛋白洗杂液，7为最后的蛋白洗出液；

附图6为实施例3中重组NS3蛋白表达的不同诱导温度结果图，图中，M为Marker，1为25℃的诱导温度，2为30℃的诱导温度，3为37℃的诱导温度，4为pMAL-c5x空载体37℃的诱导温度；

附图7为实施例3中重组NS3蛋白表达的不同诱导时间结果图，图中，M为蛋白Marker，1～8分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h的诱导时间，9为阴性对照；

附图8为实施例3中重组NS3蛋白表达的不同诱导剂浓度结果图，图中，M为蛋白Marker，1～6分别为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1mM的IPTG浓度，7为阴性对照；

附图9为实施例4中重组NS3蛋白的抗原性分析结果图，图中，M为蛋白Marker，1为重组NS3蛋白；

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

以下实施例中：

表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)购自北京天根生化科技有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

限制性内切酶Sac I、Bam I购自NEB公司；T4 DNA Ligase购自日本Takara公司；琼脂糖购自Biowest公司；IPTG、His tag Mouse Monoclonal antibody、单组分TMB显色液、快速质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PVDF膜、Ni Sepharose^TM 6 FastFlow(镍柱)填料购自GE Healthcare公司；ECL化学发光液、IRDye 800CW Goat anti-MouseIgG(H+L)、SDS-PAGE蛋白凝胶试剂盒购自广州碧云天生物有限公司；脱脂奶粉购自广州华奇胜生物科技有限公司；HRP二抗购自康为世纪生物公司；170kDa预染蛋白Marker购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Rabbit Anti-Horse IgG(H+L)购自abcam公司。

10×SDS-PAGE电泳缓冲液：分别称量Tris 15.1g、SDS 5g、甘氨酸94g，然后加入双蒸水定容至500mL，室温保存，使用时稀释为1×的工作液；

0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：分别称量考马斯亮蓝R-250 2.5g、冰醋酸100mL、甲醇450mL，然后加入双蒸水定容至1L，溶解后用滤纸过滤以便除去颗粒状物质，室温密封保存；

考马斯亮蓝脱色液：分别量取冰醋酸100mL，甲醇450mL，然后加入双蒸水定容至1L，于棕色瓶中室温密封保存；

500mM咪唑溶液：NaPO4 1.64g，NaCl 14.61g，咪唑17.02g，加去离子水定容至500mL，加入浓盐酸调整pH＝7.4；

0mM咪唑溶液：NaPO4 1.64g，NaCl 14.61g，加去离子水定容至500mL,加入浓盐酸调整pH＝7.4；

GE公司Ni²⁺填料所用咪唑缓冲液：用500mM咪唑溶液和0mM咪唑溶液配制成各浓度的咪唑溶液；

结合缓冲液：20mMNaPO4，0.5MNaCl，5mM咪唑，pH＝7.4；

1M Tris-HCl(pH 8.0)：称取Tris 12.11g置于100mL烧瓶中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解后，加入浓盐酸约4.2mL调节pH至8.0(溶液冷却至室温后再调定pH)，将溶液定容至100mL，高压灭菌后，室温保存；

1M Tris-HCl(pH 7.4)：称量Tris 12.11g置于100mL烧瓶中，加入80mL去离子水，充分搅拌溶解后，加入浓盐酸约7mL调节pH至7.4，(溶液冷却至室温后再调定pH)，将溶液定容至100mL，高压灭菌后，室温保存；

TBST缓冲液：(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.05％Tween 20)：称取NaCl 8.8g，并量取1M Tris-HCl(pH 8.0)20mL，加入800mL去离子水中充分搅拌溶解，再加入0.5mL Tween20，混匀后定容至1L，4℃保存；

转膜缓冲液：(39mM Glycine，48mM Tris，0.037％SDS，20％甲醇)：分别称量Glycine 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，置于1L烧杯中，加入600mL去离子水，充分搅拌溶解后，用去离子水定容至800mL，然后加入200mL的甲醇，混匀后室温保存；

封闭缓冲液：(5％脱脂奶粉)：称取脱脂奶粉5g加入100mL TBST缓冲液中充分搅拌溶解后，4℃备用(该试剂需现配现用)；

终止液：烧杯中加入去离子水，将浓硫酸(98％)沿着玻璃棒缓慢加入其中，最后使溶液的浓度为2mM，将配置好的终止液放置到玻璃瓶中室温条件下保存。

实施例1：重组表达载体pMAL-c5x-NS3的构建

(1)引物设计

根据EqHV毒株的NS3基因(SEQ ID NO：3)设计PCR引物，NS3基因PCR引物名称为SacI 1893F和Bam I 1893R，cDNA为GD18毒株(EqHV的广东省毒株)的反转录产物，引物序列中含有Sac I和Bam I酶切位点，保护性碱基和防止移码的碱基(如下划线所示)，其中下游引物插入了3个6*His及终止子，引物由天一辉远生物有限公司合成，序列如下：

Sac I 1893F：

5’ATCGAGCTC GATGTCACCTATTACAGCCACTGTCACT 3’(SEQ ID NO：1)

Bam I 1893R：

5’CGCGGATCCCTATCATTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGCGTTTGGGTGTCAATCTCGGCCTCCAT 3’(SEQ ID NO：2)

(2)NS3基因的PCR扩增

使用上述设计的引物进行NS3基因的PCR扩增，PCR扩增程序为：预变性：95℃，5min；94℃、30s；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环；终延伸72℃，5min，产物4℃保存；

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，得到的NS3基因PCR扩增产物的凝胶电泳图如附图1所示，图中，M为Marker，1为NS3基因PCR扩增产物，附图1显示cDNA扩增得到一条大小约1893bp的DNA片段，与预期的结果相符；

(3)PCR扩增产物与表达载体的双酶切

将回收纯化完成的PCR扩增产物与表达载体pMAL-c5x使用限制性内切酶Sac I与Bam I进行双酶切，双酶切体系如下表1所示：

表1 双酶切体系

双酶切的反应条件为：37℃60min；

参照天根生化科技(北京)有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行酶切产物的回收纯化。具体方法步骤如下：

①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

②向酶切产物中加入等倍体积溶液PN；

③将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

④向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

⑤重复步骤④；

⑥将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

⑦将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min收集DNA溶液，注意：洗脱体积不应小于30μL，体积过少影响回收效率，洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃以防DNA降解，为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将DNA溶液收集到离心管中；

(4)酶切后的PCR扩增产物与表达载体连接

调整酶切后的PCR扩增产物与酶切后的表达载体pMAL-c5x的比例，将连接体系振荡混匀后置于16℃金属浴过夜连接，使酶切后的表达载体pMAL-c5x能够竞争性结合酶切后的PCR扩增产物达到更好的连接效率，连接体系如下表2所示：

表2 连接体系

(5)连接产物的转化

把连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，具体操作步骤如下：

①从-80℃冰箱取出一份大肠杆菌DH5α感受态细胞，放于冰上解冻；

②将连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀后冰上放置30min；

③42℃水浴热激90sec，迅速置于冰上冷却3～5min；

④加800μL无抗性LB液体培养基，混匀后置于摇床37℃，180rpm振荡培养1h；

⑤3,000rpm离心5min，吸取100μL上清后弃掉其余上清，重悬菌体，将菌液涂布在氨苄抗性LB琼脂上，正面向上放置于37℃恒温培养箱中，待菌液完全吸收后倒置培养皿，培养12～16h；

(6)菌落的筛选和扩大培养

用灭菌的10μL枪头挑取氨苄平皿上生长良好的单个菌落，置于1mL氨苄抗性LB肉汤中，于摇床中37℃，180rpm振荡培养3～5h至菌液浑浊，取适量菌液进行重组表达载体pMAL-c5x-NS3的PCR鉴定，PCR鉴定体系如下表3所示：

表3 PCR鉴定体系

其中，上游引物核苷酸序列为：M13-F：5＇-TGTAAAACGACGGCCAGT-3＇(SEQ ID NO：4)，下游引物核苷酸序列为：M13-R：5＇-CAGGAAACAGCTATGACC-3＇(SEQ ID NO：5)，PCR程序为：95℃，5min；94℃、30sec；55℃，30sec；72℃，30sec，35个循环；终延伸72℃，5min，得到的重组表达载体pMAL-c5x-NS3的PCR鉴定结果图如附图2所示，图中，M为DNAMarker，1为重组表达载体pMAL-c5x-NS3，2为pMAL-c5x空载体，附图2显示重组表达载体pMAL-c5x-NS3在1500bp位置有特异性条带，与预期结果相符。将经过PCR鉴定后的阳性菌液送至华大基因公司测序；

(7)提取重组表达载体pMAL-c5x-NS3

按照天根生化科技(北京)有限公司的快速质粒小提试剂盒的说明书将经过扩大培养的阳性菌液进行质粒的小量抽提，步骤如下：

①取8mL过夜培养的阳性菌液加入离心管中室温条件下8000rpm离心30sec，弃掉上清液使用滤纸尽量去除残余液体；

②吸取150μL的P1溶液加入到菌体沉淀之中，震荡使菌体充分悬起；

③将150μL P2溶液加入到离心管中，上下颠倒离心管体10次使菌体充分与溶液接触并充分裂解，液体由浑浊转变为粘稠状清亮溶液；

④将350μL P5溶液加入到离心管中，上下颠倒离心管体10次使溶液充分混合，应当出现乳白色絮状物，室温条件下8000rpm离心2min；

⑤使用移液枪吸取上清液并且加入到吸附柱CP3中，吸取的过程中要避免吸取出乳白色絮状物，将CP3吸附柱放置在一个新的收集管中，室温条件下12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；

⑥取0.3mL加入过无水乙醇的漂洗液，加入到CP3吸附柱中，在室温条件下12000rpm离心1min，弃废液；

⑦空离2min，目的是最大限度的去除CP3吸附柱中的液体；

⑧将50μL ddH2O滴加到CP3吸附柱的中心，室温条件下放置若干min(建议给出具体时间)，在室温条件下12000rpm离心1min，得到重组表达载体pMAL-c5x-NS3，该重组表达载体pMAL-c5x-NS3的图谱如附图3所示，测浓度并放置在冰箱-20℃保存。

实施例2：重组NS3蛋白的表达及纯化

1、重组NS3蛋白的表达

(1)将重组表达载体pMAL-c5x-NS3转化入表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)，具体转化方法同上述连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞的步骤一致；

(2)用灭菌的10μL枪头挑取氨苄平皿上生长良好的单个菌落，置于1mL氨苄抗性LB肉汤中，放置于摇床中37℃，180rpm振荡培养12～15h；

(3)将摇好的菌液按1:100接入氨苄LB培养基中，200rpm，37℃摇床中培养至菌体OD_600nm值为0.5左右时，加入终浓度为1mM的诱导剂IPTG，在25℃摇床中震荡培养5h后备用；

(4)诱导完成的菌液8000rpm离心5min，弃上清，菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，将重悬的菌液在冰浴条件下超声破碎30min，工作功率为200W(工作3sec，间歇5sec为一个循环)，破碎至菌液变澄清透亮，破碎后的菌液12000rpm，离心20min，并分别收集上清液和沉淀，沉淀用与上清液等体积PBS缓冲液重悬，取重悬后的沉淀与上清作为上样样品，各取80μL加入20μL 5×SDS上样缓冲液，充分混匀，沸水浴5-10min，12000rpm离心1min，取15μL上清进行SDS-PAGE电泳，具体步骤如下：

按照如下顺序配制12.5％的PAGE凝胶(以一块1.0mm的凝胶为例)：

①取等体积分离胶缓冲液和分离胶溶液混匀(各2.7mL)；

②往步骤①中的混合溶液中加入60μL的过硫酸铵溶液，混匀，将混合溶液注入制胶玻璃板中，加入适量的水或者醇覆盖于分离胶上；

③待下层分离胶凝固后，倒去上层的覆盖溶液，并用滤纸彻底吸干覆盖溶液，取等体积的浓缩胶缓冲液和浓缩胶溶液混匀(各0.75mL)，加入15μL过硫酸铵溶液，混匀后加入到制胶玻璃板中，插入梳齿，待浓缩胶凝固后即可用于电泳；

④将上述步骤(4)中两份15μL上清进行SDS-PAGE电泳，电泳条件为：120V电泳直至蛋白Marker在凝胶上出现明显分层后更改电压为80V直至电泳完成，得到的重组NS3蛋白的可溶性鉴定结果图如附图4所示，图中，M为蛋白Marker，1为破碎后的诱导菌液上清，2为破碎后的诱导菌液沉淀，通过考马斯亮蓝染色分析上清与沉淀的蛋白表达量，重组NS3蛋白在上清和沉淀中均有表达且上清中重组NS3蛋白含量明显高于沉淀中重组NS3蛋白含量，说明该重组NS3蛋白具有可溶性。

2、重组NS3蛋白的纯化

(1)将诱导条件设置为：37℃下诱导6h，待菌液诱导表达完成后用离心机8000rpm离心10min，使用10mL结合缓冲液对菌体进行重悬处理，使用超声破碎仪对菌体进行充分破碎裂解，在室温条件下12000rpm离心20min，收集上清液；

(2)使用GE Healthcare公司产品Ni Sepharose^TM 6 Fast Flow(镍柱)填料对重组NS3蛋白进行纯化，将所购买的纯化Ni²⁺填料加入纯化用的重力柱中，滤去酒精，加入10倍柱体积的去离子水混匀洗涤残留的酒精，滤去水；

(3)用5～10倍柱体积的20mM咪唑缓冲液过柱，平衡柱子；

(4)加入适量步骤(1)中的上清液(填料的最大载量为40mg/mL)，轻摇使重组NS3蛋白与介质充分接触，收集流出液；

(5)依次用5～10倍柱体积的20mM、40mM、60mM、80mM咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，收集第一次和第二次的蛋白洗杂液，用于后续的纯度分析；

(6)用500mM咪唑缓冲液洗脱重组NS3蛋白，每次1mL，重复数次，直到完全洗脱，收集第一次、第二次、第三次和第四次的蛋白洗脱液，4℃保存，用于后续的纯度分析；

(7)使用5倍柱体积的500mM咪唑缓冲液彻底洗去填料中残留蛋白，再用5倍柱体积的去离子水清洗填料，最后加入与填料等体积的20％的乙醇，收集最后的蛋白洗出液，置于4℃保存，用于后续的纯度分析，填料介质使用不超过3次为宜；

(8)取上述第一次和第二次的洗杂液，第一次、第二次、第三次和第四次的洗脱液以及最后的蛋白洗出液，分别加入5×SDS上样缓冲液沸水浴5～10min，取煮好的样品10μL进行SDS-PAGE电泳进行纯度分析，得到的重组NS3蛋白的纯化结果图如附图5所示，图中，M为蛋白Marker，1～4分别为第一次、第二次、第三次和第四次的蛋白洗脱液，5～6分别为第一次和第二次的蛋白洗杂液，7为最后的蛋白洗出液；附图5显示上清液过柱纯化后蛋白洗脱液中得到较为纯净的重组NS3蛋白，经Bradford试剂盒测定所获重组NS3蛋白具有较高浓度(>1μg/mL)，可用于后续免疫实验；

(9)纯化好的重组NS3蛋白用微量分光光度计测量浓度后4℃保存。

实施例3：重组NS3蛋白表达的最佳诱导条件的确定

(1)最佳诱导温度的确定

于实施例2的重组NS3蛋白的表达程序的步骤(3)中，当菌体OD_600nm值达到0.6左右时，取三份菌液，在菌液中分别加入相同量的IPTG，分别在25℃、30℃和37℃下进行诱导表达，180rpm培养相同时间，将诱导完成的菌液在室温条件下8000rpm离心5min，弃掉上清液保留离心获得的菌体，使用原体积0.1倍的PBS缓冲液重悬菌体，取重悬后的菌体作为上样样品进行SDS-PAGE电泳，得到的重组NS3蛋白表达的不同诱导温度结果图如附图6所示，图中，M为Marker，1为25℃的诱导温度，2为30℃的诱导温度，3为37℃的诱导温度，4为pMAL-c5x空载体37℃的诱导温度，根据考马斯亮蓝染色结果分析不同诱导温度下的蛋白表达量，附图6显示1、2和3在120kDa左右处均出现一条较突出的蛋白条带，与重组NS3蛋白大小一致，在不同温度条件下蛋白的表达量发生变化，最终在37℃条件下蛋白表达量达到最大，因此，37℃为最佳诱导温度。

(2)最佳诱导时间的确定

在确定的诱导温度37℃下，在诱导的不同时间进行取样，在开始诱导时计时，每隔1h取一次样，样品菌液在室温条件下8000rpm离心5min，使用原体积0.1倍的PBS缓冲液重悬菌体，取重悬后的菌体作为上样样品进行SDS-PAGE电泳，得到的重组NS3蛋白表达的不同诱导时间结果图如附图7所示，图中，M为蛋白Marker，1～8分别为1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h的诱导时间，9为阴性对照，根据考马斯亮蓝染色结果分析不同诱导时间下的蛋白表达量，附图7显示经IPTG诱导6h的重组NS3蛋白表达量最大，因此，最佳诱导时间为6h。

(3)最佳诱导剂浓度的确定

在确定的诱导温度37℃下，选取不同浓度的IPTG诱导剂对菌液进行诱导，诱导6h后，取样，样品菌液在室温条件下8000rpm离心5min，使用原体积0.1倍的PBS缓冲液重悬菌体，取重悬后的菌体作为上样样品进行SDS-PAGE电泳，得到的重组NS3蛋白表达的不同诱导剂浓度结果图如附图8所示，图中，M为蛋白Marker，1～6分别为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1mM的IPTG浓度，7为阴性对照，附图8显示不同IPTG浓度诱导的重组NS3蛋白的表达量无明显差别。

实施例4：重组NS3蛋白的抗原性分析

(1)将经过SDS-PAGE切去凝胶不含蛋白的部分取出使用超纯水冲洗干净，剪裁一张与其大小相同的PVDF膜覆盖在凝胶上面，放置在三明治结构的转印夹中，使用转膜缓冲液使其充分润湿，在200mA电流强度条件下转印130min；

(2)封闭：电转结束的PVDF膜取出，使用PBS缓冲液充分冲洗，将PVDF膜放入到配置好的封闭缓冲液中，恒温摇床37℃条件下封闭1h；

(3)一抗孵育：以封闭缓冲液1:10000稀释His tag Mouse Monoclonal antibody，放置在冰箱4℃过夜孵育，PBS缓冲液洗涤4次，每次5min；

(4)二抗孵育：以封闭缓冲液1:10000稀释IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG(H+L)，37℃孵育1h，PBS缓冲液洗涤4次，每次5min；

(5)使用电泳仪对PVDF膜进行扫描并对重组NS3蛋白抗原性进行分析，得到的重组NS3蛋白的抗原性分析结果图如附图9所示，图中，M为蛋白Marker，1为重组NS3蛋白，附图9显示重组NS3蛋白的WB验证出现的条带与预期相同，说明表达的蛋白即是所需的重组NS3蛋白。

实施例5：EqHV NS3蛋白的多克隆抗体制备及纯化

1、选用新西兰大白兔作为免疫动物，使用经纯化后的1mg重组NS3蛋白与Gel 01ST水溶性佐剂按照9:1比例混合充分溶解，皮下多点注射进行首次免疫，并于首次免疫后第7d、14d、28d、35d进行加强免疫，加强免疫使用纯化的重组NS3蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1比例完全乳化后皮下多点注射，并且在免疫完成后于兔耳缘静脉采血分离血清，并测定所制备EqHVNS3蛋白的多克隆抗体效价及特异性，实验结果符合预期后，麻醉免疫动物后心脏采血获得大量的含有所需EqHV NS3蛋白的多克隆抗体的血清，血清后续送广州优迪生物公司进行纯化，同时测定血清纯化前后的效价进行比较。

2、EqHV NS3蛋白的多克隆抗体效价测定及特异性检测

将上述所获得的血清经间接ELISA方法进行效价检测，实验方法如下:

(1)将重组NS3蛋白作为抗原用包被液(PBS缓冲液)稀释后包被反应板，100μL/孔，置于4℃过夜包被，弃去包被液，用PBST缓冲液洗涤反应板3次，每次5min，200μL/孔，洗涤完成后在滤纸上彻底拍干；

(2)加入封闭缓冲液，200μL/孔，置37℃温箱2h，取出后弃去液体，用PBST缓冲液洗涤反应板3次，每次5min，洗涤完成后在滤纸上彻底拍干；

(3)将上述血清用PBS缓冲液按一定倍数稀释，加入到反应板中，100μL/孔，每份样品做3个重复孔，同时设定阴性对照孔和空白对照孔，置37℃恒温箱中孵育2h，取出后弃去液体，充分洗涤后在滤纸上彻底拍干；

(4)将HRP二抗用二抗稀释液按一定倍数稀释，加入到反应板中，100μL/孔，置37℃恒温箱中2h，取出后弃去液体，充分洗涤后在滤纸上彻底拍干；

(5)将单组分TMB显色液避光加入到反应板中，100μL/孔，置37℃恒温箱15min；

(6)从恒温箱中避光取出反应板，加入终止液终止反应，50μL/孔，立即用酶标仪在单波长处测定每孔内物质的OD_450nm值；

(7)在对照成立的情况下，判定检测血清样品的阴阳性，检测结果以待测血清样品与阴性血清样品OD_450nm比值大于2的为阳性血清，以最终血清稀释比例确定所获得血清中抗体效价，得到的EqHV NS3蛋白的多克隆抗体效价测定结果如下表4所示：

表4 EqHV NS3蛋白的多克隆抗体的效价测定

由上表结果可知，所得血清中EqHV NS3蛋白的多克隆抗体效价超过1:1000000，判断标准为纯化前血清OD值(P)与阴性血清OD值(N)的比值大于2。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

atcgagctcg atgtcaccta ttacagccac tgtcact 37

<210> 2

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cgcggatccc tatcattaat ggtgatggtg atgatgatgg tgatggtgat gatgatggtg 60

atggtgatga tgcgtttggg tgtcaatctc ggcctccat 99

<210> 3

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

tcacctataa cagccactgt cactaagaca cgtggtatac cttcagcaat tgtttgttgt 60

ctaacaggca gagacaaata tccccataga ggtcattgtt atatcttgac ctccttgact 120

aaaaccttca tgggcacagt ctgtaagggt gtattgtggt ccgtccacca tggtggcggt 180

actgctacgc ttgcttctga taaatcttct ctactgcagg tcctttgttc tcccggcgac 240

gaccttgttg cgtggcctgc tccagcgggg tctaagtctt tccagccgtg cacttgtggc 300

tcggctgacg tgtacttggt tacccgaact ggtcaggttg tcccagcgag gaagacgtcg 360

gaaaaagacg cttctctcat ttctcctttg ccaatttcat ctcttaaagg tagctcggga 420

ggtccggtcc tttgtaagga tggggatctt gtgggcatct tttgttctgc ttccgttacc 480

aggggggttg caaaaagaat acactttgcg gacatgcgtg cgcgtagtgt ttcctcctgc 540

cctccgaagt acacggatct ggactctccg cctgctgttc cttcttcgta ccaggtttct 600

ttcctacacg ctcccactgg cagtggcaag tccaccaaga tgccattgtc ttatgtggag 660

cttggctatc atgtcttagt tctcaatcct tcggtcgcat ctaccctcag ttttgggccg 720

tacatggata agacctatgg tgagtgtccc aatattagga ctggtgctag ctgcaaaact 780

acaggctcta agctcactta ttccacctat ggtaagttcc tagcggatgg tggagtctct 840

gctggcgctt atgacataat catttgtgat gagtgccata gcacagattc tacgtccgtt 900

ttaggaattg gctctgtcct tgacggggcg gagtctaagg gtgttaagct tgttgttctt 960

gctaccgcca caccaccagg gtcccaaact gttcctcatc caaacatcga cgaggaagcc 1020

cttactcaga gtggagacat ccccttctac gggaagatgt tgaagtcgtc cctgctcctt 1080

agtgggaggc atcttatctt ttgccattcg aagaagaagt gcgaggaagt cgcgcttctt 1140

ctgagaaagg ctggagctaa tgctgtcacc tactatcggg gtttggatgt ttccgtcatt 1200

ccgaatgagg ggaatgttgt cgttgtcgcc acagatgccc tcatgacagg gtattctggc 1260

aatttcgaca cagtgaccga ctgtaacact gctgtggaac tggacattga attttctctt 1320

gacccaacct tttctatggt tactactcca aagccatccg atgccgtctg tcgtacacag 1380

cgcaggggga ggactggcag gggtcgcagg ggaacttact actatgtcaa tagtggtgag 1440

cgcccctccg gtgtcctgtc gtcttccgtc ttgtgtgagt gctatgatag tggtctcgct 1500

tggttcggcc tgagccctgc acaggtcacc gtgctgcttc aggcctattt aaaacaacct 1560

ggacttccta ccggacttga ccatactgag ttttgggaga gtgtcttcat aggtttgcct 1620

actgttgatg ctttcttttt atctcagcta aaacaacaag gagttacatt cccttacctc 1680

actgccatac aagctactgt ttgtctcaat gcccaggcta aagctcccag caaagatgaa 1740

cgctggaagg tgctgtcccg gtatatcaca actaaccgga ctccaacgcc cttactgtat 1800

agacttgagg acacacacga cgacctgaca ttcacacacc ccgtgaccaa gtacatccag 1860

gcctgcatgg aggccgagat tgacacccaa acg 1893

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

caggaaacag ctatgacc 18

Claims (9)

1.一种EqHV毒株的NS3基因PCR扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列中含有Sac I和Bam I酶切位点、保护性碱基和防止移码的碱基，以及下游引物中的3个6*His及终止子，所述引物组的核苷酸序列如下所示：

上游引物Sac I 1893F：

5’ATCGAGCTC GATGTCACCTATTACAGCCACTGTCACT 3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物Bam I 1893R：

5’CGCGGATCCCTATCATTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGGTGATGATGCGTTTGGGTGTCAATCTCGGCCTCCAT 3’(SEQ ID NO：2)。

2.一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的EqHV毒株的NS3基因PCR扩增产物。

3.根据权利要求2所述的一种重组表达载体pMAL-c5x-NS3，其特征在于，所述EqHV毒株的NS3基因PCR扩增产物插入到表达载体pMAL-c5x的酶切位点Sac I和Bam I之间。

4.一种含有权利要求2或3所述的任一种重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)。

5.一种权利要求2或3所述的任一种重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据EqHV毒株的NS3基因设计引物Sac I 1893F和Bam I 1893R，以GD18毒株的反转录产物作为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

(2)用限制性内切酶Sac I和Bam I对PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行双酶切；

(3)将酶切后的PCR扩增产物和表达载体pMAL-c5x进行连接，得连接产物；

(4)将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得阳性菌，提取质粒获得重组表达载体pMAL-c5x-NS3。

6.一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法，其特征在于，所述表达方法包括权利要求5所述的步骤，并进一步包括以下步骤：

(5)将重组表达载体pMAL-c5x-NS3转化入表达菌感受态细胞Rosetta(DE3)，得到含有重组表达载体pMAL-c5x-NS3的重组表达菌；

(6)将重组表达菌接入氨苄LB培养基中并加入诱导剂IPTG进行诱导表达；

(7)取诱导后的菌液离心，加入结合缓冲液，超声破碎后离心，取上清液；

(8)将上清液加入镍柱中洗脱获得纯化后的重组NS3蛋白。

7.根据权利要求6所述的一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法，其特征在于，步骤(6)中所述诱导表达的诱导温度为37℃。

8.根据权利要求6所述的一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法，其特征在于，步骤(6)中所述诱导表达的诱导时间为6h。

9.一种EqHV NS3蛋白的原核表达方法在EqHV NS3蛋白的多克隆抗体制备领域的应用，其特征在于，包括以下步骤：

①将纯化后的重组NS3蛋白与Gel 01 ST水溶性佐剂按比例溶解后皮下注射新西兰大白兔进行首次免疫；

②将纯化后的重组NS3蛋白与弗氏不完全佐剂按比例乳化，于首次免疫后的第7d、14d、28d、35d皮下注射新西兰大白兔进行加强免疫；

③免疫完成后于兔耳缘静脉采血分离血清，测定EqHV多克隆抗体效价和特异性；

④实验结果符合预期后，于免疫兔心脏采血获得含有EqHV多克隆抗体的血清并纯化。

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