CN103450358A - 一种猪gapdh蛋白抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪GAPDH抗体及其制备方法与应用。本发明通过表达纯化猪的GAPDH蛋白，制备免疫原，免疫纯种新西兰兔，制备兔抗猪GAPDH蛋白的抗体，弥补了猪特异性抗体缺乏的空白，为猪遗传育种科学研究提供了材料；而且本发明制备的抗猪的GAPDH抗体能够很好的识别猪和鼠的GAPDH蛋白；而市场上购买的抗人的GAPDH抗体仅能够有限的识别鼠的GAPDH蛋白，对猪的GAPDH蛋白基本不能识别。

Description

一种猪GAPDH蛋白抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种猪GAPDH蛋白抗体及其制备方法与应用。

背景技术

目前国内外针对猪的抗体制备非常稀少，而随着猪分子遗传育种工作的深入开展，对猪特异性抗体的需求愈加强烈。在以猪为实验材料的研究中，经常会遇到检测某一蛋白的表达时找不到合适的抗体的情况，使得许多研究无法全面的展开。因此，制备猪的蛋白抗体十分紧迫。 

GAPDH基因是一种非常重要的内参基因，在mRNA和蛋白检测中作为标准广泛应用。GAPDH抗体在人和小鼠身上都已经有了很成熟的研究，如谭翔文等（2008）曾克隆了人的GAPDH基因的部分片段，构建了重组质粒pUC18-GAPDH，且小鼠的GAPDH单克隆抗体已经开始了商业化生产，但是猪GAPDH抗体却极度缺乏。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中猪抗体资源的不足，提供一种猪GAPDH蛋白抗体；弥补了猪特异性抗体缺乏的空白，为猪遗传育种科学研究提供了材料。

本发明的另一个目的是提供一种猪GAPDH蛋白抗体的制备方法。

本发明的另一个目的是提供一种猪GAPDH蛋白抗体的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

    一种猪GAPDH蛋白抗体，以猪的GAPDH蛋白作为抗原免疫动物，分离动物抗血清，纯化得到猪GAPDH蛋白抗体。

一种猪GAPDH蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1. 克隆得到猪GAPDH基因，将猪GAPDH基因进行原核表达得到猪GAPDH蛋白；

S2. 将猪GAPDH蛋白与等剂量的免疫佐剂均匀混合，制成免疫原，皮下注射纯种新西兰兔，经过四次免疫后，收集兔血清，通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化获得GAPDH抗体。

步骤S2所述免疫原的制备方法为：将400μL纯化的猪GAPDH蛋白和600μL PBS溶液和1mL完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂相互混合，搅拌20min混匀后得到的白色油乳剂即为免疫原。

步骤S1原核表达时，确定IPTG诱导浓度为0.01mM，诱导时间为5小时。

    如上所述猪GAPDH蛋白抗体的应用，所述猪GAPDH蛋白抗体能够高效特异识别猪GAPDH蛋白，应用于通过ELISA、Western blot检测猪相关蛋白的表达情况。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）本发明首次用猪GAPDH蛋白为抗原，制备GAPDH抗体。目前市场上GAPDH抗体主要是以人或鼠源GAPDH蛋白制备，而本发明制备的GAPDH抗体能够更特异的识别猪GAPDH蛋白，在以猪为研究对象的科学研究中具有广泛的应用前景。

（2）通过检测试验发现，本发明制备的GAPDH抗体效价达到1：4000，能够很好的应用于科学研究。

附图说明

图1.本发明兔抗猪GAPDH抗体制备流程图。

图2. 猪GAPDH基因PCR产物电泳结果；M. DNA marker；1~4为以猪肌肉cDNA为模板的PCR扩增产物；5. 阴性对照。

图3.含有pMD18-T-GAPDH重组质粒的阳性候选克隆PCR鉴定结果；M. DNA marker；1~2为单克隆菌落。

图4. 猪GAPDH蛋白序列信号肽预测结果。

图5. pET-28a（+）质粒的双酶切结果，1. 完整的pET-28a（+）质粒作为对照；2. 双酶切后的pET-28a（+）质粒；3. Marker。

图6. pMD18-T-GAPDH质粒的双酶切结果；1. Marke；2. 完整的pMD18-T-GAPDH质粒；3. 双酶切后的pMD18-T-GAPDH质粒。

图7. 重组质粒pET-28a（+）-GAPDH双酶切鉴定结果；M. Marker ；1. 双酶切前的质粒；2. 双酶切后的质粒。

图8. 不同诱导时间下蛋白表达量检测；M. 蛋白Marker；C. 不加IPTG诱导；1~5. 加入IPTG诱导后1h，2h，3h，4h，5h的蛋白表达情况。

图9. 不同诱导浓度下蛋白表达量检测；M. 蛋白Marker；C. 不加IPTG对照；1~5. IPTG浓度依次为0.01 mM，0.05 mM，0.1 mM，0.5 mM，1mM的表达产物。

图10. Ni-NTA层析柱纯化GAPDH蛋白结果；1. 纯化后所得蛋白上清；2.上清与沉淀混合；3. 菌液滤液；4. lysis buffer；5. wash buffer。

图11. 蛋白A琼脂糖凝胶纯化GAPDH抗体结果；M. 蛋白Marker；1. 购买的GAPDH抗体；2. 纯化后GAPDH抗体；3. 过滤液。

图12. Elisa检测GAPDH抗体效价。

图13. Westernblot检测GAPDH抗体，1~5泳道均为GAPDH抗原蛋白。

图14. 本发明所述抗猪GAPDH的抗体与市售抗人GAPDH的抗体的特异性比较；A. 抗猪GAPDH的抗体；B. 抗人GAPDH的抗体；PSCs为猪骨骼肌卫星细胞；C2C12为鼠成肌细胞。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作出进一步地详细阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

S1.克隆猪GAPDH基因：本发明中，首先提取猪骨骼肌卫星细胞总RNA，反转录得到cDNA，以此为模板克隆得到猪GAPDH基因。

S11. 猪总骨骼肌卫星细胞总RNA的提取参照TAKARA公司的RNAiso Plus总RNA提取试剂使用说明书。

S12. 总RNA的反转录：RNA的反转录参照TIANGEN公司的TIANScript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物： 

反应条件：70℃加热5min后迅速在冰上冷却2 min，简短离心收集反应液后加入以下各组分：

 反应条件：将以上试剂轻轻用移液器混匀；42℃温浴50 min；95℃加热5 min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存； 

S13. 设计引物：设计猪GAPDH基因扩增引物，序列如下：

F：5’-CGCGGATCCATGGTGAAGGTCGGA-3’,如SEQ ID NO：3所示；

R：5’-CCGCTCGAGCTCCTTGGAGGCCAT-3’,如SEQ ID NO：4所示；

S14. 以上述猪骨骼肌卫星细胞cDNA为模板进行PCR，反应体系如下：

    PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸30sec；35个循环；72℃后延伸10min。

通过PCR技术克隆GAPDH基因。电泳结果显示GADPH基因大约为1100 bp（见图2）。 

S2. pMD18-T-GAPDH测序载体的构建及鉴定

将纯化后的GAPDH片段与pMD18-T载体连接，转化筛选得到的阳性候选克隆，阳性质粒PCR鉴定结果见图3。将阳性质粒送公司测序，将测序结果与NCBI公布的野猪的GAPDH基因序列进行Blast，一致率接近100%，说明测序结果正确。

S3. 预测GAPDH蛋白是否含有信号肽

将测序所得猪GAPDH基因的核苷酸序列（如SEQ ID NO：1所示）翻译成蛋白序列，猪GAPDH蛋白共有333个氨基酸，猪GAPDH蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。利用SingalP-4.0进行信号肽预测，预测结果如图4，从图4结果可以看出猪GAPDH蛋白序列无信号肽。

S4. 双酶切pET-28a(+)质粒和pMD18-T-GAPDH质粒，构建pET-28a（+）-GAPDH载体，具体步骤如下：

S41. 根据OMEGA公司的E.Z.N.A.TM EndoFee Plasmid Mini Kit（无内毒素小量质粒提取试剂盒）使用说明书进行操作，分别抽提pET-28a(+)质粒和测序正确的pMD18-T-GAPDH质粒，用XhoⅠ和BamHⅠ两种限制性内切酶双酶切后分别回收产物，结果见图5和图6。图5是pET-28a（+）质粒的双酶切结果：第一泳道是完整的pET-28a（+）质粒作为对照，大小为5368bp，第二泳道是双酶切后的结果，切除掉40bp，第三泳道是Marker；图6是pMD18-T-GAPDH质粒的双酶切结果：第一泳道为Marker，第二泳道是完整的pMD18-T-GAPDH质粒，大小约为3000bp，第三泳道为双酶切后的片段，可以看到在1000～1500bp之间的GAPDH片段。

S42. 将双酶切得到的线性化pET-28a（+）载体和GAPDH片段分别回收后，用T4连接酶连接后，将连接产物转化入DH5α感受态细胞，挑取单克隆细胞扩大培养后，抽取质粒后，用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒（见图7），第一泳道是完整的质粒，第2泳道是双酶切后的片段，从图7中可以看出，酶切后，质粒被切成1000bp和5000bp左右的两条带，表明GAPDH基因已经成功连接到pET-28a（+）载体上。将这一重组质粒命名为pET-28a（+）-GAPDH。

S5. 猪GAPDH蛋白表达：将pET-28a(+)-GAPDH重组质粒转化表达菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，具体步骤如下：

S51. 将BL21(DE3)感受态细胞从-80℃的冰箱中取出，置于冰上溶解；加入10～15μL的含有pET-28a（+）-GAPDH重组质粒的链接混合液轻轻震荡后置于冰上30min。

S52. 轻轻摇匀后置于42℃水浴，90s热击，然后迅速放回冰中，静置2min。

S53. 加入400μL不含任何抗生素的LB培养液，37℃，220rpm/min，培养1小时。

S54 将培养好的菌液4000rpm/min，离心4min，弃掉4000μL上清后，轻轻吹打菌体，直至悬浮均匀。

S55. 将菌液滴加到含有卡那霉素的抗性的固体LB板中，用酒精灯烧过的涂布棒涂布均匀，放在37℃恒温箱中培养12～14个小时。

S56. 次日，挑取单克隆菌落，加入到LB培养液中，37℃，220rpm/min，培养3～4小时。

S57. 吸取适量菌液为模板，用通用引物或特异引物进行PCR扩增，然后进行琼脂糖电泳检测，初步鉴定菌落的阴阳性。

S58. 取100～150μL菌液送交华大基因公司测序。

S59. IPTG诱导浓度和诱导时间摸索

将pET-28a（+）-GAPDH重组载体转化入表达菌BL21(DE3)中，分别加入0.01 mM，0.05 mM，0.1 mM，0.5 mM，1mM不同浓度的IPTG诱导剂，在不同的诱导时间下检测蛋白表达量，确定IPTG诱导浓度为0.01mM，诱导时间为5小时（图8，图9）。

S6. GAPDH蛋白的纯化和免疫原的制备：将表达菌在含0.01mM的IPTG诱导剂的LB液体培养基中生长5个小时，4000rpm离心10min收集细菌沉淀，用尿素裂解和超声波破碎的方法充分裂解细菌，收集上清蛋白，将上清通过Ni-NTA蛋白纯化柱层析，获得纯度较高的GAPDH蛋白（图10），将纯化后蛋白透析浓度后，与佐剂均匀混合，制成免疫原，皮下注射纯种新西兰兔，经过四次免疫后，收集兔血清，通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化获得GAPDH抗体（图11）。

一、蛋白纯化的具体步骤如下：

1、蛋白的大量表达（摇瓶表达500mL细菌）：将重组菌在LB平板划线培养16h，挑取单菌落接种于40mL含卡那霉素（100μg /mL）的LB液体培养基中，37℃振摇培养6小时使OD₆₀₀达到1.0以上，4℃放置24小时，将菌液按照1：50的比例解汇总到1升LB培养基中（500mL/瓶），继续培养至OD₆₀₀达到0.5～0.6以上，加入IPTG诱导，最佳IPTG终浓度为0.05mmol/L时，诱导5小时。所得菌分别在4℃，4000rpm离心20min，收集并称量湿重，保存于-20℃备用。

2、融合蛋白变形裂解液的制备：冰上解冻细胞沉淀，按每克湿重加入5mL buffer B悬浮沉淀；室温轻摇细菌60min使细胞裂解，当细胞液变为半透明时结束裂解；室温10000rpm离心20min使细胞随便沉淀，保留上清；取20μL上清加上样缓冲液，放置于-20℃待后续试验分析。

3、融合蛋白变形裂解上清的层析过柱：在安装好的空层析柱中加入5～10mL磷酸缓冲液，然后将纯化树脂50%Ni-NTA摇匀，取3mL缓慢滴入柱中尽量避免滴到壁上；4℃垂直静置过夜。待树脂沉淀平整后，用6倍于柱床体积的Buffer B平衡柱子，调整流速（约1mL/min），待液面距树脂面1～2mm时缓慢加入25mL制备好的变性蛋白裂解上清，让其缓慢过柱，待其全部进入柱床后用4倍于柱床体积的Buffer B过柱，接着用5倍于柱床体积的Buffer C洗柱，然后用5倍体积的Buffer E回收纯化蛋白。

4、透析、浓缩和蛋白浓度的测定：

纯化蛋白的透析

透析袋使用前的处理：剪适量长度的透析袋，在透析袋漂洗液中煮沸30min，其间要将透析袋充分煮透，用蒸馏水将透析袋彻底漂洗，将透析袋浸泡于水中，煮沸15min，冷却后置于4℃冰箱过夜，用棉线将透析袋一端结扎封闭煮沸后室温保存

将纯化蛋白装入透析袋放置在1升的透析液Ⅰ中透析12小时，同样条件下依次更换透析液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ。

复性蛋白的浓缩

将透析袋包埋在聚乙二醇6000中浓缩目的蛋白，直至透析袋中含有少量液体，然后用PBS冲洗掉透析袋表面的聚乙二醇6000，再将透析袋放置在500mL的PBS溶液中，透析2-3h，取出透析袋，剪开收集目的蛋白，再用5mL高压灭菌的PBS冲洗透析袋内壁几次，收集所有的液体，浓缩后的目的蛋白置于-20℃中保存备用。

纯化柱的保存：用一定量的Buffer E过柱后再用磷酸缓冲液过柱半小时，保存于4℃；如果长期保存则用30%乙醇清洗柱后保存。

蛋白质浓度的测定：纯化后的蛋白在UV-2501PC型紫外分光光度仪上用双波长法测定蛋白质的浓度，公式为： 

蛋白质浓度（mg/mL）=1.55×A280－0.76×A260

重组融合蛋白的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：按照汪家政等（2000）方法，用DDY-288A垂直电泳槽制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），凝胶置于UVP凝胶成像系统中进行分析和照相。

蛋白纯化中用到的试剂配方

蛋白纯化缓冲液：

Lysis Buffer B（PH=8.0）：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素。

Wash Buffer C（PH=6.3）：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素。

Elution Buffer D（PH=5.9）：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素。

Elution Buffer E（PH=4.5）：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素。

磷酸缓冲液（PH=7.2）：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Cl，8M尿素。

    蛋白复性缓冲液：

透析液Ⅰ：6M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=4.5

透析液Ⅱ：6M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=5.5

透析液Ⅲ：4M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=5.5

透析液Ⅳ：4M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=6.0

透析液Ⅴ：2M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=6.0

透析液Ⅵ：2M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=7.0

透析液Ⅶ：0M尿素，0.01M Tris-Cl，0.1M NaH2PO4，PH=7.0

透析液Ⅷ：PBS缓冲液，PH=7.0

蛋白A琼脂糖凝胶试剂：

（a）平衡缓冲液：20mM 磷酸盐缓冲液 300mM NaCl， pH=7.4-8.5

（b）洗脱缓冲液：0.1mM 柠檬酸钠缓冲液 pH=4.0

（c）再生缓冲液：1M NaCl 

（d）中和缓冲液：1M Tris-Cl，pH=9.0

二、免疫原制备

重组融合蛋白油乳剂疫苗的制备：蛋白油乳剂疫苗制作分为完全免疫疫苗和不完全免疫疫苗，完全免疫疫苗，将400μL纯化蛋白和600μL PBS溶液和1mL完全弗氏佐剂相互混合，之后用匀浆机搅拌20min混匀后得到的白色油乳剂即为重组蛋白油乳剂疫苗。

不完全免疫疫苗制作方法参照完全免疫疫苗的制作方法，将其中的完全佐剂换为不完全佐剂。制备好的疫苗放于4℃保存。

主动免疫处理程序：对两只兔注射两次重组融合蛋白疫苗，疫苗注射间隔为28天。第一次免疫使用1mL内含1mg的重组蛋白的完全免疫疫苗。第二次免疫使用1mL内含1mg的重组蛋白的不完全免疫疫苗。对兔子进行免疫注射，注射部位为大腿部和背部皮下注射。 血样的采集：对试验兔进行血样采集：采血时间安排为第一次采血：注射疫苗之前一天；之后每隔七天采血一次。每次采血2mL。采血后在室温下静置1h，然后再4℃下离心10000rpm，15min。离心后分离血浆，小心吸取血清，将血清分装后放-20℃保存待测。

蛋白A琼脂糖凝胶回收GAPDH抗体蛋白

(1)样品经过平衡缓冲液稀释5-10倍，以保证血清液的成分及pH和平衡缓冲液相近。

(2)填料装柱后用超纯水流洗3-5个柱床体积以洗掉乙醇，用平衡缓冲液流洗5-10个柱床体积平衡柱子。

(3)平衡缓冲液再洗5-10个柱床体积，直至基线平稳。

(4)洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用中和缓冲液将洗脱收集抗体蛋白样品中和到中性。

S7. GAPDH抗体效价检测：纯化获得GAPDH抗体后，按照1：100，1：500，1：1000，1：2000，1：4000和1：5000的比例稀释后，通过ELISA实验检测其效价，对照组OD₄₉₀值为0.047，根据阳性/阴性≥2.1且超过吸收值（0.2～0.4）的标本为阳性，表明GAPDH抗体1：4000稀释后仍为阳性，而1：5000时OD₄₉₀值小于0.2，最终确定本发明制备的GAPDH抗体效价为1：4000（图12）。

ELISA检测GAPDH抗体效价后，通过Westernblot方法检测抗体的适用性。将GAPDH蛋白跑胶后，按1：4000的比例稀释抗体，孵育后，通过化学发光法检测GAPDH蛋白表达量。从图（13）可以看出，通过本实验制备的抗体能够与GAPDH蛋白结合，检测到一条清晰条带。表明本研究所制备GAPDH抗体具有高效价，并且能够应用于后续的研究中。

实施例2

将本发明实施例1制备的抗猪的GAPDH抗体与市售抗人的GAPDH抗体进行特异性比较，具体方法为：通过Western blot比较本发明制备的抗猪的GAPDH抗体与市售抗人的GAPDH抗体猪和鼠的GAPDH蛋白的识别能力，从图（14）可以看出，本发明实施例1制备的抗猪的GAPDH抗体能够很好的识别猪和鼠的GAPDH蛋白；而市场上购买的抗人的GAPDH抗体仅能够有限的识别鼠的GAPDH蛋白，对猪的GAPDH蛋白基本不能识别。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种猪GAPDH蛋白抗体及其制备方法与应用

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1303

<212>  DNA

<213>  猪GAPDH基因

 

<400>  1

ataaattccg gctgcagcct tcccctgcgc tctctgctcc tccccgttcg acagacagcc     60

 

gtgtgttccg tgcattgcca gccgcgtccc tgagacacga tggtgaaggt cggagtgaac    120

 

ggatttggcc gcatcgggcg cctggtcacc agggctgctt ttaactctgg caaagtggac    180

 

attgtcgcca tcaatgaccc cttcattgac ctccactaca tggtctacat gttccagtat    240

 

gattccaccc acggcaagtt ccacggcaca gtcaaggcgg agaacgggaa gcttgtcatc    300

 

aatggaaagg ccatcaccat cttccaggag cgagatcccg ccaacatcaa atggggtgat    360

 

gctggtgcta cgtatgttgt ggagtccact ggtgtcttca cgaccatgga gaaggccggg    420

 

gctcacttga agggtggggc caagagggtc atcatctctg ccccttctgc cgatgccccc    480

 

atgtttgtga tgggcgtgaa ccatgagaag tatgacaact ccctcaagat cgtcagcaat    540

 

gcctcctgca ccaccaactg cttggcaccc ctggccaagg tcatccatga ccacttcggc    600

 

atcgtggagg gactcatgac cacggtccat gccatcactg ccacccagaa gactgtggat    660

 

ggcccgtctg ggaagctgtg gcgtgatggc cgaggggctg cccagaacat catccctgct    720

 

tctaccggcg ctgccaaggc tgtgggcaag gtcatccctg agctcaacgg gaagctcact    780

 

ggcatggcct tccgtgtccc cacccccaac gtgtcggttg tggatctgac ctgccgcctg    840

 

gagaaacctg caaaatatga tgacatcaag aaggtggtga agcaggcgtc cgagggcccc    900

 

ctcaagggca tcctgggcta cactgaggac caggttgtgt cctgtgactt caacagtgac    960

 

actcactctt ccacttttga tgctggggct ggcattgccc tcaacgacca cttcgtcaag   1020

 

ctcatttcct ggtacgacaa tgaatttggc tacagcaaca gggtggtgga cctcatggtc   1080

 

cacatggcct ccaaggagta agagcccctg gaccaccaac cccagcaaga gcacgcgagg   1140

 

aggagagagg ccctcagctg ctggggagtc acagccccaa ctcgatcccc caacacaccg   1200

 

agcatctcct gacttccagt ttccatccca gacccccgga agaaggggag gggcttaggg   1260

 

agacctgcct cgtcatgtac catcaataaa gtacactgta ccc                     1303

 

 

<210>  2

<211>  333

<212>  PRT

<213>  猪GAPDH蛋白

 

<400>  2

 

Met Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val

1               5                   10                  15     

 

 

Thr Arg Ala Ala Phe Asn Ser Gly Lys Val Asp Ile Val Ala Ile Asn

            20                  25                  30         

 

 

Asp Pro Phe Ile Asp Leu His Tyr Met Val Tyr Met Phe Gln Tyr Asp

        35                  40                  45             

 

 

Ser Thr His Gly Lys Phe His Gly Thr Val Lys Ala Glu Asn Gly Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Leu Val Ile Asn Gly Lys Ala Ile Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Pro

65                  70                  75                  80 

 

 

Ala Asn Ile Lys Trp Gly Asp Ala Gly Ala Thr Tyr Val Val Glu Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Gly Val Phe Thr Thr Met Glu Lys Ala Gly Ala His Leu Lys Gly

            100                 105                 110        

 

 

Gly Ala Lys Arg Val Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ala Asp Ala Pro Met

        115                 120                 125            

 

 

Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn Ser Leu Lys Ile

    130                 135                 140                

 

 

Val Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ala Lys

145                 150                 155                 160

 

 

Val Ile His Asp His Phe Gly Ile Val Glu Gly Leu Met Thr Thr Val

                165                 170                 175    

 

 

His Ala Ile Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser Gly Lys

            180                 185                 190        

 

 

Leu Trp Arg Asp Gly Arg Gly Ala Ala Gln Asn Ile Ile Pro Ala Ser

        195                 200                 205            

 

 

Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Ile Pro Glu Leu Asn Gly

    210                 215                 220                

 

 

Lys Leu Thr Gly Met Ala Phe Arg Val Pro Thr Pro Asn Val Ser Val

225                 230                 235                 240

 

 

Val Asp Leu Thr Cys Arg Leu Glu Lys Pro Ala Lys Tyr Asp Asp Ile

                245                 250                 255    

 

 

Lys Lys Val Val Lys Gln Ala Ser Glu Gly Pro Leu Lys Gly Ile Leu

            260                 265                 270        

 

 

Gly Tyr Thr Glu Asp Gln Val Val Ser Cys Asp Phe Asn Ser Asp Thr

        275                 280                 285            

 

 

His Ser Ser Thr Phe Asp Ala Gly Ala Gly Ile Ala Leu Asn Asp His

    290                 295                 300                

 

 

Phe Val Lys Leu Ile Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn

305                 310                 315                 320

 

 

Arg Val Val Asp Leu Met Val His Met Ala Ser Lys Glu

                325                 330            

 

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物F

 

<400>  3

cgcggatcca tggtgaaggt cgga                                            24

 

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物R

 

<400>  4

ccgctcgagc tccttggagg ccat                                            24

Claims (5)

1.一种猪GAPDH蛋白抗体，其特征在于，以猪的GAPDH蛋白作为抗原免疫动物，分离动物抗血清，纯化得到猪GAPDH蛋白抗体。

2.权利要求1所述猪GAPDH蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 克隆得到猪GAPDH基因，将猪GAPDH基因进行原核表达得到猪GAPDH蛋白；

S2. 将猪GAPDH蛋白与等剂量的免疫佐剂均匀混合，制成免疫原，皮下注射纯种新西兰兔，经过四次免疫后，收集兔血清，通过蛋白A琼脂糖凝胶纯化获得GAPDH抗体。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述免疫原的制备方法为：将400μL纯化的猪GAPDH蛋白和600μL PBS溶液和1mL完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂相互混合，搅拌20min混匀后得到的白色油乳剂即为免疫原。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤S1原核表达时，确定IPTG诱导浓度为0.01mM，诱导时间为5小时。

5.权利要求1所述猪GAPDH蛋白抗体的应用，其特征在于，所述猪GAPDH蛋白抗体能够高效特异识别猪GAPDH蛋白，应用于通过ELISA、Western blot检测猪相关蛋白的表达情况。

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