CN110527668A - 一种抗弓形虫棒状体蛋白4（rop4）单克隆抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种抗弓形虫棒状体蛋白4（rop4）单克隆抗体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗弓形虫棒状体蛋白4的单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明抗ROP4的单克隆抗体由杂交瘤细胞株3B‑7分泌产生，可用于犬、猫、猪和鸡血清、血浆弓形虫循环抗原的检测，其针对弓形虫蛋白检测的最低限度为17.71ng/mL。本发明通过细胞融合技术获得的一株鼠源杂交瘤细胞株3B‑7，能够稳定分泌抗ROP4的单克隆抗体，经过鉴定发现该单克隆抗体具有效价高、特异性强等优点，为进一步应用于临床弓形虫病原的检测奠定基础。

Description

一种抗弓形虫棒状体蛋白4(ROP4)单克隆抗体及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体及其制备方法与应用。
背景技术
弓形虫属原生动物门、孢子虫纲、弓形虫属，是一种细胞内寄生机会致病原虫，能感染几乎所有的温血动物，引起人畜共患疾病。弓形虫极大威胁着人类的身体健康，尤其是孕妇和免疫力低下者。孕妇和孕畜在孕期，感染弓形虫会发生流产或产死胎。而对HIV、器官移植、癌症病人等免疫力低下者，弓形虫感染是引起死亡的重要因素。同时弓形虫病爆发也会给畜牧业带来重大经济损失。
弓形虫病感染的严重后果，迫切需要我们重视研究弓形虫病的诊断方法。传统的诊断方法，包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断等，各有利弊，单克隆抗体特异性强且在弓形虫检测方面已有应用。单克隆抗体在免疫印迹和免疫荧光的结果上具有特异性好、敏感度高、纯度高的优点，用于检测样品中是否感染弓形虫的试剂盒，能够在弓形虫免疫学诊断上提供较为准确的检测手段，特别适合用于生产实践的现场快速诊断。
棒状体蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)，又称为棒状体蛋白激酶，在虫体入侵过程中起到了重要作用，主要包括2个家族：ROP1和ROP2家族，其中ROP4属于ROP2家族。ROP4在入侵过程中可以促进纳虫泡的形成，在对宿主细胞的黏附、入侵和细胞内的复制等过程中起作用，具有较好反应原性以及较强的免疫原性，是一个很好的疫苗候选抗原。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法及其在制备用于检测弓形虫病感染的免疫检测工具中的应用。本发明以弓形虫ROP4蛋白为免疫原免疫小鼠，制备阳性单克隆杂交瘤细胞株，并通过诱生腹水与纯化，得到弓形虫ROP4蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体具有特异性好、敏感度高、纯度高的优点，具备较高检测灵敏性与特异性，为进一步应用于临床弓形虫病原的检测奠定基础。
本发明第一方面提供一种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株分泌抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。
本发明第二方面提供一种弓形虫棒状体蛋白4的单克隆抗体，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体特异性识别弓形虫棒状体蛋白4，所述的单克隆抗体由本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
在本发明一实施例中，所述弓形虫棒状体蛋白4的GenBank登录号或者NCBI的ID或其他公众可以接触的数据库的，可以查到ROP4基因序列的编号。
在本发明一实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列；所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列。
在本发明一优选实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
在本发明一优选实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
在本发明一实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列分别如SEQ ID NO.7-9所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列序列分别如SEQ ID NO.13-15所示。
在本发明一实施例中，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体不和弓形虫ROP5、ROP16、ROP18、MIC6、GRA7、GRA23任一种结合。
在本发明一实施例中，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体不和犬猫新孢子虫、猪旋毛虫、鸡住肉孢子虫、猪蛔虫、犬复孔绦虫、鸡柔嫩艾美尔球虫、猫疱疹病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、猫疱疹病毒任一种结合。
本发明第三方面提供一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求2所述的单克隆抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
本发明第四方面提供一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第二方面所述的单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
本发明第五方面提供一种药物组合物，包括：
(i)如本发明第二方面所述的单克隆抗体、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、或如本发明第四方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在本发明一实施例中，所述载体为完全弗氏佐剂。
在本发明一实施例中，所述载体为不完全弗氏佐剂。
本发明第六方面提供如本发明第二方面所述的单克隆抗体、或如本发明第三方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫偶联物、或如本发明第五方面所述的药物组合物在制备药剂、试剂、检测板或试剂盒中的用途，其中所述药剂、试剂、检测板或试剂盒用于检测弓形虫棒状体蛋白4。
在本发明一实施例中，所述弓形虫棒状体蛋白4为样品中的弓形虫棒状体蛋白4，所述样品包括但不限于犬、猫、猪和鸡中一种或多种血清或血浆。
在本发明一优选实施例中，所述单抗针对弓形虫蛋白4检测的最低限度为17.71ng/mL。
本发明第七方面提供一种抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)制备高纯度弓形虫棒状体蛋白4；
2)以步骤1)制备所得的弓形虫棒状体蛋白4为免疫原免疫小鼠；
3)将免疫鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；
4)将步骤3)制备所得的杂交瘤细胞进行阳性克隆筛选，获得阳性单克隆杂交瘤细胞株；
5)将步骤4)所得的阳性单克隆杂交瘤细胞株，诱生腹水，经纯化，得到抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。
在本发明一实施例中，步骤1)所述弓形虫棒状体蛋白4，其制备方法包括采用分子克隆手段构建ROP4的重组质粒，转入BL21感受态细胞中进行蛋白表达，纯化后，获得高纯度的ROP4蛋白。
在本发明一实施例中，步骤2)所述小鼠为BALB/c小鼠。
在本发明一实施例中，步骤2)所述免疫原免疫小鼠采用皮下多点免疫。
在本发明一实施例中，步骤2)所述免疫原中ROP4蛋白以50μg/只的量进行免疫。
在本发明一实施例中，步骤2)所述免疫原弓形虫棒状体蛋白4蛋白通过与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化后进行免疫。
在本发明一实施例中，步骤3)所述免疫鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合前需经筛选，其筛选方法为利用ELISA技术检测血清中抗体效价，取抗体效价达到要求的BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合。
在本发明一实施例中，步骤3)所述免疫鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞的融合比率为5：1。
在本发明一实施例中，步骤4)所述杂交瘤细胞进行阳性克隆筛选后，再进行2～3次的克隆化培养。
在本发明一实施例中，步骤5)所述阳性单克隆杂交瘤细胞株经扩大培养与收集后，注射入BALB/c小鼠腹腔，收集腹水，获得抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。
在本发明一实施例中，步骤5)所述纯化为利用Protein G亲和层析柱对腹水抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体进行纯化。
在本发明一实施例中，步骤5)所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的获得还包括利用ELISA技术对获得的抗体的特异性和交叉性进行检测。
本发明第八方面提供如本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株、如本发明第二方面所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体、如本发明第三方面所述的重组蛋白、如本发明第四方面所述的免疫偶联物、如本发明第五方面所述所述的药物组合物、如本发明第六方面所述的用途、或如本发明第七方面所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的制备方法在制备弓形虫检测试剂盒中的应用。
本发明的有益效果在于：由杂交瘤细胞株分泌抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体效价较高，可用于酶联免疫吸附分析法(ELISA)定性或定量检测ROP4含量，具有样品操作便捷、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点。
附图说明
图1为本发明实施例提供的弓形虫ME49株ROP4目的基因扩增图；
图2为本发明实施例提供的重组质粒pET32a-ROP4的双酶切鉴定电泳结果图，其中泳道M为DL 10000DNAMarker，泳道1为pET32a-ROP4重组质粒，泳道2为pET32a-ROP4重组质粒双酶切产物，结果显示ROP4目的基因成功插入pET32a载体中，构建正确；
图3为本发明实施例提供的pET32a-ROP4重组表达菌纯化后融合蛋白电泳图，其中泳道M为120kDa预染蛋白Marker，泳道1为pET32a对照，泳道2为pET32a-ROP4重组表达菌纯化后的融合蛋白，结果显示获得较高纯度的融合蛋白；
图4为本发明实施例提供的融合蛋白WB检测，结果显示融合蛋白能被特异性识别，说明重组蛋白表达成功；
图5为本发明实施例提供的杂交瘤细胞株亚克隆。图5A融合成功的细胞团、图5B培养1天杂交瘤细胞、图5C培养5天杂交瘤细胞、图5D培养9天杂交瘤细胞，结果显示获得一株单克隆细胞株；
图6为本发明实施例提供的纯化的单克隆抗体，结果显示抗体能够清晰的看到轻链和重链两个条带，重链分子量约65KDa，轻链分子量约23KDa；
图7为本发明实施例提供的单克隆抗体亚类鉴定，结果显示3B-7抗体为IgG1，轻链为λ。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明实施例中若无特别说明，所用试剂及耗材均为市售商品。
实施例1：构建pET32a-ROP4重组质粒
1、ROP4基因的特异性引物的设计
根据GenBank中发布的ROP4基因序列(登录号：EU047558.1)，设计针对弓形虫ROP4基因序列的特异性引物，同时据克隆所需，在上游引物ROP4F的5’端引入了EcoRⅤ酶切位点，在下游引物ROP4R的5’端引入了HindⅢ酶切位点。该组引物扩增基因片段长1737bp，约编码549个氨基酸，引物的具体核苷酸序列如下：
ROP4F：5’-GATATCGAAAGAGGTAGGGTGCCCCAT-3’(SEQ ID NO.1)
ROP4R：5’-AAGCTTTCACGTTTCCAGTGGTGGCAT-3’(SEQ ID NO.2)
2、合成上述引物，利用灭菌双蒸水进行稀释，终浓度为50pmol/μL，分装后与-20℃保存备用。
3、目的基因扩增
以弓形虫ME49虫株DNA为模板，通过加入上述步骤2)所得引物，进行PCR扩增，反应体系如下：
表1 ME49株ROP4基因的PCR扩增反应体系
结果如图1所示，通过PCR扩增，获得大量ROP4蛋白的基因。
4、重组表达载体pET32a-ROP4的构建
将回收的ROP4片段DNA连接至pMD18-T上，测序正确后，使用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切pMD18-ROP4重组质粒和pET32a(+)载体，将ROP4与线性化pET32a(+)用T4连接酶连接后，转入DH5α感受态细胞，提取pET32a-ROP4重组表达质粒，进行双酶切电泳鉴定，结果如图2所示，显示ROP4目的基因成功插入pET32a载体中，构建正确。然后将阳性的重组表达质粒转入BL21感受态细胞备用。将鉴定为阳性的重组表达质粒送往送到上海生工公司测序，测序结果与GeneBank中的序列进行比较分析，核苷酸序列正确的阳性质粒命名为pET32a-ROP4。
表2 酶切鉴定体系
阳性克隆菌液的保存：鉴定为阳性的重组质粒放在-20℃保存，对应的阳性菌液可于-20℃短暂保存，长期保存需加入等体积加入40％甘油置于-80℃保存。
实施例2：融合蛋白的表达与纯化
1、pET32a-ROP4重组质粒的诱导表达
取阳性克隆质粒转化至BL21，从培养的平板上挑取单个白色菌落，分别接种于5mL含100μg/mLAmp+的LB培养基中，37℃，200rpm培养6～8h，直到细菌出现轻微混浊时，将菌液以1:100的比例接种于20mL含100μg/mLAmp+LB培养基中，37℃，170rpm震摇培养，待对数生长期时(OD600＝0.5～1.0)加入IPTG至终浓度为1mM进行诱导培养。37℃培养5h，离心收集细菌。取1mL培养液离心后加入上样缓冲液煮沸10min，离心去除细菌碎片。取上清液进行SDS-PAGE分析，ROP4融合蛋白以包涵体的形式表达，结果如图3所示，显示获得较高纯度的融合蛋白。
2、目的蛋白的纯化与复性
菌体沉淀用包涵体结合缓冲液溶解，使用蛋白纯化镍柱纯化重组ROP4蛋白，用不同浓度的尿素溶液洗脱收集，SDS-PAGE检测显示用80mM咪唑洗脱时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图4所示，在84KDa处可获得较多的重组蛋白。采用4℃稀释复性法和硫酸铵沉淀浓缩的方法复性重组ROP4蛋白，透析以浓缩目的蛋白，最终获得纯化后的抗原蛋白。
实施例3：免疫小鼠及血清效价测定
1、小鼠免疫
将纯化的ROP4蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(IFC)混合，利用乳化器将混合物乳化至滴水不化；选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行皮下多点注射免疫，注射剂量为100μg/只。分别在免疫第15天和第29天，将纯化的ROP4蛋白弗氏不完全佐剂等体积混合，对小鼠进行皮下多点注射免疫，注射剂量为50μg/只。第三次注射1周后，尾部取血并测定血清效价；利用ELISA检测BALB/C小鼠血清中的抗体效价，以空白对照组血清为阴性对照，PBS为空白对照；抗体效价高于1:10000时，表明抗体具有足够的抗体滴度和亲和力。冲击免疫(第四次免疫)，融合前3～5天，将纯化的ROP4蛋白，不加佐剂，腹腔或尾静脉注射(50μg/只)。
2、小鼠血清抗体效价的测定(间接ELISA法)
1)抗原包被：用包被缓冲液将弓形虫裂解蛋白稀释至1μg/mL，包被聚苯乙烯板的反应孔，100μL/孔，4℃过夜。同时设置空白、阴性和阳性对照。
2)洗涤：弃去孔内的包被液，用洗涤缓冲液孔洗涤3次反应孔，每次3min。
3)封闭：每孔加入200μL的封闭液，37℃封闭2h；弃尽封闭液。
4)加一抗：每孔加入梯度稀释血清，37℃下孵育1h；孵育完毕后弃尽一抗，洗涤后甩干。
5)加二抗：每孔加入100μL用稀释液稀释的HRP-羊抗小鼠IgG二抗(1：8000)，37℃下孵育1h；孵育完毕后弃尽酶标二抗，洗涤，甩干。
6)显色：每孔加入100μL底物TMB，37℃避光反应15min；每孔加入100mL的终止液以终止显色反应。测定450nm的吸光度值(A450)。
实施例4：细胞融合及筛选
分泌单克隆ROP4蛋白抗体杂交瘤细胞株融合及筛选：取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞。融合2周左右，使用优化后的间接ELISA法对杂交瘤细胞的抗体进行检测和筛选，以杂交瘤细胞培养基作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性对照，包被抗原为浓度1μg/mL弓形虫蛋白，最终获得分泌ROP4蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。获得的杂交瘤细胞进行2次的克隆化筛选和培养；每次克隆化培养约7～10天，在倒置显微镜下观察细胞，标出肉眼可见的只有单个克隆生长的孔，进行抗体检测；将检测结果为阳性细胞再次扩大培养，直至100％孔分泌ROP4单克隆抗体，建系保存该杂交瘤细胞株。分泌单克隆ROP4蛋白抗体杂交瘤细胞株细胞融合及单克隆扩大培养结果如图5所示，结果显示成功获取单克隆细胞株，而杂交瘤细胞的稳定性检测见表3。
表3 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性结果
由表3可知，根据软件GraphPad Prism 5分析(p﹤0.01)，可知所获得的杂交瘤细胞株3B-7细胞株，传代之后分泌单克隆抗体的能力非常稳定。
ROP4蛋白单克隆抗体大量制备：1×107个杂交瘤细胞腹腔注射6～8周龄BALB/c小鼠，7～10天后收集腹水。采用间接ELISA对杂交瘤细胞上清及获得的腹水进行效价测定，杂交瘤细胞上清和杂交瘤细胞株产生的腹水稀释102400倍时，结果均为阳性(当OD450>0.147时判定为阳性样品)，效价达1:102400。具体结果见表4。
表4 杂交瘤细胞上清及腹水效价测定结果
单克隆抗体的纯化：腹水离心去除沉淀和凝块，样品经Protein G免疫亲和层析柱，pH2.8甘氨酸洗脱。收集特异性蛋白峰流出液，及时用pH9.0的Tris溶液矫正至pH7.0。蛋白定量，过滤除菌后分装，于-80℃保存。将纯化的单克隆抗体经SDS-PAGE鉴定，结果如图6所示，SDS-PAGE电泳图能够清晰的显示轻链和重链两个条带，其中重链分子量约65KDa，轻链分子量约23KDa。
实施案例5：ROP4单克隆抗体亚型测定
使用快速定性试纸法鉴定单克隆抗体的类型，结果如图7所示，ROP4单克隆抗体重链均为IgG1亚类，轻链均为λ链。
实施案例6：ROP4单克隆抗体的交叉性和特异性测定
利用间接ELISA法进行检测，0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释得到弓形虫ROP5、ROP16、ROP18、MIC6、GRA7和GRA23，及犬/猫新孢子虫、猪旋毛虫、鸡住肉孢子虫、猪蛔虫、犬复孔绦虫、鸡柔嫩艾美尔球虫、猫疱疹病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、猫疱疹病毒，包被浓度1μg/mL，加入稀释的HRP标记的ROP4，100μL/孔，4℃过夜，甩干，用0.01mol/L PBST洗板3次。用10％小牛血清的PBS(0.01M pH7.4)封闭，200μL/孔，37℃2h，甩干。并设置阴性对照，37℃孵育1h。0.01MPBST洗板3次，加入4000倍稀释的商品化的HRP标记的兔抗鼠二抗各100μL/孔，37℃1h。0.01M PBST洗板5次，甩干，TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10min。加入2M的硫酸50μL/孔终止反应，于630nm测吸光度。终点稀释法确定。ELISA灵敏度：阴性样品为PBS-T，检测结果以样品值OD 630值为阴性值2倍判定为结果阳性。
结果显示(见表5)：所制备的单克隆抗体与ROP4以外的弓形虫ROP5、ROP16、ROP18、MIC6、GRA7、GRA23均无交叉反应，同时与犬猫新孢子虫、猪旋毛虫、鸡住肉孢子虫、猪蛔虫、犬复孔绦虫、鸡柔嫩艾美尔球虫、猫疱疹病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS)、犬瘟热病毒、犬细小病毒、狂犬病毒、猫疱疹病毒均无交叉反应，表明所制备的ROP4单克隆抗体具有非常好的特异性。
表5 单克隆抗体交差性和特异性检测
实施案例7：ROP4单克隆抗体灵敏性检测
具体方法参考实施案例6，于4℃用包被液将ROP4单克隆抗体于96孔酶标反应板中的每孔中加入100μL(0.1μg)，过夜，加入封闭液，洗涤，于37℃加入不同稀释度的弓形虫裂解蛋白，加入HRP标记的anti-ROP4IgG(抗体效价1:12800，本实验室前期制备)，300倍稀释后每孔加入100μL，于37℃1h，每步反应均用洗涤液洗涤，TMB底物显色8～10min，在吸光度波长OD450下读取值：当OD450>0.159时判定为阳性样品；0.109<OD450<0.159时判定为可疑样品；OD450<0.109时，判定为阴性样品。结果如表6所示，该单抗针对弓形虫蛋白检测的最低限度为17.71ng/mL。
表6 ROP4单克隆抗体灵敏性检测
实施案例8：ROP4单克隆抗体3B-7杂交瘤细胞株CDR序列鉴定
提取3B-7株杂交瘤细胞RNA，逆转录成cDNA。根据抗体重链和轻链的恒定区设计2对简并引物，分别进行PCR扩增，目的片段回收测序。
轻链编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
轻链编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
重链核苷酸编码序列如SEQ ID NO.5所示。
重链编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
轻链和重链的CDR序列如表7所示。
表7 3B-7杂交瘤细胞株轻、重链CDR序列比较
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种抗弓形虫棒状体蛋白4（ROP4）单克隆抗体及其制备方法与应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatatcgaaa gaggtagggt gccccat 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagctttcac gtttccagtg gtggcat 27
<210> 3
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60
ctaacctgca gtgccagctc gagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240
gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttatc cgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaac 319
<210> 4
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggttactc tgaaagagtc tggccctggt atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acctgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttttggta tgggtgtgag ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt attgggatga tgacaagcta 180
taacccatcc ttgaagagcc ggctcacaat ctccaaggat acctccaaca accaggtatt 240
cctcaagatc accactgtgg acactgcaga tactgccaca tactactgtg ctcgaagagc 300
tactggtact tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc ag 352
<210> 6
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Leu Pro Ile Leu Glu
50 55 60
Glu Pro Ala His Asn Leu Gln Gly Tyr Leu Gln Gln Pro Gly Ile Pro
65 70 75 80
Gln Asp His His Cys Gly His Cys Arg Tyr Cys His Ile Leu Leu Cys
85 90 95
Ser Lys Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgagtgtaa gttac 15
<210> 8
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcacatcc 9
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catcagtgga gtagttatcc gtggacg 27
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ser Thr Ser
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggttttcac tgagcacttt tggtatgggt 30
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atttattggg atgatgacaa g 21
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgaagagct actggtactt cgatgtc 27
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Phe Gly Met Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ser Lys Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株分泌抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。
2.一种抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体，其特征在于，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体特异性识别弓形虫棒状体蛋白4，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
3.如权利要求2所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体，其特征在于，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列；所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列。
4.如权利要求2所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体，其特征在于，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列序列分别如SEQ ID NO.7-9示；所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列分别如SEQ ID
NO.13-15所示。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求2所述的单克隆抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
6.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求2所述的单克隆抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
7.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求2所述的单克隆抗体、或如权利要求5所述的重组蛋白、或如权利要求6
所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
8.如权利要求1所述的单克隆抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、或如权利要求6所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述药剂、试剂、检测板或试剂盒用于检测弓形虫棒状体蛋白4。
9.一种抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备高纯度弓形虫棒状体蛋白4；
2)以步骤1)制备所得的弓形虫棒状体蛋白4为免疫原免疫小鼠；
3)将免疫鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，制备杂交瘤细胞；
4)将步骤3)制备所得的杂交瘤细胞进行阳性克隆筛选，获得阳性单克隆杂交瘤细胞株；
5)将步骤4)所得的阳性单克隆杂交瘤细胞株，诱生腹水，经纯化，得到抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。
10.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株、如本权利要求2所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体、如权利要求5所述的重组蛋白、如权利要求6所述的免疫偶联物、如权利要求7所述的药物组合物、如权利要求8所述的用途、或如权利要求9所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的制备方法在制备弓形虫检测试剂盒中的应用。
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