CN101671394B - 抗hAPE1蛋白的抗体及其制备方法与应用该抗体的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，公开了一种人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶即hAPE1蛋白的抗体，该抗体特异性结合hAPE1蛋白76-90位和109-123位构成的构象型表位。本发明还提供一种所述抗体的制备方法及应用该抗体的ELISA试剂盒。本发明所述抗体与hAPE1蛋白的构象型表位特异性结合，可检测正常和疾病状态下hAPE1蛋白的表达，特异性好，亲和常数Ka为1.8×10^-7，效价大于1∶10⁷，具有广泛的应用前景。

Description

抗hAPE1蛋白的抗体及其制备方法与应用该抗体的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAPE1蛋白)的抗体及其制备方法以及应用该抗体的ELISA试剂盒。 

背景技术

近年来，随着医学技术的飞速发展，肿瘤标志物的检测已成为肿瘤临床诊断的常规手段之一，其原理是检测肿瘤患者肿瘤细胞特异表达的异常蛋白质或表达增高的蛋白质，从而为肿瘤的诊断和疗效评估提供参照，达到早期发现、早期诊断和早期治疗的目的。 

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(human Apurinic/apyrimidinicendonuclease/redox effector factor，hAPE1)是DNA碱基切除修复(baseexcision repair，BER)途径的关键限速酶，是一种多功能蛋白质。hAPE1蛋白是迄今发现的生物大分子中最具结构和功能特点的一个典范：其一级结构含有318个氨基酸，分子量35423Da，空间结构呈四层的α/β三明治型，主要由N端和C端两个有所重叠的功能域构成，N端是一个不规则的柔性结构区域，为氧化还原调控区；C端是一个致密的球形核酸酶结构域，为DNA修复内切酶活性区。正是这种双重结构使hAPE1具有多种生物功能：它能够与OGG1、XRCC1、PCNA、FEN1以及多聚酶β等蛋白质相互作用，同时激活BER通路中的长、短通路，修复烷化和氧化引起的DNA损伤；能够发挥3′-磷酸二酯酶和3′-5′核酸外切酶活性，分别在修复辐射引起的DNA损伤和切除DNA脱氧 核糖核苷类似物中发挥重要作用；同时，hAPE1还具有氧化还原功能，可通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性及下游靶基因表达，参与氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键的细胞反应。受控的转录因子包括与细胞增殖、分化、转化和凋亡相关的重要因子如NF-κB，AP-1，Egr-1，p53，PEBP2，Myb，HIF-1α及Pax5、8等，这些转录因子与肿瘤的生成、发展以及放化疗抵抗密切相关。 

机体各器官组织中均有hAPE1蛋白的表达，而国内外的研究均表明，肿瘤组织中的hAPE1定位和表达与相应的正常组织有显著差异。此外，通过检测肿瘤组织中hAPE1及相关因子的表达，发现其表达水平与肿瘤放化疗抵抗密切相关。因此，hAPE1的表达水平和/或类型可能作为筛选某些肿瘤的辅助手段，hAPE1有望成为肿瘤早期诊断中一项敏感而特异的指标。 

1999年，Dianova等人制备纯化了hAPE1多克隆抗体并应用于细胞实验，但其来源于免疫动物的血清，可识别多个抗原表位，因此特异性较低，且存在种属交叉反应的问题。单克隆抗体是针对某一抗原表位的特异性抗体，纯度高，特异性强。然而目前大多数hAPE1的单克隆抗体的抗原表位未知，个别单克隆抗体虽表位已知，但抗体来源于合成的多肽，其表位为线性表位，而非构象型表位。 

抗原表位(epitope)也称为抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，是抗原分子表面的一小部分，其大小相当于相应抗体的结合部位，由5～7个氨基酸、单糖或核苷酸所组成。抗原表位可分为连续性抗原表位(又称线性表位，见于T细胞表位和部分B细胞表位)和不连续抗原表位(又称构象型抗原表位，只见于B细胞抗原表位)。每一个抗原表位的性质和空间构型决定着一种特异性，是使免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基 础，与生物机体免疫调节网络密切相关。 

近来的研究发现，抗原的线性表位在体液免疫中有重要的作用，而构象型表位则与某些免疫应答发生改变或疾病状态有关。因此，寻找针对天然hAPE1蛋白的构象型表位的抗体对检测疾病状态下如肿瘤的hAPE1蛋白具有极其重要的意义。 

目前国内外对hAPE1检测的研究方法大都为免疫印迹和免疫组化法，这两种均需取组织样品进行hAPE1检测，操作步骤繁琐，处理时间长，成本高，效率低。发明人于前期研究中发现，肿瘤患者和已行放、化疗的肿瘤患者其血清中hAPE1蛋白表达显著增高，因此，对hAPE1进行血清学检测有助于肿瘤的早期临床诊断，并有效判断肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗体，其与脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1蛋白76-90位(其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)和109-123位(其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)构成的构象型表位特异性结合。 

本发明所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP.A-0120694和EP.A.0125023中描述。 

抗体末端可以引入药物、毒素、细胞因子、放射性核素、荧光素、生物素和酶、半胱氨酸尾、酪蛋白激酶底物尾、E尾等结构，有助于标记和偶联其它分子，也可以引入钙调蛋白尾、c-myc尾、葡萄球菌A蛋白尾、脂类标签、组氨酸尾等，使表达产物易于检测和纯化。 

抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP.A.184187，GB 2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。 

本发明所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、合成抗体、抗体片段、单链抗体、双链抗体及其化学修饰衍生物，在具体实施方式中，优选单克隆抗体。 

本发明所述还可以为人源化抗体。 

本发明所述抗体的亚型包括IgG、IgE、IgM、IgD和IgA，在具体实施方式中，本发明提供的单克隆抗体亚型为IgG，其亚类为IgG2b。 

在具体实施方式中，本发明提供的一种人的脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1的单克隆抗体，由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC：C200852、分类命名为杂交瘤细胞株DPCC2-G1的杂交瘤细胞株产生，保藏单位地址是湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏日期为2008年11月3日。 

本发明所述抗体可用于检测hAPE1蛋白在正常及肿瘤细胞内分布，例如：通过ELISA、Western Blot、免疫组织化学对细胞及组织中hAPE1蛋白表达的定量检测；用细胞组织化学、细胞荧光化学检测hAPE1蛋白在细胞中的定位情况；用免疫组织化学法检测单克隆抗体 相应抗原在肿瘤和正常组织中的表达和分布情况。 

本发明的另外一个目的是提供上述单克隆抗体的制备方法：用氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的hAPE1融合蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够分泌与hAPE1特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞注射动物腹腔，对产生的腹水分离纯化获得所述抗体。 

在本发明的具体实施方式中，用hAPE1融合蛋白免疫BALB/C小鼠，取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0以PEG4000介导融合，HAT选择性培养，间接ELISA法筛选，有限稀释法克隆化。将100％对hAPE1融合蛋白阳性、pET28a菌体蛋白和Eppin-His融合蛋白阴性的杂交瘤细胞定株冻存；将定株的杂交瘤细胞注射到经石蜡油预处理的BALB/C小鼠腹腔，产生腹水。腹水用Protein G柱亲和纯化，获得纯化的单克隆抗体。该单克隆抗体的结合常数Ka为1.8×10^-7，效价大于1∶10⁷。 

本发明所述抗体可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明所述的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的抗体，进行氨基酸序列分析，进行人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。 

本发明还提供制备上述抗体的杂交瘤，所述杂交瘤保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC：C200852。 

本发明的再一个目的是提供产生上述抗体的hAPE1融合蛋白，所述hAPE1融合蛋白C端含有10×His Tag，具有人APE1蛋白的生物活性，其氨基酸序列由SEQ ID No.5所示，适于用亲和层析纯化技术纯 化APE1抗体。 

本发明中所述hAPE1融合蛋白以可溶性为主，产量高，纯化条件十分简单，因此具有快速、经济、方便的特点。引入的10×His Tag是为亲和纯化所设计，能增加His柱对hAPE1融合蛋白的亲和力，更有利于非特异性蛋白的洗脱。此外，引入的10×His Tag能够明显增加hAPE1纯化蛋白在体外的稳定性。 

本发明所述hAPE1融合蛋白克服了基因重组获得的融合蛋白多不具有生物学功能的缺陷，不仅具有抗原性，还具有氧化还原、修复和抗原性多重功能，因此应用前景广泛。 

在本发明的具体实施方式中，上述hAPE1融合蛋白的具体制备方法为： 

1)以pcDNA3.1-APE1质粒为模板，分别引入Nco I、BamH I酶切位点粘端，并在下游引入10×His Tag，行PCR反应，得到重组hAPE1基因； 

2)将重组hAPE1基因与载体pET28a质粒行Nco I和BamH I双酶后连接，用卡钠霉素平板筛选阳性克隆，得到pET28a-hAPE1质粒。 

3)将pET28a-hAPE1质粒转化入BL21中，挑菌至LB培养基培养，IPTG诱导4h，离心收集菌体，冻溶后超声破菌，过滤，按Pharmacia公司提供的His亲和柱纯化得到hAPE1融合蛋白。 

本发明还提供一种诊断组合物，包括权利要求1-6任一项所述抗体，和可任选的免疫诊断方法中常规使用的合适试剂。本发明所述诊断组合物可用于肿瘤的临床诊断及判断肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。 

本发明的又一个目的是提供一种能快速、准确检测人血清中hAPE1含量的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述抗体。本发 明所述ELISA试剂盒可以是是双抗体夹心ELISA试剂盒。在本发明的具体实施方式中，本发明提供的双抗体夹心ELISA试剂盒包括本发明所述单克隆抗体、本发明所述hAPE1融合蛋白以及另一种hAPE1抗体。本发明所述ELISA试剂盒可用于肿瘤的临床诊断及判断肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性，具有更高的灵敏性，同时兼顾了特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等优势，不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，也适合于血清流行病学调查。因此，本发明所述hAPE1融合蛋白、hAPE1蛋白的抗体、诊断组合物、ELISA试剂盒具有广泛的应用前景及实用价值。 

附图说明

图1表示琼脂糖电泳检测hAPE1重组基因PCR电泳结果，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为hAPE1重组基因PCR扩增产物；泳道3为阴性对照。 

图2表示琼脂糖电泳检测pET28a-hAPE1重组载体双酶切结果，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为pET28a-hAPE1经Nco I、BamHI双酶切；泳道3为pET28a-hAPE1。 

图3表示SDS-PAGE电泳检测hAPE1融合蛋白在大肠杆菌BL21中的诱导表达及可溶性鉴定结果，泳道1为低分子量蛋白标准；泳道2为pET28a-hAPE1未诱导；泳道3为IPTG诱导pET28a-hAPE14h后；泳道4为IPTG诱导pET28a-hAPE14h破菌后上清；泳道5为IPTG诱导pET28a-hAPE14h破菌后沉淀。 

图4表示hAPE1融合蛋白的纯化结果，泳道1为低分子量蛋白标准；泳道2为上样穿透液；泳道3为30mM咪唑洗脱液；泳道4为200mM咪唑洗脱液。 

图5表示Western blot检测hAPE1融合蛋白纯化结果，A图中一抗为抗人APE1单克隆抗体(Novuse)：1为纯化后的hAPE1蛋白；2为HaLa细胞核蛋白；B图中抗体为HRP-His抗体(Pierce)：1为低分子量蛋白标准；2为纯化后的hAPE1蛋白；3为HaLa细胞核蛋白；4为Eppin-His融合蛋白(含6×His Tag)。 

图6表示hAPE1融合蛋白氧化还原活性检测结果： 

1为正常HaLa细胞核蛋白；2为感染Ad5/F35-siAPE1的HaLa细胞核蛋白；3为正常HaLa细胞核蛋白加入hAPE1融合蛋白后；4为感染Ad5/F35-siAPE1的HaLa细胞核蛋白中加入hAPE1融合蛋白后。 

图7表示hAPE1融合蛋白AP修复活性检测结果：1为BSA阴性对照；2为0.2μg APE1融合蛋白；3为2μg APE1融合蛋白；4为HaLa细胞核蛋白阳性对照。 

图8表示SDS-PAGE电泳检测DPCC 2-G1单克隆抗体腹水IgG纯化结果，泳道1为蛋白标准；泳道2为2-G1纯化前；泳道3为2-G1纯化穿透液；泳道4为2-G1纯化后。 

图9表示Western blot检测DPCC 2-G1单克隆抗体特异性的结果，1为hAPE1融合蛋白；2为HOS细胞蛋白；3为pET28a空载体诱导蛋白；4为Eppin-His融合蛋白。 

图10表示DPCC 2-G1杂交瘤细胞染色体鉴定结果。 

图11表示抗体表位分析结果：左上图为hAPE1蛋白的空间结构示意图：红色曲线表示α螺旋结构，绿色箭头曲线表示β片层结构；其余三图为抗原构象型表位在hAPE1蛋白上的定位：红色球体代表氧红色曲线表示α螺旋结构，绿色箭头曲线表示β片层结构，红色球体代表氧原子，白色球体代表碳原子，蓝色球体代表氮原子。 

图12表示激光共聚焦检测细胞中APE1定位和表达：A为荧光标记的线粒体；B为TOPRO-3探针标记的核；C为细胞中APE1蛋白的定位；D为ABC图像重组后。 

图13表示免疫细胞化学检测细胞中APE1定位和表达：A图为DPCC 2-G1单克隆抗体(1∶100)检测结果；B图为小鼠抗人APE1(1∶100，购自美国Novus)。 

图14表示免疫组织化学检测组织中APE1定位和表达A为乳腺癌组织；B：肺腺癌组织；C：肾癌组织；D：前列腺癌组织。 

图15表示双抗体夹心ELISA检测APE1蛋白的标准曲线，横坐标为标准品浓度的常用对数，纵坐标为相应OD450值。 

具体实施方式

为了有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，下文特举较佳实施例并配合附图详细说明。 

材料与方法 

HOS细胞、HaLa细胞、大肠杆菌E.coli DH5α和BL21(DE3)感受态细胞和pET28a载体均为本领域常规生物材料，真核表达载体pcDNA3.1-APE1(构建方法参见：2006年第三军医大学呼吸内科学谭永红博士的博士论文《放射性肺损伤关键靶细胞电离辐射效应及其调控研究》)和重组腺病毒Ad5/F35-siAPE1(构建方法参见：Xiang DB etal.Cancer Gene Therapy.2008；15(10)：625-35)由本室保存； 

DMEM培养基、小牛血清、聚乙二醇(PEG4000)购自Gibco公司； 

限制性内切酶Nco I和BamH I、Primer star DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自Promega公司； 

ECL检测试剂盒、HRP标记羊抗小鼠IgG抗体、HRP标记-羊抗兔 IgG抗体、HRP标记His抗体、电泳迁移率变动分析实验LightShift试剂盒、DAB显色剂购自Pierce公司； 

尿嘧啶糖基化酶(UDG)购自美国NEB公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒为Geneaid公司产品； 

完全与非完全弗氏佐剂、鼠抗体亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司；小鼠抗人APE1单克隆抗体购自Novus Biologicals公司； 

引物及测序由上海英骏生物工程公司合成； 

APE1-15肽阵列(CelluSpots TM PeptideArrays)为德国INTAVIS AG公司产品； 

His柱HiTrap chelating HP、Protein G、Protein A亲和色谱柱购自Pharmacia公司，纯化设备由重庆富进生物医药有限公司提供。 

实施例1pET28a-hAPE1原核表达载体构建和鉴定 

应用Primer Premer5.0设计软件确定引物，两端分别引入Nco I、BamH I酶切位点粘端，并在下游引入10×His Tag，上游引物核苷酸序列如SEQ ID.No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID.No.4所示， 

以pcDNA3.1-APE1质粒为模板进行PCR反应。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。分别将PCR胶回收产物及载体pET28a质粒用限制性内切酶Nco I和BamHI双酶切，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，转化入大肠杆菌E.coli DH5α中，卡钠霉素平板筛选，挑取阳性克隆扩增，提取质粒DNA，酶切和测序鉴定正确。 

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，可见1007bp左右的片段，与预期大小相符。pET28a-hAPE1载体经Nco I、BamH I双酶切后，得到两条约为1000bp和6000bp的片段，与预期的结果相符(如 图2所示)，测序结果表明：插入的hAPE1在GeneBank中登录的碱基序列完全一致，无突变，表明原核表达载体构建成功。 

hAPE1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.No.5所示。另外，经比对编码该融合蛋白的核苷酸序列与现已报道的其它编码重组的hAPE1核苷酸序列均不完全一致。 

实施例2hAPE1融合蛋白的表达、纯化与鉴定 

1.hAPE1融合蛋白的诱导表达 

将pET28a-hAPE1质粒和空载体pET28a转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，分别挑取克隆接种在含卡那霉素(50mg/L)的LB培养液中，37℃培养过夜，按1∶100转接后，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，取诱导前的菌液1ml作为对照，余下菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续培养4h后离心收集沉淀，行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。 

2.hAPE1融合蛋白的可溶性鉴定 

取诱导4h的菌液离心后弃上清，加入裂菌液(含0.1mg/L溶菌酶，5mmol/L EDTA)重悬，冰浴下超声破菌，分离上清和沉淀，将沉淀用8mol/L尿素重悬后与上清分别制样。行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定融合蛋白的表达形式。 

经IPTG诱导表达后，取细菌悬液进行12％SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示，在相对分子质量约37×10³处有目的蛋白条带，且主要以可溶性表达为主。 

3.hAPE1融合蛋白的纯化 

按上述条件大量摇菌诱导融合蛋白表达，收集菌液离心，收集沉淀，-20℃冻存过夜。次日融化沉淀，用上样缓冲液(20mmol/L PBS，pH 9.0) 重悬，冰浴下超声破菌，离心收集上清，过滤后用上样缓冲液平衡His柱后，取待纯化的样品上样，用上样缓冲液流洗至基线，再分别用30mmol/L和200mmol/L咪唑洗脱，收集蛋白峰。将纯化后的蛋白行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后分析结果如图4所示。 

4.hAPE1融合蛋白的鉴定 

细胞培养：HaLa或HOS细胞用含10％小牛血清的DMEM培养基37℃、5％CO2条件下培养传代。Ad5/F35-siAPE1以4MOI感染HaLa细胞2h后换液，继续正常培养48h后收集细胞提取核蛋白。 

提取细胞核蛋白：0.25％胰酶消化HaLa细胞或HOS细胞，收集1×107细胞，离心收集沉淀，以PBS洗涤，以500μl预冷低渗缓冲液A(10mM HEPES，10mM KCl，0.1mM MgCl₂，0.1mM EDTA，0.1mM DTT，5mM PMSF，pH 7.9)重悬，冰浴10min；离心收集沉淀，以500μl预冷缓冲液B(10mM HEPES，100mM NaCl，1.5mM MgCl₂，0.1mM EDTA，0.1mM DTT，5mM PMSF，pH 7.9)重悬，冰浴20min，离心取上清测定蛋白浓度后于-70℃保存。 

将纯化的蛋白溶液4℃透析过夜，取样行12％SDS-PAGE电泳，分A、B两组电转移到PVDF膜上，A组以HaLa细胞提取核蛋白为阳性对照，B组用带6×His Tag的Eppin-His融合蛋白为阳性对照，HaLa细胞核蛋白为阴性对照。用1％的BSA 37℃封闭2h，A组一抗用小鼠抗人APE1单抗1∶20000稀释4℃孵育过夜，二抗用HRP标记的羊抗小鼠IgG单抗1∶4000稀释37℃孵育40min；B组用HRP标记的His抗体1∶4000稀释37℃孵育1h，采用发光蛋白免疫印迹法对两组进行显影分析。 

结果如图5所示，经hAPE1抗体和His抗体孵育的融合蛋白在相对分子质量37×10³处出现特异性反应条带，表明该重组蛋白具有良好 的免疫反应性。研究发现，连接其他Tag的hAPE1融合蛋白在体外的活性极其不稳定，易降解，而引入10×His Tag后使得人APE1蛋白在体外的稳定性增加，4℃保存一周后，用ELISA法检测，其OD₄₅₀值无差别。 

5.hAPE1融合蛋白活性分析 

提取细胞核蛋白：HaLa细胞用含10％小牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM培养基，37℃、5％CO₂条件下培养，每3d传代1次。Ad5/F35-siAPE1以4MOI感染HaLa细胞2h后换液，继续正常培养48h后收集细胞提取核蛋白。 

hAPE1融合蛋白氧化还原活性检测：采用电泳迁移率变动分析实验EMSA参照文献(Zhang L，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(16)：9184-9489)，人工合成NF-κB探针序列如下： 

P1：5′-AGCTTAGAGGGGACTTTCCGAGAGGA-3’(核苷酸序列如SEQ ID No：6所示)， 

P2：5′-TCCTCTCGGAAAGTCCCCTCTAAGCT-3′(核苷酸序列如SEQ ID No：7所示)， 

其中包含NF-κB转录因子的识别序列，其3’端以生物素标记，退火形成双链，按照LightShift试剂盒说明书进行。结合反应体系(20μl)为：1×结合缓冲液，2.5％甘油，5mM MgCl₂，0.05％NP-40，50ng/μl poly(dI·dC)，2μg纯化hAPE1蛋白，以正常HaLa细胞的核蛋白(4μg)及感染Ad5/F35-siAPE1的HaLa细胞核蛋白(4μg)为对照，室温保温20min后，加探针1pmol，室温反应30min。反应完毕后，将混合物进行7.5％PAGE恒压100V电泳，以380mA恒流电转移至尼龙膜上，紫外线照射交联10min，封闭液37℃封闭20min，HRP偶联的亲和素(1∶500)37℃孵育20min，洗涤液洗涤4 次，室温平衡15min后用ECL检测试剂盒检测。 

结果显示如图6所示，正常HaLa细胞核蛋白可与NF-κB探针结合，当加入hAPE1融合蛋白后，与NF-κB探针的结合明显增加；当感染重组腺病毒Ad5/F35-siAPE1后，与NF-κB探针的结合明显减少；而当感染Ad5/F35-siAPE1后再加入hAPE1融合蛋白，与NF-κB探针的结合又显著增多。说明hAPE1可以增加HaLa细胞核蛋白与NF-κB转录因子序列的结合，具有氧化还原活性。 

hAPE1融合蛋白AP修复活性检测：参照文献(Wong H K，et al.Nucleic Acids Research，2007，35(12)：4103-4113)设计模拟AP位点的42mer寡核苷酸正义链和反义链，序列为： 

正义链22-U： 

5′-CCGCTGAATTGCACCCTCGAUCTAGGTCGATGATCCTAAGCA-3′，(核苷酸序列如SEQ ID No：8所示) 

反义链22-C： 

3′-TGCTTAGGATCATCGACCTAGGTCGAGGGTGCAATTCAGCGG-5′，(核苷酸序列如SEQ ID No：9所示) 

其中U代表尿嘧啶，22-U的5’端标记生物素，退火形成双链。22-U中含有的尿嘧啶在尿嘧啶糖基化酶(UDG)作用下可形成一个AP位点，使双链探针能够被APE1识别并将其切开为22mer的反应产物。APE1蛋白结合反应(20μl)体系为：10mM HEPES(pH7.4)，100mM KCl，不同量的纯化hAPE1蛋白(0.2μg-2μg)，以4μg HaLa细胞核蛋白做阳性对照，2μg BSA蛋白做阴性对照，探针2pmol，37℃反应30min。加甲酰胺终止反应，并将混合物进行10％PAGE(含7M尿素)电泳，电压150V 50min，电转至尼龙膜30min，紫外交联后检测步骤同EMSA。 

结果如图7所示，hAPE1融合蛋白可以参与反应切下22mer的产物，并且随着加入的蛋白量的增加，切下的产物量明显增加。提示，hAPE1融合蛋白具有AP修复活性。 

实施例3hAPE1融合蛋白在抗体亲和层析纯化中的应用 

称取0.5g填料装入纯化柱，用10～15倍柱体积的A缓冲液(1mM HCl)在0-4℃预冷条件下活化填料；用B缓冲液(0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)按0.5∶1(缓冲液：蛋白)稀释hAPE1融合蛋白后，加入到活化好的填料中，在4℃条件下，每30min流尽液体，再循环加入到纯化柱中6-8次，使充分桥联；用5倍柱体积的B液冲洗填料，洗去未结合的样品；用C缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.0)平衡2h；再用3倍柱体积的D缓冲液(0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH 3～4)和E缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl pH 8.0)交替洗涤柱子，各约2～3次，灭活填料；将待纯化的APE1单克隆抗体或多克隆抗体上样，37℃缓慢摇动4h，使抗体充分桥联；用B液冲洗柱子3次，洗去未结合的抗体和杂蛋白；用5ml 0.1M甘氨酸(pH 2.7)洗脱柱子；将洗脱液立即滴入pH9.0的1M Tris-HCl中，使缓冲体系迅速被中和，避免强酸条件下抗体解聚，即得到特异性亲和纯化的APE1单克隆抗体或多克隆抗体。该纯化的APE1抗体较普通的ProteinA或ProteinG亲和柱纯化的抗体具有更高的特异性和纯度。 

实施例4hAPE1单克隆抗体的制备 

1.动物免疫 

以实施例2所得纯化的hAPE1融合蛋白，免疫5只6～8周龄17g～22g的雌性健康BALB/C小鼠。免疫方法：首次免疫使用抗原与 完全弗氏佐剂充分乳化后四肢皮下及腹腔注射，60ug/只；4周后第2次免疫使用抗原与不完全弗氏佐剂充分乳化后四肢皮下及腹腔注射，60ug/只；14d后第3次免疫腹腔注射不加佐剂抗原60ug/只，7d后剪尾采血，以hAPE1融合蛋白作检测原，间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价；以后每间隔14d腹腔注射一次抗原60ug/只，选择ELISA血清抗体效价达1∶10⁶以上的BALB/c小鼠用于融合；融合前3d腹腔注射抗原1次加强免疫，剂量60ug/只。 

2.小鼠脾细胞的制备 

摘除小鼠眼球放血，血清留作阳性对照。按无菌操作取出脾脏，并将脾脏放在预温不完全培养基中，剥去周围结缔组织，置100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨。收集过滤后的细胞悬液于离心管中，计数，取1×10⁸个细胞，1000rpm离心5min，弃上清，置室温待用。 

3.骨髓瘤细胞的准备 

融合前2周，复苏冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)，用含8-AG的1640完全培养基于37℃，5％CO₂培养。融合前2d～3d，改用不含8-AG的1640完全培养基继续培养。取对数生长期细胞约1×10⁷～2×10⁷个细胞，1000转/min离心5min，弃上清，置室温待用。 

4.饲养细胞的准备： 

融前一天，取6～10周龄健康BALB/C小鼠，断颈法处死，浸泡在75％酒精内，消毒3～5min。用无菌剪刀剪开皮肤，充分暴露腹膜，用无菌注射器注入预冷的10ml无血清培养液。反复冲洗，更换剪刀剪开腹膜，吸出冲洗液。放入10ml离心管，1200rpm离心10min，用完全培养液重悬，计数调整细胞数2×10⁵/ml。分铺在96空细胞培养皿中，100μl/孔，37℃，5％CO₂培养备用。 

5.细胞融合 

融前一天将PEG4000置37℃，5％CO₂细胞培养箱中调整pH值和温度。将骨髓瘤细胞悬液和脾脏B淋巴细胞悬液按1∶10混合，1000rpm，离心10min，弃去上清。轻轻弹击管底，使细胞团松散成糊状。在60s内缓慢加入0.8ml预温的PEG4000，边加边转动离心管，静置90s后，立即在5min内加入10ml不完全培养基，具体加法是第1min加1ml、第2min加1ml、第3min加1.5ml、第4min加1.5ml、第5min加完，最后补至30ml。将离心管在37℃培养箱中静止5min后取出，800rpm离心6min，弃上清，加入40ml完全培养液和1×HAT，轻柔重悬，铺入8个96孔板细胞培养皿中，100μl/孔，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养10d～14d。注意：小心开关细胞养箱门，尽量避免振动。 

6.杂交瘤细胞克隆化 

融合后第5d补液，50μl/孔；融合后第10d～14d时，用间接ELISA法检测各培养孔的上清，以hAPE1融合蛋白、pET28a空载体诱导的菌体蛋白、含His Tag的Eppin蛋白为检测抗原，选择hAPE1融合蛋白强阳性、pET28a菌体蛋白和Eppin蛋白阴性的单克隆细胞，用有限稀释法转种于96孔细胞培养板，在培养箱中培养10d～14d后，再取上清按上述方法检测，将强阳性孔再进行克隆化培养，直至达到100％克隆均为hAPE1融合蛋白阳性、pET28a菌体蛋白和Eppin蛋白阴性，即杂交瘤细胞只分泌hAPE1特异性抗体，而对His Tag和杂蛋白无抗性。将强阳性孔的单克隆细胞定株，大量培养，冻存。 

结果：经4次细胞融合、间接ELISA筛选并克隆化后，获得1株稳定分泌抗人APE1蛋白的杂交瘤克隆系，命名为DPCC 2-G1，其已保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC：C200852。 

实施例5单克隆抗体的腹水制备和纯化 

1.单克隆抗体的腹水制备 

选择20～22g健康雌性BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只预处理，饲养7d后，每只小鼠腹腔注射0.5×10⁶～1×10⁶个定株的杂交瘤细胞；饲养7d～10d后，小鼠腹部明显膨隆，收集腹水，4℃离心15min，分离收集中段的澄清腹水液。 

2.单克隆抗体的纯化 

用45μm滤纸过滤腹水液。根据Ig亚类结果，选择Protein G亲和层析纯化抗体。用上样缓冲液平衡Protein G柱，上样待纯化的腹水液后，用上样缓冲液再平衡，用洗脱缓冲液洗脱Protein G柱，收集洗脱液。将纯化的抗体用10％SDS-PAGE检验纯度，Lowry法测定抗体浓度。 

结果如图8所示，显示DPCC 2-G1单克隆抗体经Protein G亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳鉴定纯度均达95％以上。 

实施例6单克隆抗体的生物学鉴定 

1.Western blot鉴定抗体的特异性 

Western Blot检测抗体特异性：以hAPE1融合蛋白、HOS细胞提取APE1蛋白、pET28a空载体在大肠杆菌E.coli BL21中诱导后的菌液、带6×His Tag的Eppin-His融合蛋白(Eppin-His融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.10所示)上样进行12％SDS-PAGE电泳，电转移到PVDF膜上，1％的BSA 37℃封闭1h，用制备的单克隆抗体(1∶2000)37℃孵育1.5h，HRP标记的羊抗小鼠IgG单抗(1∶2000)37℃孵育1h，采用发光蛋白免疫印迹法对两组进行显影分析。 

结果显示DPCC 2-G1杂交瘤分泌的抗体能特异性与hAPE1融合蛋 白、HOS细胞中的APE1蛋白反应，而不与pET28a空载体诱导蛋白和带His Tag的Eppin-His融合蛋白反应(见图9)，说明DPCC 2-G1杂交瘤分泌的单克隆抗体的特异性好。 

2.抗体亚类鉴定 

Ig亚类鉴定按照Sigma公司鼠抗体亚类鉴定试剂盒操作说明进行，每个亚类做复孔验证。结果：DPCC 2-G1杂交瘤分泌的单克隆抗体亚类为IgG2b。 

3.抗体效价 

间接ELISA法检测抗体效价：将hAPE1融合蛋白按5μg/ml 4℃包被过夜，1％BSA 37℃封闭1h，加入倍比稀释的单克隆抗体，以骨髓瘤细胞SP2/0细胞的培养上清为阴性对照，37℃孵育1h，再加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体(1∶3000)37℃孵育40min，OPD显色测定OD_495nm值，以下列公式计算结果所对应的抗体稀释倍数为单克隆抗体的效价： 

M＝(检测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性空OD值-空白孔OD值)＞2 

结果如表1所示，根据公式计算，当DPCC 2-G1单抗的稀释倍数为1∶10⁷时，M＞2，说明该单抗的效价＞1∶10⁷。 

表1间接ELISA法检测2-G1单克隆抗效价及其纯化前后的比较 

注：阴性对照为骨髓瘤细胞SP2/0细胞的培养上清 

4.杂交瘤细胞染色体鉴定 

提前48～36小时将DPCC 2-G1杂交瘤细胞传代，加入秋水仙素(100ug/ml，除菌)，使终浓度为0.4ug/ml；继续培养4～6h，收集细胞，1000r/min离心10min，弃上清；加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液5ml，重悬细胞并混匀，37℃水浴15～20min；入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3∶1混合)1ml，混匀，1000r/min离心10min，弃上清；加入固定液5ml，重悬细胞混匀，室温静置20～30min；1000r/min离心10min，弃上清；重复上述操作一次；加入5ml固定液，重悬细胞混匀，4℃过夜；次日1000r/min离心5min，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，重悬，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥；10％Giemsa染液染色10～20min，自来水洗去染液，自然干燥；镜检，选择染色体分散好、无重叠、无失散的细胞进行观察分析，每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。 

结果如图10所示，DPCC 2-G1杂交瘤细胞染色体为4倍体，大多数为端着丝点染色体，个别为中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体，符合小鼠脾细胞和骨髓瘤SP2/0细胞融合后的染色体特征。DPCC2-G1单克隆抗体杂交瘤细胞染色体数目约为96-92，平均94。 

5.单克隆抗体亲和常数测定 

以hAPE1融合蛋白按5μg/ml、2.5、1.25μg/ml作为包被抗原，100μl/孔，4℃过夜，PBS洗涤3遍，拍干；封闭：加7％小牛血清封闭液100μl/孔，37℃2h，PBST洗板拍干；将抗体浓度按2800ng/ml、1400ng/ml、700ng/ml、350ng/ml、180ng/ml、90ng/ml、45ng/ml、24ng/ml、 12ng/ml、6ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.2ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml稀释，100μl/孔，37℃1h，PBST洗板拍干；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体工作液(1∶3000稀释)100μl/孔，37℃水浴40分钟，PBST洗板拍干；加底物显色液100μl/孔，37℃避光反应10分钟；加终止液50μl/孔，立即在酶标仪上以492nm波长测定OD值；按照下列公式计算单克隆抗体亲和常数： 

$K_{\mathrm{aff}}=\frac{(n-1)}{2\×\left(n\right[A{b}^{,}]t-[\mathrm{Ab}]},n=\frac{\left[\mathrm{Ag}\right]}{\left[\mathrm{Ag}\right]}$

该公式中，n为平衡常数，为两种抗原包被浓度比值倍数(本发明中比值为4)；在曲线中，以每条曲线上段平台段的OD值为100％，以下段平台段OD值为0，[Ab]和[Ab′]为两条曲线中OD值为50％时所对应的抗体浓度，且[Ab]和[Ab′]分别与[Ag]和[Ag’]相对应。 

结果：DPCC 2-G1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，亲和常数Ka＝1.8×10^-7。 

6.种属交叉反应 

Western blot检测种属交叉反应：分别提取兔、大鼠、小鼠的心、肝脏、肺组织蛋白，用Western blot检测DPCC 2-G1单抗对兔、大鼠、小鼠的种属交叉反应。 

结果显示DPCC 2-G1杂交瘤分泌的抗体不能与兔、小鼠和大鼠的心、肝脏、肺组织蛋白反应，说明该抗体特异性好，且与兔、小鼠、大鼠无种属交叉反应。 

7.表位分析 

制备APE1-15肽阵列：根据hAPE1在GeneBank中登录的氨基酸序列，将hAPE1第1～15、4～18、7～21...304～318位氨基酸分别合成15 短肽，与支持物(如纤维素)共价结合后以点阵的形式有序地固化于载玻片的表面。(德国INTAVIS AG公司提供)。 

用1％脱脂奶粉37℃封闭APE1-15肽阵列4h，0.5‰TBST洗涤后，将DPCC 2-G1单抗1∶500稀释，4℃孵育过夜，0.5‰TBST洗涤后，37℃孵育HRP标记羊抗鼠IgG抗体(1∶3000)1h，0.5‰TBST洗涤，DAB显色10min，蒸馏水冲洗终止反应。以棕黄色点为阳性点，根据阳性点所对应的氨基酸序列，并应用Molsoft.ICM-Pro.软件分析表位。 

结果：APE1-15肽阵列与DPCC 2-G1杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体反应后，可见两个不相邻的阳性点，对应为hAPE1天然蛋白氨基酸序列的76-90位(其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示)和109-123位(其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示)。 

SEQ ID No.1和SEQ ID No.2是两个非连续的序列，提示其抗原表位是构象型表位。用三维立体结构观察软件Molsoft.ICM-Pro可以看到立体结构图如图11所示，该两段序列的氨基酸残基均位于蛋白表面。经比对未发现国外已有抗体中有相同表位的报道。 

实施例7单克隆抗体在检测细胞和组织中APE1定位和表达的应用 

1.免疫荧光染色 

取对数期生长的HOS细胞接种于六孔板内20mm×20mm盖玻片上，每孔约1×10⁵个细胞，继续培养12h后取出有细胞贴壁的盖玻片，用2％甲醛溶液室温固定20min，0.5％Triton X-10037℃打孔20min，山羊血清工作液37℃封闭30min，滴加DPCC 2-G1单抗(1∶100)4℃孵育过夜，以PBS替代一抗作为阴性对照；以异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG为二抗(1∶50)37℃孵育30min；以TOPRO-3探针 (1∶100)作为细胞核探针37℃孵育5min。以缓冲甘油封片后在激光共聚焦显微镜下观察和扫描，结果如图12所示，可见细胞核呈绿色荧光的阳性表达，说明DPCC 2-G1单克隆抗体可特异性识别细胞核内的APE1蛋白。 

2.免疫细胞化学 

取对数期生长的HOS细胞接种于六孔板内20mm×20mm盖玻片上，每孔约1×10⁵个细胞，继续培养12h后取出有细胞贴壁的盖玻片，用95％乙醇固定室温20min，0.5％Triton X-10037℃打孔20min，山羊血清工作液37℃封闭30min，滴加DPCC 2-G1单抗(1∶100)4℃孵育过夜，以PBS替代一抗作为阴性对照，以美国Novus产品小鼠抗人APE1(1∶100)为阳性对照；以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗(1∶50)37℃孵育30min；PBS清洗后用二甲苯联苯鞍(DAB)显色，苏木素复染，树脂封片，结果如图13所示，可见细胞核呈棕黄色阳性表达，说明DPCC 2-G1单克隆抗体可特异性识别细胞核内的APE1蛋白。 

3.免疫组织化学 

收集人前列腺癌、乳腺癌、肺腺癌和肾癌组织蜡块标本，常规切片，5％H₂O₂浸泡10min，PBS漂洗后用胰酶4℃修复10min，再用枸橼酸钠缓冲液微波修复中火5min，低火3min，PBS漂洗后滴加DPCC 2-G1单抗(1∶500)4℃孵育过夜，以PBS替代一抗作为阴性对照；以HRP标记的羊抗小鼠IgG为二抗37℃孵育30min；PBS漂洗后用二甲苯联苯鞍(DAB)显色，苏木素复染，树脂封片。 

结果如图14所示，可见肿瘤细胞核呈棕黄色强阳性表达，说明DPCC 2-G1单克隆抗体可特异性识别细胞核内的hAPE1蛋白，可作为良好的检测试剂。 

实施例8APE1多克隆抗体制备 

1.免疫动物 

以实施例2所得纯化的hAPE1融合蛋白为抗原，采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔。免疫程序：基础免疫前耳缘静脉取血5ml分离血清作为阴性对照。每只用抗原500μg与等体积完全弗氏佐剂充分乳化后进行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐剂加强免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐剂第3次免疫。第3次免疫后7天，耳缘静脉取血5ml分离血清，用间接ELISA检测抗血清的效价。效价达1∶64000时颈动脉插管收集全血，4℃放置过夜，4000rpm离心收集血清，-70℃保存。效价达不到要求可再加强免疫1次。 

2.特异性亲和纯化抗体 

将待纯化的血清用上样缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸三钠，PH 7.0)适当稀释后加入到Protein A柱中，用洗脱缓冲液(0.1M磷酸钠，0.1M柠檬酸钠，PH 3.0)洗脱柱子，收集单峰。收集的纯化产物再经抗原抗体特异性亲和纯化(详见实施例3)，得到纯化的hAPE1多克隆抗体。 

实施例9双抗体夹心ELISA的建立 

1.双抗体夹心ELISA的建立 

用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH 9.6)稀释单抗DPCC 2-G1单克隆抗体包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜，用洗液(0.5‰PBST，pH7.4)洗3次；5％BSA封闭，200μl/孔，37℃孵育2h后洗3次；加入APE1标准品(即实施例2所得纯化的hAPE1融合蛋白)和待测血清样本，100μl/孔，标准品做倍比稀释。37℃孵育1h后洗3次； 加入APE1多抗(即实施例8所得hAPE1多抗)，100μl/孔，37℃孵育1h后洗3次；再加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育45min后用洗涤液(1‰PBST，pH7.4)洗6次；加TMB底物，100μl/孔，37℃显色10min，以2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪450nm处测吸光度值(OD₄₅₀)。 

2.ELISA最佳反应条件的确定 

用棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度，将DPCC 2-G1单抗按1∶2000、1∶10000、1∶50000稀释3个浓度包被酶标板，阳性对照(0.5ug/ml hAPE1融合蛋白为标准品)和阴性对照(PBS)为样品，多抗按1∶2000、1∶5000、1∶10000稀释3个浓度，HRP标记羊抗兔IgG按试剂说明书推荐稀释度，按上述实验步骤操作，确定抗体的最佳工作浓度。然后将HRP标记羊抗兔IgG倍比稀释，再次做棋盘滴定。取阳性对照OD₄₅₀值在1.5左右，阴性对照OD₄₅₀值小于0.1的条件为最佳，初次结果不理想，可进一步缩小或扩大稀释度以取得抗原抗体的最佳反应浓度。 

结果：在捕获抗体稀释度为1∶40000、夹心抗体的稀释度为1∶5000和酶标记抗体稀释度为1∶5000条件下该ELISA检测方法的信价比最高。 

实施例10ELISA方法的质量评价 

1.标准曲线的绘制及灵敏度检测 

将hAPE1融合蛋白做一系列的倍比稀释，如1∶500、1∶1000、1∶2000直到1∶256000进行测定，以标准品浓度的常用对数为横座标，OD₄₅₀值为纵座标，绘制标准曲线，确定其线性检测范围及最小检出浓 度。 

2.重复性检测 

(1)批内试验：对高、中、低三个浓度的标准品在同一批板子上分别进行10次平行检测，测其OD₄₅₀值，计算变异系数CV值。CV(％)＝s/x×100％。 

(2)批间试验：在3个不同批次的板子上检测同一标准品，每次设8个重复孔，测其OD₄₅₀值，计算CV值。 

3.准确性检测 

取3份健康体检者血清，分别加入0.2ug/ml、0.5ug/ml和1.0ug/ml的标准品进行检测，计算检测值与理论值的一致性，即回收率。回收率＝检测值/理论值×100％。 

4.稳定性检测 

将包被好的板子分别放于4℃和37℃保存一周，检测同一样品，比较其OD₄₅₀值有无差别。 

结果：标准曲线如图15所示，在8.0～200ng/ml范围内曲线线性良好，r²大于0.99。本法的最低检测浓度约为2.0ng/ml。重复性、准确性及稳定性检测结果中，批内变异系数分别为8.37％，8.97％，8.60％，均小于10％；批间变异系数分别为10.47％，11.25％，14.57％，均小于15％；回收率分别为78.56％，85.23％和107.35％；同一样品，在4℃和37℃保存一周后，检测其OD₄₅₀值差别不大，说明其重复性、准确性及稳定性均较好，符合检测试剂盒要求。 

实施例11ELISA检测试剂盒的初步应用 

采用所建立的ELISA对200例健康体检者、200例肺癌患者、127例鼻咽癌患者和70例结直肠癌患者血清样本进行了检测。对计量资料 进行统计分析。结果如表2所示，显示健康体检者和肺癌患者、鼻咽癌患者及结直肠癌患者血清APE1含量分别为9.00(2.98，15.39)ng/ml，16.90(9.89，26.39)ng/ml，19.57(4.66，70.58)ng/ml和14.27(0.00，34.02)ng/ml，肺癌、鼻咽癌和结直肠癌患者血清hAPE1含量均明显高于健康体检者，差异有统计学意义，P＜0.05。 

表2健康体检者及不同肿瘤患者血清APE1蛋白含量的比较 

分组	中位数	P25	P75	Mann-Whitney U检验	P值
						健康体检者	9.00	2.98	15.39
肺癌	16.90	9.89	26.39	12056.5	0.000a
						鼻咽癌	19.57	4.66	70.58	8244.0	0.000b
结直肠癌	14.27	0.00	34.02	5589.0	0.012c

a：肺癌患者与健康体检者比较； 

b：鼻咽癌患者与健康体检者比较； 

c：结直肠癌患者与健康体检者比较。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 

SEQUENCE LISTING 

<110>中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 

<120>抗hAPE1蛋白的抗体及其制备方法与应用该抗体的试剂盒 

<130>MP090257 

<160>10 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>15 

<212>PRT 

<213>hAPE1蛋白76-90位 

<400>1 

Ile Lys Lys Lys Gly Leu Asp Trp Val Lys Glu Glu Ala Pro Asp 

1                  5                       10                     15 

<210>2 

<211>15 

<212>PRT 

<213>hAPE1蛋白109-123位 

<400>2 

Gln Glu Leu Pro Gly Leu Ser His Gln Tyr Trp SerAla Pro Ser 

1                  5                       10                     15 

<210>3 

<211>26 

<212>DNA 

<213>hAPE1基因的上游引物 

<400>3 

catgccatgg ctccgaagcg tgggaa                                26 

<210>4 

<211>57 

<212>DNA 

<213>hAPE1基因的下游引物 

<400>4 

gcggatcctc aatgatgatg atgatgatga tgatgatgat gcagtgctag gtatagg    57 

<210>5 

<211>328 

<212>PRT 

<213>hAPE1融合蛋白 

<400>5 

Met Pro Lys Arg Gly Lys Lys Gly Ala Val Ala Glu Asp Gly Asp Glu 

1                 5                       10                     15 

Leu Arg Thr Glu Pro Glu Ala Lys Lys Ser Lys Thr Ala Ala Lys Lys 

             20                      25                      30 

Asn Asp Lys Glu Ala Ala Gly Glu Gly Pro Ala Leu Tyr Glu Asp Pro 

         35                     40                      45 

Pro Asp Gln Lys Thr Ser Pro Ser Gly Lys Pro Ala Thr Leu Lys Ile 

     50                      55                     60 

Cys Ser Trp Asn Val Asp Gly Leu Arg Ala Trp Ile Lys Lys Lys Gly 

65                   70                      75                  80 

Leu Asp Trp Val Lys Glu Glu Ala Pro Asp Ile Leu Cys Leu Gln Glu 

           85                      90                      95 

Thr Lys Cys Ser Glu Asn Lys Leu Pro Ala Glu Leu Gln Glu Leu Pro 

              100                    105                    110 

Gly Leu Ser His Gln Tyr Trp Ser Ala Pro Ser Asp Lys Glu Gly Tyr 

         115                     120                     125 

Ser Gly Val Gly Leu Leu Ser Arg Gln Cys Pro Leu Lys Val Ser Tyr 

    130                     135                    140 

Gly Ile Gly Asp Glu Glu His Asp Gln Glu Gly Arg Val Ile Val Ala 

145                 150                    155                   160 

Glu Phe Asp Ser Phe Val Leu Val Thr Ala Tyr Val Pro Asn Ala Gly 

                  165                     170                   175 

Arg Gly Leu Val Arg Leu Glu Tyr Arg Gln Arg Trp Asp Glu Ala Phe 

             180                     185                    190 

Arg Lys Phe Leu Lys Gly Leu Ala Ser Arg Lys Pro Leu Val Leu Cys 

         195                    200                     205 

Gly Asp Leu Asn Val Ala His Glu Glu Ile Asp Leu Arg Asn Pro Lys 

    210                     215                     220 

Gly Asn Lys Lys Asn Ala Gly Phe Thr Pro Gln Glu Arg Gln Gly Phe 

225                 230                   235                     240 

Gly Glu Leu Leu Gln Ala Val Pro Leu Ala Asp Ser Phe Arg His Leu 

                 245                     250                     255 

Tyr Pro Asn Thr Pro Tyr Ala Tyr Thr Phe Trp Thr Tyr Met Met Asn 

              260                     265                    270 

Ala Arg Ser Lys Asn Val Gly Trp Arg Leu Asp Tyr Phe Leu Leu Ser 

         275                     280                    285 

His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Cys Asp Ser Lys Ile Arg Ser Lys Ala 

    290                     295                     300 

Leu Gly Ser Asp His Cys Pro Ile Thr Leu Tyr Leu Ala Leu His His 

305                 310                     315                   320 

His His His His His His His His 

                    325 

<210>6 

<211>26 

<212>DNA 

<213>NF-κB探针P1 

<400>6 

agcttagagg    ggactttccg    agagga 

26 

<210>7 

<211>26 

<212>DNA 

<213>NF-κB探针P2 

<400>7 

tcctctcgga    aagtcccctc    taagct 

26 

<210>8 

<211>42 

<212>DNA 

<213>AP位点正义链22-U 

<400>8 

ccgctgaatt    gcaccctcga    uctaggtcga    tgatcctaag    ca 

42 

<210>9 

<211>42 

<212>DNA 

<213>AP位点反义链22-C 

<400>9 

Tgcttaggat    catcgaccta    ggtcgagggt     gcaattcagc    gg 

42 

<210>10 

<211>186 

<212>PRT 

<213>Eppin-His蛋白 

<400>10 

Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly 

1                  5                       10                    15 

Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe 

              20                     25                      30 

Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp 

         35                      40                    45 

Lys Ala Met Ala Asp Ile Met Gly Ser Ser Gly Leu Leu Ser Leu Leu 

     50                     55                      60 

Val Leu Phe Val Leu Leu Ala Asn Val Gln Gly Pro Gly Leu Thr Asp 

65                   70                     75                   80 

Trp Leu Phe Pro Arg Arg Cys Pro Lys Ile Arg Glu Glu Cys Glu Phe 

                  85                      90                    95 

Gln Glu Arg Asp Val Cys Thr Lys Asp Arg Gln Cys Gln Asp Asn Lys 

             100                     105                    110 

Lys Cys Cys Val Phe Ser Cys Gly Lys Lys Cys Leu Asp Leu Lys Gln 

         115                    120                    125 

Asp Val Cys Glu Met Pro Lys Glu Thr Gly Pro Cys Leu Ala Tyr Phe 

    130                     135                   140 

Leu His Trp Trp Tyr Asp Lys Lys Asp Asn Thr Cys Ser Met Phe Val 

145                 150                    155                    160 

Tyr Gly Gly Cys Gln Gly Asn Asn Asn Asn Phe Gln Ser Lys Ala Asn 

                  165                   170                      175 

Cys Leu Asn Thr Cys Lys Asn Lys Arg Phe 

             180                    185 

Claims (5)

1.一种抗体，其特征在于，由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC：C200852的杂交瘤细胞株产生。

2.一种杂交瘤，其特征在于，所述杂交瘤保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C200852。

3.一种诊断组合物，其特征在于，包括权利要求1所述抗体，和可任选的免疫诊断方法中常规使用的合适试剂。

4.一种包含权利要求1所述抗体的ELISA试剂盒。

5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的hAPE1融合蛋白。

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