CN101709088A - 抗Cyr61蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，由杂交瘤细胞株CGMCC 3298或CGMCC 3351制得，能与Cyr61蛋白N端SEQ ID No 1特异结合。该抗Cyr61蛋白单克隆抗体可用于抑制细胞增殖、粘附和迁延，还可用于Cyr61蛋白的体外检测。

Description

抗Cyr61蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体，尤其涉及一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，该抗体能与Cyr61蛋白结合，具有抑制类风关滑膜细胞和恶性肿瘤细胞增殖、粘附和迁延的作用，还可用于Cyr61蛋白的体外检测。

背景技术

人Cyr61蛋白(hCyr61)由381个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸和脯氨酸残基，相对分子质量为42kDa。目前已知，Cyr61广泛表达于多种正常组织细胞，包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、膀胱及血管平滑肌细胞、间质细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等。此外，Cyr61还在某些肿瘤细胞中高表达，目前已知的有乳腺癌细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞、胃癌细胞、黑色素瘤细胞等，是重要的细胞基质调节因子，广泛参与调控细胞增殖、粘附、迁移、分化、凋亡等多种功能。

由于Cyr61蛋白富含半胱氨酸，在表达时容易形成二硫健而导致出现多种构象，而且，Cyr61作为重要的基质蛋白，保守性很强，在哺乳动物之间的同源性很高，尤其是与小鼠的Cyr61同源性高达93％，因此，制备单抗的技术难度较高。由于种种原因，到目前为止，世界上只有商业化的抗Cyr61的多克隆抗体(Santa Crus，USA)，而没有单克隆抗体。

本实验室曾经制备了2株抗Cyr61单抗，分别为杂交瘤CGMCC NO.2766和CGMCCNO.2767(已经申请专利)。为了深入研究Cyr61的功能及进行后续的临床应用，本发明报道了新制备和筛选出的单抗4株：这4株单抗均为IgG1κ型、分别结合不同的Cyr61蛋白的不同区片断、生物学功能也不同。因此，本发明中的4株单抗可用于下列研发应用：如制备人源化抗体、构建用于检测人样本中Cry61表达量的试剂盒等，有巨大的潜在商业价值。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，该抗体能与Cyr61蛋白结合。

本发明的另一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体在抑制细胞增殖、粘附和迁延中的应用。

本发明的又一个目的在于提供一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体在Cyr61蛋白体外检测中应用。

本发明所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其能与Cyr61蛋白N端126-267序列(SEQ ID No 1)专一性结合。

根据引物设计原则及GeneBank(NM_001554)中公布的人Cyr61全长eDNA序列2295bp，利用引物设计软件Primer5.0进行设计，去除信号肽部分，两端各加相应的限制性酶切位点构建人Cyr61蛋白(hCyr61(26-381))(SEQ ID No 2)表达载体和人Cyr61蛋白N端126-267序列(hCyr61(126-267))表达载体并于工程菌中表达。

杂交瘤技术为本领域技术人员制备单克隆抗体所熟知，将具有分泌抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤，使得融合细胞具有两种亲本细胞的特性，即成为能够分泌抗体并能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过克隆化后成为单个细胞克隆，分泌的抗体即为单克隆抗体。该技术一般包括三个步骤：(一)细胞融合和筛选；(二)培养基培养和筛选，以及(三)细胞克隆和培养。

本发明使用常用的杂交瘤技术制备抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，包括按照常规免疫方法(如：腹腔、皮下和静脉)，在皮内注射蛋白抗原(如：人Cyr61蛋白)免疫哺乳动物，将免疫动物的脾细胞与同种系来源的骨髓瘤细胞融合。本发明中，纯化的重组人Cyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠(常规方法)。于免疫结束后取小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP20/Ag-14在聚乙二醇(PEG)作用下进行融合，通过ELISA筛选稳定分泌抗hCyr61的单克隆杂交瘤细胞株，ELISA方法鉴定单克隆抗体的亚类和亚型，并比较阳性克隆培养上清抗体的效价。利用纯化的人Cyr61N端融合蛋白片段(hCyr61(126-267))包被固相，通过ELISA方法初步分析筛选出单克隆抗体的结合表位所在区域。选择重链亚型为IgG1的杂交瘤细胞株，通过无血清培养及亲和层析获取少量纯化抗体，从中再选择效价较高的杂交瘤细胞注入BALB/c小鼠腹腔，制备大量高效价的单克隆抗体，用Protein A-Sepharose柱纯化腹水单克隆抗体并定量。最后，通过Western Blotting进一步明确纯化单克隆抗体的特异性及其抗原结合表位分布区域。

本发明选择杂交瘤细胞株CGMCC 3298和CGMCC 3351制备抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，所制得的抗体为IgG1亚型κ亚类。这些抗体具有抑制类风关滑膜细胞增殖、抑制类风关滑膜细胞粘附、抑制人乳腺癌细胞增殖、粘附、迁移和侵袭。

本发明抗Cyr61蛋白的单克隆抗体能与Cyr61蛋白体外检测中应用，如：ELISA方法体外检测Cyr61蛋白

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明通过常用的杂交瘤技术筛选出2株Cyr61蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。经测定，这些抗Cyr61蛋白的单克隆抗体属于IgG1，且其轻链为κ型。

经实验验证，抗Cyr61蛋白的单克隆抗体具有抑制细胞增殖、粘附和迁延的作用。

附图说明

图1为表达人全长Cyr61的表达质粒pET28(a)-hCyr61构建示意图；

图2A为pET28a-hCyr61重组质粒酶切鉴定；

图2B为pET28a-hCyr61重组质粒测序结果；其中A表示T7promoter引物测序结果，B表示T7terminator引物测序结果；图上箭头标识hCyr61上、下游引物所在位置；

图3A为His-hCyr6融合蛋白的表达鉴定；其中M表示低分子量蛋白Marker；图3A左图1、3、5和7表示4个不同克隆诱导前；2、4、6和8表示4个不同克隆诱导后；图3A右图Pre表示诱导前；IN表示诱导后；CL表示裂解上清；Pellet表示包涵体沉淀，箭头所示为表达蛋白；

图3B为His-hCyr61融合蛋白序列测定；其中方框部分为去除的信号肽序列，下划线部分为pET28a(+)载体上带有组氨酸等序列；

图4A为His-hCyr61融合蛋白的割胶电洗脱纯化与鉴定结果；其中M表示低分子量蛋白Marker，Pre表示诱导前；IN表示诱导后，Pellet表示包涵体裂解液，Elu表示过层析柱后的洗脱蛋白，Ele表示割胶电洗脱的纯化蛋白；

图4B为Western Blotting鉴定；其中M表示预染蛋白Marker，1表示pET28a-OVA66m菌体裂解液，2表示pET28a-hCyr61菌体裂解液，3表示割胶电洗脱纯化的His-hCyr61重组蛋白；

图5为表达载体pET28(a)-hCyr61-XN构建示意图；

图6为pET28a-hCyr61-XN重组质粒酶切鉴定结果：其中Mark表示DNA标志，1表示pET28a-hCyr61-XN质粒，2表示pET28a-hCyr61-XN酶切片断；

图7A为纯化蛋白SDS-PAGE电泳结果；图中M表示低分子量蛋白Marker，FL表示纯化的His-hCyr61全长的融合蛋白，XN表示纯化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；

图7B为及Western Blotting鉴定重组His-hCyr61N末端片段；图中M表示低分子量蛋白Marker，FL表示纯化的His-hCyr61全长的融合蛋白，XN表示纯化的近N末端的His-hCyr61-XN融合蛋白片段；

图8A为9株抗人Cyr61单克隆抗体特异性鉴定；其中His-Cyr61代表以His-Cyr61融合蛋白包被孔测定杂交瘤培养上清的OD492nm值，His-OVA66代表以His-OVA66m融合蛋白包被孔测定杂交瘤培养上清的OD492nm值；

图8B为ELISA分析单克隆抗体的亚类及亚型；PAb：免疫小鼠血清作为阳性对照测定其抗体的亚类及亚型；CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300、CGMCC 3351；

图8C为SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度与分子量；其中，M表示低分子量蛋白Marker；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号CGMCC 3298、CGMCC 3351、CGMCC 3299和CGMCC 3300相对应；

图9A为4株重链为IgG1型单克隆抗体的结合抗原位点的ELISA分析；其中，FL表示hCyr61_26-381全长蛋白包被孔的OD值，XN表示hCyr61_26-267包被孔的OD值，XC表示hCyr61_103-381包被孔的OD值；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图9B为免疫印迹分析小鼠抗hCyr61单克隆抗体的特异性及对Cyr61不同片段的结合；其中，FL表示hCyr61_26-381全长蛋白，XN表示hCyr61_26-267，XC表示hCyr61_103-381，hCyr61购自Peprotech公司的人Cyr61标准蛋白，OVA66m为人卵巢癌相关肿瘤抗原(作为阴性对照)；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图10A为间接免疫荧光法检测滑膜细胞表达Cyr61蛋白(×400)；鼠抗人Cyr61单抗：以单克隆抗体CGMCC 3298及CGMCC 3299为一抗检测FLS细胞中Cyr61蛋白；DAPI表示用DAPI染料显示细胞核，Merge表示Cyr61抗体测定的细胞图片与DAPI染核的图片的叠加；数字3298和3299分别与保藏号相对应；

图10B为抗Cyr61McAb与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(Cyr61高表达)结合，而不与MCF-7(Cyr61低表达)结合天然的Cyr61蛋白特异性的结合；其中，A表示real-timePCR分析显示人乳腺癌细胞株MDA-MB-231为Cyr61高表达，MCF-7为Cyr61低表达，B表示Western Blotting显示抗Cyr61 McAb能与细胞所表达的Cyr61特异的结合，C表示免疫荧光显示抗Cyr61单抗CGMCC 3351能与细胞所表达的Cyr61特异的结合；

图11为细胞免疫化学染色法检测人FLS及小鼠NIH3T3细胞表达Cyr61蛋白(×200)；

图12小鼠抗人Cyr61单克隆抗体对滑膜细胞增殖的抑制作用，*p＜0.05，**：p＜0.01；*p＜0.0001；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图13A为hCyr61促进滑膜细胞的粘附并成剂量依赖关系，*p＜0.05，**p＜0.001，***p＜0.0001；

图13B为不同株单克隆抗体或不同浓度的肝素与hCyr61包被板预孵育后，检测滑膜细胞的粘附能力的变化，与hCyr61包被孔相比具有显著差异；其中，R78E4为CGMCC 3298；R131E3为CGMCC 3299；R220E5为CGMCC3300；R367E10为CGMCC3351*p＜0.05，**p＜0.001，***p＜0.0001；

图14A为3H-TDR掺入法检测细胞增殖，*p＜0.05，**p＜0.001；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图14B为MTT法检测细胞增殖，计算抑制率％，*p＜0.05，**p＜0.001；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图15为抗体抑制MDA-MB-231细胞的粘附，*：P＜0.05；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图16为抗体抑制MDA-MB-231细胞的迁移，**：P＜0.01；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

图17为抗体抑制MDA-MB-231细胞的迁移作用，**：P＜0.01；数字3298、3351、3299和3300分别与保藏号相对应；

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。

实施例1构建表达人Cyr61全长(26-381)蛋白质粒与蛋白表达

根据引物设计原则及GeneBank(NM_001554)中公布的人Cyr61全长cDNA序列2295bp，利用引物设计软件Primer 5.0进行设计，去除信号肽部分，两端各加相应的限制性酶切位点。

Cyr61全长(26-381)蛋白的引物：

上游引物：5’-TTGGATCCTGCCCCGCTGCCTGCCACT-3’

(划线处为BamH I酶切位点)；

下游引物：5’TTAAGCTTCTAGTCCCTAAATTTGTGAATGTCATT-3’

(划线处为Hind III酶切位点)。

工程菌：BL21(DE3)、表达载体：pET28(a)。

将质粒pET28(a)分别用限制性内切酶BamH I和Hind III共消化，根据常规连接方法将所扩增出的人全长Cyr61(hCyr61-FL)连接入pET28(a)载体，构建质粒pET28(a)-hCyr61(见图1)

采用酶切和测序方法对其进行鉴定，结果表明所构建重组质粒完全正确，与GenBank上所报道的序列NM_001554完全一致(见图2A，酶切鉴定用箭头标出；图2B，测序鉴定)。表明所扩增片断与pET28(a)连接正确，符合实验设计，可用于后续质粒扩增与目的蛋白的表达。

重组人Cyr61全长表达蛋白诱导表达：按照常规分子克隆方法进行。简述之：挑取单克隆菌落振摇过夜后接种于5ml新鲜LB液体培养基中，37℃250rpm振摇至OD600至0.6～0.8时，加入终浓度1mmol/L IPTG诱导3h；SDS-PAGE检测结果显示，诱导后的菌液蛋白在45KDa处有明显的条带，而未诱导的菌液蛋白无相应条带(见图3A左，箭头所示)。进一步收集表达菌经超声碎菌及高速离心后收集沉淀物并用含有8M尿素的变性裂解液(DSB)彻底溶解后，SDS-PAGE电泳显示在45KDa处有明显的条带表达(见图3A右，箭头所示)。而序列分析显示，去除信号肽部分的hCyr61蛋白的分子量约为38.9KDa，而融合蛋白带有的pET28a(+)载体组氨酸等序列，其分子量约为5.8KDa，故构建的His-hCyr61融合蛋白分子量约44.7KDa，与SDS-PAGE凝胶显示的目的蛋白分子量一致(见图3B)。

重组人Cyr61表达蛋白纯化与鉴定：采用上述方法，进行大量诱导。收集菌液沉淀，提取包涵体蛋白的裂解上清用protin-2000镍柱纯化，加入不同浓度咪唑洗脱纯化蛋白。为了进一步得到高纯度的蛋白，将含有目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE割胶纯化。可见纯化后获得单个条带，表明纯度很高(图4A，箭头所示)。进一步采用SDS-PAGE电泳，经半干转膜电泳将蛋白转移至PVDF膜上，用商品化兔抗人hCyr61抗体作为一抗进行WesternBlotting检测。结果显示，pET28a-hCyr61菌体裂解液及纯化后的目的蛋白在45kDa处均有结合条带，而阴性对照的pET28a-OVA66m菌体裂解液无条带显示，表明重组蛋白为目的蛋白(图4B)。

实施例2构建表达人Cyr61全长(26-267)蛋白质粒与蛋白表达

Cyr61蛋白N端片段的引物(Cyr61-XN-26-267aa)

上游引物：5’-TTGGATCCTGCCCCGCTGCCTGCCACT-3’

(划线处为BamH I酶切位点)；

下游引物：5’-TTAAGCTTCTAACAAATCCGGGTTTCTTTCACA-3’

(划线处为Hind III酶切位点)；

工程菌：BL21(DE3)，表达载体：pET28(a)。

将质粒pET28(a)分别用限制性内切酶BamH I和Hind III共消化，根据常规连接方法将所扩增出的人Cyr61N端片断(Cyr61-XN-26-267aa)插入pET28(a)载体中，获得相应重组表达质粒：pET28a-hCyr61-XN(见图5)。

His-Cyr61N末端片段重组质粒的鉴定：抽提类风湿性关节炎病人滑膜细胞的总RNA，通过RT-RCR方法获取cDNA，利用针对N末端及C末端的两对引物PCR扩增得到Cyr61-XNDNA片段，分别与经Bam HI和Hind III双酶切回收的pET28(a)载体进行连接反应。构建的重组质粒经转化扩增后，抽提阳性克隆质粒做酶切和测序鉴定，结果表明：Cyr61-XN基因为728bp(图6，箭头所示)，而与Gene Bank中序列比对，可见上述片断分别位于Cyr61基因序列的282-1009nt，而且酶切结果表明与pET28(a)连接正确，符合预期实验设计。

His-Cyr61N末端融合蛋白片段的表达纯化及鉴定：采用与人全长Cyr61蛋白表达和纯化的相同方法，诱导表达hCyr61-XN融合蛋白片段，并将纯化的hCyr61-XN融合蛋白片段进行蛋白印迹分析。结果表明：纯化后的hCyr61-XN融合蛋白片段在35kDa处，hCyr61-FL(人Cyr61全长蛋白)条带位于45kDa(图7A)；蛋白印迹分析表明该35kDa左右片段与hCyr61-FL(人Cyr61全长蛋白)相同，均能与市售抗Cyr61蛋白特异性结合(图7B)，符合预期实验目的。

上述结果表明获得了hCyr61_26-267并诱导这个蛋白片段的表达，通过层析柱洗脱获得纯度相对高的目的蛋白，用于后续单克隆抗体表位的初步筛选。

实施例3小鼠抗人Cyr61单克隆抗体的制备与结合部位分析

BABC/c小鼠：雌性，6～8周龄4只及8～10周龄以上50只，由中国科学院上海科学研究院动物中心提供。

小鼠骨髓瘤细胞SP20/Ag-14，为传代保存。

按照常规单抗制备方法制备，用作鉴定用Cyr61蛋白为商品化重组人Cyr61蛋白(PeproTech Inc.New Jersey，USA，Cat：120-25)。

按照常规免疫方法，用自制人His-hCyr61融合蛋白免疫BABL/c小鼠并取小鼠脾细胞，按照经典方法进行细胞融合。经连续5次亚克隆和ELISA筛选，其中9株杂交瘤细胞能稳定分泌特异性抗人Cyr61抗体(仅与纯化或者His-hCyr61反应，而不结合His，也不与His-OVA66m结合)(见图8A)。进一步鉴定其抗体的类型，其中5株亚型为IgM类κ型，另外4株亚型为IgG1类κ型(分别命名为CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300和CGMCC 3351(见图8B)。采用这4株单抗杂交瘤制备腹水(常规方法)，经Protein A-Sepharose亲和层析后，进行SDS-page电泳，结果表明这4株单抗的重链均位于52kD左右，而轻链位于27kD左右，再次验证这4株单克隆抗体的类型为IgG1类κ型(图8C)。

单克隆抗体的结合表位分析：

用原核表达纯化的His-hCyr61全长及其N末端hCyr61_26-267、C末端片段hCyr61_103-381包被ELISA板，分别测定4株IgG1类杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体与上述不同抗原的结合能力。进一步采用蛋白印迹法进行确定。结果表明：单克隆抗体CGMCC 3298和CGMCC 3351仅结合hCyr61全长和N末端，而对C末端无结合能力，提示这两株杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合表位位于hCyr61蛋白的N末端26～103aa之间，故其不与C末端103～267片段结合；单克隆抗体CGMCC 3299和CGMCC 3300对3种蛋白均有结合能力，提示这CGMCC 3299和CGMCC 3300的结合表位位于hCyr61蛋白N末端和C末端片段的重叠部位即103～267aa之间，故其和N末端hCyr61_26-267(XN)及C末端片段hCyr61_103-381(XC)均具有很强的结合能力，而与阴性对照OVA66蛋白无结合。ELISA检测结果见图9A，蛋白印迹结果见图9B。

4株抗体效价与亲和力测定：

分别采用商业化无血清培养基培养4株杂交瘤，收集上清，用Bethyl抗体定量法和ELISA法测定了抗体的浓度与效价。采用Biocore方法分析了这4株抗体的亲和力。结果见表1。

表14株IgG1杂交瘤细胞培养上清中抗人Cyr61抗体浓度、效价和亲和力

实施例4抗人Cyr61单克隆抗体功能

类风关滑膜细胞来自于关节置换手术的废弃滑膜(病人均经过知情同意与医院伦理委员会通过)。BALB/c小鼠成纤维细胞株NIH3T3、人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231，均为传代保存。细胞培养等方法见结果中简述。

与人细胞中Cyr61蛋白结合能力：

以纯化的4株小鼠抗人Cyr61单克隆抗体(CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300、CGMCC 3351)作为一抗，通过间接免疫荧光法测定制备的单克隆抗体与胞浆Cyr61的结合能力，结果证实该抗体能与类风湿性关节炎病人滑膜细胞胞浆的Cyr61蛋白结合，细胞核无荧光显示。图10A显示CGMCC 3298、CGMCC 3299的荧光检测结果。该结果进一步证实了制备单克隆抗体的特异性，同时也证实了RA病人滑膜细胞高表达Cyr61蛋白，与既往的Realtime PCR及Western Blotting测定结果相符。同样，4株单抗均能与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(Cyr61高表达)结合，而不与MCF-7(Cyr61低表达)结合。图10B显示CGMCC 3351与人乳腺癌细胞株MDA-MB-231(Cyr61高表达)结合，而不与MCF-7(Cyr61低表达)结合的荧光检测结果。

与小鼠3T3细胞胞内Cyr61蛋白结合能力：

由于人Cyr61蛋白与小鼠Cyr61同源性高达93％。由此，本发明中制备CGMCC 3298单克隆抗体作为一抗，通过间接法检测，同时测定人滑膜成纤维细胞和小鼠3T3细胞胞内Cyr61蛋白。如图11所示，两种细胞显色均呈阳性，而无关抗体作为一抗的细胞不显色，提示该抗体即可特异性结合人Cyr61蛋白又与小鼠的Cyr61蛋白具有交叉反应性。这一方面显示制备抗Cyr61单抗的难度，另一方面表明在后续的动物模型实验中，抗人Cyr61抗体阻断小鼠的肿瘤和关节炎发病具有可行性和理论依据。

对类风关滑膜细胞的作用：

(1)、抑制类风关滑膜细胞增殖：在正常血清培养的类风关滑膜细胞中，分别加入不同浓度的4株单克隆抗体(CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300及CGMCC 3351)，3H-TdR掺入方法检测这4株单抗对于其增殖的作用。结果表明：单克隆抗体CGMCC 3298和CGMCC 3351对于滑膜细胞增殖有抑制作用，而且呈典型的浓度依赖性。而CGMCC 3299及CGMCC 3300无此作用(见图12)。

(2)、抑制类风关滑膜细胞粘附：Cyr61作为一种基质蛋白，能促进多种细胞的粘附，并因此而参与肿瘤细胞的转移及损伤修复等病理生理过程。但是对于Cyr61促进滑膜细胞的粘附尚未见报道。本发明中测定了所制备4株单抗对于人类风关滑膜细胞粘附的作用。首先采用不同浓度的人Cyr61标准蛋白包板，通过粘附实验证实Cyr61能促进滑膜细胞的粘附并成剂量依赖关系(见图13A)。然后用所制备的4株小鼠抗人Cyr61蛋白与包被Cyr61蛋白预孵育，再加入类风关滑膜细胞检测其黏附作用的改变。结果显示，单克隆抗体CGMCC3299及CGMCC 3300具有明显抑制类风关滑膜细胞粘附的作用，并以CGMCC 3299的抑制效果更明显，而单克隆抗体CGMCC 3298及CGMCC 3351的抑制作用不显著(见图14B)。因为Cyr61是一种肝素结合蛋白，其促进细胞粘附的作用有赖于其肝素结合位点。因此，采用低分子量肝素与Cyr61蛋白预作用作为阳性对照，可见肝素显著抑制Cyr61促滑膜细胞的粘附作用，并成剂量依赖关系(见图13B)。

对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的作用：

(1)抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外增殖：

在正常血清培养的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞中，分别加入不同浓度的4株单克隆抗体(CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300及CGMCC 3351)，3H-TdR掺入法和MTT法检测这4株单抗对于其增殖的作用。结果表明：单克隆抗体CGMCC 3298和CGMCC 3351对于人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖有抑制作用，而且呈典型的浓度依赖性。而CGMCC 3299及CGMCC 3300无此作用(见图14)。

CGMCC 3298

CGMCC 3351

CGMCC 3299

CGMCC 3300

(2)、抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231粘附作用

将Cyr61蛋白以4ug/ml，100ul/well包板，4°过夜。经1％BSA封闭2h，PBS洗涤后加入1ug/孔的4株单克隆抗体(CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300及CGMCC 3351)，37°孵育1h后，加入5×10⁴的细胞/孔，37°孵育1h后结晶紫染色、2％SDS溶解结晶，OD550检测。结果显示抗体CGMCC 3299有抑制细胞粘附的作用，而其他3株(CGMCC 3298、CGMCC 3300及CGMCC 3351)无明显作用(见图15)。

(3)、抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231迁移

采用Transwell实验观察抗体对MDA-MB-231细胞迁移的影响。在Transwell下室里加入条件培养液(MDA-MB-231细胞培养液)0.8ml，同时分别加入4株单抗(CGMCC 3298、CGMCC 3299、CGMCC 3300及CGMCC 3351)和对照IgG1单抗(浓度为10ug/ml)；在培养上层加入2×10⁴/孔的MDA-MB-231细胞。于孵育4h后吸弃上层液体，4％多聚甲醛固定15min，棉签拭去膜上层细胞，结晶紫染色20分钟。镜下观察，拍照，计数。结果显示：4株单抗中，只有CGMCC 3351具有明显抑制MDA-MB-231细胞迁移的作用(见图16)。

(3)、抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231侵袭生长

在Transwell的上层小室里铺胶100ul、下室仍加入条件培养液(MDA-MB-231细胞培养液)0.8ml和4株单抗及对照IgG1单抗(浓度均为10ug/ml)。将MDA-MB-231细胞加入上层(5×10⁴/孔)，26h后吸弃上层液体，4％多聚甲醛固定15min，棉签拭去膜上层细胞，结晶紫染色20分钟。镜下观察，拍照，计数。结果显示：4株单抗中，只有CGMCC 3351具有明显抑制MDA-MB-231细胞迁移的作用(见图17)。

综上实验结果，本发明筛选得到的抗人Cyr61单克隆抗体生物学特性见表2

表24株抗人Cyr61单克隆抗体生物学特性

序列表

<110>上海免疫学研究所

<120>抗Cyr61蛋白的单克隆抗体及其应用

<130>LBJ.HF.9011

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>SEQ ID No 1

<211>142

<212>PRT

<213>Cyr61蛋白N端126-267序列

<400>1

Gly Ala Val Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly Cys Pro Asn

1               5                   10                  15                  20

Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp

        25                  30                  35                  40                  45

Pro Met Glu Asp Gln Asp Gly Leu Leu Gly Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu

                50                  55                  60                  65

Thr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Ser Ser Leu Lys Arg Leu Pro Val Phe Gly Met

        70                  75                  80                  85                  90

Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro Leu Gln Gly Gln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser

                95                  100                 105                 110

Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu

        115                 120                 125                 130                 135

Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys

                140

<210>SEQ ID No 2

<211>356

<212>PRT

<213>人Cyr61蛋白26-381序列

<400>2

Cys Pro Ala Ala Cys His Cys Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg

1               5                   10                  15                  20

Asp Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys Ser Lys Thr Gln Pro Cys

        25                  30                  35                  40                  45

Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe Gly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg

                50                  55                  60                  65

Ala Gln Ser Glu Gly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser Phe Gln Pro

        70                  75                  80                  85                  90

Asn Cys Lys His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu

                95                  100                 105                 110

Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly Cys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu Glu

        115                 120                 125                 130                 135

Trp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Pro Met Glu Asp Gln Asp Gly Leu Leu Gly Lys Glu

                140                 145                 150                 155

Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu Thr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Ser

        160                 165                 170                 175                 180

Ser Leu Lys Arg Leu Pro Val Phe Gly Met Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro Leu Gln Gly Gln

                185                 190                 195                 200

Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg

        205                 210                 215                 220                 225

Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys

                230                 235                 240                 245

Gly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro

        250                 255                 260                 265                 270

Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Leu Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys

                275                 280                 285                 290

Val Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe Arg Cys Glu Asp Gly

        295                 300                 305                 310                 315

Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser Cys Lys Cys Asn Tyr Asn Cys Pro His Ala

                320                 325                 330                 335

Asn Glu Ala Ala Phe Pro Phe Tyr Arg Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp

        340                 345                 350                 355

Claims (10)

1.一种抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体与Cyr61蛋白SEQID No 1特异结合。

2.根据权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株CGMCC 3298或CGMCC3351制得。

3.根据权利要求2所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于由杂交瘤细胞株CGMCC 3298制得的腹水型抗Cyr61蛋白的单克隆抗体的效价可达1×10⁸。

4.根据权利要求2所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于由杂交瘤细胞株CGMCC 3351制得的腹水型抗Cyr61蛋白的单克隆抗体的效价可达1×10⁷。

5.根据权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体为IgG1。

6.根据权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体轻链为κ型。

7.根据权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，在抑制类风关滑膜细胞以及恶性肿瘤细胞增殖、黏附和迁延中的应用。

8.根据权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，在Cyr61蛋白体外检测中应用

9.根据权利要求8所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体，在ELISA体外检测Cyr61蛋白中的应用。

10.一种Cyr61蛋白的ELISA检测方法，包括权利要求1所述的抗Cyr61蛋白的单克隆抗体。

Images