CN108752454A - 一种人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用，涉及抗体及其制备技术领域。所述抗体是通过SEQ ID NO：1所示的活性氨基酸序列为抗原肽免疫动物制备得到的。本发明提供的磷酸化抗体有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨CYR61蛋白的多种生物学功能；实际应用中便于研究人CYR61蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件或疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于检测用药后肿瘤相关蛋白表达的差异，为临床肿瘤疾病的诊断与治疗提供潜在的作用靶点。

Description

一种人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及抗体及其制备技术领域，特别涉及一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用。
背景技术
CCN家族由6个拥有相似功能区的蛋白组成，CYR61是该家族中第一个被发现的蛋白。该家族蛋白一直以来被认为是分泌蛋白，并作为细胞基质蛋白被深入研究。CCN家族蛋白在细胞内合成，并在信号肽的引导下分泌到细胞外，它们在肿瘤发生和发展中伴随着肿瘤内外环境的一系列改变，可在细胞内和细胞外起作用。该家族蛋白参与了细胞粘附、分裂、迁移、耐药、存活、分化、血管生成、纤维化、骨骼生成和创伤愈合等生理过程，其中的很多现象与肿瘤相关。CYR61(CCN1)、CTGF(CCN2)、CCN5基因敲除小鼠往往死于胚胎期或出生早期。
CYR61在肿瘤中所表现的生物学功能是多样的，并且在不同的肿瘤组织细胞中，CYR61的功能也不尽相同。CYR61mRNA高表达于恶性乳腺肿瘤细胞，还能促进胃腺癌细胞RF-1细胞恶化；同时CYR61在卵巢癌中高表达，并且和淋巴结转移正相关。然而CYR61在肺癌、平滑肌瘤中的表达水平却明显降低，作为肿瘤抑制因子发挥着重要作用。例如，在非小细胞肺癌中CYR61的表达低于癌旁正常肺组织，并与肺癌病理类型、淋巴结转移等因素相关。
目前研究表明：CYR61蛋白主要与肿瘤细胞的增殖和迁移、肿瘤细胞的生长调节和肿瘤血管形成有关，其作用机制可通过相关的信号通路来完成。在组织中CYR61过表达也可以促进其受体AVβ3的表达，形成“CYR61-ACβ3自分泌调节环路”，产生细胞的生长和抗凋亡信号。在乳腺癌中，HRG通过CYR61上调AVβ3的水平，CYR61与AVβ3结合激活ERK1/ERK2MAPK信号通路，抑制P53的聚集，产生抗紫杉醇耐药作用。在神经胶质瘤细胞中，CYR61通过整联蛋白偶联激酶(ILK)使糖原合成激酶-3β(GSK3-β)磷酸化，激活β-catenin/LEF通路，从而促进细胞增殖基因的表达，CYR61还可通过激活PI3K/AKT信号通路促使凋亡蛋白Bad活性降低，促进细胞生长和迁移。在肺癌中，CYR61作为肿瘤抑制因子发挥着重要作用。在体外实验中，CYR61导致G0/G1期的阻滞，可以抑制肺癌细胞的生长。
磷酸化、泛素化等翻译后修饰在细胞信号通路介导的生理和病理过程中发挥着关键作用。鉴于CYR61在肿瘤发生和发展过程中发挥的重要作用，因而进一步研究CYR61蛋白的翻译后修饰具有重要意义。我们前期研究发现，CYR61氨基酸序列中的Ser188位点是其蛋白磷酸化修饰的位点，在调控CYR61蛋白自身进行中可能具有重要的作用。抗体是蛋白质功能研究的重要工具，已被广泛用于肿瘤等疾病诊断、治疗等临床应用中，因而一种特异识别人CYR61的Ser188磷酸化位点的抗体有待于进一步的开发。
发明内容
为了解决CYR61蛋白磷酸化修饰有效研究的问题，为此，本发明的首要目的在于提供一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽。
本发明的另一目的在于提供一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体。
本发明的另一目的在于提供上述抗原肽和抗体的应用。
本发明的再一目的在于提供上述抗体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽，其活性氨基酸序列如SEQID NO：1所示，且其中的Ser氨基酸被磷酸化修饰。
一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体，其是通过上述特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽免疫动物制备得到的。
所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO：1所示的活性氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Ser上添加有磷酸化基团；
(2)利用步骤(1)合成的抗原肽的N末端与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)进行偶联，免疫动物并收集抗血清；
(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体。
上述步骤(1)中所述的抗原肽可以通过以下步骤合成：
制备人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽，以CYR61蛋白Ser188位点为中心，N端毗邻四个CYR61氨基酸序列，C端连接五个氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser188上添加磷酸化基团。
上述步骤(2)中所述的免疫动物的步骤可以包括：
用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。
上述步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤可以包括：
将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的合成肽(抗原肽)的效价及其是否能够特异性识别目的合成肽(抗原肽)，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Western Blot实验确定抗血清是否能够特异性识别Ser188位点磷酸化的CYR61蛋白。
上述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤可以包括：
采用合成肽偶联载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首先采用非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。
上述特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽和/或抗体在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。
本发明还提供一种用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂，其包括上述特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽和/或抗体。
本发明制备得到的高特异性的针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体可用Western blot实验可检测正常细胞、肿瘤细胞及用药后肿瘤细胞的表达差异，有助于研究CYR61蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用，为临床肿瘤疾病的诊断或治疗提供潜在的作用靶点，还可以用IHC、ELISA等免疫学相关实验以检测人CYR61蛋白的磷酸化水平，探讨其与肿瘤、血液系统、心血管系统等疾病的关系，在疾病诊断、治疗及预后判定等方面具有广泛的临床应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的磷酸化抗体在实际应用中能够检测人CYR61蛋白的翻译后磷酸化修饰情况；
(2)本发明提供的磷酸化抗体实际应用中便于研究人CYR61蛋白特定位点磷酸化修饰在特定生物学事件如肿瘤细胞化疗耐药、DNA损失、细胞周期等的相关性；
(3)本发明是针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化作用的激酶，探讨CYR61蛋白的多种生物学功能；
(4)本发明提供的磷酸化抗体有助于探讨人CYR61蛋白的磷酸化修饰在肿瘤疾病发生发展过程中的作用机制，亦可用于检测用药后肿瘤相关蛋白表达的差异，为临床肿瘤疾病的诊断与治疗提供潜在的作用靶点。
附图说明
图1是人CYR61蛋白结构分区图。
图2是根据本发明实施例的的制备与纯化高特异性的人CYR61磷酸化抗体技术路线图。
图3是人CYR61蛋白Ser188位点在PhosohoSitePlus数据库查询结果。
图4是人CYR61蛋白Ser188位点附近氨基酸抗原性分析示意图。
图5是免疫前血清筛选Western blot结果图，其中，1：BSA标准蛋白(5μg)；2：Ser188-BSA非磷酸化合成肽(5μg)；3：pSer188-BSA磷酸化合成肽(5μg)；一抗：阴性血清1:5000稀释液。
图6是Western blot检测纯化前后的血清对Ser188位点磷酸化合成肽的特异性情况；其中，图A中，1：BSA标准蛋白(5μg)；2：Ser188-BSA合成肽(5μg)；3：pSer188-BSA合成肽(5μg)；一抗：188位点抗血清纯化前1:5000稀释液。图B中，1：BSA标准品(5μg)；2：Ser188-BSA合成肽(5μg)；3：pSer188-BSA合成肽(5μg)；一抗：188位点抗血清纯化后1:500稀释液。
图7是纯化后的Ser188位点磷酸化抗体(命名为：p-CYR61-S188抗体)对磷酸化抗原和非磷酸化抗原的ELISA检测数据图。
图8是细胞水平验证p-CYR61-S188抗体的特异性。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
人CYR61蛋白结构分区图，如图1所示。
参见图2，本发明实施例提供的针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体的制备方法与应用，总体上包括以下步骤：
步骤一：首先通过生物信息软件筛选人CYR61氨基酸序列中可能发生磷酸化的位点，并通过质谱和数据库确定了人CYR61蛋白的Ser188位点(图3)，分析该位点的抗原性(图4)，设计相应的抗原肽，并分析其同源性；
步骤二：合成含Ser188磷酸化位点的抗原肽。采用多肽合成技术分别合成步骤一所设计含Ser188磷酸化位点的10个氨基酸抗原肽，其中氨基酸Ser188添加磷酸化基团，并与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联，作为免疫原制备磷酸化抗体；与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化的填料进行亲和纯化，与之相对应，分别合成非磷酸化修饰合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离的填料，所有合成肽都经HPLC的纯化；
步骤三：全抗原免疫动物及收集抗血清。分别将步骤二中Ser188位点磷酸化合成肽(抗原肽)-KLH偶联全抗原与佐剂联合免疫SPF级新西兰大白兔，采用经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下(s.c)注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉(i.m)注射，腰部两侧进行皮内(i.d)注射，家兔爪垫部位注射等多部位多点注射抗原乳状液。免疫次数包括1次引发注射、3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射，以ELISA测定抗血清针对目的合成肽的效价；
步骤四：纯化并鉴定人CYR61蛋白Ser188位点特异性磷酸化抗体。采用合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离-亲和纯化循环纯化技术。首先分别使用Ser188位点对应的非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；第二次使用磷酸化合成肽(抗原肽)偶联牛血清白蛋白(BSA)与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体，以Western blot实验确定抗血清特异性识别磷酸化合成肽(抗原肽)；最终分别获得纯化的抗p-Ser188磷酸化抗体，命名为p-CYR61-S188抗体；以2.5％(wt/vol)BSA，0.01％(vol/vol)Tween-20和25％(vol/vol)甘油的混合液保存，再次以ELISA检测纯化后抗体效价以及针对磷酸化目的合成肽(抗原肽)、非磷酸化合成肽的识别性，最后以Western blot实验进行抗体鉴定。
以下结合具体实施例参照附图，对本发明提供的针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体的制备技术路线，进一步进行阐述和说明。
实施例1确定人CYR61蛋白磷酸化位点
1.1首先通过生物信息软件NetPhorest 2.0和NetPhos 2.0筛选人CYR61蛋白中可能发生磷酸化的位点，随后通过质谱文献查阅和蛋白质磷酸化位点数据库PhosohoSitePlus(图3)的查找，确证Ser188是人CYR61氨基酸序列中的一个磷酸化位点；同时利用软件CLC Protein Workbench 5计算人CYR61氨基酸序列的抗原性(图4)，最终确定人CYR61蛋白特异性磷酸化位点Ser188。
1.2设计人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽。以人CYR61蛋白Ser188位点为中心，N端毗邻四个CYR61氨基酸序列，C端连接五个氨基酸序列，设计的合成肽(抗原肽)序列，在氨基酸Ser188上添加磷酸化基团，肽段序列为：GFDAS(p)EVELT。
实施例2合成包括Ser188磷酸化位点的合成肽(抗原肽)
根据半抗原合成肽的设计，分别在Ser188位点上添加一个磷酸化基团得到磷酸化合成肽(抗原肽)，并与血蓝蛋白(KLH)偶联得到全抗原用于家兔免疫(pSer188-KLH)。此外将磷酸化合成肽(抗原肽)通过戊二醛法与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和纯化层析柱的填料(pSer188-BSA)。与之相对应，合成一段Ser188对应的非磷酸化合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联用作亲和分离层析柱的填料(Ser188-BSA)。
实施例3所述全抗原按常规制备多克隆抗体的方法制备抗血清
3.1制备阴性血清：从用于注射的新西兰大白兔(2～3kg，雌性，健壮，购于中科院斯莱克实验动物中心)的耳静脉采取3mL血液于采血管中，用棉球压迫止血。将血液置室温1h左右，待血液凝固形成血块，4℃下放置2h使血清析出，2500g离心10min，吸取上清，标记为阴性对照血清，分装并贮存于-20℃待测。
3.2免疫前筛选-Western blot：分别取BSA标准品、Ser188-BSA、pSer188-BSA各5μg，加入适当的5×SDS上样缓冲液，沸水浴煮沸10min使蛋白质变性，10000×g离心1min；SDS-PAGE电泳分离胶为8％，浓缩胶为5％；按预定顺序使用加样枪上样，在不用的样品孔中加等体积的1×SDS凝胶上样缓冲液；80V20min电泳后改为120V约50min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。转膜条件：恒流300mA，时间为120min。5％脱脂奶粉封闭，摇床37℃1h。将转印膜放入用一抗稀释缓冲液按1:5000配制免疫前抗血清稀释液，水平缓慢摇匀，4℃过夜。次日使用1×PBST洗膜10min，重复4次。将膜置于用1×PBST按1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG的二抗稀释液中，摇床37℃，60min。弃二抗溶液，1×PBST洗膜10min，重复3次。按照厂家说明使用ECL试剂盒显影，拍照记录。结果如图5：未出现目的条带，即未出现针对目的组织或细胞提取物的抗体，为理想实验动物。
3.3动物免疫：约73天
3.3.1用无菌的1×PBS分别溶解pSer188-KLH合成肽粉末，用一个无菌注射器吸取抗原溶液，另一个注射器吸取等量弗氏完全佐剂(CFA)，二者之间以塑料管连接，来回反复抽吸，将pSer188-KLH肽段分别与CFA混匀，直至形成完全乳化的乳状液，滴于水中不扩散。
3.3.2首次免疫分别经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下(s.c)注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉(i.m)注射，腰部两侧进行皮内(i.d)注射，家兔爪垫部位注射等多部位多点注射抗原乳状液。两种抗原的首次免疫总量约为0.61mg。
3.3.3首次免疫20天后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.9mg。
3.3.4免疫12天后进行加第二次强免疫，用弗氏不完全佐剂(IFA)代替CFA作为免疫佐剂制备抗原乳状液并按首次免疫方式进行注射，此次加强免疫的抗原总量均约为0.9mg。
3.3.5最后一次加强免疫3天后，家兔进行腹主动脉大采血，大量收集血清。将收集了血液的烧杯封闭后室温静置过夜，使血块收缩。次日无菌操作将析出的血清分装于50mL离心管中，4000g离心10min，取上清，分装1mL/管，标记为免疫后抗血清(共约51mL)，贮存于-20℃。
3.3.6免疫后抗血清的效价测定，具体步骤如下：
3.3.6.1用抗原包被液(CBS)分别将磷酸化抗原pSer188-BSA和非磷酸化抗原Ser188-BSA包被，加入至96孔酶标板中，每孔0.1mL，封盖滴定板后振荡混匀，4℃过夜包被(12h以上)。
3.3.6.2包被完毕，弃去孔中的液体，1×PBST充分洗涤滴定板的各包被孔，弃去洗涤液，重复3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。各包被孔内加入封闭缓冲液(0.25％BSA/PBST)，200μL/孔，37℃孵育2h，1×PBST洗涤滴定板3次，每次洗涤后在滤纸上扣干残留液体。
3.3.6.3用1×PBST将免疫后抗血清按1:1000、1:3000、1:9000、1:27000、1:81000、1:243000、1:729000的比例稀释，以1×PBS缓冲液作为空白对照，分别加入至96孔酶标板，盖封滴定板，37℃孵育1h。
3.3.6.4弃去孔中液体，用1×PBST洗涤滴定板3次。加入用1×PBST按1:5000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗稀释液，100μL/孔，37℃孵育1h。盖封滴定板，37℃孵育1h。用1×PBST洗涤滴定板5次，扣干。加入临时配制的TMB显色液，100μL/孔，室温避光反应30min。加入2M H2SO4终止反应，50μL/孔。酶标仪450nm测各孔OD值。
3.3.6.5免疫Ser188抗原后抗血清稀释度为1:1000、1:3000、1:9000、1:27000的免疫后抗血清的ELISA检测值均在0.5以上(见下表1)；
表1免疫Ser188抗原后抗血清ELISA检测的OD值
原血清稀释度 Ser188-BSA pSer188-BSA
1:1000 2.453 2.462
1:3000 2.224 2.264
1:9000 0.956 1.939
1:27000 0.519 0.819
1:81000 0.134 0.191
1:243,000 0.028 0.057
1:729000 0.012 0.023
BLANK 0.003 0.013
实施例4纯化并鉴定人CYR61蛋白Ser188特异性磷酸化位点
4.1磷酸化合成肽层析柱与非磷酸化合成肽层析柱的制备。
合成肽偶联层析柱是使用Thermo scientificCoupling Resin试剂盒制备，具体步骤如下：
4.1.1用偶联缓冲液分别溶解Ser188-BSA、pSer188-BSA，溶解浓度均为0.7mg/ml。分别取7mg Ser188-BSA、6mg pSer188-BSA溶解液加入至5mL树脂，混匀后分别加入至层析柱室温混匀15分钟，将层析柱室温正置30分钟，分别取下层析柱上下两端的帽子，收集流出的液体，并用3倍体积树脂的偶联缓冲液冲洗柱子。
4.1.2盖上层析柱底端盖子，向偶联缓冲液中加入50mM L-Cysteine·HCl，混匀后取等体积的缓冲液于层析柱，室温混匀15分钟后，静置30分钟。
4.1.3取下底端盖子，释放偶联缓冲液，用6倍体积的洗涕液(1M NaCl)清洗层析柱，再用2倍体积储存缓冲液冲洗层析柱，盖上盖子，加入1倍体积的储存缓冲液，4度保存备用。
4.2磷酸化抗体的纯化
抗体纯化是使用Thermo scientificCoupling Resin试剂盒制备，具体步骤如下：
4.2.1取下层析柱底端盖子，释放储存缓冲液，加入6mL的结合缓冲液洗涕层析柱。将Ser188抗血清加入至对应的非磷酸化层析柱子，收集流出液，重复两次，得到Ser188流出液，然后用12mL洗涕液清洗层析柱，保留底端留出的洗脱液，最后用洗脱液洗脱层析柱得到对应的非磷酸化抗体。
4.2.2将4.2.1中收集的流出液加入至对应的冲洗后的磷酸化柱子，之后用12mL洗涕液清洗层析柱，最后用洗脱液洗脱层析柱得到对应的Ser188磷酸化抗体，抗体溶于1×PBS，加入0.1％NaN3备用。
Western blot检测纯化前后的血清对Ser188位点磷酸化合成肽的特异性情况，如图6所示；其中，图A中，1：BSA标准蛋白(5μg)；2：Ser188-BSA合成肽(5μg)；3：pSer188-BSA合成肽(5μg)；一抗：188位点抗血清纯化前1:5000稀释液。图B中，1：BSA标准品(5μg)；2：Ser188-BSA合成肽(5μg)；3：pSer188-BSA合成肽(5μg)；一抗：188位点抗血清纯化后1:500稀释液。结果表明纯化后的Ser188位点抗血清能特异识别磷酸化的Ser188肽段，而不识别非磷酸化的Ser188肽段。
4.3再次以ELISA检测纯化后磷酸化抗体的效价及针对磷酸化目的合成肽(抗原肽)、非磷酸化合成肽的识别性。首先分别包被人工合成的磷酸化合成肽抗原-BSA和非磷酸化合成肽抗原-BSA，加入不同比例稀释的纯化前血清以及纯化后抗血清孵育，洗涤后加入HRP标记羊抗兔IgG稀释液，孵育后洗涤，TMB显色，反应终止测定OD450。结果如图7所示：Ser188磷酸化抗体稀释度为1:9000时，针对磷酸化抗原的OD450值大于3，针对非磷酸化抗原的OD450值低于0.25且P/N值大于3，则纯化后Ser188磷酸化抗体效价至少为1:9000以上。
实施例5人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体在肿瘤中的应用
5.1本发明制备得到高特异性的人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体可用Westernblot实验检测细胞磷酸化水平差异，如图8所示，在293T细胞(市售)转染Flag-CYR61-WT(将人的CYR61基因的蛋白编码序列克隆至过表达载体pcDNA3.1(+)Vector[invitrogen]，得到重组载体Flag-CYR61-WT)、Flag-CYR61-S188A质粒(将Flag-CYR61-WT质粒的188Ser突变为丙氨酸所得到的质粒)，24h后提取细胞蛋白，在免疫沉淀Flag产物中，Ser188位点磷酸化抗体(命名为：p-CYR61-S188)能识别Ser188位点处于磷酸状态的CYR61蛋白，而不能识别Ser188位点非磷酸化状态的CYR61蛋白，证明该磷酸化抗体特异性良好。
5.2本发明提供的磷酸化抗体在实际应用中能够应用于WB(Western blot)、ELISA等免疫学实验中检测人CYR61蛋白的转录后磷酸化修饰情况，从而探讨人CYR61蛋白磷酸化修饰在肿瘤相关疾病中的意义。
5.3人CYR61蛋白的降解依赖于磷酸化修饰，其半衰期的延长可使细胞持续增殖分化，因此磷酸化抗体在实际应用中便于研究人CYR61蛋白Ser188位磷酸化修饰对于特定生物学事件如细胞增殖、细胞分化的影响，从而探讨其在肿瘤等疾病发生发展过程中的作用。
5.4本发明是针对人CYR61蛋白特定Ser188位点制备的磷酸化多克隆抗体，有助于研究介导其发生磷酸化的激酶作用，探讨人CYR61蛋白潜在的细胞信号通路，从而发现临床肿瘤疾病的诊断和治疗的潜在作用靶点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学孙逸仙纪念医院
<120> 一种人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原、抗体及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽
<220>
<221> NP_BIND
<222> (5)..(5)
<223> 磷酸化修饰
<400> 1
Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu Thr
1 5 10

Claims (9)

1.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽，其特征在于：其活性氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，且其中的Ser氨基酸被磷酸化修饰。
2.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体，其特征在于：其是通过权利要求1所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽免疫动物制备得到的。
3.一种特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)合成SEQ ID NO：1所示的活性氨基酸序列的抗原肽，氨基酸Ser上添加有磷酸化基团；
(2)利用步骤(1)合成的抗原肽的N末端与载体蛋白血蓝蛋白进行偶联，免疫动物并收集抗血清；
(3)将步骤(2)收集的抗血清进行纯化和鉴定，得到特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的抗原肽通过以下步骤合成：
制备人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽，以CYR61蛋白Ser188位点为中心，N端毗邻四个CYR61氨基酸序列，C端连接五个氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示的合成肽，并采用多肽合成技术进行合成，在氨基酸Ser188上添加磷酸化基团。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的免疫动物的步骤包括：
用上述步骤(1)合成的抗原肽偶联血蓝蛋白与佐剂联合免疫新西兰大白兔；免疫方式为经颈部、背部皮肤较薄、松弛的部位两侧皮下注射，臀肌与大腿部两侧分别肌肉注射，腰部两侧皮内注射，爪垫注射等多部位多点注射；免疫次数包括1次引发注射，3～4次加强注射和最后一次抗原直接注射。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的纯化和鉴定的步骤包括：
将上述步骤(2)收集的抗血清以ELISA实验测定抗血清针对目的抗原肽的效价及其是否能够特异性识别目的抗原肽，利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化，以Western Blot实验确定抗血清是否能够特异性识别Ser188位点磷酸化的CYR61蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述利用亲和分离-亲和纯化循环技术对抗血清进行纯化的步骤包括：
采用合成肽偶联载体蛋白牛血清白蛋白与琼脂糖层析柱的亲和层析法进行抗体亲和分离及亲和纯化；首次采用非磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和分离除去抗血清中的非磷酸化抗体，得到含磷酸化抗体流出液；接着使用磷酸化合成肽偶联牛血清白蛋白与琼脂糖作为层析柱的填料进行亲和纯化，除去磷酸化抗体中低亲和力的低序列复杂性表位抗体。
8.权利要求1所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗原肽在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。
9.权利要求2所述的特异性针对人CYR61蛋白Ser188位点磷酸化抗体在制备用于肿瘤、血液系统、心血管系统疾病的诊断、治疗及预后判定的药物制剂中的应用。
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