CN105017403B

CN105017403B - 胰腺癌相关多肽dap44单克隆抗体的制备及其应用

Info

Publication number: CN105017403B
Application number: CN201510400228.4A
Authority: CN
Inventors: 陈勇; 方城; 白泉; 姚雪彪; 赵宁; 郭欣; 吕行
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2035-07-09
Also published as: CN105017403A

Abstract

本发明通过色谱高效分离和质谱蛋白组学分析筛选出胰腺癌相关多肽DTNBP1Associated Peptide 44(DAP44)，并公开了其氨基酸序列，利用多肽固相合成技术合成DAP44抗原。以DAP44抗原作为免疫原，利用杂交瘤技术制备针对此抗原的单克隆抗体，通过抗体效价检测、交叉配对和亚类鉴定确立两株高亲和力的单克隆抗体，用于DAP44的免疫组化检测，为后续建立DTNBP1检测试剂盒奠定基础。

Description

胰腺癌相关多肽DAP44单克隆抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种胰腺癌相关多肽DAP44，及由多肽抗原免疫实验动物制备的杂交瘤细胞株和杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

背景技术

胰腺癌是一种凶险的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率成不断上升趋势。由于胰腺解剖位置隐蔽，胰腺癌早期一般缺少典型的临床症状，大多数胰腺癌患者发现时已处于进展期，肿瘤已向周围脏器、淋巴和血管侵润或转移。生存预后差，中位生存时间仅为3-5个月，其5年生存率小于5％。尽管外科手术是胰腺癌治疗的唯一有效手段，但目前仅有不足20％的病人可以达到一个满意的手术切除和根治效果。研究表明，肿瘤分期是一个影响胰腺癌预后的重要独立影响因素，分期越早的病人其预后越好；癌肿小于1cm或更小时确诊,切除率可达90％，且术后生存率明显改善。因此，胰腺癌的早期诊断是患者存活率提高的关键。

目前对于胰腺癌的诊断主要依赖于影像学方法如CT或MRI等，但对于胰腺癌的早期诊断敏感性不高，难以发现较小的胰腺肿瘤(直径＜1.5cm)。临床上也多应用肿瘤标志物来辅助诊断胰腺癌，目前研究较多的血清标志物有血清癌胚抗原(CEA)、胰腺癌胚抗原(POA)、胰腺相关抗原(PCAA)、胰腺特异性抗原(PaA)和糖抗原(CA19-9)等。其中最常用的CA19-9，对胰腺癌的较高的特异性(82％～90％)和敏感性(79％～81％)。但CA19-9作为辅助诊断指标，存在一定的局限性，如在胰腺炎、肝硬化等良性疾病和消化道其它恶性肿瘤中出现假阳性；在Lewis a阴性基因型患者中的出现假阴性。因此，寻找一种新的高敏感性、特异性胰腺癌相关肿瘤标志物对胰腺癌的诊断具有重大临床意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种可用于胰腺癌检测的肿瘤标志物。通过体积排阻高效色谱和质谱检测筛选了一段长度为44个氨基酸的多肽序列，该多肽在胰腺癌中特异性高表达，经生物学信息分析发现，该多肽与精神分裂症相关蛋白DNTBP1高度同源，将该多肽命名为DTNBP1Associated Peptide(DAP44)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的是提供了一种DAP44的抗原表位，其序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种能特异性识别DAP44蛋白的单克隆抗体，其制备方法为：

(1)利用上述DAP44抗原表位肽免疫动物；

(2)取经免疫的动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗DAP44抗原表位多肽的杂交瘤细胞；

(3)杂交瘤细胞腹腔接种BALB/Ac小鼠，制备腹水。即为抗DAP44蛋白表位多肽的单克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供了一种DAP44单克隆抗体，由保藏号为CCTCCC201564(No.2D1C11)的杂交瘤细胞系所产生。

本发明的另一个目的在于提供了一种DAP44单克隆抗体，其由保藏号为CCTCCC201565(No.1E8H3)的杂交瘤细胞系所产生。

本发明提供由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，经抗体配对筛选，所得抗体具有高度的亲和性和特异性，能够与DAP44结合，从而对胰腺癌进行检测。

本发明所述单克隆抗体可以是，例如单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物或同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

本发明产生抗体间接ELISA效价不低于1：512000。

本发明的单克隆抗体，具有良好的稳定性，对DAP44具有很好的特异性识别能力。

本发明的单克隆抗体及DAP44多肽表位用于胰腺癌的诊断。

附图说明

图1a是胰腺癌患者术前血清质谱图。

图1b是胰腺癌患者术后血清质谱图。

图2是酶切后肽段的质谱图。

图3-1是No.2D1C11单克隆抗体的免疫组化应用。

图3-2是No.1E8H3单克隆抗体的免疫组化应用。

具体实施方式

实施例1 DAP44蛋白的筛选与测序

收集临床50例胰腺癌患者术前和术后第5天血清蛋白样本，预处理去除白蛋白等大分子，蛋白浓缩定量。准备好刀豆蛋白A填充的亲和层析色谱柱，将样品直接装载在亲和色谱柱上(分离色谱)，检测波长280nm。由于缺少糖基化位点，血清中的大多数蛋白质不与亲和色谱柱的刀豆蛋白A发生相互作用，只有少数蛋白质区域表现出对刀豆蛋白A的强烈亲和性，亲和柱上所保留的即为N端糖基化的糖蛋白。通过体积排阻色谱高效分离和收集蛋白样本，利用MALDI—TOF—MS质谱技术分析比较胰腺癌患者术前和术后第五天的血清糖蛋白质谱结果，发现在所有检测到的质量/电荷(M/Z)峰值中，胰腺癌患者的术前血清中有一个明显的高强度峰值，而在术后峰值较低。随后我们对50例患者术前和术后血清进行了评估，其中在42例患者血清中发现了同样的峰值变化，阳性率为84％，表明该峰可能对应一个潜在的胰腺癌肿瘤标志物(图1)。以PNGase F酶裂解此峰的碳水化合物基团，通过质谱分析发现，此峰值具有1086.8的质荷比(图2)。经过肽段测序和生物学信息分析，发现其为一段含有44个氨基酸的多肽片段，氨基酸序列SEQ ID NO：1。该多肽的前36个氨基酸序列与精神分裂症相关蛋白DTNBP1的N端序列完全一致，提示该多肽可能与DTNBP1高度同源，命名为DTNBP1Associated Peptide(DAP44)。

实施例2 小鼠单克隆抗体的制备与筛选

小鼠免疫

利用多肽固相化学合成法合成DAP44抗原表位肽，序列如SEQ ID NO：2所示，末端进行KLH偶联。取8周龄健康BALB/Ac小鼠，将适量合成的KLH偶联半抗原与弗氏完全佐剂1:1混合乳化，行背部皮下多点免疫。首次免疫后2周，将DAP44蛋白与弗氏不完全佐剂混合，再次免疫小鼠，方法同前。以后每隔3周，进行第三、四次强化免疫。第四次免疫3天后，小鼠眼静脉取血，选择血清ELISA效价较高的小鼠做细胞融合。

细胞融合、杂交瘤细胞株的建立

取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(脾细胞：Sp2/0＝5:1)在PEG4000作用下融合。将融合后的细胞转移至预先接种饲养细胞的96孔板，37℃5﹪CO₂细胞培养箱中孵育。7天内HAT培养基培养，7天后换成HT培养基，14天后换成常规RPMI1640培养基。将融合后的细胞适当稀释，分别接种于96孔板，用间接ELISA法检筛选分泌抗DAP44 mAb的杂交瘤细胞株。以DAP44多肽为包被抗原，以免疫小鼠血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养上清为阴性对照。采用TMB显色，2mol/L浓硫酸终止反应，用酶标仪测定各孔450nm波长OD值。挑选OD值最高的单克隆进行有限稀释法亚克隆，直至阳性孔比例为100％。得到四个杂交瘤细胞株，编号为：No.1C6A11、No.2D1C11，No.1E8H3、No.5B6D4。

腹水的制备

取6周龄健康雌性BALB/Ac小鼠，腹腔注射0.5ml无菌液态石蜡。10天后，无菌条件下将0.5ml(约1×10⁶个/ml)杂交瘤细胞注入小鼠腹腔。14天后，处死小鼠，收集腹水。

抗体的纯化

用饱和(NH₄)₂SO₄沉淀法粗提γ-球蛋白，将所得产物与上样缓冲液1:1混合，过滤。将protein A装入层析柱中，用10倍柱床体积上样缓冲液过protein A柱，流速1ml/min。将处理好的腹水样品上样，流速1ml/min。用10倍柱床体积上样缓冲液洗脱杂蛋白，流速1ml/min，直至没有蛋白洗出。用洗脱液洗脱抗体，直至漏出液中不含蛋白，测定蛋白含量。5-10倍柱床体积的再生液再生层析柱，PBS 4℃透析过夜。采用SDS-PAGE凝胶电泳检查抗体纯度，No.1C6A11抗体纯度为81％，No.1E8H3抗体纯度为96％，No.2D1C11抗体纯度为98％，No.5B6D4抗体纯度为96％。

单克隆抗体效价检测和配对筛选

以合成的DAP44多肽为包被抗原，1μg/ml，100μl/well，96孔板孵育过夜。以过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(H&L)为二抗，间接ELISA法检测单克隆抗体效价。如表1所示，4种单克隆细胞株产生的抗体效价均较高，分别为1:256000、1:512000、1:512000、1:512000，表明抗体与抗原具有较高亲和力。分别以4种单克隆细胞株抗体为孵育抗体和检测抗体，经间接ELISA配对实验检测，发现以No.2D1C11单克隆细胞株所产生抗体为包被抗体和以No.1C6A11和No.1E8H3单克隆细胞株所产生抗体为检测抗体时，反应体系具有较好的敏感性和特异性，如表2所示。进一步将抗原倍比稀释后检测，发现以No.2D1C11单克隆细胞株所产生抗体为包被抗体时，以No.1E8H3单克隆细胞株所产生抗体作为检测抗体具有最高的敏感性和特异性，如表3所示。因此，最终选定编号为No.2D1C11和No.1E8H3的杂交瘤细胞株，为后续建立DAP44 ELISA试剂盒奠定基础。

表1.单克隆抗体效价测定

表2.单克隆抗体配对实验

表3.配对抗体敏感性检测

单克隆抗体亚类鉴定

参照SouthernBiotech公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞No.2D1C11和No.1E8H3进行鉴定，经鉴定No.2D1C11重链为IgG1，轻链为κ链；No.1E8H3重链为IgG2b，轻链为κ链。

实施例3 单克隆抗体的免疫组化应用

用上述筛选的两株DAP44抗体No.2D1C11和No.1E8H3，按常规法作病理切片，对人胰腺癌组织石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法如下：烤片，68℃，20分钟，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；3％H₂O₂室温孵育10min阻断灭活内源性过氧化物酶；抗原修复：将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸5-10min，自然冷却；正常山羊血清工作液室温封闭30min，倾去勿洗；滴加一抗(1:300)4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次×5min；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3次×5min；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3次×5min；DAB显色，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。结果判读：经免疫组化染色，发现胰腺癌细胞浆内呈现均匀的棕黄色颗粒，强阳性，背景清晰，无非特异染色；正常胰腺组织细胞浆内呈现少量黄色弱阳性颗粒(图3)。结果表明：DAP44在胰腺癌中特异性高表达，单克隆抗体No.2D1C11和No.1E8H3可以特异性的应用于DAP44的检测。

杂交瘤细胞株的保藏

将杂交瘤细胞株于2015年6月10日保藏于湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，编号No.2D1C11的杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC C201564，编号为No.1E8H3的杂交瘤细胞株保藏号为CCTCC C201565。

Claims

1.一种单克隆抗体，其特征是该单克隆抗体由保藏号为CCTCC C201564的杂交瘤细胞产生。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备治疗胰腺癌疾病药物试剂中的应用。