KR20120078192A - 혈청 아밀로이드 ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 - Google Patents

혈청 아밀로이드 ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)의 발현 수준이 높게 나타난다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 알 수 있다.

Description

혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포{Serum amyloid A specific monoclonal antibody and hybridoma cell producing the same}
본 발명은 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
현대의학의 눈부신 발전에도 불구하고 암 발생 및 암으로 인한 사망은 지속적으로 증가하고 있다. 이에 따라, 암의 진단 및 치료에 소모되는 개인 가계 및 국가적/사회적인 손실이 크게 발생되고 있다. 따라서, 암의 예방, 진단 및 치료기술의 개발은 국제적으로 대두되고 있는 과제이다. 즉, 종합적인 암 관리를 통한 암 발생 및 암으로 인한 사망을 최소화하여 비용 부담을 감소시키기 위해서는 암의 조기검진이 필요하다.
암 중에서 국?내외적으로 사망률 1위, 발병율 2~3위인 폐암은 암세포의 성장으로 인한 주변 조직 침범, 기도폐쇄, 림프절 전이 등의 증상을 초래하는 것이 보통이지만, 환자의 10~15% 정도는 아무런 증상 없이 정기 검진에서 진단된다. 또한, 대부분의 폐암이 진단 당시에 이미 제 Ⅲ기 이상으로 진행된 상태로 진단되므로 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 생존율이 매우 낮은 편이다. 따라서, 폐암을 조기에 진단하여 폐암으로 인한 사망률을 줄이는 것이 시급한 문제이다.
폐암은 세포의 크기에 따라 소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)과 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)으로 구분된다. 소세포폐암은 전체 폐암의 약 20%를 차지하며, 신경내분비(neuroendocrine) 유래의 암세포로서 병의 진행 속도가 매우 빠르다. 폐암 환자의 예후는 좋지 않으며 5년 생존율이 5~10% 정도라고 보고되어 있고, 폐암 환자의 대부분이 진단시 이미 말기 환자로 판명되고 있는 실정이다.
현재 폐암을 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 복합적으로 사용되고 있는데, 현재까지는 종양의 크기, 림프절 전이 유무 등을 조사하거나, 폐 종양 조직 또는 림프절 등을 생검하여 면역조직화학방법으로 분석하거나 흉부 X-ray 촬영, 흉부 전산화 단층 촬영(CT), 자기공명영상(MRI), 기관지 내시경을 이용하여 진단하고 있다. 그러나, 흉부전산화 단층 촬영의 경우 폐암의 크기가 약 0.1㎝ 이상 되어야 측정이 가능한데, 이 시기는 이미 암이 다른 조직으로 전이되었을 가능성이 높다는 문제가 있고, 기관지 내시경을 이용한 방법은 내시경이 기관지로 삽입되어 폐 내부를 직접 관찰할 수 있으나 폐 말단에 있는 종양을 관찰하기 어렵다는 공간적 한계의 문제를 가지고 있다. 또한, 상기 방법들은 비용면에서 매우 고가일 뿐만 아니라 진단의 민감도도 낮아 폐암을 조기 진단하는데 어려움이 많다.
상기와 같이, 폐암 환자는 조기진단이 중요하기 때문에, 빠르고 간편하며 정확하게 진단할 수 있는 새로운 방법이 필요하다. 따라서, 폐암의 스크리닝의 개념에서 객담검사 분석(sputum assay) 또는 흡인액(bronchial aspiration)을 통한 세포학(cytology) 검사방법이 사용되어 왔다. 그러나, 상기 방법들도 진단율이 낮아 스크리닝 개념에서의 그 유용성은 여전히 의문시되고 있다.
따라서, 건강검진시 혈액 채취로 폐암을 간편하고 빠르게 진단할 수 있는 폐암 진단 스크리닝 및 모니터링을 위한 항체의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 혈청 아밀로이드 A(serum amyloid A; SAA)는 반응성 아밀로이드증 (reactive amyloidosis)의 염증상황의 전구 물질로 알려져 있으며, 다양한 신체 상황에서 혈청내 농도가 증가하는 주된 급성기 단백질(acute phase protein)이다. SAA 다중유전자 패밀리(SAA multigene family)는 4개의 유사한 유전자를 포함하는데, 이들 중 SAA1과 SAA2가 급성기 반응(acute phase response)에 나타나는 주된 단백질이며, SAA3는 슈도-유전자(pseudo-gene), SAA4는 지속적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. SAA1과 SAA2는 같은 염색체(chromosome)에 존재하며 유전적으로 상동성(homology)이 매우 높아 전체 122개의 아미노산 중 서로 다른 특이한 (unique) 아미노산이 9개 밖에 되지 않는다. 그러나, 이 2개의 단백질은 DNA의 각기 다른 부위에 의해 발현되는 각기 다른 유전자이다. SAA에 대한 항체가 많이 연구되고 있지만 대부분 SAA1 항원에 대한 항체들이며, 아직까지 SAA2 항원에 대한 항체에 관한 연구 및 개발은 미미한 상태이다. 또한, SAA 항체가 진단제로 사용되어지기 위해서는 상용 항체보다 높은 특이도(specificity)가 요구된다.
따라서, 폐암에 높게 발현되는 폐암 특이적 마커인 SAA1 및 SAA2에 대한 항체의 제작과 이를 이용한 진단제의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 폐암 특이적 마커인 SAA1 및 SAA2에 대한 항체에 관하여 연구하던 중, 면역화된 마우스의 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 혼합하고 폴리에틸렌글리콜을 넣어 세포융합하여 하이브리도마 세포를 선별하고 이로부터 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체를 생산한 후, 상기 단일클론항체가 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하고자 한다.
도 1은 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 도이다.
도 2는 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명의 하이브리도마 세포(1H1, KCTC 11834BP)의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 하이브리도마 세포(1H1, KCTC 11834BP)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 도이다.
도 5는 혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 직접 ELISA 실험을 통해 확인한 도이다.
도 6은 도 5의 직접 ELISA 분석 결과를 이용하여 평가한 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)로부터 생산된 단일클론항체의 민감도 및 특이도를 나타낸 도이다.
본 발명은 하이브리도마 세포(KCTC 11833BP 및 KCTC 11834BP)에 의해 생산되고, 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포(KCTC 11833BP 및 KCTC 11834BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 하이브리도마 세포(KCTC 11833BP 및 KCTC 11834BP)를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계,
2) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계, 및
3) 상기 복수액으로부터 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는, 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혈청 아밀로이드 Ａ에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료 중 혈청 아밀로이드 Ａ의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 단일클론항체는 하이브리도마 세포(KCTC 11833BP 및 KCTC 11834BP)에 의해 생산되고, 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
상기 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)는 SAA1 및 SAA2를 포함한다.
본 발명의 단일클론항체를 얻기 위해서는, 먼저 이를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조에 필요한 마우스를 면역화시켜야 한다. 구체적으로는, 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)를 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS)에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 1차 주사한다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 혈청 아밀로이드 Ａ와 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트(incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 마우스의 복강 내에 2차 주사한다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하고, 마지막 면역화한 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 혈청 아밀로이드 Ａ를 마우스의 꼬리 정맥에 부스터(booster) 주사한다. 상기 면역화된 마우스의 혈청을 채취하여 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인하고, 면역화된 마우스로부터 비장세포를 적출한다. 적출된 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 세포수를 기준으로 10:1의 비율로 혼합하고 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 넣어 세포융합시키고 배양한다.
상기 융합세포군 중에서 혈청 아밀로이드 Ａ에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고, 선별된 융합세포가 단일클론이 되도록 제한 희석법(limiting dilution)을 사용하여 융합세포를 희석한 후, 하나의 세포로부터 증식한 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택한다. 최종적으로 선택한 융합세포를 각각 "10G1" 및 "1H1"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 각각 2010년 12월 16일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11833BP(10G1), KCTC 11834BP(1H1)).
상기 얻어진 하이브리도마 세포[10G1(KCTC 11833BP) 및 1H1(KCTC 11834BP)]를 마우스의 복강 내로 주사하고, 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취한 후, 상기 복수액으로부터 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리한다.
본 발명에 따른 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 혈청 아밀로이드 A 항원 (SAA1 및 SAA2)의 발현 수준이 높게 나타난다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 알 수 있다.
본 발명의 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 폐암 진단 키트는, 폐암 마커인 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료에서 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현 수준을 측정하여, 폐암의 진단 또는 예후를 조기에 예측할 수 있다. 구체적으로, 혈청 아밀로이드 A(SAA)를 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분획하고 고정체로 전이하여 고정시킨 후, 고정된 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 특이적으로 결합하는 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행하고, 혈청 아밀로이드 A (SAA)의 발현 수준을 측정한다. 즉, 폐암 환자와 정상인의 혈청에서 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현 수준을 측정하고 비교하여, 폐암 환자 혈청에서의 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 발현 수준이 정상인의 혈청에서 보다 높으면, 폐암을 갖는 것으로 진단하거나 폐암의 가능성을 가질 것으로 예측하는 것이다.
상기 생물학적 시료는 포유동물로부터 수득된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 소변과 같은 시료를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등으로 전처리할 수 있다.
상기 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF 막 (polyvinylidene difluoride membrane), 폴리비닐 수지 또는 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.
상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
상기 폐암 진단 키트는 혈청 아밀로이드 A(SAA) 단백질을 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 상기 폐암 진단 키트는 혈청 아밀로이드 A(SAA)에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있다.
상기 2차 항체 접합체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein), 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.
상기 발색 기질 용액은 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충액(0.1M NaOAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다.
세척액은 인산염 완충액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02M 인산염 완충액, 0.13M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액이 사용될 수 있다.
본 발명에서 항체는 전체 형태의 항체(이하 "전항체"라고 함) 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 갖는 항체로서, 실질적으로 전항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.
상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체를 생산하는 세포 선별
1. 마우스의 면역화
하이브리도마 세포의 제조에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 혈청 아밀로이드 Ａ(30㎍/㎕)를 인산염 완충액(phosphate buffered saline; PBS) 150㎕에 희석하고 동일한 부피의 프로인트 완전 아주반트(complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 에멀젼을 제조하였다. 상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 1차 주사하였다. 1차 면역화 후 마우스의 면역성을 높이기 위하여 2주 후에 혈청 아밀로이드 Ａ 150㎕와 동일한 부피의 프로인트 불완전 아주반트 (incomplete Freund's adjuvant, Sigma)를 혼합하여 에멀젼을 제조한 후, 상기 에멀젼을 6주령의 암컷 Balb/c 마우스의 복강 내에 2차 주사하였다. 2차 면역화 후 2주 후에 3차 면역화하였다. 마지막 면역화한 후 1주일 후에 세포융합 실험을 실시하기 3일 전 혈청 아밀로이드 Ａ 10~30㎍/㎕를 마우스의 꼬리 정맥에 부스터 (booster) 주사하였다.
상기 면역화된 마우스를 에테르로 마취시킨 후 헤파린 처리된 주사기로 심장에서 채혈한 후, 혈액을 4℃에서 하룻밤 정치시키고 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청을 적당히 나누어 -80℃에 보관하였다.
2. 세포 융합
먼저, 세포융합을 위해 골수종 세포(myeloma cell)를 준비하였다. 골수종 세포인 SP2/O 세포를 배양하고, 세포밀도를 2.5~5×104/㎖로 하였다. 세포융합 24시간 전에 SP2/O 세포를 1/3로 희석하여 준비하였다.
상기 1에서 면역화된 마우스의 혈청에서 ELISA 법으로 항체의 역가를 확인하여 항체 생성력이 있음을 확인한 후, 면역화된 마우스를 에테르로 마취시키고 몸통의 좌측에 위치한 비장세포(spleen cell)를 적출하였다. 적출된 비장세포를 SF-DMEM2(DMEM + 2×AA)로 세척하고 비장세포를 용출시켰다. 세포 현탁액을 수거하여 튜브에 담고 정치시켜 무거운 덩어리들을 가라앉히고 상층액을 새 튜브로 옮긴 다음 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한(tapping) 후 SF-DMEM2를 채웠다. 비장세포와 골수종 세포인 SP2/O 세포를 각각 원심분리하고 세척한 다음, 세척과정을 1회 더 반복하였다. 세척한 SP2/0 세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 또한, 세척한 비장세포의 상층액을 제거하고 탭핑한 후, LB(lysis buffer) 1㎖에 적혈구(RBC, red blood cell)를 넣어 처리한 후 SF-DMEM2를 채웠다. 그 다음, 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 원심분리하고, 원심분리된 비장세포와 SP2/O 세포의 상층액을 제거한 다음 탭핑하고 SF-DMEM2 10㎖를 채웠다. 비장세포와 SP2/O 세포를 각각 e-튜브에서 100배로 희석하고 계수하여 농도를 결정하였다[비장세포의 농도(1×108, 8×107, 5×107), SP2/O 세포의 농도(1×107, 8×106, 5×106)]. 비장세포와 SP2/O 세포는 10:1의 비율로 결정하였다. 결정된 농도의 비장세포와 SP2/O 세포를 튜브에 함께 넣고 원심분리하였다. 원심분리된 세포의 상층액을 제거한 후 알콜솜 위에 엎어 놓고 30초~1분 동안 반건조시키고 탭핑하였다. 여기에 PEG(2㎖, 1.5㎖, 1㎖)를 1분 동안 천천히 넣으면서 피펫팅하여 반응시키고 SF-DMEM2를 넣으면서 튜브를 흔들어준 다음 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 탭핑하지 않은 상태에서 HT 배지[HT 50×(HT(sigma) 1 vial + SF-DMEM1 10㎖) 1㎖, FBS 10㎖, SF-DMEM1(DMEM + 1×AA) 30㎖]를 방울방울 떨어뜨리고, 조금씩 속도를 올리면서 50㎖가 되도록 하였다. 이 현탁액을 다시 37℃, 5% CO2 배양기에서 3시간 동안 배양하였다.
3. 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별 및 클로닝
상기 2에서 제조한 융합세포군 중에서 혈청 아밀로이드 Ａ에만 특이적으로 반응하는 융합세포들을 선별하고 항체의 생성여부를 확인하기 위하여, 효소면역방법을 이용하여 스크리닝하였다.
세포융합 후 8~9일째에 배지를 교환하고, 96 웰에서부터 24 웰까지 잘 자랄 때까지 cDMEM2에서 배양하였다. 배지를 교환한 후 5~7일째에 색이 변한 웰의 상층액을 거두고 cDMEM2로 채운 후 ELISA 시험을 수행하였다. ELISA 시험 후 웰을 선택하여 24 웰로 옮겨 배양하였다. 24 웰에서 배양한 후 다시 ELISA 시험을 수행하였다. 구체적으로는, 24 웰의 융합세포 농도를 확인하고, 96 웰 플레이트에 0.5 cell/well이 되도록 15㎖의 배양액에 융합세포를 희석하였다. 융합세포 희석액을 각 웰당 150㎕씩 분주하였다. 현미경으로 검경하여 1개의 세포가 들어있는 웰을 체크하였다. 세포가 어느 정도 자란 웰의 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 1차 스크리닝을 수행하였다. 1차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 24 웰로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 2차 스크리닝을 수행하였다. 24 웰에서 키운 융합세포의 흡광도(O.D 값)를 ELISA로 확인하고, 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하여 25T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 원심분리한 후 상층액을 거두어 ELISA 및 웨스턴 블롯으로 확인하여 3차 스크리닝을 수행하였다. 3차 스크리닝을 토대로 선택된 융합세포를 다시 75T/C 배양 플라스크로 옮겨 배양하고 ELISA로 흡광도를 확인하여 흡광도가 1이 넘는 융합세포만 선택하였다. 최종적으로 선택한 융합세포를 각각 "10G1" 및 "1H1"로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 각각 2010년 12월 16일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 11833BP(10G1), KCTC 11834BP(1H1)).
실시예 2 : 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 생산 및 정제
1. 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 생산
상기 실시예 1에서 선택한 최종 융합세포(하이브리도마 세포, "10G1" 및 "1H1")로부터 혈청 아밀로이드 A에 대한 단일클론항체를 생산하기 위하여, 7~8 주령의 암컷 Balb/C 마우스 복강(abdominal cavity)에 프리스탄(pristane) 500㎕를 주사하였다. 75T/C 배양 플라스크에서 배양한 융합세포를 수거하여 원심분리한 다음, 상층액을 제거하고 인산염 완충액에 넣고 피펫팅하였다. 프리스탄 투여 7~10일 후 상기 실시예 1에서 선택한 융합세포[10G1(KCTC 11833BP), 1H1(KCTC 11834BP)]를 각각 8×105 ~ 4×107으로 마우스의 복강 내에 주사하였다. 5~7일 후에 마우스의 복강에 복수(ascites)가 가득찼을 때 18G 주사 바늘을 이용하여 복수를 뽑았다. 복수를 4℃에서 하룻밤 두었다가 다음날 원심분리하여 노란 지방층을 포함한 덩어리 물질을 제거하고 상층액만을 분리하였다. 분리한 상층액은 분주하여 -20℃에 보관하였다.
2. 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 정제
저장액(20% 에탄올)에 저장되어 있는 Protein G Fast Flow Bed를 적당량 컬럼에 채우고 20% 에탄올을 흘려 내린 후, 5 Bed Volum의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 세척하였다. 복수액을 인산염 완충액으로 적당량 희석시킨 후 Protein G 컬럼에 로딩하였다. 3 Bed Volum의 결합 완충액(20mM sodium phosphate, pH 7.0)으로 결합한 후, 3 Bed Volum의 용출 완충액(0.1M glycine buffer, pH 3.0~2.5)으로 0.5㎖씩 분획을 용출하였다(11개의 분획). 각 분획을 35㎕의 중화 완충액(1M Tris-HCl, pH 9.0)으로 중화시켰다. 70% 에탄올로 냉장온도에서 하룻밤 정치시킨 후, 다시 저장액(20% 에탄올)에서 다음 번 사용시까지 냉장 보관하였다. 각 분획의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, Ammersharm GE 컬럼으로 탈염(desalting)하였다.
결과는 표 1에 나타내었다.
단일클론항체의 정제
복수액 로딩 단백질 용출액 탈염
(GE 컬럼, Ammersharm)		 회수율
1130㎍ 1938㎍ 1309㎍ 11.7%
표 1에 나타난 바와 같이, 1130㎍의 복수액으로부터 1938㎍의 혈청 아밀로이드 A에 대한 단일클론항체가 Protein G 컬럼을 이용하여 정제되었고, GE 컬럼을 이용하여 염이 제거된 혈청 아밀로이드 A에 대한 단일클론항체는 1309㎍ 이었다. 회수율은 11.7% 이었다.
실험예 1 : 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)의 혈청 아밀로이드 Ａ 항원에 대한 결합 특이성 실험 - 웨스턴 블롯
본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, 정상인의 혈청(39명), 폐암 환자의 혈청(40명) 샘플에서 혈청 아밀로이드 A의 발현 수준을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 하이브리도마 세포[10G1(KCTC 11833BP), 1H1(KCTC 11834BP)]의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 결과는 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)는 약 13kDa 밴드 부근에서 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA)의 발현 수준이 높게 나타났고, 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 높게 발현되었다. 그러나, 시판되는 항체(RnD 사)의 경우 정상인의 혈청과 폐암 환자의 혈청에서 다양한 단백질의 밴드가 나타났다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)는 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성이 높음을 알 수 있다.
실험예 2 : 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 Ａ 항원에 대한 결합 특이성 실험 - 웨스턴 블롯
본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, BL21 세포 용해물 0.2㎍, SAA1 BL21 세포 용해물 0.2㎍, SAA2 BL21 세포 용해물 0.2㎍, 합성된 SAA 항원(Peprotech 사) 80ng 샘플에서 혈청 아밀로이드 A(SAA1, SAA2)의 발현 수준을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 하이브리도마 세포[10G1(KCTC 11833BP), 1H1(KCTC 11834BP)]로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 웨스턴 블롯 실험을 통해 확인한 결과는 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)의 발현 수준이 높게 나타남을 확인하였다. 1H1의 경우 SAA1 항원에 대해서는 강하게 발현되고 SAA2 항원에 대해서는 약하게 발현되는 것으로 확인되었으나, 이것은 적은양의 SAA2 BL21 세포 용해물을 로딩하였기 때문으로 판단된다. 이후, 동일한 양의 SAA1 BL21 세포 용해물 및 SAA2 BL21 세포 용해물을 로딩하여 실험한 결과 10G1 항체와 마찬가지로 SAA1 및 SAA2의 발현 수준이 높게 나타남을 확인하였다. 반면, 시판되는 항체(RnD 사)의 경우 SAA1 항원에 대해서만 강하게 발현되었으며, SAA2 항원에 대해서는 약하게 발현되었다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1)로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)에 대한 결합 특이성이 모두 높게 나타남으로, 높은 특이도의 항원결합부위(epitope)를 갖고 있을 것으로 예상할 수 있다.
실험예 3 : 하이브리도마 세포(10G1)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 Ａ 항원에 대한 결합 특이성 실험 - 직접 ELISA
본 발명의 하이브리도마 세포(10G1)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, 정상인의 혈청(39명), 폐암 환자의 혈청(40명) 샘플에서 혈청 아밀로이드 A의 발현 수준을 직접 ELISA 법을 이용하여 확인하였다.
혈청 샘플군(정상인의 혈청 및 폐암 환자의 혈청)에서 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)로부터 생산된 단일클론항체의 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성을 직접 ELISA 실험을 통해 확인한 결과는 도 5에 나타내었고, 도 5의 직접 ELISA 분석 결과를 이용하여 평가한 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)로부터 생산된 단일클론항체의 민감도 및 특이도는 도 6에 나타내었다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1)로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA)의 발현 수준이 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 높게 나타남을 확인하였다. 또한, 직접 ELISA 분석 결과를 이용하여 계산한 AUC(area under the curve)는 0.797로 민감도 및 특이도가 높음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1)로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원에 대한 결합 특이성이 높음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 정상인의 혈청에서보다 폐암 환자의 혈청에서 혈청 아밀로이드 A 항원 (SAA1 및 SAA2)의 발현 수준이 높게 나타난다. 따라서, 본 발명의 하이브리도마 세포(10G1 및 1H1) 및 이로부터 생산된 단일클론항체는 혈청 아밀로이드 A 항원(SAA1 및 SAA2)에 대한 결합 특이성이 모두 높음을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC11833BP 20101216 한국생명공학연구원 KCTC11834BP 20101216

Claims (11)

  1. 하이브리도마 세포(KCTC 11833BP)에 의해 생산되고, 혈청 아밀로이드 Ａ (SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  2. 하이브리도마 세포(KCTC 11834BP)에 의해 생산되고, 혈청 아밀로이드 Ａ (SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)는 SAA1 및 SAA2인 것을 특징으로 하는 단일클론항체.
  4. 제 1항의 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP).
  5. 제 2항의 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포(1H1, KCTC 11834BP).
  6. 1) 제 4항의 하이브리도마 세포(10G1, KCTC 11833BP)를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계,
    2) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계, 및
    3) 상기 복수액으로부터 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는, 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 생산방법.
  7. 1) 제 5항의 하이브리도마 세포(1H1, KCTC 11834BP)를 마우스의 복강 내로 주사하는 단계,
    2) 복강이 부풀어 오른 마우스로부터 복수액을 채취하는 단계, 및
    3) 상기 복수액으로부터 혈청 아밀로이드 Ａ(SAA)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 분리하는 단계를 포함하는, 혈청 아밀로이드 Ａ에 대한 단일클론항체의 생산방법.
  8. 제 1항의 혈청 아밀로이드 Ａ에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료 중 혈청 아밀로이드 Ａ의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트.
  9. 제 2항의 혈청 아밀로이드 Ａ에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하며, 항원-항체 결합반응을 통해 생물학적 시료 중 혈청 아밀로이드 Ａ의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 포유동물로부터 수득된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트.
  11. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 항원-항체 결합반응은 효소면역분석법 (ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법(flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 폐암 진단 키트.
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