CN106661110B - 抗muc1抗体或其抗原结合片段及其用途 - Google Patents

抗muc1抗体或其抗原结合片段及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供：展现对具有在癌症细胞以高水平表达的糖苷结构的MUC1的特异性的抗体；制备该抗体的方法；和使用该抗体用于诊断以及预防和/或治疗癌症的新工具和方法。本发明的抗体是针对人MUC1的单克隆抗体，其中所述抗体特异性识别具有人MUC1串联单元且进一步在该人MUC1串联单元的氨基酸序列中的任意苏氨酸或丝氨酸上具有O‑连接糖苷核心核心O(Tn)的糖肽。一种检测人体液样品中MUC4的方法。包括该单克隆抗体的试剂盒。用于预防和/或治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述药物组合物包含该单克隆抗体作为活性成分。

Description

抗MUC1抗体或其抗原结合片段及其用途
技术领域
本发明涉及抗MUC1抗体，或其抗原结合片段，及它们的用途。更具体地，涉及针对MUC1糖肽的抗体，或其抗原结合片段，以及涉及采用其的用于恶性肿瘤的诊断技术和预防和/或治疗技术。
相关申请的交叉引用
该申请要求2014年4月28日提交的日本专利申请号2014-92299的优先权，其整体明确通过引用并入本文。
背景技术
“MUC1”是一类粘蛋白糖蛋白。其包含由MUC1基因(MUC1)编码的核心蛋白和许多通过O-型糖链键与核心蛋白键接的糖链。粘蛋白具有的形式有分泌的粘蛋白，其由上皮细胞等产生，以及膜结合的粘蛋白，其包含疏水跨膜部分且和细胞膜结合。MUC1是上皮细胞的膜结合的粘蛋白，其存在于正常细胞中在乳腺细胞远端表面，存在于乳脂肪滴中，以及存在于多种腺体上皮细胞中，例如在胰腺和肾中(非专利文献1)。其分子量大于或等于400kDa，其中50％由O-键-类型糖链组成。该糖蛋白包含短的N端区域，含串联重复(其25％由具有羟基基团的氨基酸表征)的中央区域，含31个氨基酸的跨膜区域，以及在胞质侧的短C端区域。含有中央区域的胞外区域在许多情况下被切掉并释放。每个串联重复(串联单元)包含20个氨基酸(Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala)，具有五个可以由O-糖链修饰的位点。等位基因之间所述串联重复的数目可以在20至125个变化，因此该区域称作可变数目的串联重复(VNTR)。VNTR区域具有大小多态性，其中所表达的重复的数目具有遗传学个体差异。已知基于特定氨基酸遗传突变的四种类型的序列多态性。在该序列多态性中，从Pro-Asp-Thr-Arg(PDTR)至Pro-Glu-Ser-Arg(PESR)的突变的频率高(非专利文献)。
已知MUC1在许多癌症中过表达，例如乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。具体而言，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中观察到90％或更多的过表达。此外，升高的MUC1表达伴随着多种癌症不良预后，血液中MUC1的浓度在癌症患者中升高(非专利文献1)。
最初通过O-糖链修饰转移至MUC1的VNTR区域的丝氨酸和苏氨酸残基的频率最高的糖是GalNAc(有时表示为Tn)。因此，产生了Tn抗原。尽管Tn在正常MUC1罕见，其在癌症衍生的MUC1中被发现。之后，唾液酸、半乳糖或GlcNAc被添加至Tn，产生唾液酸-Tn(STn)，核心1(T)，或核心2。当唾液酸被添加至核心2，产生唾液酸T(ST)。其它糖链不再添加至STn，但GlcNAc和GalNAc被转移至Tn。在癌症细胞中，O-型糖链被不完全加工，导致表达癌症中常见的糖抗原Tn(GalNAcα-1-Ser/Thr)、STn(Siaα2-6GalNAcα-1-O-Ser/Thr)、T(Galβ1-3GalNAcα-1-O-Ser/Thr)、核心2(GlcNAcβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr)、ST(Siaα2-3Balβ1-3Ga1Nacα1-O-Ser/THR/Siaα2-6(Galβ1-3)GalNAcα1-O-Ser/Thr)。由于不同糖链的修饰(例如MUC1的串联重复中可以用O-糖链修饰的五个位点的修饰)，抗原结构(表位)随着癌症进展而变化(非专利文献4)。GalNAc最初被转移至的O-糖苷的多种核心结构是已知的且已经被分配编号。核心0、1和2的核心结构给出如下：
核心0(Tn抗原)：GalNAc
核心1(T抗原)：Galβ1-3GalNAc
核心2：Galβ1-3(GlcNAcβ1-6)GalNAc
MUC1蛋白通过O-糖基化的糖链的添加在上皮细胞层的保护、免疫反应、细胞粘附、炎性反应、癌症发生和癌转移起重要作用。已经报道了MUC1在癌症发生中的过表达以及O-糖基化的剧烈变化和癌症发生和转移之间的联系。此外，采用MUC1单克隆抗体的乳腺癌和卵巢癌诊断和治疗性药物的研发正在进行(非专利文献1)。最近，已经发现MUC糖蛋白和半乳凝素之间的相互作用在癌症发展和转移中是重要的(非专利文献5)。
已经报道多种单克隆抗体用于纯化MUC1和衍生自MUC1的合成肽和糖肽(专利文献1-5，非专利文献6和7)。大部分这些抗体的最小序列识别被认为是位于MUC1串联重复中的肽中Ala-Pro-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro。该序列所含的苏氨酸被认为是大量O-糖基化，且因此被认为对结合MUC1的抗体的选择性和亲和力有影响。然而，对于上述报道中的所有单克隆抗体，即使基于构成表位的肽中糖链键的存在或不存在鉴别到差异，也没有鉴别到糖链结构的差异。因此，癌症细胞选择性是不足够的。相反，本发明人已经制备了对于MUC1的STn正常组织相关结构相对于癌症相关结构具有高交叉反应性比例的抗体(专利文献6和7)。
然而，即使这些抗体也难以精确识别O-糖基化核心肽和MUC1核心肽结构形式的不同糖链肽结构的差异。
专利文献1：JP Patent No.3698370
专利文献2：JP-A-2002-502621
专利文献3：JP-A-2003-519096
专利文献4：US-A-2006/0292643
专利文献5：JP-A-2010-505775
专利文献6：W02010/050528
专利文献7：W02011/135869
专利文献8：JP-A-2006-111618
非专利文献1：Beatson et al.,Immunotherapy 2:305-327(2010)
非专利文献2：Engelmann et al.,J.Bioi.Chem.276:27764-27769(2001)
非专利文献3：Bafina et al.,Oncogene 29:2893-2904(2010)
非专利文献4：Clin.Cancer Res.19:1981-1983(2013)
非专利文献5：Liu et al.,Nature Rev Cancer 5:29-41(2005)
非专利文献6：Danielczyk et al.,Cancer lmmunol.lmmunother.55:1337-1347(2006)
非专利文献7：Cao et al.,Histochem.Cell Biol.115:349-356(2001)
非专利文献8：Ohyabu et al.,J.Am.Chem.Soc.131:17102-17109(2009)
非专利文献9：Matsusita et al.,Biochim.Biophy.Acta 1840:1105-1116(2014)
非专利文献10：Hashimoto et al.,Chem.Eur.J.17:2393-2404(2011)
非专利文献11：Lu-Gang et al.,J.Bioi.Chem.282:773-781(2007)
专利文献1-8和非专利文献1-11明确地通过引用以其整体并入本文。
发明概述
待通过本发明解决的问题
本发明人已经开发了高灵敏度的、高性能的糖肽固定化阵列，其能够精确地实现表位定位以及抗体的特异性分析，并且已经建立了确定真表位结构的新方法。使用该方法，他们对上述七种已存在的抗MUC1抗体进行表位分析。结果，他们发现这些抗体中没有一种能够识别MUC1的核心肽中的差异或核心肽中O-糖基化糖肽结构的差异(非专利文献8和9)。
本发明人进一步通过NMR证明在所述抗MUC1抗体的表位区域，主链肽中被诱导出构象改变，其特异于与侧链结合的糖链结构。他们还澄清了肽构象灵敏地被特性氨基酸残基的糖链修饰所改变，而这限定出抗MUC1抗体的抗原结构(非专利文献8)。他们还通过MS和NMR分析了粘蛋白衍生的合成糖肽的三维结构的变化。在此基础上，他们确定糖肽的构象受到存在于所述肽中若干个苏氨酸残基的糖链修饰的影响，以及在特定位置的糖链修饰赋予肽主链的稳定构象(非专利文献10)。
基于该知识，本发明的目的是提供抗MUC1抗体，特异于在癌症细胞高度表达的具有O-键-类型糖链的糖肽。本文中，术语“特异于具有O-键-类型糖链的糖肽”指的是能够精确识别O-糖基化核心肽的多种糖肽结构和MUC1的核心肽结构中的差异。
本发明的另一目的是提供合成的糖肽作为适于制备该抗体的抗原。本发明的仍另一目的是提供用该抗体诊断、预防和/或治疗癌症的新工具和方法。
本发明人利用他们收集的关于糖链和糖肽的新技术知识来实现上述目的。他们人工地合成了包含Tn的糖肽，并应用该人工合成的糖肽作为抗原来制备单克隆抗体，所述Tn构成了最初通过O-糖链修饰被转移至MUC1的VNTR区域中的丝氨酸或苏氨酸残基的核心糖结构。对于从包含Tn的糖肽获得的大量抗MUC1抗体(下文也称作“Tn抗原”)，他们采用装载有来自不同粘蛋白的VNTR区域的糖肽的微阵列(含有用作抗原的糖肽)来分析抗体特异性，并检查抗体的特性。他们还针对于多种癌症细胞表达的MUC1的结合和累积，与癌症患者血清反应，抑制癌症细胞增殖的效果以及抑制转移的效果来检查这些抗体。该检查的结果是，他们发现能够精确识别MUC1的核心肽结构和由核心肽的O-糖基化产生的多种糖肽结构中的差异。以该基础创造本发明。
解决问题的手段
本发明如下所示。
[1]
针对人MUC1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性识别在人MUC1串联单元的氨基酸序列中的任意苏氨酸或丝氨酸上具有O-键-类型糖链核心0(Tn)的MUC1串联单元和糖肽。
[2]
[1]的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人MUC1串联单元的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述O-键-类型糖链核心0(Tn)结合SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中第8位苏氨酸。
[3]
[1]的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人MUC1串联单元的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述O-键-类型糖链核心0(Tn)结合SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第8位丝氨酸。
[4]
[1]-[3]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有以下i)-iii)中给出的结合特性。
i)不结合其中O-键-类型糖链核心0(Tn)被O-键-类型糖链T或STn取代的糖肽；
ii)不结合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和
iii)不结合MUC2的串联单元肽或MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
[5]
[1]-[4]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个抗原结合部分，所述抗原结合部分包含免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域，所述重链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:8所述氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，且CDR3包含SEQID NO:10所示氨基酸序列，所述轻链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’包含SEQ ID NO:11所述氨基酸序列，CDR2’包含SEQ ID NO:12所示氨基酸序列，且CDR3’包含SEQ ID NO:13所示氨基酸序列。
[6]
[1]-[4]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个抗原结合部分，所述抗原结合部分包含免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域，所述重链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1包含SEQ ID NO:16所述氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO:17所示氨基酸序列，且CDR3包含SEQID NO:18所示氨基酸序列，所述轻链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’包含SEQ ID NO:19所述氨基酸序列，CDR2’包含SEQ ID NO:20所示氨基酸序列，且CDR3’包含SEQ ID NO:21所示氨基酸序列。
[7]
[5]的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7。
[8]
[6]的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:15。
[9]
[1]-[8]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是包含互补决定区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一个的肽。
[10]
[1]-[9]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合片段是Fab、F(ab’)2、Fab’、双抗体、单链抗体(例如scFv或dsFv)、双特异性抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
[11]
[1]-[10]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其用于特异性检测MUC1。
[12]
一种特异性检测人体液样品中MUC1的方法，包括:
(a)使[1]至[10]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述样品接触；和
(b)在接触后测量所述样品中抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物的形成。
[13]
[12]的方法，其用于检测恶性肿瘤的存在或不存在，其中所述恶性肿瘤在所述体液样品中展现MUC1的不正常表达。
[14]
[13]的方法，其中所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
[15]
用于应用[12]至[14]中任一项的方法的试剂盒，包含：
(a)[1]至[10]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(b)用于测量抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物的试剂。
[16]
用于预防或治疗恶性肿瘤的药物组合物，其包含[1]至[10]中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
[17]
[16]的组合物，其中所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
发明效果
本发明提供针对人MUC1的单克隆抗体形式的抗MUC1抗体，其特异性识别MUC1的串联单元肽的O-键-类型糖链是核心0(Tn)的MUC1，不识别或不结合没有添加O-键-类型糖链的裸肽或者除了O-键-类型糖链是Tn的那些之外的MUC1链肽，并且提供采用抗原糖肽制备抗体的方法。使用本发明的抗MUC1抗体，有可能特异性地、高度灵敏地、可靠地和便利地检测MUC1蛋白，并且检测MUC1表达相对于正常对照发生改变的恶性肿瘤和炎症疾病。通过本发明的抗MUC1抗体抑制癌症进展或转移，其能够被应用为预防和/或治疗癌症的药物。
附图简述
[图1]MUC1-衍生糖肽的MALDI-TOFMS谱。
[图2]MUC2-衍生糖肽的MALDI-TOFMS谱。
[图3]MUC4-衍生糖肽的MALDI-TOFMS谱。
[图4]通过糖肽-固定化微阵列评价SN-101和SN-102的反应特异性。
[图5]用抗体SN-101和SN-102对表达MUC1的细胞的免疫荧光染色的结果。
[图6]用抗体SN-101的细胞增殖阻断测试结果。
[图7]显示抗体SN-101和SN-102可变区的氨基酸序列的实例。
[图8]显示含有抗体SN-101的可变区的氨基酸序列。
[图9]显示含有抗体SN-102的可变区的氨基酸序列。
本发明实施方式
下面将更详细地描述本发明。
1.抗原糖肽和抗体
本发明的抗体是针对人MUC1的单克隆抗体，其特异性识别在人MUC1串联单元的氨基酸序列中的任意苏氨酸或丝氨酸上具有O-键-类型糖链核心0(Tn)的MUC1串联单元和糖肽。
本发明的抗体的实例是这样的单克隆抗体，其中所述人MUC1串联单元的氨基酸序列包含上述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且所述O-键-类型糖链核心0(Tn)键接至SEQID NO:1所示的氨基酸序列中第8位苏氨酸。本发明的抗体的另一实例是这样的单克隆抗体，其中所述MUC1串联单元的氨基酸序列包含上述SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述O-键-类型糖链核心0(Tn)键接至SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中第8位丝氨酸。
本发明的这些抗体可以是具有以下i)-iii)中的结合特性的那些：
i)不结合其中O-键-类型糖链核心0(Tn)被O-键-类型糖链T或STn取代的糖肽；
ii)不结合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和
iii)不结合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串联单元肽或具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
1-1.抗原糖肽
作为MUC1串联重复的O-键-类型糖链被最初转移至核心肽的糖最经常是GalNAc。因此，产生了Tn抗原。尽管Tn在正常MUC1罕见，但其在癌症衍生的MUC1中被发现。
人MUC1的串联单元肽具有以下氨基酸序列：Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(SEQ ID NO:1)。
人MUC1的串联单元肽变体具有以下氨基酸序列：Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Glu-Ser-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(SEQ ID NO:2)。
在制备抗原中，其中O-键-类型糖链被添加至上述肽两者之一的前述氨基酸的糖肽可以被用作抗原。O-键-类型糖链被添加至的该肽是人工合成的。
所述O-键-类型糖链是包含Tn(GalNAc)的核心结构的糖链。所述O-键-类型糖链结合具有上述SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列的串联单元肽的第八位氨基酸苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)。
通过本发明人开发的高度利用微波和酶合成方法的合成技术进行抗原糖肽的合成。更具体地，例如，其可以基于非专利文献9和专利文献6至8描述的方法实施。非专利文献9和专利文献6至8的全部内容具体地通过引用并入本文.
1-2.抗体：
本发明的抗体可以通过常规方法采用1-1描述的糖肽作为抗原制备。所述抗原糖肽可以与载体蛋白连接以增强其抗原性特性.在该情况下,可以合成结合载体蛋白所需的Cys被添加至糖肽的C端的抗原糖肽并用作所示抗原糖肽.载体蛋白包括钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等等。可购买获得本领域已知的商业试剂盒.将抗原施用至哺乳动物例如小鼠、兔或大鼠。免疫主要通过静脉内、皮下、腹膜内或足垫注射进行。免疫间隔不特别限制。免疫可以以若干天至若干周的间隔进行1至5次。在最后免疫之后从几天至90天收集产生抗体的细胞。产生抗体的细胞的实例为淋巴细胞、脾细胞和外周血细胞。所述产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤。可以采用通常可获得的已经建立的骨髓瘤细胞的细胞系。期望采用具有药物选择性、在非融合状态不能在HAT选择性培养基(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)上生长、以及仅仅能够在与产生抗体的细胞融合的状态存活的特性的细胞。骨髓瘤细胞的实例为骨髓瘤细胞株例如SP2、P3X63-Ag.8.UI(P3U)、和NS-1。
细胞融合后从细胞中筛选靶杂交瘤。例如，细胞悬浮液用含胎牛血清的RPM-1640培养基合适地稀释，然后接种至微量滴定板。将选择性培养基(如HAT培养基)添加至各孔，接着培养细胞，合适地替换培养基。结果，在开始用选择性培养基培养后，生长大约10至30天的细胞可以收获为杂交瘤。接着，用酶联免疫吸附测定(ELISA)等筛选杂交瘤上清液以测定与MUC1反应的抗体是否存在。融合的细胞通过有限稀释法等建立产生靶单克隆抗体的杂交瘤。
可以采用常规细胞培养方法、腹水形成方法等从已经建立的杂交瘤收集单克隆抗体。所述抗体可以通过合适地选择已知的方法例如硫酸铵沉淀、离子交换色谱法、凝胶过滤、亲和色谱法或其一些组合纯化。
可以用于本发明的单克隆抗体的球蛋白类型并不具体限定。可以是IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，优选IgG和IgM。
使用上述方法制备的本发明的抗-MUC1单克隆抗体是小鼠抗体。通过已经建立的若干已知技术，它们可以被转换成嵌合抗体或人源化抗体(转换方法将在下文进一步描述)。和本发明的抗小鼠MUC1单克隆抗体具有相同抗原特异性的嵌合抗体和人抗体包括在本发明的抗体内。和本发明的抗小鼠MUC1单克隆抗体具有相同抗原特异性且具有一不同抗原特异性的双特异性抗体包括在本发明的抗体内。
本发明的单克隆抗体的具体实例是单克隆抗体SN-101和SN-102，其在实施例中描述。单克隆抗体SN-101是由根据布达佩斯条约以保藏号NITE BP-01845于2014年4月16日保藏于国立技术与评价研究所专利微生物保藏所(NPMD)(2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba Prefecture,Japan,292-0818)的杂交瘤细胞系统分泌的单克隆抗体。单克隆抗体SN-102是由杂交瘤株3C10-E11分泌的单克隆抗体(见实施例)。
单克隆抗体SN-101是具有重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID No:6的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID No:7的氨基酸序列。单克隆抗体SN-101包含至少一个抗原结合位点，其含有免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域。所述重链可变区结构域在其序列内包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。以及CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:10。上面所述轻链可变区结构域在其序列内包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’。CDR1’包含氨基酸序列SEQ ID NO:11。CDR2’包含氨基酸序列SEQ IDNO:12。以及CDR3’包含氨基酸序列SEQ ID NO:13。
单克隆抗体SN-102是具有重链可变区和轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。单克隆抗体SN-102包含至少一个抗原结合位点，其含有免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域。所述重链可变区结构域在其序列内包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:16。CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。以及CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:18。上面所述轻链可变区结构域在其序列内包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’。CDR1’包含氨基酸序列SEQ ID NO:19。CDR2’包含氨基酸序列SEQID NO:20。以及CDR3’包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。
单克隆抗体SN-101具有如下i)至v)的结合特性：
i)结合MUC1衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys；
ii)不结合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖链已经被T或STn取代的糖肽；
iii)不结合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和
iv)不结合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串联单元肽或具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
单克隆抗体SN-101还结合无C端Cys的MUC1-衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，且不结合具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)。
单克隆抗体SN-102具有如下i)至vi)的结合特性：
i)结合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，其中Tn糖链键接至具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第8位苏氨酸；
ii)不结合或仅仅弱结合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖链已经被T或STn取代的糖肽；
iii)不结合包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)；
iv)不结合这样的糖肽，其中Tn在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第14位丝氨酸或第15位苏氨酸处修饰；
v)结合这样的糖肽，其中Tn糖链在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的全部苏氨酸和丝氨酸处修饰；和
vi)不结合MUC2的串联单元肽或MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
单克隆抗体SN-102结合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys，所述糖肽在其C端具有Cys且其中Tn糖链被键接至具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽的第8位苏氨酸，并且不结合具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的肽(裸肽)。
本发明除了上述单克隆抗体外还涵盖单克隆抗体的抗原结合片段。所述抗原结合片段是含有SN-101或SN-102的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一个的肽。所述抗原结合片段例如是Fab、F(ab’)2、Fab’双抗体、或单链抗体(如scFv或dsFv)。然而，所述抗原结合片段并不旨在限定于上述的。其仅需要是含有SN-101或SN-102的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一个，且具有和上述SN-101的i)-v)相同的结合特性或和上述SN-102的i)-vi)相同的结合特性的肽。在嵌合抗体、人抗体或双特异性抗体中，其足以使得所述免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域为含有SN-101或SN-102的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3、CDR1’、CDR2’和CDR3’中的至少一个的肽，具有和上述SN-101的i)-v)相同的结合特性或具有和上述SN-102的i)-vi)相同的结合特性。
抗原结合片段及其制备方法将解释如下。
[Fab、F(ab')2、Fab']
制备方法(1)：通过用预先制备的酶消化小鼠单克隆抗体并通过还原反应切断二硫键制备。
-Fab:用木瓜蛋白酶消化。
-F(ab')2:用胃蛋白酶消化。
-Fab':用胃蛋白酶消化并用β-巯基乙醇还原处理以切断二硫键。
制备方法(2)：采用遗传重组技术通过蛋白表达技术制备
-Fab:
-编码VH(H链可变区)和CH1(H链恒定区结构域1)的碱基序列
-编码VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)的碱基序列
为使得上述两种序列被大肠杆菌和动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)表达，它们被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得Fab。
-F(ab')2、Fab':
-编码VH(H链可变区)和CH1(H链恒定区结构域1)以及含有用于形成二聚体半胱氨酸的铰链区的碱基序列
-编码VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)的碱基序列
为使得上述两种序列被大肠杆菌或动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)表达，它们被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得F(ab’)2和Fab’。
[scFv、dsFv]
制备方法:采用遗传重组技术通过蛋白表达技术制备
-scFv:
-编码VH(H-链可变区)的碱基序列
-编码柔性氨基酸例如接头序列”GSSSGSSSSGSSSSGSSSS”等的碱基序列。
-编码VL(L-链可变区)的碱基序列
为使得在大肠杆菌或动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)中表达为连续的VH-接头-VL或VL-接头-VH融合蛋白，其被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得scFv。
-dsFv:
-编码VH(H链可变区)的碱基序列
-编码VL(L链可变区)的碱基序列
在VH的C端侧和VH之间插入半胱氨酸。为使得在大肠杆菌或动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)中表达为连续的VH-接头-VL或VL-接头-VH融合蛋白，其被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得dsFv。
[双抗体]
制备方法:采用遗传重组技术通过蛋白表达技术制备
(1)编码针对抗原X的VH(H链可变区)的碱基序列(2)编码针对抗原X的VL(L链可变区)的碱基序列(3)编码针对抗原X的VH(H连可变区)的碱基序列(4)编码针对抗原X的VL(L链可变区)的碱基序列
(5)编码柔性氨基酸例如接头序列”GSSSGSSSSGSSSSGSSSS”的碱基序列。
为使得在大肠杆菌或动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)表达VH(1)-接头(5)-VL(4)和VH(3)-接头(5)-VL(2)为连续的融合蛋白，它被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得双抗体。
[嵌合抗体或人源化抗体]
-嵌合抗体
制备方法:采用遗传重组技术通过蛋白表达技术制备
-编码小鼠VH(H链可变区)和人抗体H链恒定区的碱基序列
-编码小鼠VL(L链可变区)和人抗体L链恒定区的碱基序列
为使得上述两种序列在动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)表达，它们被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得嵌合抗体。
-人源化抗体
制备方法:采用遗传重组技术通过蛋白表达技术制备
-编码人源化VH的碱基序列，其中CDR1、CDR2和CDR3被插入至FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4中人抗体可变区VH的FR1、FR2、FR3和FR4之间，构成小鼠VH(H-链可变区)和人抗体H链恒定区
-编码人源化VL的碱基序列，其中CDR1、CDR2和CDR3被插入至FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4中人抗体可变区VL的FR1、FR2、FR3和FR4之间，构成小鼠VL(H-链可变区)和人抗体L链恒定区
为使得上述两种序列在动物细胞(CHO、HEK293、昆虫细胞)表达，它们被并入适于特定细胞的表达载体，之后所述基因被导入至细胞，通过产生重组蛋白获得人源化抗体。
2-1.检测人体液样品中MUC1的方法
本发明包括在人体液样品中特异性检测MUC1的方法。该方法包括如下步骤(a)和(b)：
(a)使本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述样品接触；和
(b)在接触后测量所述样品中抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物的形成。
2-2.用于免疫学测量人MUC1的试剂盒
本发明的试剂盒使得可以应用本发明的检测人MUC1的方法。其包括：
(a)本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段；和(b)用于测量抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物的试剂。
该试剂盒所采用的本发明的单克隆抗体(也称作“抗-MUC1抗体”)可以被固定于支持物上。所述支持物可以是抗原会粘附的任何支持物，其是本领域普通技术人员已知的。例如，所述支持物可以使微量滴定板的测试孔，硝酸纤维素或一些其它合适的膜。或者，所述支持物可以是珠或盘(例如玻璃、纤维玻璃、乳胶或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。所述支持物还可以是磁性颗粒或纤维光学传感器。
本发明的抗-MUC1抗体可以用可通过简单测量方法可视化检测的放射性同位素、酶、荧光材料、发光材料或金属胶体、有色乳胶等标记。可以用于标记的放射性同位素为：14C、3H、32P、125I、131I等等。特别适合使用125I。这可以通过氯胺-T方法、过氧化物酶方法、iodogen法、Bolton-Hunter法等连接至所述单克隆抗体。可以用作标记的酶的实例为β-半乳糖苷酶(βGAL)、碱性磷酸酶(ALP)和辣根过氧化物酶(HRP)。这些可以通过常规方法连接至所述单克隆抗体。可以用作标记的荧光材料包括荧光素(fluorescein)、荧光胺、异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明。可以用作标记的发光材料包括：荧光素(luciferin)、鲁米诺衍生物和吖啶酯类。金胶体和有色乳胶可以应用于简单的检测方法。
可以基于所采用的免疫学检测方法合适地确定用于测量抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物的试剂。可以采用能够检测抗体(或其抗原结合片段)-抗原复合物(当人体液样品含人MUC1时形成)的已知试剂。
在本发明中，属于“人体液样品”是潜在地含有人MUC1的材料，例如人血浆、血清、血液、尿、唾液或癌症组织分泌物。
除了使用本发明的单克隆抗体作为抗体外，本发明的MUC1检测方法可以使用常规已知免疫学测量方法实现。常规已知免疫学测量方法的实例为免疫组化染色方法、免疫电子显微术和免疫测定(例如酶促免疫测定(ELISA、EIA)、荧光免疫测定、放射性免疫测定(RIA)、免疫色谱、免疫凝集方法以及蛋白印迹法)。步骤(b)中在接触后测量抗体-抗原复合物形成的方法可以基于所述免疫学测量方法合适地选择。
所述免疫学测量方法将更详细地描述。一个实例是夹心式免疫学测量方法，包含将本发明的单克隆抗体(第一单克隆抗体)固定于固相上并将其与含抗原的样品孵育的步骤；添加将标记的第二单克隆抗体并孵育所获得的混合物的步骤；和检测在混合物中产生的经标记的抗原-抗体复合物的步骤。在本发明的免疫学测量方法中，可以同时孵育所述样品、固定的第一单克隆抗体和经标记的第二单克隆抗体。任何的夹心式免疫学测量方法例如夹心式放射性免疫测定(RIA)、夹心式酶促免疫测定(EIA)、夹心式荧光免疫测定(FIA)、夹心式发光免疫测定(CLEIA)和基于夹心式测定的免疫色谱术都可以采用为所述夹心式免疫学测量方法，取决于检测方法。对于定量，RIA和EIA方法是期望的。
夹心式RIA方法可以基于期望的实施方式进行。在夹心式RIA方法中，具体地，上面已经固定有第一单克隆抗体(本发明的单克隆抗体)的珠与标准溶液或样品混合，混合物在4至45℃(优选25至37℃)孵育1至4小时(优选2小时)(第一个反应)。在清洗后，添加含有例如已经用125I标记的第二单克隆抗体的溶液，混合物在4至45℃(优选25至37℃)孵育1至4小时(优选2小时)(第二个反应)。在清洗后，用伽马计数器等检测结合至珠上的抗原-抗体复合物的放射活性以定量。在另一优选的实施方式中，进行夹心式EIA方法。在夹心式EIA方法中，具体地，上面已经固定有第一单克隆抗体的珠与经标记的溶液或样品混合，混合物在4至45℃(优选25至37℃)孵育1至4小时(优选2小时)(第一个反应)。在清洗后，添加含有用酶标记如辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二单克隆抗体的溶液，混合物在4至45℃(优选25至37℃)孵育1至4小时(优选2小时)，包含抗体-抗体的免疫复合物在珠上形成(第二个反应)。珠上的酶活性用该酶特异性的底物测量，例如，当酶标记是HRP时，通过色度法用四甲基联苯胺(TMB)测量。因此可以测量捕获在珠上的量。色度法定量可以使用常规分光光度计进行。
2-3.检测人MUC1
本发明的方法可以用于检测在体液样品中是否存在展现异常MUC1表达的恶性肿瘤。举例而言，展现异常MUC1表达的恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。本发明的抗体和MUC1特异性反应，并因此有效地检测和人MUC1相关的恶性肿瘤例如乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
已报道MUC1在恶性肿瘤中的过表达，例如乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。具体而言，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中发现MUC1的90％或更高的过表达。MUC1的过表达伴随着多种癌症的不良预后。患者血液中的MUC1的浓度升高(非专利文献1)。
据报道MUC1的O-糖苷出现剧烈变化伴随着癌变、癌症进展和转移(非专利文献1)。在健康上皮组织中，MUC1的VNTR区域中的O-糖链修饰正常地由含8-10个单糖单元的聚乳糖胺长链和支链糖组成。由于正常MUC1的细胞外区域被如此大量的糖链修饰，其显示出对粘膜的保护、吸水和润滑作用；对细菌和外来物质的攻击的保护作用；和细胞间的调节作用和对细胞基质相互作用的调节作用。此外，MUC1表达于健康细胞的细胞顶端。然而，在癌症细胞中顶端表达消失，变成非极性表达，MUC1在整个细胞表面出现。当这出现时，VNTR区域的O-糖链修饰的模式剧烈变化，出现简单的短糖链的O-糖链修饰而不是正常细胞中看到的包含长链和支链的复杂糖链。伴随癌症发展的MUC1低糖链修饰和非极性表达是由正常隐藏的肽表位的暴露和产生新的碳水化合物表位引起。因此，本发明的抗体，其与MUC1的这些表位特异性反应，能够区分和识别健康和癌性MUC1，且能用于检测与人MUC1相关的恶性肿瘤。仅仅攻击对癌症细胞阳性的MUC1也变得可能。
本发明的免疫学测量试剂盒含有上面描述的抗-MUC1抗体。因此，本发明的试剂盒可以用于检测包含于收集自怀疑受疾病阻碍或患疾病的样本的样品中的人MUC1，并因此快速和容易地确定样本中障碍或疾病的存在。用于采用此种免疫学测量方法测定疾病或障碍的试剂是广泛已知的。本领域普通技术人员将能够容易地选择除抗体外的合适组分。只要本发明的免疫学测量试剂盒是用于实现免疫学测量方法的技术，其可以用作任何方法的一部分。
本发明还提供用于采用本发明的抗体诊断癌症的方法、含有本发明的抗体的诊断剂和含有抗体的诊断试剂盒。本发明所述诊断癌症的方法、诊断剂和诊断试剂盒中含有的所述抗体是本发明上文所述的抗体。本发明的抗体可以用于这些癌症诊断中，因为它们特异性地结合上述特定癌症。
本发明的抗体可以用作用于诊断上述恶性肿瘤和用于检测患者中疾病进展的标志物。在一种实施方式中，可以通过比较和评估获得自患者的生物学样品相对于事先基于MUC1水平确定的截断值来诊断患者中的癌症。
通过上述(b)获得的测量结果和通过相同步骤(a)和(b)对对照样品获得的测量结果可以比较并用于检测在已经测量的体液样品中是否存在恶性肿瘤。对照样品可以使获得自健康人的体液样品。
为了确定癌症存在与否，检测自结合至并保留于固相支持物上的报道基团的信号通常与相应于预定截断值的信号相比较。在一实施方式中，所述截断值是通过将固定的抗体与来自无癌症患者的样品孵育而获得的信号的平均值。通常而言，当样品产生超出预定截断值三个标准差的信号时，其被认为是癌症阳性的。可以例如从一组假阳性比例(100％-特异性)和真阳性比例(即，灵敏度)的图(对应于各自可能的诊断测试结果的截断值)确定所述截断值。最接近图左上边缘的截断值(即该值含有最大区域)是最精确的截断值。产生高于本发明的方法确定的截断值的信号的样品将被认为是阳性。或者，所述截断值也可以沿着图迁移至图的左边以最小化假阳性的比例，或迁移至右边以最小化假阴性的比例。通常而言，产生高于该方法确定的截断值的信号的样品将被认为是癌症阳性。
3.药物组合物
本发明的药物组合物含有单克隆抗体作为活性成分，用于预防和/或治疗恶性肿瘤，且可以含有任何药学可接受载体。所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
本发明的抗-MUC1抗体及其抗原结合片段可用于预防和/或治疗涉及MUC1的疾病。涉及MUC1的疾病包括恶性肿瘤，例如乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。在具有这些恶性肿瘤的患者中，MUC1表达异常、MUC1糖链结构异常和导致的功能异常是公认的。因此，本发明的抗-MUC1抗体能够通过抑制恶性肿瘤的作用预防和/或治疗恶性肿瘤。
本发明的抗-MUC1抗体和其抗原结合片段抑制加速的细胞增殖、癌症转移等等(其由于不正常MUC1表达、MUC1不正常糖链结构而出现并导致在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌中观察到的功能不正常)，允许预防和/或治疗癌症。
最近，已经发现MUC1和半乳凝素之间的相互作用在乳腺癌和结肠癌等的转移中是重要的(非专利文献11)。在癌症细胞侵袭和转移的过程中，癌症细胞离开最初部位，侵入周围的细胞外基质和内皮细胞，并穿透血管和淋巴管。最终，它们附着于第二位点并增殖。癌症细胞从循环到转移部位的迁移包括(i)循环癌症细胞的停止以及癌症细胞和血管内皮细胞之间的瞬时弱接触(对接)；(ii)用不同的粘附受体诱导局部改变和配体表达(整合素、钙粘蛋白等)，和随后(iii)癌症细胞对血管内皮细胞的强粘附(锁定)。已经了解MUC1和半乳凝素3的相互作用在这三个过程中起重要作用。半乳凝素是识别β-半乳糖苷结构并结合或交联糖链的蛋白的通称。半乳凝素3是15种半乳凝素之一且已知是存在于内皮细胞，以及在免疫细胞的细胞质和核中、在表面上和在细胞外基质等。已经证明癌症细胞的MUC1结合半乳凝素3，半乳凝素3的血液浓度在具有转移性癌症的患者中相对于健康对照升高，循环癌症细胞对血管内皮细胞的粘附取决于癌症细胞的MUC1表达和在上皮细胞中存在细胞外半乳凝素3，细胞外半乳凝素3与癌症细胞MUC1的结合导致MUC1的细胞表面的显著局部改变，加强了癌症细胞和血管内皮细胞的结合等等。其还显示血液中半乳凝素和MUC1的相互作用是癌症细胞转移至远端器官的重要基础分子机制。因此，如果能够阻断MUC1和半乳凝素3的结合，将认为可能抑制全部上述转移过程(i)至(iii)并抑制转移。
在下文较远给出的实施例中，本发明的抗体描述为阻断MUC1和半乳凝素3的结合。这提示使用本发明的抗体，将可能预防和/或治疗在癌症发展中过表达MUC1的癌症如胰腺癌、卵巢癌和肺癌的转移。
本发明的抗-MUC1单克隆抗体是小鼠抗体。本发明的药物组合物所用的抗体优选是已经转换成嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体的小鼠抗体。小鼠抗体可以使用已知方法转换成嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
本发明的药物组合物可以由本领域普通技术人员已知的方法配制，活性成分是本发明的抗体。例如，其能够以在水中或一些其它药学可接受液体中的无菌溶液的形式胃肠外使用，或作为悬浮液注射。例如，可能通过和药学可接受载体或介质的合适组合来配制，所述药学可接受载体或介质具体为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘剂等，混合于一般公认的制剂所需的单位剂量形式。确定在这些制剂中活性成分的量以产生在指定范围内的合适的剂量。
用于注射的无菌组合物可以根据采用例如注射用蒸馏水的媒介物的常用制剂来配制。注射用水性溶液的实例为生理盐水和含有葡萄糖或一些其他佐剂如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠的等张溶液。例如，合适的增溶剂例如醇，具体而言，乙醇和多元醇如丙二醇和聚乙二醇，以及非离子型表面活性剂如聚山梨酯80TM和HCO-6，可以组合使用。
油性液体的实例是芝麻油和大豆油；苯甲酸苄酯和苯甲醇形式的增溶剂可以组合使用。缓冲液例如磷酸缓冲液、醋酸钠缓冲液；安抚剂如盐酸普鲁卡因；稳定剂如苯甲醇和酚；以及氧化抑制剂也可以配制。制备的注射剂通常装载于合适的安瓿中。为了递送至细胞，可以使用脂质体包裹药物。
施用可以是口服或胃肠外。优选胃肠外施用。具体实例是注射剂、鼻施用剂、通过肺的施用剂和透皮施用。实例是全身性施用或局部施用，以注射的形式如静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射。
本发明的抗体的剂量和施用方法可以基于患者的年龄、体重和性别；待治疗的症状的性质；它们的严重程度等等合适地选择。以示例的方式，含有所述抗体的药物组合物的单剂量可以在0.0001mg至1,000mg每公斤体重的范围内选择。或者，施用的剂量可以在0.01至100,000mg/患者身体的范围内选择。然而，这些数字并不是必然限制。施用的剂量和施用的方法可以基于患者年龄、体重、性别、症状等合适地变化。本领域普通技术人员将能够做出合适的选择。
实施例
下面将通过实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
糖肽合成
合成用于评价抗体特异性的糖肽的方法如下给出。对于每种化合物，合成具有与用于特异性评价的交联酮连接的序列以及化合物1至4中的Cys的化合物。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(化合物1)
使用TentaGel S RAM树脂(0.24mmol/g,50mg,12μmol)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物6(6.3mg,产率22％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro- Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(化合物2)
使用TentaGel S RAM树脂(0.24mmol/g,100mg,36μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(144μmol),HBTU(144μmol),HOBt(144μmol)和DIEA(216μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Naca(1→0))(43μmol),HBTU(43μmol)和HOBt(43μmol)以及DIEA(108μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(43μmol)和HOBt(43μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物2(13.3mg,产率15％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro- Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(化合物3)
使用TentaGel S RAM树脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac4Galβ(1→3)Ac2GalNAcα(1→O)(58μmol),HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)以及DIEA(144μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物3(22.0mg,产率17％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(唾液酸-T)-Arg-Pro-Ala- Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(化合物4)
将化合物3(10mM,300μL,水)与通过混合1,000mM HEPES缓冲液(pH 7.3,30μL),1,000mM HEPES缓冲液(pH 7.0,30μL),1,000mM MnCl2(6μL),150mM CMP-NeuAc(60μL),1.4U/mLα2,3-(O)-唾液酸转移酶,大鼠,重组,草地夜蛾(30μL,Calbiochem),和水(74μL)获得的反应溶液混合。混合物在25℃孵育24小时，之后通过反向高效液相色谱法纯化反应液，产生冻干粉末形式的化合物4(5.5mg,60％产率)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物5)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol,Biotage的产品)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物5(45.8mg,产率45％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro- Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物6)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物6(43.2mg,产率39％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser(Tn)-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物7)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Ser(Ac3GalNacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物7(21.1mg,产率19％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物8)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacα(1→O))(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物8(48.2mg,产率43％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr(Tn)-Ser(Tn)-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro- Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物9)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.45mmol/g,100mg,45μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(180μmol),HBTU(180μmol),HOBt(180μmol)和DIEA(270μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3GalNacα(1→O)或Fmoc-Ser(Ac3GalNacα(1→O)(54μmol),HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)以及DIEA(135μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(54μmol)和HOBt(54μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物9(37.8mg,产率25％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro- Gly-Ser-Thr-Ala--Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物10)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.90mmol/g,200mg,90μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(360μmol),HBTU(360μmol),HOBt(360μmol)和DIEA(540μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacβ(1→3)Ac2Ga1Nacα(1→O))(108μmol),HBTU(108μmol)和HOBt(108μmol)以及DIEA(270μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(108μmol)和HOBt(108μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:2.5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物10(110mg,产率46％)。
合成5-氧代己酰-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(唾液酸-T)-Arg-Pro-Ala- Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(化合物11)
将化合物8(10mM,496μL,水)与通过混合1,000mM HEPES缓冲液(pH 7.0,30μL),1,000mM MnCl2(8μL),200mM CMP-NeuAc(95μL),1.4U/mLα2,3-(O)-唾液酸转移酶,大鼠,重组,草地夜蛾(28μL,Calbiochem),和水(212μL)获得的反应溶液混合。混合物在25℃孵育24小时，之后通过反向高效液相色谱法纯化反应液，产生冻干粉末形式的化合物11(14mg,96％产率)。
合成5-氧代己酰-Pro-Pro-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr- Thr-Thr-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2(化合物12)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.48mmol/g,25mg,12μmol)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反应9分钟进行。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水:三异丙基硅烷(95:2.5:2.5,v/v/v)处理1小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物12(7.2mg,产率30％)。
合成5-氧代己酰-Pro-Pro-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr- Ser-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2(化合物13)
使用Rink Amide-ChemMatrix树脂(0.48mmol/g,25mg,12μmol)形式的固相支持物合成糖肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(48μmol),HBTU(48μmol),HOBt(48μmol)和DIEA(72μmol)在DMF溶液中反应9分钟进行。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacα(1→O))(14μmol),PyBOP(14μmol)和HOBt(14μmol)以及DIEA(36μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加PyBOP(14μmol)和HOBt(14μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水:三异丙基硅烷(95:2.5:2.5,v/v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物13(4.7mg,产率14％)。
合成5-氧代己酰-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr- Asp-Thr-Ser-Cys-NH2(化合物14)
使用TentaGel S RAM树脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol,获得自Rapp Polymere,GmbH)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物14(9.0mg,产率11％)。
合成5-氧代己酰-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val- Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH2(化合物15)
使用TentaGel S RAM树脂(0.24mmol/g,200mg,48μmol,获得自Rapp Polymere,GmbH)形式的固相支持物合成肽固相。氨基酸延伸反应在微波辐照条件(40W,2,450MHz,50℃)通过将Fmoc氨基酸衍生物(192μmol),HBTU(192μmol),HOBt(192μmol)和DIEA(288μmol)在DMF溶液中反应6分钟进行。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。糖链取代氨基酸延伸反应通过使Fmoc-Thr(Ac3Ga1Nacα(1→O))(58μmol),HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)以及DIEA(108μmol)在DMF溶液中用微波辐照反应10分钟进行。添加HBTU(58μmol)和HOBt(58μmol)且混合物用微波辐照反应10分钟。混合物在室温用乙酸酐/DIEA/DMF(10:5:85,v/v/v)溶液处理1分钟以乙酰化未反应的氨基基团。接着，通过微波辐照(40W,2,450MHz,50℃),进行20％哌啶/DMF处理3分钟以去除Fmoc基团保护。在糖肽合成中,(1)用不同Fmoc氨基酸延伸，(2)乙酰化处理，和(3)Fmoc去除的三个步骤顺序地重复进行。所获得的固相树脂用三氟乙酸:水(95:5,v/v)处理2小时。过滤反应溶液，加入乙醚诱导沉淀，获得粗结晶。粗产物溶解于甲醇，加入1N氢氧化钠将溶液调节为pH12.0-12.5，且处理在室温进行1小时。向其添加10％乙酸将溶液调节至pH7附近，之后蒸馏掉溶剂。获得的残余物通过反相高效液相色谱法纯化，产生冻干粉末形式的化合物15(13.0mg,产率14％)。
化合物1至15的鉴定数据总结:
衍生自MUC1的糖肽的MALDI-TOFMS谱：图1
(a)化合物1,m/z calcd for C100H160N30O34S[M+H]+2358.151,found2358.383；
(b)化合物2,m/z calcd for C108H173N31O39S[M+H]+2561.231,found2561.457；
(c)化合物3,m/z calcd for C114H183N31O44S[M+H]+2723.283,found2723.504；
(d)化合物4,mlz calcd for C125H200N32O52S[M+H]+3014.379,found 3014.640
(e)化合物5,m/z calcd for C97H156N29O33[M+H]+2255.142,found 2254.927；
(f)化合物6,m/z calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2457.954；
(g)化合物7,mlz calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2458.077；
(h)化合物8,m/z calcd for C105H169N30O38[M+H]+2458.221,found 2458.159
(i)化合物9,m/z calcd for C137H221N34O58[M+H]+3270.538,found 3270.308
(j)化合物10,m/z calcd for C111H179N30O43[M+H]+2620.274,found2620.049；
(k)化合物11,m/z calcd for C122H196N31O51[M+H]+2911.369,found2911.207；
衍生自MUC2的糖肽的MALDI-TOFMS谱：图2
(l)化合物12,m/z calcd for C90H144N20O31[M+Na]+2024.020,found 2024.111；
(m)化合物13,m/z calcd for C122H196N24O51[M+Na]+2836.338,found 2836.501；
衍生自MUC4的糖肽的MALDI-TOFMS谱：图3
(n)化合物14,m/z calcd for C73H181N20O28S[M+Na]+1777.804,found1777.910；
(o)化合物15,m/z calcd for C81H131N21O33S[M+Na]+1980.884,found1981.045。
实施例1
采用Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr- Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr作为抗原制备单克隆抗体
通过向Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr的C端添加载体蛋白结合所需的Cys获得化合物Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr Cys-NH2(85μg)与钥孔血蓝蛋白(KLH)缀合并施用至BDF(注册商标)-1小鼠的尾巴基部以诱导免疫应答。17个小时后采用相同方法用化合物3进行额外的免疫。3天后收集血液并收集髂淋巴结。所收集的细胞和骨髓瘤SP2细胞融合。杂交瘤在HAT选择性培养基中培养，并选择产生抗体的细胞。接着，杂交瘤培养上清液接种至ELISA板并在结合反应中用化合物2筛选。
融合细胞克隆通过有限稀释法进行。分别建立了产生靶单克隆抗体SN-102的杂交瘤株3A9-4B1(NPMD,保藏号NITE BP-01845)，产生靶单克隆抗体SN-102的3C10-E11。
实施例2培养产生单克隆抗体(SN-101和SN-102)的细胞株并获得纯化的抗体
培养方法：产生SN-101的杂交瘤株NITE BP-01845生长于含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基。将22mL量的无血清培养基Panserin H4000(PAN-Biotech)添加至8.1x106回收的细胞以获得上清液。培养细胞使他们驯化于培养基。驯化的细胞在相同培养基中生长至1.0x108并继代培养至5.0x105/mL。然后静止培养2周,在该点通过离心去除培养物上清液.另一杂交瘤株3C10-E11通过相同办法培养以获得培养物上清液。
纯化方法：通过如下给出的方法从经培养的杂交瘤株NITE BP-01845纯化SN-101。使200mL量的培养物上清液通过0.45μm滤器以获得纯化的抗体材料。或者，将硫酸铵添加至培养物上清液实现50％饱和，并10,000g离心20分钟以收集沉淀物。其溶解于10mL的PBS中，透析溶液获得纯化的材料，并采用HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare)进行亲和色谱。连接于AKTA Explorer 100(GE Healthcare)后的HiTrap Protein G HP柱用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡，添加培养物上清液。没有结合至柱的不需要的组分用相同缓冲液洗掉，之后用小量的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.5)洗脱并通过添加小量1M tris-HCl缓冲液(pH9.0)中和。将通过柱的级分重复添加至柱以增加抗体的收集率。到该点的操作产生2.3mg的SN-101。从200ml的3C10-E11的培养物上清液中，通过相同方法产生8.3mg的SN-102。
实施例3抗体的反应特异性评估
制备固定化糖肽的阵列
用于固定化糖链阵列的底材(Sumitomo Bakelite制造)用2M HCl在37℃处理2小时,去除t-叔丁氧羰基基团(Boc基团)保护。产物用水洗涤两次，然后干燥以将氨氧基(aminoxy)置于所述底材的表面上。将点样溶液(25mM AcOH/吡啶,0.005％Triton X-100,pH 5.4)添加至表1所示的不同合成糖肽以将它们溶解。点样器(BioChip Arrayer,Cartesian制造)采用点样针(CMP,针直径0.4mm,Arraylt Corp.)来对底材点样。反应在80℃进行1小时以将糖肽固定化在所述底材上。用水进行一次洗涤，产物浸没于10mg/mL的琥珀酸酐中，在室温进行反应3小时，未反应的氨氧基得到保护。用水进行两次洗涤并干燥产物。
反应上清液用如下给出的反应溶液稀释10-倍。将Hybricover(SumitomoBakelite制备)置于固定化的糖肽阵列上，铺开70μL的所述稀释的溶液，反应在室温下进行2小时。去除Hybricover并用清洁溶液和水各洗涤一次底材以使其清洁。干燥所述底材，放置Hybricover，并将在如下溶液中制备为1μg/mL的Anti-IgG(H+L),小鼠,山羊-多抗,和Cy3(Rockland Immunochemicals)接种在所述底材上。这些在室温反应1小时。在反应后，用清洁溶液洗涤产物。用扫描仪(Typhoon TRIO+,GE Healthcare)测量Cy3的荧光强度。用ArrayVisionTM软件(GE Healthcare)创建荧光响应数字图像。结果在图4给出。
反应溶液：50mM Tris·HCl(pH 7.4),100mM NaCl,1mM CaCl2,MnCl2,MgCl2,0.05％Tween 20
清洁溶液：50mM Tris·HCl(pH 7.4),100mM NaCl,1mM CaCl2,MnCl2,MgCl2,0.05％Triton X-100
表1.
[表1]用作免疫原的MUC1衍生糖肽及其类似物的序列数据(结合交联酮和Cys的序列)
Figure BDA0001192409590000321
Figure BDA0001192409590000331
化合物1-4：SEQ ID NO:3
化合物5-11：SEQ ID NO:1
化合物12和13：SEQ ID NO:4
化合物14和15：SEQ ID NO:5
抗体SN-101和SN-102的表征
抗体SN-101和SN-102分别识别如下MUC1的糖链Tn结构和修饰的位置：
SN-101
i)结合MUC1衍生糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys；
Ii)不结合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖链已经被T或STn取代的糖肽；
iii)不结合包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的肽(裸肽)；和
iv)不结合具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的MUC2的串联单元肽或具有SEQ IDNO:5的氨基酸序列的MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
SN-102
i)结合糖肽Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr，其中Tn糖链键接至具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第8位苏氨酸；
ii)不结合或仅仅弱结合其中MUC1衍生糖肽的Tn糖链已经被T或STn取代的糖肽；
iii)不结合包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽(裸肽)；
Iv)不结合这样的糖肽，其中Tn在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的第14位丝氨酸或第15位苏氨酸处修饰；
V)结合这样的糖肽，其中Tn糖链在具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的肽的全部苏氨酸和丝氨酸处修饰；和
iv)不结合MUC2的串联单元肽或MUC4的串联单元肽中Tn被修饰的糖肽。
实施例4在患者血清中检测MUC1糖肽
检查是否使用抗体SN-101会在乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌样本血清中检测出抗原肽。样本数目是来自清楚地临床诊断为所述疾病的患者的5-10个血清样品且若干正常血清样品作为阴性对照。在正常血清中没有检测出抗原糖肽，而在患者血清样品检测出抗原糖肽。
实施例5通过抗体SN-101和SN-102对表达MUC1的细胞的免疫荧光染色
乳腺癌株OCUB-M在含10％FBS的DMEM中在37℃下5％CO2中培养过夜。吸掉培养基。细胞层用PBS洗涤并用含4％多聚甲醛的PBS固定10分钟。然后，在含0.1％Triton XTM-100的PBS中进行浸没处理，随后用封闭缓冲液(含1％BSA的PBS)封闭20分钟。用封闭缓冲液稀释的抗体SN-101或SN-102的10μg/mL溶液然后反应1小时。通过反应封闭溶液而不是一抗来制备负对照。去除抗体溶液，用PBS洗涤，然后和2μg/mL Alexa
Figure BDA0001192409590000341
555-标记的抗-小鼠IgG抗体反应。产物用PBS洗涤，封装，然后用用BZ-9000(KEYENCE)一体化荧光显微镜观察，产生特异性染色图像(见图5)。
实施例6细胞增殖阻断测试
DMEM(10％FBS)培养基中培养的乳腺癌细胞OCUB-M接种于96孔板，每孔3x103细胞。细胞在5％CO2大气中37℃培养48小时，然后添加抗体SN-101至终浓度0.565mg/ml或1.3mg/mL。细胞在5％CO2大气中37℃培养48小时，此时加入20μL每孔的Cell Titer96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega)试剂。细胞在37℃在5％CO2大气中孵育2小时。在490nm吸光度的测量显示，相对于对照，细胞数目以浓度依赖性方式降低(见图6)。
实施例7测试阻断半乳凝素3的结合
将悬浮于RPMI-1640(10％FBS)的4.8xl03乳腺癌细胞MCF-7添加至8孔腔室载玻片的各孔，细胞在5％CO2大气在37℃培养16小时。吸掉培养基并添加PBS中4％甲醛以浸没所述细胞于大约2mm。细胞被固定15分钟。吸掉固定溶液，用PBS洗涤孔3次，每次5分钟。封闭用封闭缓冲液(含5％BSA的PBS)进行1小时。吸掉封闭溶液。制备单独抗体以及不同浓度的抗体和半乳凝素3的混合物。这些在4℃孵育2小时。吸掉抗体，之后用PBS洗涤孔3次，每次5分钟。添加Cy5标记的抗-小鼠IgG抗体，混合物在室温于暗室中孵育1小时。吸掉二抗，之后用PBS洗涤孔3次，每次5分钟。BZ-9000(KEYENCE)一体化荧光显微镜的观察显示半乳凝素3和MUC1结合的阻断依赖于抗体浓度。
工业实用性
本发明提供了抗体，其以极其高的特异性识别人MUC1的串联单元肽已经用O-键-类型糖链Tn修饰的糖肽。本发明的抗MUC抗体的使用允许以高灵敏度、可靠地以及便利地以特异于Tn修饰的糖肽中的表位的方式检测MUC1的存在，以及允许测定恶性肿瘤为MUC1相关疾病，且因此被认为在医疗诊断领域中有用。本发明的抗MUC1抗体还影响MUC1相关癌症细胞的功能，并因此被认为在癌症治疗等领域有用。
[序列表]
SEQ ID NO:1:人MUC1的串联单元肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:2:人MUC1的串联单元肽突变体的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:cys添加至C端的人MUC1的串联单元肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:4:人MUC2的串联单元肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:5:人MUC4的串联单元肽的氨基酸序列
SEQ ID NO:6:SN101H的氨基酸序列
SEQ ID NO:7:SN101L的氨基酸序列
SEQ ID NO:8:SN101H的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:9:SN101H的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:10:SN101H的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:11:SN101L的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:12:SN101L的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:13:SN101L的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:14:SN1021H的氨基酸序列
SEQ ID NO:15:SN102L的氨基酸序列
SEQ ID NO:16:SN102H的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:17:SN102H的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:18:SN102H的CDR3的氨基酸序列
SEQ ID NO:19:SN102L的CDR1的氨基酸序列
SEQ ID NO:20:SN102L的CDR2的氨基酸序列
SEQ ID NO:21:SN102L的CDR3的氨基酸序列
序列表
<110> 医化学创药株式会社
<120> 抗MUC1抗体或其抗原结合片段及其用途
<130> 151297H
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 1
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Gly Val Thr
20
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 2
Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Gly Val Thr
20
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 3
Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Cys
20
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 4
Pro Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Pro Pro Thr Ser Thr Thr Thr Leu
1 5 10 15
Pro Pro Thr
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 5
Ser Ala Ser Thr Gly His Ala Thr Pro Leu Pro Val Thr Asp Thr Ser
1 5 10 15
Cys
<210> 6
<211> 135
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 6
Met Asp Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ile Ile Val Leu Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Asn Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 7
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys
130
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 8
Asn Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 9
Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 10
Gly Val Phe Asp Tyr
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 11
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 12
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 13
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 139
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 14
Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ile Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val His Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 15
<211> 131
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 15
Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 16
Asp Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 17
Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 18
Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 19
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 20
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo Sapience
<400> 21
Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr
1 5

Claims (11)

1.针对人MUC1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特异性识别在SEQ ID NO:1所示的人MUC1串联单元的氨基酸序列中的任意苏氨酸或丝氨酸上具有O-键-类型糖链核心0(Tn)的MUC1串联单元和糖肽，
其中所述抗体包含至少一个抗原结合部分，所述抗原结合部分包含免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域，所述重链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1由SEQ ID NO:8所示氨基酸序列组成，CDR2由SEQID NO:9所示氨基酸序列组成，且CDR3由SEQ ID NO:10所示氨基酸序列组成，所述轻链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’由SEQ ID NO:11所示氨基酸序列组成，CDR2’由SEQ ID NO:12所示氨基酸序列组成，且CDR3’由SEQ ID NO:13所示氨基酸序列组成；或
其中所述抗体包含至少一个抗原结合部分，所述抗原结合部分包含免疫球蛋白重链可变区(VH)结构域和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结构域，所述重链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，CDR1由SEQ ID NO:16所示氨基酸序列组成，CDR2由SEQID NO:17所示氨基酸序列组成，且CDR3由SEQ ID NO:18所示氨基酸序列组成，所述轻链可变区结构域在其序列中包含互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，CDR1’由SEQ ID NO:19所示氨基酸序列组成，CDR2’由SEQ ID NO:20所示氨基酸序列组成，且CDR3’由SEQ ID NO:21所示氨基酸序列组成。
2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:7。
3.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
4.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab’)2、Fab’、双抗体、单链抗体、双特异性抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
5.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是scFv或dsFv。
6.权利要求1至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于特异性检测人体液样品中的MUC1的试剂盒中的用途，所述试剂盒用途通过包括以下的方法特异性检测人体液样品中的MUC1:
(a)使权利要求1至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述样品接触；和
(b)在接触后测量所述样品中抗体或其抗原结合片段-抗原复合物的形成。
7.权利要求6的用途，其用于确定在所述体液样品中恶性肿瘤的存在，其中所述恶性肿瘤展现MUC1的不正常表达。
8.权利要求7的用途，其中所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
9.用于特异性检测人体液样品中的MUC1的试剂盒，包含：
(a)权利要求1至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(b)用于测量抗体或其抗原结合片段-抗原复合物的试剂。
10.用于预防或治疗恶性肿瘤的药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
11.权利要求10的组合物，其中所述恶性肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌和卵巢癌。
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