WO2015166934A1 - 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途 - Google Patents

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利尚 三好
健太郎 成地
田中　誠一
佐藤　正治
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医化学創薬株式会社
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    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to an anti-MUC1 antibody or an antigen-binding fragment thereof and use thereof. More specifically, the present invention relates to an antibody against MUC1 glycopeptide or an antigen-binding fragment thereof and a malignant tumor diagnostic technique and a preventive or / and therapeutic technique using the same. (Cross-reference of related applications) This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2014-92299 filed on April 28, 2014, the entire description of which is specifically incorporated herein by reference.
  • MUC1 is a kind of mucin glycoprotein, and has a core protein encoded by the MUC1 gene (MUC1) and an infinite number of sugar chains linked to the core protein through O-type sugar chain bonds.
  • MUC1 secretory mucins produced by epithelial cells and the like, and membrane-bound mucins that have a hydrophobic transmembrane site and are bound to the cell membrane.
  • MUC1 is a membrane-bound mucin of epithelial cells. In normal cells, MUC1 is present on the tip of mammary cells, milk fat droplets, pancreas, kidney, and some glandular epithelial cells [Non-patent Document 1].
  • the molecular size is over 400 kDa, 50% of which is O-linked sugar chains.
  • This glycoprotein is composed of a short N-terminal region, a central region consisting of tandem repeats with 25% of amino acids with hydroxyl groups, a transmembrane region consisting of 31 amino acids, and a short C-terminal region on the cytoplasmic side. The region is cleaved and released under various conditions.
  • Each tandem repeat (tandem unit) has 20 amino acids (Pro-Asp- Thr- Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser - Thr- Ala-Pro-Pro- Ala-His-Gly-Val- Thr - Ser- Ala).
  • VNTR variable number of tandem repeats
  • size polymorphisms that are genetically different in the number of repeats expressed by individuals are generated, and four types of sequence polymorphisms due to gene mutations of specific amino acids are known.
  • sequence polymorphisms the mutation frequency from Pro-Asp- Thr- Arg (PDTR) to Pro-Glu-Ser-Arg (PESR) is high [Non-patent Document 2].
  • MUC1 is known to be overexpressed in many cancers such as breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, ovarian cancer, and overexpression is observed in 90% or more particularly in breast cancer, ovarian cancer and pancreatic cancer. Furthermore, high expression of MUC1 is associated with poor prognosis of various cancers, and the concentration of free MUC1 in blood increases in cancer patients [Non-patent Document 1].
  • the first sugar transferred by O-glycan modification to the serine and threonine residues in the VNTRs region of MUC1 is most often GalNAc (sometimes referred to as Tn), resulting in the generation of a Tn antigen. .
  • Tn is rarely seen in normal MUC1, but is found in cancer-derived MUC1.
  • sialic acid, galactose, or GlcNAc is added to Tn to produce sialyl-Tn (STn), core 1 (T), or core 2, respectively.
  • sialic acid is added to the core 2
  • sialyl T (ST) is generated.
  • GlcNAc and GalNAc are transferred to Tn.
  • Tn (GalNAc ⁇ -1-Ser / thr), STn (Sia ⁇ 2-6 GalNAc ⁇ 1-O-Ser / Thr), which are common in cancer, are processed.
  • T (Gal ⁇ 1-3 GalNAc ⁇ -1-O-Ser / Thr)
  • Core 2 (GlcNAc ⁇ 1-3GalNAc ⁇ 1-O-Ser / Thr)
  • ST Sia ⁇ 2-6 (Gal ⁇ 1-3) GalNAc ⁇ 1-O-Ser / Thr).
  • Non-Patent Document 1 Recently, it has been recognized that the interaction between MUC glycoprotein and galectin is important for cancer progression and metastasis [Non-Patent Document 5].
  • the present inventors produced an antibody having a high cross-reactivity ratio of the normal tissue-related structure to the cancer-related structure STn of MUC1 [Patent Documents 6 and 7].
  • Patent Documents 6 and 7 it has been difficult to accurately distinguish the difference between the core peptide structure of MUC1 and various glycopeptide structures O-glycosylated to the core peptide.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3698370
  • Patent Document 2 Japanese Special Table 2002-502621
  • Patent Document 3 Japanese Special Table 2003-519096
  • Patent Document 4 US Patent Application Publication 2006/0292643
  • Patent Document 5 Japanese Patent Special Publication 2010-505775
  • Patent Document 6 Japanese Patent Special Publication 2010-505775
  • Patent Document 7 Japanese Patent Special Publication 2010-505775
  • Patent Document 7 Japanese Patent Special Publication 2010-505775
  • Patent Document 7 Japanese Patent Document 7
  • Patent Document 7 WO02011 / 135869
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-111618
  • Non-Patent Document 1 Beatson et al., Immunother. 2: 305-327 (2010)
  • Non-Patent Document 2 Engelmann et al., J. Biol. Chem. 276: 27764-27769 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Bafina et al., Oncogene 29: 2893-2904 (2010)
  • Non-Patent Document 4 Clin. Cancer Res. 19: 1981-1983 (2013)
  • Non-Patent Document 5 Liu et al., Nature Rev Cancer 5: 29-41 (2005)
  • Non-Patent Document 6 Danielczyk et al., Cancer Immunol. Immunother.
  • Non-Patent Document 7 Cao et al., Histochem. Cell Biol. 115: 349-356 (2001)
  • Non-Patent Document 8 Ohyabu et al., J. Am. Chem. Soc. 131: 17102-17109 (2009)
  • Non-patent document 9 Matsusita et al., Biochim. Biophy. Acta 1840: 1105-1116 (2014)
  • Non-Patent Document 10 Hashimoto et al., Chem. Eur. J. 17: 2393-2404 (2011)
  • Non-Patent Document 11 Lu-Gang et al., J. Biol. Chem. 282: 773-781 (2007)
  • the entire descriptions of Patent Documents 1 to 8 and Non-Patent Documents 1 to 11 are specifically incorporated herein by reference.
  • the present inventors have developed a highly sensitive and high performance glycopeptide-immobilized microarray capable of accurately performing antibody specificity analysis and epitope mapping, and established a new method for determining the true epitope structure. did. Using this method, epitope analysis of the aforementioned seven existing anti-MUC1 antibodies was performed. As a result, it was revealed that none of the antibodies can recognize the difference between the core peptide structure of MUC1 and the glycopeptide structure O-glycosylated to the core peptide [Non-patent Documents 8 and 9].
  • the present inventors have proved by NMR that a conformational change of the main chain peptide is induced specifically in the structure of the sugar chain bound to the side chain in the epitope region of the anti-MUC1 antibody. Furthermore, it has been clarified that the conformation of the peptide is sensitively changed by sugar chain modification at a specific amino acid residue, which defines the antigen structure of the anti-MUC1 antibody [Non-patent Document 8]. In addition, changes in the three-dimensional structure of mucin-derived synthetic glycopeptides were analyzed using MS and NMR.
  • an object of the present invention is to provide an anti-MUC1 antibody specific to a glycopeptide having an O-linked sugar chain that is highly expressed in cancer cells.
  • “specific to a glycopeptide having an O-linked sugar chain” means that the difference between the core peptide structure of MUC1 and the various glycopeptide structures O-glycosylated to the core peptide can be accurately identified. Means.
  • an object of the present invention is to provide a synthetic glycopeptide that serves as an antigen suitable for antibody production.
  • another object of the present invention is to provide a new means and method for the diagnosis and prevention or / and treatment of cancer using the antibody.
  • the present inventor has developed an O-sugar to serine and threonine residues in the VNTRs region of MUC1.
  • a glycopeptide having Tn which is the core sugar structure that is first transferred by chain modification, was artificially synthesized, and a monoclonal antibody was prepared using this artificially synthesized glycopeptide as an antigen.
  • Tn antigens Some of the anti-MUC1 antibodies obtained from the above-mentioned glycopeptides having Tn (hereinafter sometimes referred to as Tn antigens) are loaded with glycopeptides derived from the VNTRs region of various mucins including glycopeptides used as antigens.
  • the specificity of the antibody was analyzed using a microarray, and the characteristics of the antibody were examined. Furthermore, these antibodies were examined for binding / accumulation to MUC1 expressed in various cancer cells, response to cancer patient sera, cancer cell proliferation inhibitory action, cancer metastasis inhibitory action and the like. As a result of these studies, an antibody capable of accurately discriminating the difference between the core peptide structure of MUC1 and the various glycopeptide structures O-glycosylated to the core peptide has been found, and the present invention has been completed based thereon.
  • the present invention is as follows. [1] A monoclonal antibody against human MUC1, which is specific to a human MUC1 tandem unit and a glycopeptide having an O-linked sugar chain core 0 (Tn) in any one of threonine and serine in the amino acid sequence of the human MUC1 tandem unit The antibody or antigen-binding fragment thereof, which recognizes automatically. [2] The amino acid sequence of the human MUC1 tandem unit includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the O-linked sugar chain core 0 (Tn) binds to threonine at position 8 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1].
  • the amino acid sequence of the human MUC1 tandem unit includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the O-linked sugar chain core 0 (Tn) binds to serine at the 8-position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1].
  • the O-linked sugar chain core 0 (Tn) does not bind to the glycopeptide substituted with O-linked sugar chain T or STn.
  • ii) does not bind to a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (naked peptide), and iii) It does not bind to a glycopeptide in which Tn is modified to a tandem unit peptide of MUC2 or a tandem unit peptide of MUC4.
  • the determination region includes CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, CDR2 is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDR3 is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and the light chain variable region domain is The sequence includes complementarity determining regions CDR1 ′, CDR2 ′, CDR3 ′, CDR1 ′ is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, CDR2 ′ is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, and CDR3 ′ is SEQ ID NO: The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [4], comprising the amino acid sequence of 21.
  • [7] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [5], having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • [8] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [6], which has a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the antigen-binding fragment is a peptide comprising at least one of the complementarity determining regions CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 ′, CDR2 ′, and CDR3 ′ according to any one of [1] to [8] The antibody or antigen-binding fragment thereof described.
  • the antigen-binding fragment is Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, diabody, single chain antibody (eg, scFv, dsFv), bivalent specific antibody, chimeric antibody, or humanized antibody [1. ] To the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [9] to [9].
  • a method for specifically detecting MUC1 in a human body fluid sample comprising: (a) contacting the sample with the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10], (b) The method comprising measuring the formation of an antibody (or antigen-binding fragment thereof) -antigen complex in the sample after contact.
  • [13] [12] The method according to [12] for use in detecting the presence or absence of a malignant tumor in which abnormal expression of MUC1 is observed in the body fluid sample.
  • [14] [13] The method according to [13], wherein the malignant tumor is selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer.
  • [15] (a) the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10]; (b) A kit for use in the method according to any one of [12] to [14], comprising a reagent for measuring an antibody (or an antigen-binding fragment thereof) -antigen complex.
  • [16] [1] A pharmaceutical composition for preventing or / and treating malignant tumor, comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [10] as an active ingredient.
  • [17] [16] The composition according to [16], wherein the malignant tumor is selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer.
  • MUC1 which is a monoclonal antibody against human MUC1 and whose O-linked sugar chain of the tandem unit peptide of MUC1 is core 0 (Tn) is specifically recognized, and the O-linked sugar chain is
  • a method using an anti-MUC1 antibody and an antigen glycopeptide for producing an antibody which does not recognize and bind to a naked peptide not added or an MUC1 glycopeptide whose O-linked sugar chain is other than Tn.
  • the anti-MUC1 antibody of the present invention the MUC1 protein can be detected specifically, highly sensitively, reliably and simply, and malignant tumors or inflammation in which changes in MUC1 expression are observed relative to normal controls. It becomes possible to determine the disease.
  • the anti-MUC1 antibody of the present invention can be used as a preventive or / and therapeutic agent for cancer by suppressing cancer progression and metastasis.
  • MALDI-TOFMS spectrum of MUC1-derived glycopeptide MALDI-TOFMS spectrum of MUC2-derived glycopeptide.
  • MALDI-TOFMS spectrum of MUC4-derived glycopeptide Evaluation of reaction specificity of SN-101 and SN-102 by glycopeptide-immobilized microarray. The result of immunofluorescence staining of cells expressing MUC1 with antibody SN-101 or SN-102. Results of cell growth inhibition experiment with antibody SN-101.
  • the amino acid sequences of the variable regions of antibodies SN-101 and SN-102 are shown.
  • the amino acid sequence containing the variable region of antibody SN-101 is shown.
  • the amino acid sequence containing the variable region of antibody SN-102 is shown.
  • the antibody according to the present invention is a monoclonal antibody against human MUC1 and is an O-linked saccharide to any one of human MUC1 tandem unit and threonine and serine in the amino acid sequence of human MUC1 tandem unit. Said antibody specifically recognizes a glycopeptide having a chain core 0 (Tn).
  • the amino acid sequence of the human MUC1 tandem unit includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the O-linked sugar chain core 0 (Tn) is represented by SEQ ID NO: 1. It is a monoclonal antibody that binds to threonine at position 8 of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the human MUC1 tandem unit includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the O-linked sugar chain core 0 (Tn) is represented by SEQ ID NO: 2. Mention may be made of monoclonal antibodies that bind to serine at position 8 of the amino acid sequence shown.
  • These antibodies of the present invention can further have the binding properties shown in i) to iii) below.
  • the O-linked sugar chain core 0 (Tn) does not bind to the glycopeptide substituted with O-linked sugar chain T or STn.
  • ii) does not bind to a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (naked peptide)
  • iii) does not bind to a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (naked peptide)
  • the tandem unit peptide of MUC2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or the tandem unit peptide of MUC4 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5 does not bind to the glycopeptide modified with Tn.
  • the sugar that is first transferred to the core peptide as the O-linked sugar chain of the tandem repeat of the antigen glycopeptide MUC1 is most often GalNAc, resulting in the generation of Tn antigen. Tn is rarely seen in normal MUC1, but is found in cancer-derived MUC1.
  • the tandem unit peptide of human MUC1 has the following amino acid sequence. Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr (SEQ ID NO: 1)
  • tandem unit peptide variant of human MUC1 has the following amino acid sequence. Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Glu-Ser-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr (SEQ ID NO: 2)
  • glycopeptide obtained by adding an O-linked sugar chain to a predetermined amino acid of any of the above peptides can be used as an antigen.
  • This glycopeptide added with an O-linked sugar chain is artificially synthesized.
  • the O-linked sugar chain is a sugar chain having a Tn core structure (GalNAc). Furthermore, the O-linked sugar chain binds to threonine (Thr) or serine (Ser), which is the eighth amino acid of the tandem unit peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the synthesis of the antigen glycopeptide can be carried out by a synthesis technique developed by the present inventors and utilizing a microwave and an enzyme synthesis method. More specifically, for example, it can be carried out according to the methods described in Non-Patent Document 9 and Patent Documents 6-8. The entire descriptions of Non-Patent Document 9 and Patent Documents 6 to 8 are specifically incorporated herein by reference.
  • the antibody of the present invention can be prepared by a conventional method using the glycopeptide described in 1-1 as an antigen.
  • the antigen glycopeptide may be bound to a carrier protein in order to enhance antigenicity.
  • the glycopeptide obtained by adding Cys necessary for binding to the carrier protein to the C-terminus of the glycopeptide is synthesized as an antigen glycopeptide.
  • carrier proteins include keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), and ovalbumin (OVA), which are known in the art and commercially available kits are also sold.
  • Antigen is administered to mammals such as mice, rabbits, rats and the like.
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or into the footpad.
  • the interval between immunizations is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 5 times at intervals of several days to several weeks.
  • Antibody-producing cells are collected several to 90 days after the final immunization day. Examples of antibody-producing cells include lymph node cells, spleen cells, peripheral blood cells and the like.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells generally available cell lines can be used.
  • myeloma cells As a cell to be used, it has drug selectivity and cannot grow in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, thymidine) in an unfused state, and can only survive in a state fused with antibody-producing cells. It is desirable to have.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • myeloma cells include myeloma cell lines such as SP2, P3X63-Ag.8.UI (P3UI), NS-1.
  • the cell suspension is appropriately diluted with a fetal bovine serum-containing RPM-1640 medium and then spread on a microtiter plate.
  • a selective medium for example, HAT medium
  • cell culture is performed by appropriately replacing the selective medium.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Cloning of the fused cells is performed by a limiting dilution method or the like to establish a hybridoma that produces the target monoclonal antibody.
  • a normal cell culture method or ascites formation method can be employed as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma.
  • the antibody can be purified by appropriately selecting a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, or a combination thereof.
  • the globulin type of the monoclonal antibody that can be used in the present invention is not particularly limited, and any of IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD may be used, but IgG and IgM are preferred.
  • the anti-MUC1 monoclonal antibody of the present invention produced using the hybridoma is a mouse antibody, and the mouse antibody is produced by converting it into a chimeric antibody or a humanized antibody using some known techniques. (The conversion method will be described later), and chimeric antibodies and humanized antibodies having the same antigen specificity as the anti-mouse MUC1 monoclonal antibody of the present invention are also included in the antibodies of the present invention. Furthermore, a bivalent specific antibody having the same antigen specificity as the anti-mouse MUC1 monoclonal antibody of the present invention and having a different antigen specificity is also encompassed by the antibody of the present invention.
  • monoclonal antibody of the present invention are monoclonal antibodies SN-101 and SN102 which are also described in the Examples.
  • Monoclonal antibody SN-101 was released in April 2014 in accordance with the Budapest Treaty as an independent administrative agency, National Institute for Materials Science (NPMD) (2-5-8 Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). It is a monoclonal antibody secreted by the hybridoma cell line deposited on the 18th month under the deposit number NITE BP-01845.
  • the monoclonal antibody SN102 is a monoclonal antibody secreted by the hybridoma strain 3C10-E11 (see Examples).
  • Monoclonal antibody SN-101 is an antibody having a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7. Furthermore, the monoclonal antibody SN-101 has at least one antigen-binding site comprising an immunoglobulin heavy chain variable region (VH) domain and an immunoglobulin light chain variable region (VL) domain, and the heavy chain variable region domain Contains the complementarity determining regions CDR1, CDR2, and CDR3 in the sequence, CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • the light chain variable region domain includes complementarity determining regions CDR1 ′, CDR2 ′, and CDR3 ′ in the sequence, CDR1 ′ is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and CDR2 ′ is the amino acid of SEQ ID NO: 12.
  • CDR3 ′ consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • Monoclonal antibody SN-102 has a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. Furthermore, the monoclonal antibody SN-102 has at least one antigen-binding site including an immunoglobulin heavy chain variable region (VH) domain and an immunoglobulin light chain variable region (VL) domain, and the heavy chain variable region domain Includes the complementarity determining regions CDR1, CDR2, and CDR3 in the sequence, CDR1 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, CDR2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and CDR3 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the light chain variable region domain includes complementarity determining regions CDR1 ′, CDR2 ′, CDR3 ′ in the sequence, CDR1 ′ is composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR2 ′ is the amino acid of SEQ ID NO: 20 CDR3 ′ consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • Monoclonal antibody SN-101 has the binding properties shown in i) to v) below.
  • the Tn sugar chain of the glycopeptide derived from MUC1 does not bind to the glycopeptide substituted with T or STn iii) does not bind to the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (naked peptide), iv) It does not bind to a glycopeptide in which Tn is modified with the tandem unit peptide of MUC2 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or the tandem unit peptide of MUC4 having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 5.
  • the monoclonal antibody SN-101 is a glycopeptide Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp- (Tn) Thr-Arg-Pro- derived from MUC1, which does not have Cys at the C-terminus. It also binds to Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr and does not bind to the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (naked peptide).
  • Monoclonal antibody SN-102 has the binding properties shown in i) to vi) below.
  • the Tn sugar chain of the glycopeptide derived from MUC1 does not bind to the glycopeptide substituted with T or STn, or is a weak bond even when bound, iii) does not bind to the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (naked peptide), iv) The peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 does not bind to the glycopeptide in which the Tn sugar chain is modified to serine at position
  • the monoclonal antibody SN-102 is a glycopeptide Gly-Val-Thr-Ser-Ala in which a Tn sugar chain is bonded to threonine at the 8-position of a peptide having Cys at the C-terminus and having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It also binds to -Pro-Asp- (Tn) Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys It does not bind to a peptide having the amino acid sequence shown (naked peptide).
  • the present invention includes an antigen-binding fragment of the monoclonal antibody in addition to the monoclonal antibody.
  • the antigen-binding fragment is a peptide containing at least one of the complementarity determining regions CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 ',' CDR2 ', 2 and CDR3' of the SN-101 or SN-102.
  • the antigen-binding fragment can be, for example, Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, diabody, single chain antibody (eg, scFv, dsFv).
  • the antigen-binding fragment is not intended to be limited to the above, and includes at least one of the complementarity determining regions CDR1, CDR2, CDR3, CDR1 ', CDR2', and CDR3 'of the SN-101 or SN-102 Any peptide may be used as long as it has the same binding characteristics shown in i) to v) as SN-101 or the same binding characteristics shown in i) to vi) as SN-102.
  • the chimeric antibody and the humanized antibody, and the bivalent specific antibody, the immunoglobulin heavy chain variable region (VH) domain and the immunoglobulin light chain variable region (VL) domain are complementary to the SN-101 or SN-102.
  • Fab, F (ab ') 2, Fab' Production method (1): It can be produced by digesting a mouse monoclonal antibody with a predetermined enzyme or cleaving a disulfide bond by a reduction treatment.
  • -Fab digestion with Papain.
  • -F (ab ') 2 digestion with Pepsin.
  • -Fab ' Disulfide bond cleavage by digestion with Pepsin and reduction treatment with ⁇ -mercaptoethanol.
  • Production method (2) It can be produced by protein expression technology using gene recombination technology.
  • ⁇ Fab -Base sequence encoding VH (H chain variable region) and CH1 (H chain constant region domain 1)-Base sequence encoding VL (L chain variable region) and CL (L chain constant region)
  • Fab is obtained by incorporating into an expression vector suitable for each cell and then introducing the gene into the cell and producing it as a recombinant protein.
  • ⁇ F (ab ') 2, Fab' ⁇ VH (H chain variable region) and CH1 (H chain constant region domain 1), nucleotide sequence encoding a hinge region containing cysteine to form a dimer ⁇ VL (L chain variable region) and CL (L chain constant) Nucleotide sequence encoding normal region)
  • E. coli or animal cells CHO, HEK293, insect cells
  • F (ab ′) 2 and Fab ′ are obtained by producing as a recombinant protein. .
  • [scFv, dsFv] Production method It can be produced by a protein expression technique using a gene recombination technique.
  • E. coli or animal cells CHO, HEK293, insect cells
  • ScFv is obtained by producing as a recombinant protein.
  • dsFv -Base sequence encoding VH (H chain variable region)-Base sequence encoding VL (L chain variable region) Inserting cysteine at the C-terminal side of VH, VL, E. coli or animal cells (CHO, HEK293, insect cells)
  • dsFv is obtained by integrating into an expression vector suitable for each cell and then introducing the gene into a cell and producing it as a recombinant protein.
  • [diabody] Production method It can be produced by a protein expression technique using a gene recombination technique.
  • Base sequence encoding VH (H chain variable region) for antigen X (2) Base sequence encoding VL (L chain variable region) for antigen X (3) VH (H chain variable region) for antigen Y Encoding base sequence (4) Base sequence encoding VL (L chain variable region) for antigen Y (5) Ringer sequence: Flexible amino acids such as “GSSSGSSSSGSSSSGSSSS” Encoding base sequence A series of VH (1) -linker (5) -VL (4) and VH (3) -linker (5) -VL (2) as fusion proteins in E. coli or animal cells (CHO, HEK293, insects) In order to express in a cell), it is incorporated into an expression vector suitable for each cell, and then introduced into a cell and produced as a recombinant protein to obtain a diabody.
  • Chimeric antibody or humanized antibody Production method: It can be produced by a protein expression technique using a gene recombination technique. -Base sequence encoding mouse VH (H chain variable region) and human antibody H chain constant region-Base sequence encoding mouse VL (L chain variable region) and human antibody L chain constant region , HEK293, insect cells), and then incorporated into an expression vector suitable for each cell, and then introduced into a cell and produced as a recombinant protein to obtain a chimeric antibody.
  • ⁇ Humanized antibodies Production method It can be produced by a protein expression technique using a gene recombination technique. -Insert CDR1, CDR2, CDR3 of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 of mouse VH (H chain variable region) between FR1, FR2, FR3, FR4 of human antibody variable region VH.
  • Nucleotide sequence encoding humanized VH and human antibody H chain constant region-CDR1, CDR2, CDR3 of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 constituting mouse VL (L chain variable region) is human
  • animal cells CHO, HEK293, insect cells
  • humanized VL inserted between FR1, FR2, FR3, and FR4 of antibody variable region VL and human antibody L chain constant region Then, it is incorporated into an expression vector suitable for each cell, and then introduced into a cell and produced as a recombinant protein to obtain a humanized antibody.
  • the present invention includes a method for specifically detecting MUC1 in a human body fluid sample, and the method includes the following steps (a) and (b): . (a) contacting the sample with the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, (b) The formation of an antibody (or antigen-binding fragment thereof) -antigen complex in the sample after contact is measured.
  • kit for immunological measurement of human MUC1 The kit of the present invention is a kit for use in the human MUC1 detection method of the present invention, (a) the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof; (b) an antibody (or an antigen-binding fragment thereof) -a reagent for measuring an antigen complex.
  • the monoclonal antibody of the present invention or the antigen-binding fragment thereof (which may be simply referred to as anti-MUC1 antibody) used in the kit can be immobilized on a carrier.
  • the carrier can be any material known to those of skill in the art to which an antigen can be attached.
  • the carrier can be a test well of a microtiter plate or nitrocellulose or other suitable membrane.
  • the carrier can be a bead or disk (eg, glass, fiberglass, latex, or a plastic material such as polystyrene or polyvinyl chloride).
  • the carrier can also be a magnetic particle or an optical fiber sensor.
  • the anti-MUC1 antibody of the present invention can be labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, or a colloidal gold, colored latex, or the like in a publicly-determined official position measurement method.
  • a radioisotope used for labeling include 14 C, 3 H, 32 P, 125 I, and 131 I.
  • 125 I is preferably used.
  • Examples of enzymes that can be used for labeling include ⁇ -galactosidase ( ⁇ GAL), alkaline phosphatase (ALP), and horseradish peroxidase (HRP). These can be bound to monoclonal antibodies by conventional methods.
  • Examples of the fluorescent substance used for labeling include fluorescein, fluoresamine, fluorescein isothiocyanate, and tetramethylrhodamine isothiocyanate.
  • Examples of luminescent substances used for labeling include luciferin, luminol derivatives, and acridinium esters. In a simple measurement method, colloidal gold or colored latex may be used.
  • the reagent for measuring the antibody (or antigen-binding fragment thereof) -antigen complex can be appropriately determined according to the immunoassay used.
  • a known reagent capable of detecting an antibody-antigen complex formed when human MUC1 is contained in a human body fluid sample can be used.
  • a “human body fluid sample” is a sample that may contain human MUC1, such as human plasma, serum, blood, urine, sputum saliva, and cancer tissue secretion.
  • the specific detection method of MUC1 of the present invention can be performed using a conventionally known immunological measurement method except that the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof is used as the antibody.
  • Conventionally known immunological measurement methods include, for example, immunohistochemical staining and immunoelectron microscopy, and immunoassays [enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescent immunoassay, radioimmunoassay (RIA), immunochromatography] , Immunoagglutination method, Western blot method, etc.].
  • the method for measuring the formation of the antibody-antigen complex formed in the sample after contact in step (b) can be appropriately selected according to the immunological measurement method.
  • the immunological assay will be explained in more detail.
  • a step of immobilizing the monoclonal antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof (first monoclonal antibody) on a solid phase and incubating with a sample containing an antigen, adding a labeled second monoclonal antibody, and a mixture obtained A sandwich immunoassay comprising the steps of incubating and detecting the produced labeled antigen-antibody complex in the mixture.
  • the sample may be incubated simultaneously with the solid-phased first monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof and the labeled second monoclonal antibody.
  • Sandwich immunoassays include sandwich radioimmunoassay (RIA method), sandwich enzyme immunoassay (EIA method), sandwich fluorescence immunoassay (FIA method), sandwich luminescence immunoassay (by sandwich detection method). All sandwich immunoassays such as CLIA method), sandwich luminescent enzyme immunoassay method (CLEIA method), and immunochromatography method based on the sandwich method can be applied. For quantification, the RIA method and the EIA method are preferable.
  • a sandwich RIA method can be performed.
  • the sandwich RIA method is performed by adding beads mixed with a first monoclonal antibody (monoclonal antibody of the present invention) to a standard solution or sample and mixing the mixture, and mixing at 4 to 45 ° C, preferably from 25 ° C. Incubate at 37 ° C. for 1 to 4 hours, preferably 2 hours (first reaction). After washing, a solution containing a second monoclonal antibody labeled with, for example, 125I is added and incubated at 4 ° C. to 45 ° C., preferably 25 ° C. to 37 ° C. for 1 to 4 hours, preferably 2 hours. An antibody complex is formed (second reaction).
  • a sandwich EIA method can be performed. Specifically, the sandwich EIA method is performed by adding beads mixed with the first monoclonal antibody to a standard solution or sample and mixing them at 4 ° C. to 45 ° C., preferably 25 ° C. to 37 ° C. for 1 to 4 hours. Incubate preferably for 2 hours (first reaction). After washing, a solution containing a second monoclonal antibody labeled with an enzyme label, such as horseradish peroxidase (HRP), is added, and a temperature of 4 ° C.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Enzyme activity on the beads is measured by a colorimetric method via a substrate specific to the enzyme, eg, tetramethylbenzidine (TMB) if the labeling enzyme is HRP, so that the amount captured on the beads Can be measured. Colorimetric determination can be performed with a normal spectrophotometer or the like.
  • TMB tetramethylbenzidine
  • the method of the present invention can be used to detect the presence or absence of a malignant tumor in which abnormal expression of MUC1 is observed in a body fluid sample.
  • the malignant tumor in which abnormal expression of MUC1 is observed is, for example, selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with MUC1, detection of malignant tumors such as breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer related to human MUC1 It is effective for.
  • MUC1 overexpression has been reported in malignant tumors such as breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer.
  • overexpression of MUC1 has been observed in 90% or more of breast cancer, ovarian cancer, and pancreatic cancer.
  • High expression of MUC1 is associated with poor prognosis of various cancers, and the concentration of free MUC1 in blood is increased in cancer patients.
  • Non-patent Document 1 The O-glycan modification found in the VNTRs region of MUC1 is composed of polylactosamine-type long and branched sugars usually containing 8-10 monosaccharide units in normal epithelial tissues. In normal MUC1, the extracellular region is modified with such many sugar chains to protect mucous membranes, hydrate, lubricate, protect against bacterial and foreign body attack, and interact between cells and cell matrix. Shows regulatory action.
  • MUC1 is expressed in apical cells in normal cells, but apical expression is lost in cancer cells, resulting in nonpolar expression, and MUC1 is expressed throughout the cell surface.
  • the pattern of O-glycosylation modification in the VNTR region changed completely, and changed to a complex sugar chain composed of long and branched chains found in normal cells. Chain modification is observed.
  • Nonpolar expression and low sugar chain modification of MUC1 associated with carcinogenesis creates exposure of normal cryptic peptide epitopes and new carbohydrate epitopes. Therefore, the antibody of the present invention that specifically reacts with an epitope whose modified sugar chain is Tn among these epitopes of MUC1 can recognize normal and cancer MUC1 separately, and is related to human MUC1. It can be used in the detection of malignant tumors. Furthermore, it can be used when attacking only MUC1 positive for cancer cells.
  • the immunoassay kit of the present invention contains the above-described anti-MUC1 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. Therefore, by using the kit of the present invention, by specifically detecting human MUC1 contained in a sample collected from a subject suspected of having a disease or a disorder, the disease or disorder of the subject can be detected. It can be used to quickly and easily determine the presence. Reagents for determining diseases or disorders using such immunological measurement methods are well known, and those skilled in the art can easily select appropriate components other than antibodies. Further, the immunological measurement kit of the present invention can be used in any method as long as it is a method for performing an immunological measurement method.
  • the present invention can also provide a method for diagnosing cancer using the antibody of the present invention, a diagnostic agent containing the antibody of the present invention, or a diagnostic kit containing the antibody.
  • the antibody contained in the cancer diagnostic method, diagnostic agent or diagnostic kit of the present invention is the antibody of the present invention described above. Since the antibody of the present invention can specifically bind to the aforementioned specific cancer, it can be used for diagnosis of these cancers.
  • the antibody of the present invention can be used as a marker for diagnosing the above-mentioned malignant tumor or for monitoring the progression of disease in a patient.
  • a patient's cancer is assessed by determining the MUC1 level for a biological sample obtained from the patient using an antibody of the present invention and comparing the result to a predetermined cutoff value. Therefore, it can be used for diagnosis of malignant tumors.
  • the measurement result obtained in (b) above is compared with the measurement result obtained through the same steps (a) and (b) in the control sample, and the presence or absence of malignant tumor in the measured body fluid sample It can be used for detection.
  • the control sample can be a body fluid sample obtained from a healthy person.
  • the signal detected from the reporter group that remains bound to the solid support is generally compared to a signal corresponding to a predetermined cutoff value.
  • the cutoff value is the average value of the signal obtained when the immobilized antibody is incubated with a sample from a patient without cancer.
  • a sample that produces a signal that is three standard deviations above a predetermined cut-off value is considered positive for cancer.
  • the cut-off value is determined, for example, from a set of plots of true positive percentage (ie sensitivity) and false positive percentage (100% -specificity) corresponding to each possible cutoff value of the diagnostic test result. obtain.
  • the cut-off value on the plot closest to the upper left corner is the most accurate cut-off value, and samples that produce a signal higher than the cut-off value determined by the method of the present invention are positive Can be considered.
  • the cut-off value can be shifted to the left along the plot to minimize the false positive rate or to the right to minimize the false negative rate.
  • a sample that produces a signal that is higher than the cut-off value determined by this method is considered positive for the cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or / and treatment of malignant tumors containing a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the malignant tumor is selected from the group consisting of breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer.
  • the anti-MUC1 antibody and antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used for prevention and / or treatment of diseases involving MUC1, respectively.
  • Diseases involving MUC1 include malignant tumors such as breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, and ovarian cancer. In these malignant tumor patients, abnormal expression of MUC1, abnormal sugar chain structure of MUC1 and abnormal function are observed. Therefore, the anti-MUC1 antibody of the present invention has a function of suppressing malignant tumors. Can be prevented or / and treated.
  • the anti-MUC1 antibody and antigen-binding fragment thereof of the present invention are each an abnormality in MUC1 expression, an abnormality in the sugar chain structure of MUC1 and an abnormality in function due thereto, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer, For ovarian cancer, it is possible to prevent or / and treat cancer by suppressing cell proliferation enhancement or cancer cell metastasis caused by these abnormalities.
  • Non-patent Document 11 When cancer cells infiltrate or metastasize, they leave the primary site, infiltrate the surrounding extracellular matrix and endothelial cells, permeate blood vessels and lymph vessels, and finally attach to and proliferate at secondary sites.
  • the migration of cancer cells from the circulation to the metastasis site consists of (i) cessation of circulating cancer cells and transient weak contact (docking) between cancer cells and vascular endothelial cells (ii) various adhesion receptors (integrins) And cadherin, etc.) and the induction of changes in the expression / localization of their ligands, followed by (iii) strong attachment of cancer cells to vascular endothelial cells (rocking).
  • These three processes include MUC1 and galectin. It has been found that three interactions play a major role.
  • Galectin is a generic term for proteins that recognize ⁇ -galactoside structures and bind or crosslink sugar chains.
  • Galectin 3 is one of 15 types of galectins, and is located in the cytoplasm, nucleus, and cell surface of endothelial cells and immune cells. It is known to exist in extracellular matrix and the like. MUC1 in cancer cells binds to galectin 3, blood galectin 3 concentration in patients with metastatic cancer is higher than in normal controls, and adhesion of circulating cancer cells to vascular endothelial cells expresses MUC1 in cancer cells Dependence on the presence of extracellular galectin 3 in endothelial cells, and the binding of extracellular galectin 3 to cancer cell MUC1 markedly changes the localization of MUC1 cell surface and strengthens the binding between cancer cells and vascular endothelial cells The interaction between blood galectin and MUC1 has been shown to be an important basic molecular mechanism for the transfer of cancer cells to distant organs. Therefore, if the binding between MUC1 and galectin 3 can be blocked, all of the above cancer metastasis processes (i) to (iii) are suppress
  • the antibody of the present invention inhibits the binding between MUC1 and galectin 3. Therefore, it has been clarified that the antibody of the present invention can be used to prevent and / or treat metastasis of cancer that overexpresses MUC1 due to canceration.
  • the anti-MUC1 monoclonal antibody of the present invention is a mouse antibody.
  • the antibody used in the pharmaceutical composition of the present invention is preferably an antibody obtained by converting a mouse antibody into a chimeric antibody, a humanized antibody, or a bivalent specific antibody. Conversion of a mouse antibody into a chimeric antibody or a humanized antibody can be performed using a known method as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a method known to those skilled in the art using the antibody of the present invention as an active ingredient.
  • it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
  • a pharmaceutical preparation by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Suitable solubilizers such as Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-60 may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled into a suitable ampoule. Liposomes can also be used to encapsulate the drug for cell delivery.
  • Administration is oral or parenteral, preferably parenteral administration. Specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration. As an example of the injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the dose and administration method of the antibody of the present invention can be appropriately selected depending on the patient's annual salary, weight, sex, nature or severity of symptoms to be treated, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing this antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1,000 mg per kg of body weight per time. Alternatively, the dose can be selected within the range of 0.01 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the age, weight, sex, symptom, etc. of the affected patient, but can be appropriately selected by a person concerned.
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (48 ⁇ mol), HBTU (48 ⁇ mol), HOBt (48 ⁇ mol), and DIEA (72 ⁇ mol) under conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • microwave irradiation 40 W, 2450 MHz, 50 ° C.
  • these three steps (1) elongation with various Fmoc amino acids, (2) acetylation treatment, and (3) de-Fmocation were sequentially repeated.
  • the obtained solid phase resin was treated with trifluoroacetic acid: water (95: 5, v / v) for 2 hours.
  • the reaction solution was filtered and precipitated by adding ether to obtain crude crystals.
  • the crude product was purified by reverse phase high performance liquid chromatography to obtain Compound 1 as a lyophilized powder (6.3 mg, yield 22%).
  • the amino acid elongation reaction was carried out for 6 minutes with a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (144 ⁇ mol), HBTU (144 ⁇ mol), HOBt (144 ⁇ mol) and DIEA (216 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was performed for 10 minutes under microwave irradiation in a DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (43 ⁇ mol), HBTU (43 ⁇ mol), HOBt (43 ⁇ mol) and DIEA (108 ⁇ mol). did.
  • HBTU 43 ⁇ mol
  • HOBt 43 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was carried out for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (192 ⁇ mol), HBTU (192 ⁇ mol), HOBt (192 ⁇ mol), and DIEA (288 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was performed using a DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 4 Gal ⁇ (1 ⁇ 3) Ac 2 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O) (58 ⁇ mol), HBTU (58 ⁇ mol), HOBt (58 ⁇ mol), DIEA (144 ⁇ mol). The reaction was performed for 10 minutes under microwave irradiation.
  • HBTU 58 ⁇ mol
  • HOBt 58 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (180 ⁇ mol), HBTU (180 ⁇ mol), HOBt (180 ⁇ mol), DIEA (270 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (180 ⁇ mol), HBTU (180 ⁇ mol), HOBt (180 ⁇ mol), DIEA (270 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was carried out with DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (54 ⁇ mol), HBTU (54 ⁇ mol), HOBt (54 ⁇ mol) and DIEA (135 ⁇ mol) for 10 minutes under microwave irradiation. did.
  • HBTU 54 ⁇ mol
  • HOBt 54 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (180 ⁇ mol), HBTU (180 ⁇ mol), HOBt (180 ⁇ mol), DIEA (270 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was performed for 10 minutes under microwave irradiation in a DMF solution of Fmoc-Ser [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (54 ⁇ mol), HBTU (54 ⁇ mol), HOBt (54 ⁇ mol), and DIEA (135 ⁇ mol). did.
  • HBTU 54 ⁇ mol
  • HOBt 54 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (180 ⁇ mol), HBTU (180 ⁇ mol), HOBt (180 ⁇ mol), DIEA (270 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was carried out with DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (54 ⁇ mol), HBTU (54 ⁇ mol), HOBt (54 ⁇ mol) and DIEA (135 ⁇ mol) for 10 minutes under microwave irradiation. did.
  • HBTU 54 ⁇ mol
  • HOBt 54 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (180 ⁇ mol), HBTU (180 ⁇ mol), HOBt (180 ⁇ mol), DIEA (270 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • Glycosyl-substituted amino acid elongation reaction was performed using Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] or Fmoc-Ser [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (54 ⁇ mol), HBTU (54 ⁇ mol) and HOBt (54 ⁇ mol), DIEA The mixture was reacted with (135 ⁇ mol) DMF solution for 10 minutes under microwave irradiation. Further, HBTU (54 ⁇ mol) and HOBt (54 mol) were added and reacted for 10 minutes under microwave irradiation.
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute. Subsequently, the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). In the synthesis of glycopeptide, these three steps (1) elongation with various Fmoc amino acids, (2) acetylation treatment, and (3) de-Fmocation were sequentially repeated.
  • the obtained solid phase resin was treated with trifluoroacetic acid: water (95: 5, v / v) for 2 hours.
  • the reaction solution was filtered and precipitated by adding ether to obtain crude crystals.
  • the crude product was dissolved in methanol, adjusted to pH 12.0-12.5 with 1N aqueous sodium hydroxide solution and treated at room temperature for 1 hour. After adjusting to pH 7 by adding 10% acetic acid, the solvent was distilled off.
  • the obtained residue was purified by reverse phase high performance liquid chromatography to give Compound 9 as a lyophilized powder (37.8 mg, yield 25%).
  • the amino acid elongation reaction was carried out for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (360 ⁇ mol), HBTU (360 ⁇ mol), HOBt (360 ⁇ mol), and DIEA (540 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). did.
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was carried out using a DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 4 Gal ⁇ (1 ⁇ 3) Ac 2 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (108 ⁇ mol), HBTU (108 ⁇ mol), HOBt (108 ⁇ mol) and DIEA (270 ⁇ mol). For 10 minutes under microwave irradiation.
  • HBTU 108 ⁇ mol
  • HOBt 108 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the amino acid elongation reaction was performed for 9 minutes with a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (48 ⁇ mol), HBTU (48 ⁇ mol), HOBt (48 ⁇ mol), and DIEA (72 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • microwave irradiation 40 W, 2450 MHz, 50 ° C.
  • these three steps (1) elongation with various Fmoc amino acids, (2) acetylation treatment, and (3) de-Fmocation were sequentially repeated.
  • the obtained solid phase resin was treated with trifluoroacetic acid: water: triisopropylsilane (95: 2.5: 2.5, v / v / v) for 1 hour.
  • the reaction solution was filtered and precipitated by adding ether to obtain crude crystals.
  • the amino acid elongation reaction was performed for 9 minutes with a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (48 ⁇ mol), HBTU (48 ⁇ mol), HOBt (48 ⁇ mol), and DIEA (72 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • Glycosylated amino acid elongation reaction was performed for 10 minutes under microwave irradiation in a DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (14 ⁇ mol), PyBOP (14 ⁇ mol), HOAt (14 ⁇ mol) and DIEA (36 ⁇ mol). did.
  • the amino acid elongation reaction was performed for 6 minutes with a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (192 ⁇ mol), HBTU (192 ⁇ mol), HOBt (192 ⁇ mol), and DIEA (288 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.). .
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • microwave irradiation 40 W, 2450 MHz, 50 ° C.
  • these three steps (1) elongation with various Fmoc amino acids, (2) acetylation treatment, and (3) de-Fmocation were sequentially repeated.
  • the obtained solid phase resin was treated with trifluoroacetic acid: water (95: 5, v / v) for 2 hours.
  • the reaction solution was filtered and precipitated by adding ether to obtain crude crystals.
  • the crude product was purified by reverse phase high performance liquid chromatography to give Compound 14 as a lyophilized powder (9.0 mg, yield 11%).
  • the amino acid elongation reaction was carried out for 6 minutes in a DMF solution of Fmoc amino acid derivative (192 ⁇ mol), HBTU (192 ⁇ mol), HOBt (192 ⁇ mol), and DIEA (288 ⁇ mol) under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the sugar chain-substituted amino acid elongation reaction was performed for 10 minutes under microwave irradiation with a DMF solution of Fmoc-Thr [Ac 3 GalNAc ⁇ (1 ⁇ O)] (58 ⁇ mol), HBTU (58 ⁇ mol), HOBt (58 ⁇ mol), and DIEA (144 ⁇ mol). did.
  • HBTU 58 ⁇ mol
  • HOBt 58 ⁇ mol
  • the unreacted amino group was acetylated by treatment with an acetic anhydride / DIEA / DMF (10: 5: 85, v / v / v) solution at room temperature for 1 minute.
  • the Fmoc group was deprotected by treatment with 20% piperidine / DMF for 3 minutes under the conditions of microwave irradiation (40 W, 2450 MHz, 50 ° C.).
  • the compound 3 was boosted in the same manner, and blood was collected 3 days later to collect iliac lymph nodes.
  • the collected cells were fused with myeloma cells SP2 and cultured in HAT selection medium to select antibody-producing cells.
  • the culture supernatant of the obtained hybridoma was spread on an ELISA plate and screened by a binding reaction with compound 2.
  • Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution, etc., and hybridoma strain 3A9-4B1 (NPMD accession number NITE BP-01845) that produces the target monoclonal antibody SN-101 and hybridoma strain that produces the target monoclonal antibody SN-102 Established 3C10-E11.
  • SN-101 was purified from the cultured hybridoma strain NITE BP-01845 by the following method. 200 ⁇ mL of the culture supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m filter to obtain a material for antibody purification. Alternatively, ammonium sulfate was added to the culture supernatant to achieve 50% saturation, and the precipitate was collected by centrifugation at 10,000 g for 20 minutes. This was dissolved in 10 ml of PBS and dialyzed against the same solution as purified material and subjected to affinity chromatography using a HiTrap-Protein-G-HP column (GE Healthcare).
  • a HiTrap Protein G HP column connected to AKTA explorer 100 was equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), and the sample was added. After washing unnecessary components that do not bind to the column with the same buffer, the bound antibody is eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.5), and added with a small amount of 1 M Tris-HCl buffer (pH 9.0). It was summed up. In addition, the fraction recovered through the column was repeatedly added to the column and eluted to improve the antibody recovery rate. Through the work so far, we have obtained 2.3 mg of SN-101. As a result of performing the same purification method from 200 ⁇ mL of the other 3C10-E11 culture supernatant, 8.3 mg of SN-102 was obtained.
  • the culture supernatant was diluted 10 times with the following reaction solution.
  • a hybrid cover (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was placed on the glycopeptide-immobilized array, and 70 ⁇ L of the diluted solution was developed and reacted at room temperature for 2 hours. The hybrid cover was removed, and the substrate was washed once with the following washing solution and water. After drying the substrate, cover with a hybrid cover and develop anti-IgG (H + L), Mouse, Goat-Poly, Cy3 (manufactured by Rockland Immunochemicals) to 1 ⁇ g / mL with the following solution on the substrate. And reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, washing with the washing solution.
  • Antibody SN-101 and antibody SN-102 specifically recognized and bound to the sugar chain Tn structure and modification position of the glycopeptide derived from MUC1, respectively.
  • SN-101 (i) a glycopeptide in which a Tn sugar chain is bound to threonine at position 8 of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp- (Tn) Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys Combined with (ii) The Tn sugar chain of the MUC1-derived glycopeptide does not bind to the glycopeptide substituted with T or STn.
  • Tn sugar chain is linked to threonine at position 8 of the peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Binds to -Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr (ii)
  • the Tn sugar chain of the glycopeptide derived from MUC1 does not bind to the glycopeptide substituted with T or STn, or is weak even when bound.
  • Example 4 Detection of MUC1 Glycopeptide in Patient Serum Using antibody SN-101, whether antigen glycopeptide is detected in serum of breast cancer, prostate cancer, hepatocellular carcinoma, pancreatic cancer, colon cancer and ovarian cancer specimens did. The number of specimens was 5 to 10 patient sera clinically diagnosed with the disease, and several normal sera were used as negative controls. Antigen glycopeptide was not detected in normal serum, but antigen glycopeptide was detected in patient serum.
  • Example 5 Immunofluorescence staining of MUC1-expressing cells with antibody SN-101 and antibody SN-102
  • Breast cancer cell line OCUB-M was cultured overnight at 37 ° C. in 5% CO 2 in D-MEM containing 10% FBS. . The medium was removed by suction, the cell layer was washed with PBS, and then fixed with PBS containing 4% paraformaldehyde for 10 minutes. Subsequently, after osmotic treatment with PBS containing 0.1% Triton X TM -100, blocking was performed with a blocking buffer (PBS containing 1% BSA) for 20 minutes.
  • PBS containing 1% BSA blocking buffer
  • Example 6 Cell Growth Inhibition Experiment Breast cancer cells OCUB-M cultured in a DMEM (10% FBS) medium were seeded in a 96-well plate at 3 ⁇ 10 3 per well. After culturing at 37 ° C. for 48 hours in a 5% CO 2 atmosphere, antibody SN-101 was added to a final concentration of 0.565 mg / mL or 1.13 mg / mL. After culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 48 hours, 20 ⁇ L of Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) reagent was added per well and incubated at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 2 hours. As a result of measuring the absorbance at 490 nm, a decrease in the number of cells was recognized in a concentration-dependent manner as compared with the control (see FIG. 6).
  • Example 7 Galectin 3 Binding Inhibition Experiment Three 4.8 ⁇ 10 3 breast cancer cells MCF-7 suspended in RPMI-1640 (10% FBS) were added to an 8-well chamber slide at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. For 16 hours. The medium was removed by suction, and 4% formaldehyde in PBS was added to the extent that cells were immersed 2 mm. Cells were fixed for 15 minutes. The fixative was removed by suction and washed 3 times with PBS for 5 minutes each. Blocking was performed with a blocking buffer (PBS containing 5% BSA) for 1 hour.
  • RPMI-1640 % FBS
  • the blocking solution was removed by aspiration, and the antibody alone, various concentrations of SN-101 and galectin 3 were mixed and incubated at 4 ° C. for 2 hours.
  • the antibody was removed by suction and then washed 3 times with PBS for 5 minutes each.
  • Cy5-labeled anti-mouse IgG antibody was added and incubated for 1 hour at room temperature in the dark. After the secondary antibody was removed by suction, it was washed 3 times with PBS for 5 minutes each.
  • an all-in-one fluorescence microscope BZ-9000 (KEYENCE) inhibition of binding between galectin 3 and MUC1 was observed depending on the antibody concentration.
  • an antibody that recognizes a glycopeptide modified with an O-linked sugar chain Tn on a tandem unit peptide of human MUC1 very specifically is provided.
  • the anti-MUC1 antibody of the present invention it is possible to detect the presence of MUC1 in a highly sensitive, reliable and simple manner, specifically for a glycopeptide epitope modified with Tn, and as a disease related to MUC1 Since it becomes possible to determine a malignant tumor, it is considered useful in the field of medical diagnosis.
  • the anti-MUC1 antibody of the present invention is considered to be useful in the medical field such as cancer therapy by affecting the function of cancer cells involving MUC1.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of a tandem unit peptide of human MUC1
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence of a variant of a tandem unit peptide of human MUC1
  • SEQ ID NO: 3 Amino acid of a peptide obtained by adding Cys to the C-terminus of a tandem unit peptide of human MUC1
  • SEQ ID NO: 4 Amino acid sequence of tandem unit peptide of human MUC2 SEQ ID NO: 5: Amino acid sequence of tandem unit peptide of human MUC4
  • 6 Amino acid sequence of SN-101H
  • SEQ ID NO: 7 Amino acid sequence of SN-101L
  • SEQ ID NO: 8 Amino acid sequence of CDR1 of SN-101H
  • SEQ ID NO: 9 amino acid sequence of CDR2 of SN-101H
  • SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of CDR3 of SN-101H
  • 11 amino acid sequence of CDR

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Abstract

本発明は、癌細胞に高発現する糖鎖構造を有するMUC1に特異性を有する抗体、この抗体の作製方法、並びに前記抗体による癌の診断と予防又は／及び治療の新たな手段及び方法を提供する。本発明は、ヒトMUC１に対するモノクローナル抗体であって、ヒトMUC１タンデムユニット並びに前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列中のスレオニン及びセリンのいずれか１つにO-結合型糖鎖コア０（Tn）を有する糖ペプチドを特異的に認識する、前記抗体。ヒト体液サンプル中のMUC１を検出する方法。上記モノクローナル抗体を含むキット。上記モノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防又は／及び治療用の医薬組成物。

Description

抗ＭＵＣ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途
　本発明は、抗MUC１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途に関する。より特定するとMUC１糖ペプチドに対する抗体又はその抗原結合性断片及びこれを用いた悪性腫瘍の診断技術及び予防又は／及び治療技術に関する。
(関連出願の相互参照)
　本出願は、２０１４年４月２８日出願の日本特願２０１４－９２２９９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　MUC１はムチン糖タンパク質の1種であり、MUC１遺伝子（MUC1）にコードされたコアタンパク質と、O-型糖鎖結合を介してコアタンパク質に結合した無数の糖鎖をもつ。ムチンには上皮細胞などが産生する分泌型ムチンと、疎水性の膜貫通部位を持ち細胞膜に結合した状態で存在する膜結合型ムチンがある。MUC１は、上皮細胞の膜結合型ムチンであり、正常細胞では乳腺細胞の先端面や乳脂肪滴、あるいは膵臓、腎臓やいくつかの腺上皮細胞に存在する[非特許文献１]。分子サイズは400kDa以上で、その50％をO-結合型糖鎖が占める。本糖タンパク質は、短いN末端領域、水酸基を持つアミノ酸が25％を占めるタンデムリピートからなる中央領域、31アミノ酸からなる膜貫通領域、細胞質側の短いC末端領域からなり、中央領域を含む細胞外領域は種々の条件で切断され遊離する。各タンデムリピート（タンデムユニット）は、5つのO-糖鎖修飾可能な部位を有する20アミノ酸（Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala）よりなる。タンデムリピートの数は対立遺伝子依存的に20～125の間で変動するので、この領域はVNTR（variable number of tandem repeats）と言われる。VNTR領域は、個体によって発現される反復数が遺伝的に異なるサイズ多型を生じるとともに、特定のアミノ酸の遺伝子変異による4種の配列多型が知られる。配列多型の中ではPro-Asp-Thr-Arg(PDTR)からPro-Glu-Ser-Arg(PESR)への変異頻度が高い[非特許文献２]。
　MUC1は、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌など多くの癌で過剰発現することが知られ、特に乳癌、卵巣癌、膵癌では90％以上で過剰発現が認められる。更に、MUC１の高発現は種々の癌の予後不良を伴い、癌患者では血中の遊離MUC1濃度が上昇する[非特許文献１]。
　MUC1のVNTRs領域のセリン、スレオニン残基へのO-糖鎖修飾で最初に転移される糖は、GalNAc(Tnと表記されることがある)の場合が最も多く、この結果Tn抗原が生成する。Tnは正常MUC1では殆ど見られないが、癌由来のMUC1で認められる。次いで、Tnにシアル酸、ガラクトース、又はGlcNAcが付加して、それぞれsialyl-Tn（STn）、コア１（T)又はコア２が生成する。コア２にシアル酸が付加するとシアリルT（ST）が生成する。STnに更に他の糖鎖が付加されることはないが、TnにはGlcNAc、GalNAcが転移される。癌細胞において、O-型糖鎖は不完全に処理されて、癌に一般的な糖抗原Tn（GalNAc α-１-Ser/thr）、STn（Sia α2-6 GalNAc α1-O-Ser/Thr）、T（Gal β1-3 GalNAc α-１-O-Ser/Thr）、コア２(GlcNAc β1-3GalNAc α1-O-Ser/Thr）、ST（Sia α2-3Gal β1-3GalNAc α１-O-Ser/Thr／Sia α2-6(Gal β1-3)GalNAc α１-O-Ser/Thr）の発現をもたらす。癌が進行する間に、MUC１のタンデムリピート中の５つのO-糖鎖修飾可能な部位へのこのような異なる糖鎖修飾に起因して抗原構造（エピトープ）は変化する[非特許文献４]。尚、最初にGalNAcが転移されたO-グリカンのコア構造は多種知られ、番号が付けられ、コア０、１及び２のコア構造を以下に示す。
コア０（Tn antigen）    GalNAc
コア１（T antigen）     Galβ1-3GalNAc
コア２：                Galβ1-3(GlcNAcβ1-6) GalNAc
　MUC１コアタンパク質のO-グリコシル化による糖鎖付加は、上皮細胞表層の保護、免疫反応、細胞接着、炎症反応、及び癌化、癌転移に重要な役割を果たしている。癌化によるMUC1の過剰発現や、O-グリコシル化の劇的な変化と癌化及び癌転移との関連性が報告されている。更に、MUC1に対するモノクローナル抗体が、乳癌や卵巣癌を対象とした診断薬及び治療薬としての研究開発が進められている[非特許文献１]。又最近、癌進行及び転移にはMUC糖タンパク質とガレクチンの相互作用が重要であることが認められるようになった[非特許文献５]。
　過去に、精製したMUC１並びにMUC１に由来する合成ペプチド及びグリコペプチドに対する多数のモノクローナル抗体が報告されている[特許文献1－5、非特許文献6、7]。これらの抗体の殆どの最小配列認識は、MUC１のタンデムリピートのペプチド中のAla-Pro-Thr-Arg-Pro-Ala-Proに存在すると考えられる。この配列中に含まれるスレオニンについては、重度にO-グリコシル化されているため、MUC１に結合する抗体の選択性及び親和性に影響を及ぼすことが考えられる。しかし、上記報告中のいずれのモノクローナル抗体も、エピトープであるペプチドの糖鎖結合の有無による差異は認識できたとしても、その糖鎖構造の差異までは認識できなかった。そのため、癌細胞に対する選択性は不十分であった。それに対して本発明者らは、MUC１の癌関連構造STnに対する正常組織関連構造の交差反応性比が高い抗体を作製した[特許文献6、7]。しかし、これらの抗体も、MUC１のコアペプチド構造及びコアペプチドにO-グリコシル化された各種糖ペプチド構造の差異を正確に識別することは困難であった。
　　［特許文献１］日本特許第３６９８３７０号明細書
　　［特許文献２］日本特表２００２－５０２６２１公報
　　［特許文献３］日本特表２００３－５１９０９６公報
　　［特許文献４］米国特許出願公報２００６／０２９２６４３
　　［特許文献５］日本特表２０１０－５０５７７５公報
　　［特許文献６］ＷＯ０２０１０／０５０５２８
　　［特許文献７］ＷＯ０２０１１／１３５８６９
　　［特許文献８］日本特開２００６－１１１６１８号公報
　　［非特許文献１］Beatsonら、Immunother.2:305-327 (2010)
　　［非特許文献２］Engelmannら、J. Biol. Chem. 276: 27764-27769 (2001)
　　［非特許文献３］Bafinaら、Oncogene 29: 2893-2904 (2010)
　　［非特許文献４］Clin.Cancer Res.19: 1981-1983 (2013)
　　［非特許文献５］Liuら、Nature Rev Cancer 5:29-41 (2005)
　　［非特許文献６］Danielczykら、Cancer Immunol. Immunother. 55: 1337-1347 (2006)
　　［非特許文献７］Caoら、Histochem. Cell Biol.115:349-356 (2001)
　　［非特許文献８］Ohyabuら、J. Am. Chem.Soc. 131: 17102-17109 (2009)
　　［非特許文献９］Matsusitaら、Biochim. Biophy. Acta 1840: 1105-1116 (2014)
　　［非特許文献１０］Hashimotoら、Chem. Eur. J. 17: 2393-2404 (2011)
　　［非特許文献１１］Lu-Gangら、J. Biol. Chem.282: 773-781 (2007)
特許文献１～８及び非特許文献１～１１の全記載は、ここに特に開示として援用される。
　本発明者らは、抗体の特異性解析及びエピトープマッピングを正確に実施することができる、高感度・高性能の糖ペプチド固定化マイクロアレイを開発し、真のエピトープ構造を決定する新たな方法を確立した。この方法を用いて前記した既存の７つの抗MUC１抗体のエピトープ解析を行った。その結果、いずれの抗体もMUC１のコアペプチド構造及びコアペプチドにO-グリコシル化された糖ペプチド構造の差異を認識できないことが明らかになった[非特許文献8、9]。
　更に本発明者らは、抗MUC1抗体のエピトープ領域では側鎖に結合する糖鎖の構造特異的に主鎖ペプチドのコンフォメーション変化が誘起されていることをNMRにより証明した。さらに、ペプチドのコンフォメーションが特定のアミノ酸残基での糖鎖修飾により敏感に変化しており、これが抗MUC1抗体の抗原構造を規定していることを明らかにした[非特許文献8]。また、ムチン由来の合成糖ペプチドの３次元構造の変化をMS及びNMRを用いて解析した。それにより、糖ペプチドのコンフォメーションが、ペプチドに数個存在するスレオニン残基への糖鎖修飾によって影響され、特定位置の糖鎖修飾がペプチド主鎖の安定したコンフォメーションをもたらすという新知見を示した[非特許文献10]。
　これらの知見を踏まえて、本発明は、癌細胞で高発現をするO-結合型糖鎖を有する糖ペプチドに特異的な抗MUC1抗体を提供することを解決すべき課題とする。ここで、「O-結合型糖鎖を有する糖ペプチドに特異的」とは、MUC１のコアペプチド構造及びコアペプチドにO-グリコシル化された各種糖ペプチド構造の差異を正確に識別することができることを意味する。
　さらに本発明は、この抗体作製に適した抗原となる合成糖ペプチドを提供することを解決すべき課題とする。加えて、本発明は、前記抗体による癌の診断と予防又は／及び治療の新たな手段及び方法を提供することも解決すべき課題とする。
　本発明者は、糖鎖及び糖ペプチドに関して本発明者らが得た新しい技術と知見を応用して、上記課題を解決するために、MUC1のVNTRs領域のセリン、スレオニン残基へのO-糖鎖修飾で最初に転移されるコア糖構造であるTnを有する糖ペプチドを人工的に合成し、この人工的に合成した糖ペプチドを抗原に用いてモノクローナル抗体を作製した。前記Tnを有する糖ペプチド（以下、Tn抗原と呼ぶことがある）から得られた抗MUC１抗体のいくつかについて、抗原に用いた糖ペプチドを含む各種ムチンのVNTRs領域に由来する糖ペプチドを搭載したマイクロアレイを用いて抗体の特異性解析を行い、抗体の特性を検討した。更にこれらの抗体は、各種癌細胞に発現したMUC1への結合・集積、癌患者血清に対する反応、癌細胞増殖抑制作用、癌転移抑制作用などについて検討した。これらの検討の結果、MUC１のコアペプチド構造及びコアペプチドにO-グリコシル化された各種糖ペプチド構造の差異を正確に識別することができる抗体を見出し、それに基づいて本発明は完成された。
　本発明は、以下の通りである。
[１]
ヒトMUC１に対するモノクローナル抗体であって、ヒトMUC１タンデムユニット並びに前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列中のスレオニン及びセリンのいずれか１つにO-結合型糖鎖コア０（Tn）を有する糖ペプチドを特異的に認識する、前記抗体又はその抗原結合性断片。
[２]
前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の８位のスレオニンに結合する、[１]に記載されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[３]
前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号２で示されるアミノ酸配列の８位のセリンに結合する、[１]に記載されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[４]
下記i)～iii)に示す結合特性を有する[１]～[３]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
i)前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）が、O-結合型糖鎖T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合せず
ii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、かつ
iii)MUC2のタンデムユニットペプチド又はMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しない。
[５]
免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号8のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号9のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号10のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号11のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号12のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号13のアミノ酸配列からなる、[１]～[４]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
［６］
免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号16のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号17のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号18のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号19のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号20のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号21のアミノ酸配列からなる、[１]～[４]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
［７］
配列番号6のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、［５］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［８］
配列番号14のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、［６］に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［９］
前記抗原結合性断片は、前記相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 及び CDR3'の少なくとも１つを含むペプチドである、[１]～[８]のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
［１０］
前記抗原結合性断片は、Fab、F（ab'）２、Fab'、diabody、一本鎖抗体（例えば、scFv、dsFv）、二価特異的抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である[１]～[９]のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
 [１１]
MUC1の特異的検出に用いるための[１]～[１０]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[１２]
ヒト体液サンプル中のMUC１を特異的に検出する方法であって、
(a)上記サンプルを[１]～[１０]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させ、
(b)接触後のサンプルにおける抗体（又はその抗原結合性断片）－抗原複合体の形成を測定することを含む、前記方法。
[１３]
前記体液サンプル中の、MUC１の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いるための[１２]に記載の方法。
[１４]
前記悪性腫瘍が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌からなる群より選択されるものである、[１３]に記載の方法。
[１５]
(a)[１]～[１０]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、
(b)抗体（又はその抗原結合性断片）－抗原複合体を測定するための試薬を含む、[１２]～[１４]のいずれか1項 に記載の方法に使用するためのキット。
[１６]
[１]～[１０]のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する、 悪性腫瘍の予防又は／及び治療用の医薬組成物。
[１７]
前記悪性腫瘍が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌からなる群より選択されるものである、[１６]記載の組成物。
　本発明により、ヒトMUC１に対するモノクローナル抗体であって、かつMUC１のタンデムユニットペプチドのO-結合型糖鎖がコア０（Tn）であるMUC１を特異的に認識し、前記O-結合型糖鎖が付加していないnaked peptideや前記O-結合型糖鎖がTn以外であるMUC１糖ペプチドを識別し結合しない、抗MUC１抗体及び抗体を作製するための抗原糖ペプチドを用いた方法が提供される。本発明の抗MUC１抗体を用いることにより、特異的かつ高感度に、信頼性をもって、かつ簡便にMUC１タンパク質を検出することができ、正常対照に対してMUC１発現の変化が認められる悪性腫瘍や炎 症疾患を判定することが可能になる。更に本発明の抗MUC１抗体で癌の進行や転移を抑えることによって、癌の予防又は／及び治療薬として用いることが可能であることが示された。
MUC1由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 MUC2由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 MUC4由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 糖ペプチド固定化マイクロアレイによるSN-101及びSN-102の反応特異性評価。 抗体SN-101又は抗体SN-102によるMUC1 発現細胞の免疫蛍光染色結果。 抗体SN-101による細胞増殖阻害実験結果。 抗体SN-101及びSN-102の可変領域のアミノ酸配列を示す。 抗体SN-101の可変領域を含むアミノ酸配列を示す。 抗体SN-102の可変領域を含むアミノ酸配列を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗原糖ペプチド及び抗体
　本発明に係わる抗体は、ヒトMUC１に対するモノクローナル抗体であって、ヒトMUC１タンデムユニット並びに前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列中のスレオニン及びセリンのいずれか１つにO-結合型糖鎖コア０（Tn）を有する糖ペプチドを特異的に認識する、前記抗体である。
　本発明に係わる抗体の一例は、前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の８位のスレオニンに結合するモノクローナル抗体である。本発明に係わる抗体の別の一例は、前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号２で示されるアミノ酸配列の８位のセリンに結合するモノクローナル抗体を挙げることができる。
　これら本発明の抗体は、下記i)～iii)に示す結合特性をさらに有するものであることができる。
i)前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）が、O-結合型糖鎖T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合せず
ii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、かつ
iii) 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するMUC2のタンデムユニットペプチド又は配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しない。
１－１．抗原糖ペプチド
　MUC1のタンデムリピートのO-結合型糖鎖として最初にコアペプチドに転移される糖はGalNAcの場合が最も多く、この結果Tn抗原が生成する。Tnは正常MUC1では殆ど見られないが、癌由来のMUC1で認められる。
　ヒトMUC１のタンデムユニットペプチドは、下記アミノ酸配列を有する。
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr（配列番号１）
　また、ヒトMUC１のタンデムユニットペプチド変異体は、下記のアミノ酸配列を有する。
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Glu-Ser-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr（配列番号２）
　抗原作製においては、上記いずれかのペプチドの所定のアミノ酸にO-結合型糖鎖を付加した糖ペプチドを抗原として用いることができる。このO-結合型糖鎖を付加した糖ペプチドは、人工的に合成したものである。
　前記O-結合型糖鎖は、Tnのコア構造（GalNAc）を有する糖鎖である。さらに、前記O-結合型糖鎖は、前記配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列を有するタンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニン（Thr）又はセリン（Ser）に結合する。
　抗原糖ペプチドの合成は、本発明者らが開発した、マイクロ波と酵素合成法とを高度に活用した合成技術により行うことができる。より具体的には、例えば、非特許文献9や特許文献6～8記載の方法に準じて実施できる。非特許文献9及び特許文献6～8の全記載は、ここに特に開示として援用される。
１－２．抗体:
　本発明の抗体は、１－１に記載の糖ペプチドを抗原として用いて常法により調製できる。抗原糖ペプチドは、抗原性を高めるためキャリアタンパク質と結合させても良く、その場合、上記糖ペプチドのC末端にキャリアタンパク質との結合に必要なCysを付加したものを合成し、抗原糖ペプチドとして用いることができる。キャリアタンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、オボアルブミン（OVA）などがあり、当技術分野では公知であり市販のキットも販売されている。抗原を哺乳類、例えばマウス、ウサギ、ラットなどに投与する。免疫は主として静脈内、皮下、腹腔内、足蹠に注入することにより行われる。また免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１～５回の免疫を行う。最終の免疫日から数日から90日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、リンパ節細胞、脾臓細胞、末梢血細胞などが挙げられる。ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。ミエローマ細胞は、一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。使用する細胞としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生育できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが望ましい。ミエローマ細胞としては、例えばSP2、P3X63-Ag.8.UI(P3U I)、NS-1などのミエローマ細胞株が挙げられる。
　細胞融合後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、細胞懸濁液をウシ胎児血清含有RPM-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまく。各ウェルに選択培地（例えばHAT培地）を加え、以後適当に選択培地を交換して細胞培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10～30日程度で生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。次に、ハイブリドーマの上清を、MUC1に反応する抗体が存在するか否かについて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）等を用いてスクリーニングする。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
　樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法などを採用することができる。抗体の精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることによって精製することができる。
　本発明において使用可能なモノクローナル抗体のグロブリンタイプは、特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDのいずれでも良いが、IgG及びIgMが好ましい。
　前記ハイブリドーマを用いて作製される本発明の抗MUC1モノクローナル抗体はマウス抗体であるが、マウス抗体は公知の幾つかの確立された技法を用いて、キメラ抗体、またはヒト化抗体に変換し製造することができ（変換方法は後述する）、本発明の抗マウスMUC1モノクローナル抗体と同様の抗原特異性を有するキメラ抗体、及びヒト化抗体も本発明の抗体に包含される。さらに、本発明の抗マウスMUC1モノクローナル抗体と同様の抗原特異性を有し、かつ異なる抗原特異性を有する二価特異的抗体も、本発明の抗体に包含される。
[規則91に基づく訂正 11.05.2015]　
　本発明のモノクローナル抗体の具体例は、実施例にも記載されているモノクローナル抗体SN-101及びSN102である。モノクローナル抗体SN-101は、ブダペスト条約に基づき独立行政法人製品評価技術 基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2014年４月１８日に受託番号NITE BP-01845として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体SN102は、ハイブリドーマ株3C10-E11(実施例参照) により分泌される、モノクローナル抗体である。
　モノクローナル抗体SN-101は、配列番号6のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体である。さらに、モノクローナル抗体SN-101は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号8のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号9のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号10のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号11のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号12のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号13のアミノ酸配列からなる。
　モノクローナル抗体SN-102は、配列番号14のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する。さらに、モノクローナル抗体SN-102は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号16 のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号17のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号18のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号19のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号20のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号21のアミノ酸配列からなる。
　モノクローナル抗体SN-101は、下記i)～v)に示す結合特性を有する。
　i)MUC1由来の糖ペプチドGly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro- Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cysに結合し、
　ii)前記MUC1由来の糖ペプチドのTn糖鎖が、T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合せず
　iii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、
　iv) 配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するMUC2のタンデムユニットペプチド又は配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しない。
尚、モノクローナル抗体SN-101は、C末端にCysを有さない、 MUC1由来の糖ペプチドGly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro- Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thrにも結合し、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）には結合しない。
モノクローナル抗体SN-102は、下記i)～vi)に示す結合特性を有する。
i) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの8位のスレオニンにTn糖鎖が結合した糖ペプチドGly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thrに結合し、
ii)前記MUC1由来の糖ペプチドのTn糖鎖が、T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合しないか、結合しても弱い結合であり、
iii)配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、
iv)配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの14位のセリン、15位のスレオニンにTn糖鎖が修飾された糖ペプチドには結合せず、
v) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドのスレオニン、セリンの全てにTn糖鎖が修飾された糖ペプチドには結合し、
iv)MUC2のタンデムユニットペプチド又はMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しない。
尚、モノクローナル抗体SN-102は、C末端にCysを有する、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの8位のスレオニンにTn糖鎖が結合した糖ペプチドGly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cysにも結合し、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）には結合しない。
　本発明は、前記モノクローナル抗体に加えて、前記モノクローナル抗体の抗原結合性断片を包含する。前記抗原結合性断片は、前記SN-101又はSN-102の相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 及び CDR3'の少なくとも１つを含むペプチドである。前記抗原結合性断片は、例えば、Fab、F(ab')2、Fab'、diabody、一本鎖抗体（例えば、scFv、dsFv）であることができる。但し、抗原結合性断片は、上記に限定される意図ではなく、前記SN-101又はSN-102の相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 及び CDR3'の少なくとも１つを含むペプチドであり、SN-101と同様の上記i)～v)に示す結合特性を有するもの、又はSN-102と同様の上記i)～vi)に示す結合特性を有するものであればよい。さらに、キメラ抗体及びヒト化抗体、並びに二価特異的抗体は、免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインが、前記SN-101又はSN-102の相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 及び CDR3'を含むペプチドであり、SN-101と同様の上記i)～v)に示す結合特性を有するもの、又はSN-102と同様の上記i)～vi)に示す結合特性を有するものであればよい。
　抗原結合性断片とその作製方法の例について以下に説明する。
　[Fab、F(ab')2、Fab']
　作製法(1) ：マウスモノクローナル抗体を所定の酵素で消化したり、還元処理によりジスルヒド結合を切断することにより作製できる。
　・Fab：Papainによる消化。
　・F(ab')2：Pepsinによる消化。
　・Fab'：Pepsinによる消化及びβ-mercaptoethanolを用いた還元処理によるジスルヒド結合の切断。
　作製法(2)：遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現技術により作製できる。
　・Fab：
　・VH（H鎖可変領域）とCH1（H鎖定常領域ドメイン１）をコードする塩基配列
　・VL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）をコードする塩基配列
　上記２配列を大腸菌もしくは動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでFabを得る。
　・F(ab')2、Fab'：
　・VH（H鎖可変領域）とCH1（H鎖定常領域ドメイン１）、2量体を形成するための
　　システインを含むヒンジ領域をコードする塩基配列
　・VL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）をコードする塩基配列
　　記２配列を大腸菌もしくは動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでF(ab')2及びFab'を得る。。
　[scFv, dsFv]
　作製法: 遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現技術により作製することができる。
　・scFv：
　・VH（H鎖可変領域）をコードする塩基配列
　・リンガー配列： 「GSSSGSSSSGSSSSGSSSS」など、フレキシブルなアミノ酸を
　　コードする塩基配列
　・VL（L鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　一続きのVH-linker-VLもしくはVL-linker-VHの融合タンパク質として大腸菌もしくは動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでscFvを得る。
　・dsFv：
　・VH（H鎖可変領域）をコードする塩基配列
　・VL（L鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　VH、VLのC末側にシステインを挿入し、大腸菌もしくは動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでdsFvを得る。
　[diabody] 
　作製法: 遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現技術により作製することができる。
　　　(1)抗原Xに対するVH（H鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　　(2)抗原Xに対するVL（L鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　　(3)抗原Yに対するVH（H鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　　(4)抗原Yに対するVL（L鎖可変領域）をコードする塩基配列
　　　(5)リンガー配列： 「GSSSGSSSSGSSSSGSSSS」など、フレキシブルなアミノ酸を　
　　　コードする塩基配列
　一続きのVH(1)-linker(5)-VL(4)とVH(3)-linker(5)-VL(2)を融合タンパク質として大腸菌もしくは動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでdiabodyを得る。
 [キメラ抗体、またはヒト化抗体]
　・キメラ抗体：
　作製法: 遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現技術により作製することができる。
　・マウスVH（H鎖可変領域）とヒト抗体H鎖定常領域をコードする塩基配列
　・マウスVL（L鎖可変領域）とヒト抗体L鎖定常領域をコードする塩基配列
　上記２配列を動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでキメラ抗体を得る。
　・ヒト化抗体：
　作製法 遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現技術により作製することができる。
　・マウスVH（H鎖可変領域）を構成するFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4のうちCDR1, CDR2, CDR3をヒト抗体可変領域VHのFR1, FR2, FR3, FR4の間に挿入したヒト化VHとヒト抗体H鎖定常領域をコードする塩基配列
　・マウスVL（L鎖可変領域）を構成するFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4のうちCDR1, CDR2, CDR3をヒト抗体可変領域VLのFR1, FR2, FR3, FR4の間に挿入したヒト化VLとヒト抗体L鎖定常領域をコードする塩基配列
　上記２配列を動物細胞（CHO、HEK293、昆虫細胞）で発現させるために、各々の細胞に適した発現ベクターへ組込組込んだ後、細胞へ遺伝子導入し組換えタンパク質として産生することでヒト化抗体を得る。
　
２－１．ヒト体液サンプル中のMUC1を特異的に検出する方法
　本発明は、ヒト体液サンプル中のMUC1を特異的に検出する方法を包含し、この方法は以下の(a)及び(b)の工程を含む。
(a)上記サンプルを本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させる、
(b)接触後のサンプルにおける抗体(又はその抗原結合性断片)－抗原複合体の形成を測定する。
２－２．ヒトMUC1の免疫学的測定用キット
　本発明のキットは、上記本発明のヒトMUC1検出方法に使用するためのキットであって、
(a)本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、
(b)抗体(又はその抗原結合性断片)－抗原複合体を測定するための試薬とを含む。
　上記キットに用いられる本発明の本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（単に、抗MUC1抗体と呼ぶこともある）は、担体に固定化することができる。担体は、抗原が付着し得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、担体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、担体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック物質）であり得る。担体はまた、磁性粒子または光学繊維センサーであり得る。
　本発明の抗MUC1抗体は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、または目視判定可能な官位測定法などでは金コロイドや着色ラテックスなどにより標識され得る。標識に用いられる放射性同位元素としては、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、125Ｉ、131Ｉなどであり、特に、125Ｉが好適に用いられる。これらは、クロラミンＴ法、ペルオキシダーゼ法、Iodogen法、ボルトハンター法などにより、モノクローナル抗体に結合され得る。標識に用い得る酵素としては、例えば、βガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などを含む。これらは常法によりモノクローナル抗体に結合され得る。標識に用いる蛍光物質としては、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。標識に用いる発光物質としては、ルシフェリン、ルミノール誘導体、アクリジニウムエステルなどがある。簡易測定法などでは、金コロイドや着色ラテックスを用いてもよい。
　抗体(又はその抗原結合性断片)－抗原複合体を測定するための試薬は、用いられる免疫学的測定方法に応じて適宜 決定できる。ヒト体液サンプル中にヒトMUC1が含まれる場合に形成される抗体－抗原複合体を検出し得る公知の試薬を用いることができる。
　本発明において、「ヒト体液サンプル」とは、例えば、ヒトの血漿、血清、血液、尿、 唾液、癌組織分泌物などのヒトMUC1を含む可能性がある試料である。
　本発明のMUC1の特異的検出方法は、抗体として本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いること以外は、従来公知の免疫学的測定方法を用いて実施できる。従来公知の免疫学的測定方法としては、例えば、免疫組織化学染色法及び免疫電顕法、並びに免疫アッセイ[酵素免疫アッセイ（ELISA、EIA）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（RIA）、免疫クロマト法、免疫凝集法及びウエスタンブロット法等]等を挙げることができる。工程(b)における接触後のサンプルに形成された抗体－抗原複合体形成を測定する方法は、免疫学的測定方法に応じて適宜選択できる。
　免疫学的測定法についてより詳細に説明する。本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（第１のモノクローナル抗体）を固相に固定し、抗原を含む試料と共にインキュベートする工程、さらに標識した第２のモノクローナル抗体を加えて、得られた混合物をインキュベートする工程、および混合物中の生成した標識された抗原抗体複合体を検出する工程を包含するサンドイッチ免疫学的測定法が例示される。また、本発明の免疫学的測定法では、試料と、固相化した第１のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片および標識した第２のモノクローナル抗体とを同時にインキュベートしてもよい。サンドイッチ免疫学的測定法としては、その検出方法により、サンドイッチ放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、サンドイッチ蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、サンドイッチ発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、サンドイッチ発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が応用しうる。定量のためには、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法が好ましい。
　好ましい実施態様によれば、サンドイッチＲＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＲＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体）を固相したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、例えば125Ｉで標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃～４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体／抗体複合体を形成する（第２反応）。洗浄後、ビーズに結合した抗原抗体複合体の放射活性をガンマーカウンターなどで検出することによりの量を測定し得る。他の好ましい実施態様によれば、サンドイッチＥＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＥＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃～４５℃、好ましくは２５℃～３７℃で、１～４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体－抗体からなる免疫複合体を形成する（第２反応）。ビーズ上の酵素活性を、酵素に特異的な基質、例えば、標識酵素がＨＲＰであればテトラメチルベンヂチン（ＴＭＢ）を介して比色法により測定し、それによりビーズ上の捕獲された量を測定し得る。比色定量は、通常の分光光度計などで行われ得る。
２－３．ヒトMUC1の検出
　本発明の方法は、体液サンプル中のMUC1の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いることができる。MUC1の異常な発現がみられる悪性腫瘍としては、例えば、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌からなる群より選択されるものである。本発明の抗体は、上述したように、MUC1と特異的に反応するために、ヒトMUC1に関連する、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌などの悪性腫瘍の検出に有効である。
　MUC1の過剰発現が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌などの悪性腫瘍において報告されている。特に乳癌、卵巣癌、及び膵癌では90％以上でMUC1の過剰発現が認められている。MUC１の高発現は種々の癌の予後不良を伴い、癌患者では血中の遊離MUC1濃度が上昇する。[非特許文献１]
　更に、癌化や癌進行、転移に伴って、MUC1のO-グリカンの劇的な変化が起こることが報告されている[非特許文献１]。MUC1のVNTRs領域に見られるO-糖鎖修飾は、正常上皮組織では通常8－10個の単糖ユニットを含むポリラクトサミン型の長鎖及び分岐鎖糖で構成される。正常MUC1は細胞外領域がこのような沢山の糖鎖で修飾されることで、粘膜の保護や水和、潤滑作用、細菌や異物の攻撃からの保護作用、細胞間及び細胞マトリックス間相互作用の調節作用を示す。又、MUC1は正常細胞では細胞頂端（apical）に発現するが、癌細胞では頂端発現が無くなり無極性発現となり、細胞表層全体にMUC1が表出する。その際に、VNTR領域のO-糖鎖修飾のパターンは一変し、正常細胞に見られた長鎖及び分岐鎖で構成される複雑な糖鎖に変わって、 単純で短い糖鎖によるO-糖鎖修飾が認められる。癌化に伴うMUC1の無極性発現及び低糖鎖修飾は、正常な潜在的（cryptic）ペプチドエピトープの露出及び新規炭水化物エピトープを創出させる。従って、MUC1のこれらのエピトープ の内の、修飾糖鎖がTnであるエピトープに特異的に反応する本発明の抗体は、正常及び癌のMUC1を区別して認識することができ、ヒトMUC1に関連する悪性腫瘍の検出において用いることができる。更に癌細胞に陽性のMUC1のみを攻撃する場合に利用することも可能になる。
　本発明の免疫学的測定用キットは、上述した本発明の抗MUC1抗体又はその抗原結合性断片を含むものである。従って、本発明のキットを用いて、疾患への罹患又は障害の存在が疑われる被検体から採取したサンプル中に含まれるヒトMUC1を特異的に検出することによって、該被験体の疾患または障害の存在を迅速かつ簡便に判定するために利用ができる。このような免疫学的測定方法を利用した疾患又は障害の判定用試薬は周知であり、当業者であれば、抗体以外の適当な成分を容易に選択することができる。また本発明の免疫学的測定用キットは、免疫学的測定方法を行うための手法であればいずれの方法においても利用することができる。
　本発明は、本発明の抗体を用いる癌の診断法、本発明の抗体を含む診断剤、あるいは抗体を含む診断キットを提供することもできる。本発明の癌の診断法、診断剤または診断キットにおいて含まれる抗体は、上述した本発明の抗体である。本発明の抗体は、前述の特定の癌に特異的に結合することができることから、これらの癌の診断に使用されうる。
　本発明の抗体は、前述した悪性腫瘍の診断のためまたは患者における疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用され得る。１つの実施態様において、患者の癌は、患者から得られる生物学的サンプルについてのMUC1レベルを本発明の抗体を用いて求め、その結果をあらかじめ決定されたカットオフ値と比較して評価することにより悪性腫瘍の診断等にも利用することができる。
　上記(b)で得られた測定結果と対照サンプルに於いて同様の(a)及び(b)の工程を経て得られた測定結果とを比較して、測定された体液サンプルにおける悪性腫瘍の有無の検出に用いることができる。対照サンプルは、健常人から入手した体液サンプルであることができる。
　癌の存在または非存在を決定するために、固相支持体に結合して留まるレポーター基から検出されるシグナルは、一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの実施態様において、カットオフ値は、固定された抗体が癌を有さない患者からのサンプルとともにインキュベートされた場合に得られるシグナルの平均値である。一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値を上回る３つの標準偏差であるシグナルを生じるサンプルは、癌について陽性であると考えられる。カットオフ値は、例えば、診断試験結果のそれぞれの可能なカットオフ値に対応する真の陽性の割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（100％－特異性）の組のプロットから決定され得る。上部左隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最大領域を含む値）は最も正確なカットオフ値であり、そして本発明の方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プロットに沿って、偽陽性の割合を最小にするために左にシフトし得るか、または偽陰性の割合を最小にするために右にシフトし得る。一般に、本方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは、その癌について陽性であるとされる。
３．医薬組成物
　本発明の医薬組成物は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する悪性腫瘍の予防又は／及び治療用の医薬組成物であり、任意で医薬的に許容される担体を含むことかできる。前記悪性腫瘍が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌からなる群より選択されるものである。
　本発明の抗MUC1抗体及びその抗原結合性断片は、それぞれMUC1が関わる疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。MUC1が関わる疾患としては、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌などの悪性腫瘍がある。これらの悪性腫瘍の患者においては、MUC1の発現の異常、MUC1の糖鎖構造の異常及びそれによる機能の異常が認められるので、本発明の抗MUC1抗体は悪性腫瘍を抑制する作用によって、悪性腫瘍を予防又は／及び治療することが可能である。
　本発明の抗MUC1抗体及びその抗原結合性断片は、それぞれMUC1発現の異常、MUC1の糖鎖構造の異常及びそれによる機能の異常が認められる乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、卵巣癌に対し、それらの異常によって生起される細胞増殖の亢進や癌細胞転移などを抑制することによって、癌の予防又は／及び治療をすることが可能である。
　更に最近、乳癌や大腸癌などの癌転移にはMUC1とガレクチンの相互作用が重要であることが認められている[非特許文献１１]。癌細胞が浸潤や転移する際には、原発部位を離れ周辺の細胞外マトリックス及び内皮細胞に浸潤し、血管及びリンパ管に浸透して、最終的に２次部位に付着し増殖する。癌細胞を循環から転移部位への遊出は、(i)循環する癌細胞の停止及び癌細胞と血管内皮細胞との一過性の弱い接触（ドッキング）(ii)種々の接着受容体（インテグリンやカドヘリンなど）とそのリガンドの発現／局在の変化の誘導、及びそれに続く(iii)癌細胞の血管内皮細胞への強い付着（ロッキング）のプロセスを踏むが、これら３つのプロセスにMUC1とガレクチン３の相互作用が主要な役割を果たしていることが分かってきた。ガレクチンは、β-ガラクトシド構造を認識して結合あるいは糖鎖同士を架橋するタンパク質を総称するが、ガレクチン３は15種あるガレクチンの1種で、内皮細胞や免疫細胞の細胞質内、核、細胞表面、細胞外マトリックス等に存在することが知られている。癌細胞のMUC1がガレクチン３に結合すること、転移癌患者の血中ガレクチン３濃度は、正常対照に比べて上昇していること、循環癌細胞の血管内皮細胞への接着が癌細胞のMUC1発現及び内皮細胞の細胞外ガレクチン３の存在に依存すること、細胞外ガレクチン３の癌細胞MUC1への結合によってMUC1の細胞表層の局在が著しく変化し癌細胞と血管内皮細胞の結合が強くなることなどがこれまで認められ、血中ガレクチンとMUC1の相互作用が癌細胞の遠隔臓器への転移に重要な基本的分子機構であることを明らかにされている。従って、MUC1とガレクチン３との結合をブロックすることができれば、上記の癌転移プロセスの(i)～(iii)はいずれも抑止され、癌転移は抑制されることが可能になると考えられる。
　後述の実施例において、本発明の抗体が、MUC1とガレクチン３の結合を阻害することを示した。従って、本発明の抗体を用いて、癌化によりMUC1を過剰発現する癌の転移の予防及び／又は治療が可能であることが明らかになった。
　本発明の抗MUC1モノクローナル抗体はマウス抗体である。本発明の医薬組成物に用いる抗体は、マウス抗体をキメラ抗体、ヒト化抗体、または二価特異的抗体に変換したものであることが好ましい。マウス抗体のキメラ抗体、またはヒト化抗体への変換は、例を前述したように、公知の方法を用いて行うことができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を有効成分として、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－６０と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、リポソームも細胞送達のために該薬剤をカプセル化するために使用可能である。
　投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
　本発明の抗体の用量および投与方法は、患者の年齡、体重、性別、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により適宜選択することができる。本抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり0.0001mgから1,000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、患者あたり0.01～100,000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患 者の年齢、体重、性別、症状などにより変動するが、当事者であれば適宜選択することが可能である。
　以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
　糖ペプチドの合成
　　抗体の特異性評価のための糖ペプチドの合成法を以下に示した。いずれの化合物も特異性評価に用いるための架橋用のケトンを、また化合物１～４にはCysを結合させた配列の化合物を合成した。
5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2（化合物１）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel SRAM resin（０．２４mmol/g，５０mg, １２μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相 樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１を得た (6.3 mg,収率22%)。
5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2（化合物２）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel SRAM resin（０．２４mmol/g，１００mg, ３６μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１４４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１４４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１４４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２１６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（４３μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４３μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４３μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１０８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（４３μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４３μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物２を得た(13.3 mg,収率15%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2（化合物３）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel SRAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ4Ｇａｌβ（１→３）Ａｃ2ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）（５８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物３を得た (22.0mg,収率17%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Sialyl-T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2（化合物４）の合成
　　化合物３（１０ｍＭ, ３００μｌ, water）を１０００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０, ３０μｌ）,１０００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０, ３０μｌ）,１０００ｍＭ ＭｎＣｌ2（６μｌ）,１５０ｍＭ ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ（６０μｌ）,１．４Ｕ／ｍＬα２,３－（Ｏ）－Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, Ｒａｔ, Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ, Ｓ. ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（３０μｌ, Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）, ｗａｔｅｒ（７４μｌ）を混合した反応液に混合した。２５℃で２４時間インキュベート後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として 化合物４を得た(5.5 mg,収率60%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物５）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４５mmol/g ，１００mg, ４５μmol, バイオタージ社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１８０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相 樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物５を得た (45.8 mg,収率45%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物６）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４５mmol/g ，１００mg, ４５μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１８０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（５４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１３５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物６を得た(43.2 mg,収率39%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物７）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４５mmol/g ，１００mg, ４５μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１８０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（５４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１３５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物７を得た(21.1 mg,収率19%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物８）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４５mmol/g ，１００mg, ４５μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１８０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（５４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１３５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物８を得た(48.2 mg,収率43%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr(Tn)-Ser(Tn)-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物９）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４５mmol/g ，１００mg, ４５μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１８０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１８０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１８０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]またはＦｍｏｃ－Ｓｅｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（５４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１３５μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５４ｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物９を得た(37.8 mg,収率25%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物１０）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．９０mmol/g ，２００mg, ９０μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０Ｍ Ｈｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（３６０μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３６０μ ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３６０μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５４０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間 反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ4Ｇａｌβ（１→３）Ａｃ2ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（１０８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１０８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１０８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２７０μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（１０８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１０８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を 濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１０を得た(110 mg,収率46%)。
　5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Sialyl-T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly- Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2（化合物１１）の合成
　　化合物８（１０ｍＭ, ４９６μｌ, water）を１０００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０, ３０μｌ）,１０００ｍＭ ＭｎＣｌ2（８μｌ）, ２００ｍＭ ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ（９５μｌ）, １．４Ｕ／ｍＬα２,３－（Ｏ）－Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, Ｒａｔ, Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ, Ｓ. ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（２８μｌ, Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）, ｗａｔｅｒ（２１２μｌ）を混合した反応液に混合した。２５℃で２４時間インキュベート後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として 化合物１１を得た(14 mg,収率96%)
　5-oxohexanoyl-Pro-Pro-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-Thr- Thr-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2（化合物１２）の合成
　　ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４８mmol/g ，２５mg, １２μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で９分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（９５： ２．５：２．５, ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えて ｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１２を得た(7.2 mg,収率30%)。
　5-oxohexanoyl-Pro-Pro-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-
　Thr(Tn)-Thr(Tn)-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2（化合物１３）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４８mmol/ g，２５mg, １２μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で９分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（１４μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１４μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（１４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＰｙＢＯＰ（１４μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（１４μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射 （４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５, ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１３を得た(4.7 mg,収率14%)。
　5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH2（化合物１４）の合成
　　ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel SRAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol,ラップポリマー社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍ ｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５，ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５,ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１４を得た(9.0 mg,収率11%)。
　5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr- Ser-Cys-NH2（化合物１５）の合成
　　糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel SRAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol,ラップポリマー社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ[Ａｃ3ＧａｌＮＡｃα（１→Ｏ）]（５８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順 次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０－１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１５を得た(13.0 mg,収率14%)。
　化合物１～１５の同定データを以下にまとめて記載する。
　MUC1由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図１）
　(a)化合物1, m/z calcd for C100H160N30O34S [M + H]+ 2358.151, found 2358.383;　
　(b)化合物2, m/z calcd for C108H173N31O39S [M + H]+ 2561.231, found 2561.457;　
　(c)化合物3, m/z calcd for C114H183N31O44S [M + H]+ 2723.283, found 2723.504;　
　(d)化合物4, m/z calcd for C125H200N32O52S [M + H]+ 3014.379, found 3014.640
　(e)化合物5, m/z calcd for C97H156N29O33 [M + H]+ 2255.142, found 2254.927;
　(f)化合物6, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2457.954;
　(g)化合物7, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2458.077;
　(h)化合物8, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2458.159
　 (i)化合物9, m/z calcd for C137H221N34O58 [M + H]+ 3270.538, found 3270.308
　(j)化合物10, m/z calcd for C111H179N30O43 [M + H]+ 2620.274, found 2620.049;　
　(k)化合物11, m/z calcd for C122H196N31O51 [M + H]+ 2911.369, found 2911.207;　
　MUC2由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図２）
　(l)化合物12, m/z calcd for C90H144N20O31 [M + Na]+ 2024.020, found 2024.111;　
　(m)化合物13, m/z calcd for C122H196N24O51 [M + Na]+ 2836.338, found 2836.501 
　MUC4由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図３）
　(n) 化合物14, m/z calcd for C73H181N20O28S [M + Na]+ 1777.804, found 1777.910;
　(o) 化合物15, m/z calcd for C81H131N21O33S [M + Na]+ 1980.884, found 1981.045;
実施例１
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thrを抗原として 用いたモノクローナル抗体の作製Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-ThrのC末端にキャ リアータンパク質結合に必要なCysを付加した化合物Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr Cys-NH2（８５μｇ）をキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）とコンジュゲートし、マウスBDF-1テールベースに投与し免疫反応を惹起した。17日後に同様の方法で化合物３の追加免疫を行い、3日後に採血して腸骨リンパ節を採集した。採集した細胞はミエローマ細胞SP2と細胞融合後、HAT選択培地で培養し抗体 産生細胞を選択した。次に、得られたハイブリドーマの培養上清をELISAプレート上にまき、化合物２との結合反応でスクリーニングした。
融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体SN-101を産生するハイブリドーマ株3A9-4B1（NPMD受託番号NITE BP-01845）および目的のモノクローナル抗体SN-102を産生するハイブリドーマ株3C10-E11を樹立した。
実験例２　モノクローナル抗体（SN-101及びSN-102）産生細胞株の培養と、抗体の精製取得
　培養法：SN-101を産生するハイブリドーマ株NITE BP-01845を、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-1640培地で増殖させた。回収した8.1×106個の細胞に対し、22 mlの無血清培地Panserin H4000（PAN-Biotech）を加えて懸濁し、培養することにより、この培地への馴化を行った。馴化した細胞を同培地で1.0×108個程度まで増殖させ、5.0×105/mlとなるように継代した。これを2週間静置培養した後に、遠心分離により培養上清を得た。もう一方の抗体SN-102を産生するハイブリドーマ株3C10-E11についても上記方法と同様に培養し、培養上清を得た。
　精製法：培養したハイブリドーマ株NITE BP-01845から、SN-101を以下の方法で精製した。培養上清200 mLを0.45 μmのフィルターでろ過し、抗体精製の材料とした。または培養上清に硫酸アンモニウムを加えて50%飽和とし、10000 g、20分間の遠心分離により沈殿を回収した。これを10 mlのPBSに溶解し、さらに同溶液に対して透析したものを精製材料として、HiTrap Protein G HPカラム（GEヘルスケア）によるアフィニティークロマトグラフィーに供した。AKTA explorer 100（GEヘルスケア）に接続したHiTrap Protein G HPカラムを、20 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化し、試料を添加した。同緩衝液でカラムに結合しない不要な成分を洗浄した後に、結合した抗体を0.1 Mグリシン塩酸緩衝液（pH 2.5）で溶出し、少量の1 Mトリス塩酸緩衝液（pH 9.0）の添加により中和した。また、カラムを通過した画分を繰り返しカラムに添加、溶出することにより、抗体の回収率が向上した。ここまでの作業を通して、SN-101を2.3 mg得ることができた。もう一方の3C10-E11の培養上清200 mLからは、同様の精製法を行った結果、SN-102が8.3 mg得られた。
実施例３　抗体との反応特異性評価
糖ペプチド固定化アレイの作製
　糖鎖固定化アレイ用基板（住友ベークライト社製）を２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、ｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）の脱保護を行った。水で2回洗浄後、乾燥させ、基板表面にアミノオキシ基を作製した。表１に示した各合成糖ペプチドにスポッティング溶液（25mM AcOH/Pyridine, 0.005%Triton X-100, pH 5.4）を加え溶解し、スポッター（BioChip Arrayer,、Cartesian社製)、スポットピン(CMP, ピン径0.4mm、Arraylt社)を用いて基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させ、基板に糖ペプチドを固定化した。水で１回洗浄後、１０ｍｇ/ｍＬの無水コハク酸に浸漬させ、室温で３時間反応し、未反応のアミノオキシ基の保護を行った。水で２回洗浄し、乾燥した。
　培養上清を下記反応溶液で１０倍希釈した。糖ペプチド固定化アレイにハイブリカバー（住友ベークライト社製）を被せ、希釈溶液７０μLを展開し、室温で２時間反応した。ハイブリカバーを外し下記洗浄溶液及び水で一回ずつ基板を洗浄した。基板を乾燥させた後、ハイブリカバーをかぶせ、Anti-IgG(H＋L), Mouse, Goat-Poly, Cy3（ロックランドイムノケミカルズ社製）を下記溶液で１μｇ／ｍＬに調製したものを基板上に展開し、室温で１時間反応した。反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はスキャナ（Typhoon TRIO+、GEヘルスケア)を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。蛍光応答のデジタル画像はArray VisionTMSoftware version 8（GEヘルスケア）を用いて作成した。結果を図４に示す。反応溶液：50mM Tris・HCl (pH 7.4)、100mM NaCl、1mM CaCl2、MnCl2、MgCl2、0.05% Tween 20 洗浄溶液：50mM Tris・HCl (pH 7.4)、100mM NaCl、1mM CaCl2、MnCl2、MgCl2、0.05% Tr iton X-100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　　化合物１～４：配列番号３
　　　化合物５～１１：配列番号１
　　　化合物１２～１３：配列番号４
　　　化合物１４～１５：配列番号５
抗体SN-101及び抗体SN-102の特徴
　抗体SN-101及び抗体SN-102は、それぞれMUC1に由来する糖ペプチドの糖鎖Tn構造及び修飾位置を下記のように特異的に認識し結合した。
SN-101
(i) 配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの8位のスレオニンにTn糖鎖が結合した糖ペプチド
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cysに結合し
(ii)前記MUC1由来の糖ペプチドのTn糖鎖が、T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合せず
(iii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、
(iv)MUC2のタンデムユニットペプチド又はMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しなかった。
SN-102
(i) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの8位のスレオニンにTn糖鎖が結合した糖ペプチドGly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thrに結合し
(ii)前記MUC1由来の糖ペプチドのTn糖鎖が、T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合しないか、結合しても弱い結合であり
(iii)配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、
(iV)配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドの14位のセリン、15位のスレオニンにTn糖鎖が修飾された糖ペプチドには結合せず
(V) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチドのスレオニン、セリンの全てにTn糖鎖が修飾された糖ペプチドには結合し
(iv)MUC2のタンデムユニットペプチド又はMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しなかった。
実施例４　患者血清中のMUC1糖ペプチドの検出
　抗体SN-101を用いて、乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌及び卵巣癌検体血清中に抗原糖ペプチドが検出されるかを検討した。検体数は、臨床的に明らかに該疾患と診断された患者血清5～10例、陰性コントロールとして正常血清数例とした。正常血清では抗原糖ペプチドが検出されなかったが、患者血清では抗原糖ペプチドが検出された。
　実施例５　抗体SN-101及び抗体SN-102によるMUC1 発現細胞の免疫蛍光染色
　乳癌細胞株OCUB-Mを10% FBSを含むD-MEM中で5% CO2下、37℃で一晩培養した。培地を吸引除去し、PBSで細胞層を洗浄後、4%パラホルムアルデヒドを含むPBSで10分間固定した。続いて0.1% Triton XTM-100を含むPBSで浸透処理した後に、ブロッキングバッファー（1% BSA含有PBS）で20分間ブロッキングを行った。次にブロッキングバッファーで希釈した抗体SN-101または抗体SN-102の10 μg/mL溶液を1時間反応させた。陰性コントロールには、一次抗体の代わりにブロッキング液を反応させたものを用意した。抗体溶液を除き、PBSで洗浄した後に、2 μg/mL のAlexa FluorR 555標識抗マウスIgG抗体を反応させた。PBSで洗浄し、封入した後に、オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-9000(KEYENCE)で観察したところ、特異的な染色像が得られた(図５参照)。
実施例６　細胞増殖阻害実験
　DMEM (10% FBS) 培地にて培養した乳癌細胞 OCUB-M を 1 ウェルあたり3x103個となるように９６ウエルプレートに播種した。5％CO2 雰囲気下３７℃で 48 時間培養した後、抗体SN-101を終濃度 0.565 mg/mL、あるいは1.13 mg/mL となるように添加した。5％CO2雰囲気下３７℃で48 時間培養した後、Cell Titer 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) 試薬を1 ウェルあたり、20 μL 添加、5％CO2雰囲気下３７℃で2 時間インキュベートした。490 nm の吸光度を測定した結果、コントロールと比較して濃度依存的に細胞数の減少を認めた（図６参照）。
実施例７　ガレクチン３結合阻害実験
　８ウェル型チェンバースライドに、RPMI-1640（10% FBS）に浮遊させた乳癌細胞MCF-7を4.8x103個ずつ添加し、５％CO2雰囲気下、３７℃で１６時間培養した。培地を吸引除去し、細胞が2 mm浸る程度の4% ホルムアルデヒド in PBSを加えた。細胞を１５分間固定した。固定液を吸引除去し、PBSで各５分間、３回洗浄した。ブロッキングバッファー（5% BSA含有PBS）で１時間ブロッキングをおこなった。ブロッキング液を吸引除去し、当該抗体のみ、様々な濃度のSN-101とガレクチン３とを混合し、４℃で２時間インキュベートした。抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。Cy5ラベル化抗マウスIgG抗体を添加し、暗室、室温で１時間インキュベートした。2次抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000(KEYENCE)で観察したところ、当該抗体濃度依存的にガレクチン３とMUC１との結合阻害が認められた。
　本発明により、ヒトMUC1のタンデムユニットペプチドにO-結合型糖鎖Tnで修飾された糖ペプチドを極めて特異的に認識する抗体が提供される。本発明の抗MUC1抗体を用いることで、Tnで修飾された糖ペプチドエピトープ特異的に、高感度に、信頼性をもって、かつ簡便に MUC1の存在を検出することができ、MUC1に関連する疾患として悪性腫瘍を判定することが可能になるので、医療診断分野において有用と考えられる。更に、本発明の抗MUC1抗体は、MUC1が関わる癌細胞の機能に影響を与えることにより、癌治療など医薬分野において有用であると考えられる。
　配列番号１：ヒトMUC1のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列
　配列番号２：ヒトMUC1のタンデムユニットペプチドの変異体のアミノ酸配列
　配列番号３：ヒトMUC1のタンデムユニットペプチドのC末端にＣｙｓを付加したペプチドのアミノ酸配列
　配列番号４：ヒトMUC2のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列
　配列番号５：ヒトMUC4のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列
配列番号６：ＳＮ－１０１Ｈのアミノ酸配列
配列番号７：ＳＮ－１０１Ｌのアミノ酸配列
配列番号８：ＳＮ－１０１ＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号９：ＳＮ－１０１ＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０：ＳＮ－１０１ＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：ＳＮ－１０１ＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１２：ＳＮ－１０１ＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１３：ＳＮ－１０１ＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１４：ＳＮ－１０２Ｈのアミノ酸配列
配列番号１５：ＳＮ－１０２Ｌのアミノ酸配列
配列番号１６：ＳＮ－１０２ＨのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１７：ＳＮ－１０２ＨのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１８：ＳＮ－１０２ＨのＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１９：ＳＮ－１０２ＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２０：ＳＮ－１０２ＬのＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２１：ＳＮ－１０２ＬのＣＤＲ３のアミノ酸配列

Claims (17)

  1. ヒトMUC１に対するモノクローナル抗体であって、ヒトMUC１タンデムユニット並びに前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列中のスレオニン及びセリンのいずれか１つにO-結合型糖鎖コア０（Tn）を有する糖ペプチドを特異的に認識する、前記抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号１で示されるアミノ酸配列の８位のスレオニンに結合する、請求項１に記載されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  3. 前記ヒトMUC１タンデムユニットのアミノ酸配列は配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、かつ前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）は前記配列番号２で示されるアミノ酸配列の８位のセリンに結合する、請求項１に記載されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  4. 下記i)～iii)に示す結合特性を有する１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
    i)前記O-結合型糖鎖コア０（Tn）が、O-結合型糖鎖T又はSTnに置換された糖ペプチドに結合せず
    ii)配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）に結合せず、かつ
    iii)MUC2のタンデムユニットペプチド又はMUC4のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合しない。
  5. 免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号8のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号9のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号10のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号11のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号12のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号13のアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  6. 免疫グロブリン重鎖可変領域（VH）ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（VL）ドメインを含む少なくとも1つの抗原結合部位を有しており、前記重鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3を含み、CDR1は配列番号16のアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号17のアミノ酸配列からなり、CDR3は配列番号18のアミノ酸配列からなり、前記軽鎖可変領域ドメインは、その配列中に、相補性決定領域CDR1', CDR2', CDR3'を含み、CDR1'は配列番号19のアミノ酸配列からなり、CDR2'は配列番号20のアミノ酸配列からなり、CDR3'は配列番号21のアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  7. 配列番号6のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号7のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  8. 配列番号14のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号15のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  9. 前記抗原結合性断片は、前記相補性決定領域CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 及び CDR3'の少なくとも１つを含むペプチドである、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  10. 前記抗原結合性断片は、Fab、F（ab'）２、Fab'、diabody、一本鎖抗体（例えば、scFv、dsFv）、二価特異的抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
  11. MUC1の特異的検出に用いるための請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  12. ヒト体液サンプル中のMUC１を特異的に検出する方法であって、
    (a)上記サンプルを請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と接触させ、
    (b)接触後のサンプルにおける抗体(又はその抗原結合性断片)－抗原複合体の形成を測定することを含む、前記方法。
  13. 前記体液サンプル中の、MUC１の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いるための請求項１２に記載の方法。
  14. 前記悪性腫瘍が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌からなる群より選択されるものである、請求項１３に記載の方法。
  15. (a)請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、
    (b)抗体(又はその抗原結合性断片)－抗原複合体を測定するための試薬を含む、請求項１２～１４のいずれか1項 に記載の方法に使用するためのキット。
  16. 請求項１～１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防又は／及び治療用の医薬組成物。
  17. 前記悪性腫瘍が乳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵癌、大腸癌、及び卵巣癌からなる群より選択されるものである、請求項１６記載の組成物。
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