RU2814073C2 - КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА, ПЕПТИДНЫЙ ЛИНКЕР И/ИЛИ ЛИГАНД - Google Patents

КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА, ПЕПТИДНЫЙ ЛИНКЕР И/ИЛИ ЛИГАНД Download PDF

Info

Publication number
RU2814073C2
RU2814073C2 RU2020141476A RU2020141476A RU2814073C2 RU 2814073 C2 RU2814073 C2 RU 2814073C2 RU 2020141476 A RU2020141476 A RU 2020141476A RU 2020141476 A RU2020141476 A RU 2020141476A RU 2814073 C2 RU2814073 C2 RU 2814073C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
amino acid
fab
cancer
human muc1
Prior art date
Application number
RU2020141476A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020141476A (ru
Inventor
Тору Асано
Йориката САНО
Акифуми Моринака
Хироки СИРАИ
Кадзунори ХИРАЯМА
Митинори Акаива
Хиройоси Ямада
Нобуюки Сираиси
Original Assignee
Астеллас Фарма Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Астеллас Фарма Инк. filed Critical Астеллас Фарма Инк.
Publication of RU2020141476A publication Critical patent/RU2020141476A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2814073C2 publication Critical patent/RU2814073C2/ru

Links

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает конъюгат, в молекуле которого через линкер или напрямую объединены Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека и по меньшей мере один фрагмент 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA). Также раскрывается хелатный комплекс указанного конъюгата с ионами парамагнитного металла или радиоизотопа металла. Изобретение может быть применимо для диагностики или лечения рака, клетки которого экспрессируют MUC1. 9 н. и 15 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 5 пр.

Description

Область техники
[0001] Настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека и пептидный линкер и/или лиганд. Настоящее изобретение также относится к композиции для диагностики и/или фармацевтической композиции, содержащей конъюгат, и способу диагностики и/или лечения онкологического заболевания с использованием конъюгата.
Уровень техники
[0002] Муцин 1 (MUC1) представляет собой связанный с мембраной гликопротеин, который экспрессируется со стороны полости эпителиальных клеток, составляющих эпителиальные ткани молочной железы, трахеи, желудочно-кишечного тракта и т. д. (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4 (1): 45-60). MUC1 сверхэкспрессируется в опухолевых клетках рака молочной железы (Mod. Pathol., 2005 Oct; 18 (10): 1295-304), рака легкого (Hum. Pathol., 2008 Jan; 39 (1): 126-36), колоректального рака (Int. J. Oncol., 2000 Jan; 16 (1): 55-64), рака мочевого пузыря (PLoS One, 2014 Mar; 9 (3): e92742), рака кожи (Histopathology, 2000 Sep; 37 (3): 218-23), рака щитовидной железы (J. Pathol., 2003 Jul; 200 (3): 357-69), рака желудка (J. Pathol., 2000 Mar; 190 (4): 437-43), рака поджелудочной железы (Int. J. Oncol., 2004 Jan; 24 (1): 107-13), рака почки (Mod. Pathol., 2004 Feb; 17 (2): 180-8), рака яичников (Gynecol. Oncol., 2007 Jun; 105 (3): 695-702) и рака шейки матки (Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul; 122 (1): 61-9), и т. д. MUC1 полезен в качестве молекулы-мишени для детектирования опухолевого поражения (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4 (1): 45-60; и Pathol. Res. Pract., 2010 Aug 15; 206 (8): 585-9).
[0003] MUC1 подвергается O-гликозилированию треонина в положении 9 последовательности тандемных повторов из 20 аминокислот HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO: 15), присутствующей во внеклеточном домене. В опухолевых клетках это O-гликозилирование является неполным, и O-гликозилирование, такое как T(Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr), Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr) и 2,3ST(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr), как известно, происходит опухолеспецифическим образом (PTL 1 и NPL 1). Так как MUC1 в нормальных тканях не подвергается такому опухолеспецифическому O-гликозилированию, человеческий опухолеспецифический MUC1 особенно полезен в качестве молекулы-мишени для лечения различных видов онкологических заболеваний у человека. Например, антитело 1B2 (PTL 1), антитело PankoMab (NPL 2) и антитело 5E5 (PTL 2) известны в качестве антител против такого человеческого опухолеспецифичного MUC1. Сообщается, что среди этих антител антитело 1B2 имеет высокую специфичность в отношении человеческого опухолеспецифического MUC1 по сравнению с антителом PankoMab (PTL 1).
[0004] Также существует большая потребность в визуализации или раннем детектировании опухолевого поражения. Кроме того, также существует потребность в дифференциации между злокачественным и доброкачественным поражением. Исходя из таких потребностей, также полезно визуализировать опухолевое поражение с помощью методов молекулярной визуализации, таких как рентгеновская визуализация (ПЭТ и ОФЭКТ), с использованием антитела, специфически связывающегося с человеческим опухолеспецифичным MUC1, в качестве диагностического препарата in vivo. Кроме того, внимание также привлекли лекарственные средства на основе антител, содержащие антитело, конъюгированное с лекарственным средством для лечения онкологического заболевания.
[0005] Между тем, в целом, антитела имеют длительный период полужизни в крови и им необходим периода до 4-5 дней для достижения соотношения опухоль/кровь, которое обеспечивает соотношение сигнал/фон, достаточное для визуализации опухоли после введения в организм (Clin. Pharmacol. Ther., 2010 May; 87 (5): 586-92). Кроме того, Fc-области антител вызывают фармакологический эффект, такой как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) (NPL 1; и Curr. Opin. Biotechnol., 2002 Dec; 13 (6): 609-14). Более того, антитела накапливаются в печени независимо от мишени, и опухолевые клетки, такие как клетки рака молочной железы, могут метастазировать в печень. Накопление в печени препятствует детектированию метастазов в печени во время диагностики очагов системного рака из-за отдаленных метастазов (Clin. Pharmacol. Ther., 2010 May; 87 (5): 586-92).
[0006] Напротив, ожидается, что низкомолекулярные фрагменты антител, такие как Fab, scFv, диатело и минитело, будут использоваться в качестве терапевтических антител из-за легкости доступа к очагам в связи с их высоким проникновением в ткани и низкой стоимостью производства с использованием системы экспрессии в E. coli. или дрожжах. Кроме того, в целом, фрагменты антител, такие как Fab, подходят для использования в качестве диагностических лекарств из-за их короткого периода полужизни в крови и характеристик почечной экскреции (Nat. Biotechnol., 2005 Sep; 23 (9): 1126-36).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА
[0007] PTL 1: WO2010/050528
PTL 2: WO2008/040362
НЕ ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА
[0008] NPL 1: Glycoconj. J., 2013 Apr; 30 (3): 227-36
NPL 2: Cancer ImmunolImmunother, 2006 Nov; 55 (11): 1337-47
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
[0009] Одновалентные Fab-фрагменты имеют молекулярную массу приблизительно 50 кДа, что меньше, чем у антител, имеющих молекулярную массу приблизительно 150 кДа, выводятся почками, а также имеют короткий период полужизни в крови. Следовательно, они достигают отношения опухоль/кровь, которое обеспечивает отношение сигнал/фон, достаточное для визуализации опухоли, в пределах от 2 до 32 часов после введения. У них отсутствует Fc-область, и поэтому они не вызывают ни ADCC, ни CDC. Фрагменты Fab обычно удаляются с помощью почечной экскреции и, следовательно, не мешают обнаружению метастазов в печени. Исходя из этих особенностей, можно ожидать, что Fab-фрагменты будут более эффективными в качестве диагностических препаратов in vivo по сравнению с антителами.
[0010] Однако активность связывания Fab-фрагментов часто ослабляется из-за того, что они одновалентны, а не двухвалентны. Антитела должны быть помечены детектируемым веществом, таким как флуоресцентный краситель или контрастное вещество, для их использования в качестве диагностических препаратов in vivo или лекарственных препаратов для использования в методах фотоиммунотерапии. Еще одна проблема заключается в ослаблении их активности связывания из-за мечения таким веществом.
[0011] Целью настоящего изобретения является предоставление конъюгата, содержащего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, пептидного линкера и лиганда, и конъюгата, содержащего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека и лиганда, причем конъюгаты обладают превосходной активностью связывания в отношении человеческого опухолеспецифического MUC1, эквивалентной активности связывания Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека. Другой целью настоящего изобретения является создание композиции для диагностики, содержащей конъюгат, и способа диагностики с ее использованием, а также фармацевтической композиции, содержащей конъюгат, и способа лечения с ее использованием.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
[0012] Авторы настоящего изобретения получили Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий благоприятную аффинность в отношении опухолеспецифического MUC1 человека, и провели тщательные исследования, а затем получили конъюгат путем связывания Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека с лигандом через пептидный линкер (или без его опосредования). Конъюгат обладает аффинностью к опухолеспецифическому MUC1 человека, эквивалентной аффинности самого Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека. В частности, настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, пептидному линкеру и лиганду, и конъюгату, содержащему Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека и конкретному лиганду. Кроме того, было подтверждено, что конъюгат свободен от ослабления активности связывания против опухолеспецифического MUC1 человека даже за счет связывания метящей части, и сохраняет благоприятную активность связывания против опухолеспецифичного MUC1 человека. На основе этих результатов предложен подход к диагностике и подход к лечению с использованием конъюгата по настоящему изобретению.
[0013] Конкретно, в одном аспекте настоящее изобретение может быть следующим:
[1]. Конъюгат, представленный следующей формулой (I):
(Y-S1-X)p-Fab (I)
где
Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12;
X представляет собой пептидный линкер или связь;
S1 представляет собой спейсер или связь;
Y представляет собой лиганд; и
p представляет собой натуральное число от 1 до 25;
при условии, что когда X представляет собой связь, S1 представляет собой -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или связь, а Y представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA).
[2]. Конъюгат по п. [1], отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[3]. Конъюгат по п. [1], отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
[4]. Конъюгат по п. [2], отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[5]. Конъюгат по п. [4], отличающийся тем, что Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[6]. Конъюгат по п. [4], отличающийся тем, что Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[7]. Конъюгат по любому из пп.[1]-[6], отличающийся тем, что X представляет собой пептидный линкер, содержащий пептид из 2-4 аминокислот и имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую мембранным ферментом почечной щеточной каймы или лизосомным ферментом.
[8]. Конъюгат по п. [7], отличающийся тем, что S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)-, или связь, и
X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из следующих (1)-(9):
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2)-Gly-Lys-Z2-,
(3)-Gly-Phe-Lys-Z2-,
(4)-Met-Val-Lys-Z2-,
(5)-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6)-Gly-Lys-Lys-Z2-,
(7)-Gly-Arg-Lys-Z2-,
(8)-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- и
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
где Met представляет собой метионин, Ile представляет собой изолейцин, Gly представляет собой глицин, Lys представляет собой лизин, Phe представляет собой фенилаланин, Val представляет собой валин, Tyr представляет собой тирозин, Arg представляет собой аргинин, Z1 представляет собой группу, представленную следующей формулой (II), -Lys-Z2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (III), -Tyr-CH2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (IV), и -Lys-C(=S)- представляет собой группу, представленную следующей формулой (V):
[Химическая Формула 1]
[9]. Конъюгат по любому из пп. [1]-[8], отличающийся тем, что Y представляет собой дефероксамин (DFO) или 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA).
[10]. Конъюгат по любому из пп. [1]-[9], отличающийся тем, что Y представляет собой DFO.
[11]. Конъюгат по любому из пп. [1]-[9], отличающийся тем, что Y представляет собой DOTA.
[12]. Конъюгат по любому из пп. [1]-[6], отличающийся тем, что
Y представляет собой DOTA,
S1 представляет собой -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или связь, и
X представляет собой связь.
[13]. Конъюгат по п. [10], отличающийся тем, что (Y-S1-X)p-Fab выбран из группы, состоящей из
[Химическая Формула 2]
и атом азота аминогруппы, содержащейся в Fab, связан с атомом углерода концевой C(=NH) группы X.
[14]. Конъюгат по п. [11], отличающийся тем, что (Y-S1-X)p-Fab выбран из группы, состоящей из
[Химическая Формула 3]
и атом азота аминогруппы, содержащейся в Fab, связан с атомом углерода концевой C(=NH) группы X.
[15]. Конъюгат по п. [12], отличающийся тем, что (Y-S1-X)p-Fab выбран из группы, состоящей из
[Химическая Формула 4]
и атом азота аминогруппы, содержащейся в Fab, связан с атомом углерода концевой группы C(=O) или группы C(=S).
[16]. Конъюгат по любому из пп. [13]-[15], отличающийся тем, что p представляет собой натуральное число от 1 до 4.
[17]. Конъюгат по любому из пп.[1]-[16], дополнительно содержащий металл.
[18]. Конъюгат по п. [17], отличающийся тем, что металл представляет собой радиоизотоп металла.
[19]. Конъюгат по п. [18], отличающийся тем, что металл представляет собой 89Zr.
[20]. Конъюгат по п. [18] или [19], который представляет собой ПЭТ-индикатор.
[21]. Композиция для диагностики, содержащая один или более конъюгатов по любому из пп. [17]-[20] и фармацевтически приемлемый носитель.
[22]. Композиция для диагностики по п. [21], которая представляет собой лекарственное средство для ранней диагностики или лекарственное средство для стадии.
[23]. Композиция для диагностики по п. [21] или [22], которую используют для диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1.
[24]. Композиция для диагностики по п. [23], отличающаяся тем, что онкологическое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников или рак шейки матки.
[25]. Фармацевтическая композиция, содержащая один или более конъюгатов по любому из пп. [17]-[20] и фармацевтически приемлемый носитель.
[26]. Фармацевтическая композиция по п. [25], которая представляет собой фармацевтическую композицию для лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1.
[27]. Фармацевтическая композиция по п. [26], отличающаяся тем, что онкологическое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников или рак шейки матки.
[28]. Применение конъюгата по любому из пп. [17]-[20] для получения композиции для диагностики онкологического заболевания и/или фармацевтической композиции для лечения онкологического заболевания.
[29]. Конъюгат по любому из пп. [17]-[20] для применения при диагностике онкологического заболевания и/или лечении онкологического заболевания.
[30]. Способ диагностики онкологического заболевания, включающий введение пациенту диагностически эффективного количества конъюгата по любому из пп. [17]-[20].
[31]. Способ лечения онкологического заболевания, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата по любому из пп. [17]-[20].
[32]. Применение конъюгата по любому из пп. [17]-[20] для диагностики онкологического заболевания и/или лечения онкологического заболевания.
ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0014] Конъюгат, содержащий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, пептидный линкер и лиганд, и конъюгат, содержащий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека и конкретный лиганд в соответствии с настоящим изобретением, обладают превосходной активностью связывания против опухолеспецифического MUC1 человека. Следовательно, ожидается, что конъюгат по настоящему изобретению, дополнительно содержащий металл, будет полезен для диагностики и/или лечения онкологического заболевания.
Краткое описание чертежей
[0015] Фиг. 1 представляет собой график и таблицу, показывающие активность связывания P10-1 Fab, P10-2 Fab и 1B2 Fab из сравнительного примера против опухолевпецифичного MUC1 человека.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0016] Далее настоящее изобретение будет описано подробно. Однако настоящее изобретение этим не ограничивается. Научные термины и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники, если здесь не указано иное.
[0017] 1. Конъюгат по настоящему изобретению
Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой (I):
(Y-S1-X)p-Fab (I),
где
Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека;
X представляет собой пептидный линкер или связь;
S1 представляет собой спейсер или связь;
Y представляет собой лиганд; и
p представляет собой натуральное число от 1 до 25;
при условии, что когда X представляет собой связь, S1 представляет собой -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или связь, а Y представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4, 7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA).
[0018] 1-1. Fab-фрагмент (Fab) антитела против MUC1 человека
Будет описан Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представленный «Fab» в формуле (I).
[0019] Основная структура молекулы антитела является общей для всех классов и состоит из тяжелых цепей с молекулярной массой от 50000 до 70000 и легких цепей с молекулярной массой от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот, имеет структуру, характерную для каждого класса, и называются γ, μ, α, δ, и ε цепями, соответствующими IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. IgG дополнительно имеет IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые называются γ1, γ2, γ3, и γ4, соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, состоящей приблизительно из 220 аминокислот и известных как два типа, L и K типы, которые называются λ и κ цепями, соответственно. Что касается пептидной конфигурации базовой структуры молекулы антитела, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны через дисульфидные связи (связи S-S) и нековалентные связи с образованием молекулярной массы от 150000 до 190000. Две легкие цепи могут соединяться с любой из тяжелых цепей. Индивидуальная молекула антитела постоянно состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.
[0020] Четыре (или пять для цепей μ и ε) и две внутрицепочечные S-S связи присутствуют в тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, и каждая составляет одну петлю на 100-110 аминокислотных остатков. Эта конформация похожа на петли и называется структурной единицей или доменом. Как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи домен, расположенный на N-конце, не имеет постоянной аминокислотной последовательности даже среди препаратов из одних и тех же классов (подклассов) животных одного вида, и поэтому называется вариабельной областью. Соответствующие домены называются вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL). Аминокислотная последовательность на С-концевой стороне от нее является почти постоянной на уровне класса или подкласса и называется константной областью. Соответствующие домены представлены CH1, CH2, CH3 и CL.
[0021] Специфичность связывания антитела с антигеном зависит от аминокислотной последовательности фрагмента, состоящего из VH и VL. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с белками системы комплемента или различными клетками, отражает разницу в структуре между константными областями Ig соответствующих классов. Известно, что вариабельность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи существенно ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях. Эти области называются областями, определяющими комплементарность (CDR; CDR1, CDR2 и CDR3 по порядку со стороны N-конца). Остальные фрагменты вариабельной области называются каркасными областями (FR) и являются относительно постоянными.
[0022] Область между доменом CH1 и доменом CH2 константной области тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Эта область богата пролиновыми остатками и содержит множество межцепочечных S-S связей, которые соединяют две тяжелые цепи. Например, шарнирные области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 содержат 2, 4, 11 и 2 остатка цистеина, соответственно, которые образуют S-S-связи между тяжелыми цепями. Шарнирная область является областью, очень чувствительной к протеолитическому ферменту, такому как папаин или пепсин. В случае расщепления антитела папаином тяжелые цепи отщепляются в положении на N-концевой стороне от S-S связей между тяжелыми цепями шарнирной области и, таким образом, разлагаются на два Fab-фрагмента и один фрагмент Fc. Фрагмент Fab состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащих вариабельную область тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Fab-фрагмент содержит вариабельные области и обладает антигенсвязывающей активностью.
[0023] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент, имеющий следующую особенность:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12.
[0024] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
[0025] Любая константная область Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 и т. д. может быть выбрана в качестве константной области тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащаяся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой константную область человеческого Igγ1.
[0026] Любая константная область Ig λ или Ig κ может быть выбрана в качестве константной области легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащаяся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой константную область человеческого Ig κ.
[0027] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой следующий Fab-фрагмент:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0028] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0029] В случае экспрессии антитела, включающего Fab-фрагмент, в клетках, антитело, как известно, подвергается посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционной модификации включают в себя расщепление С-концевого лизина тяжелой цепи карбоксипептидазой, модификацию N-концевого глутамина или глутаминовой кислоты тяжелой цепи и легкой цепи до пироглутаминовой кислоты путем пироглутамилирования, гликозилирования, окисления, дезамидирования и гликирования. Известно, что такая посттрансляционная модификация встречается в различных антителах (Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008 Jul; 97 (7): 2426-2447).
[0030] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, также может включать Fab-фрагмент, полученный в результате посттрансляционной модификации. Примеры Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека по настоящему изобретению, полученного в результате посттрансляционной модификации, включают Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий на N-конце пироглутамилированную тяжелую цепь. В данной области известно, что такая посттрансляционная модификация N-концевым пироглутамилированием не влияет на активность антитела (Anal. Biochem., 2006 Jan 1; 348(1): 24-39).
[0031] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
[0032] В определенном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
[0033] В альтернативном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0034] В определенном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:
Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую форму. кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0035] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, связывается с опухолеспецифичным MUC1 человека. Опухолеспецифичный MUC1 экспрессируется при онкологическом заболевании, таком как рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников или рак шейки матки. Способ измерения активности связывания полученного Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека против опухолеспецифичного MUC1 человека включает такие методы, как ИФА и FACS. В случае использования, например, ИФА, клетки, положительные по опухолеспецифичному MUC1 человека (например, клетки T-47D), иммобилизуют на планшете для ИФА, в который затем добавляют Fab-фрагмент и происходит реакция, а затем анти-Igκ-антитело или подобное, меченное пероксидазой хрена или тому подобное, вступает в реакцию. Затем связывание вторичного антитела идентифицируют путем измерения активности с использованием реагента для определения его активности (например, хемилюминесцентный субстрат пероксидазы хрена для метки пероксидазы хрена) или тому подобное.
[0036] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, может быть легко получен специалистами в данной области с использованием метода, известного в данной области, на основе информации о последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, раскрытого в настоящем документе. Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, может быть получен в соответствии с методом, описанным, например, в разделе <Способ получения Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению>, упомянутом позже.
[0037] 1-2. Лиганд (Y)
Будет описан лиганд, представленный как «Y» в формуле (I).
«Лиганд» представляет собой группу, способную образовывать хелатный комплекс с металлом в конъюгате по настоящему изобретению, и означает группу, состоящую из хелатирующего агента. Образованная группа представляет собой группу, имеющую связь путем удаления протона из хелатирующего агента. Группа, образованная хелатирующим агентом, связана с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека напрямую или через спейсер и/или пептидный линкер.
[0038] «Хелатирующий агент» относится к соединению, которое может образовывать координационную связь с металлом. В настоящем описании примеры «хелатирующего агента» включают сидерофор и не сидерофор. Примеры сидерофоров включают тип гидроксамовой кислоты, тип катехола и тип смешанного лиганда. Примеры сидерофоров типа гидроксамовой кислоты включают феррихром, дефероксамин (DFO), представленный следующей формулой:
[Химическая Формула 5]
фузарин C, орнибактин и родоторуловая кислота. Примеры сидерофоров катехолового типа включают энтеробактин, бациллибактин и вибриобактин. Примеры сидерофоров лиганда смешанного типа включают азотобактин, пиовердин и иерсиниабактин. В случае сидерофоров DFO может реагировать через его реактивную функциональную группу -NH2 со спейсером или пептидным линкером, и сидерофор, отличный от DFO, также может реагировать через его реакционноспособную функциональную группу, такую как карбоксильная группа, гидроксильная группа или аминогруппу со спейсером или пептидным линкером способом, обычно используемым специалистами в данной области.
[0039] Примеры не сидерофоров включают DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота, CAS No: 60239-18-1), представленную следующей формулой:
[Химическая Формула 6]
DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота, CAS No: 67-43-6), DTPA-BMA(1,7-бис(метилкарбамоилметил)-1,4,7-триазагептан-1,4,7- триуксусная кислота, CAS No: 119895- 95-3), EOB-DTPA (N-[(2S)-2-[бис(карбоксиметил)амино]-3-(4-этоксифенил)пропил]-N-[2- [бис(карбоксиметил)амино]этил]глицин, CAS No: 158599-72-5), TTHA (триэтилентетрамингексауксусная кислота, CAS No: 869-52-3), DO3A (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS NO: 217973-03-0), HP-DO3A (10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7- триуксусная кислота, CAS No: 120041-08-9) и их известные реакционноспособные производные.
[0040] Примеры определенного варианта осуществления «хелатирующего агента», составляющего лиганд, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, включают DFO, DOTA, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A и HP-DO3A. Определенным вариантом осуществления является DFO или DOTA.
[0041] Соединения и конъюгаты, описанные в настоящем документе, также охватывают свободные формы и их соли, если не указано иное. В этом контексте «его соль» представляет собой соль, которая может быть образована соединением или конъюгатом, который может образовывать соль присоединения кислоты или соль с основанием, в зависимости от типа заместителя в соединении или конъюгате. Конкретные их примеры включают соли присоединения кислоты с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромоводородная кислота, йодоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота, или органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота, лимонная кислота, метансульфокислота, этансульфокислота, бензолсульфокислота, п-толуолсульфокислота, азотнокислота и глутаминовая кислота; соли с неорганическими основаниями, такие как соли натрия, калия, магния, кальция и алюминия, или с органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин и орнитин; соли с различными аминокислотами и производными аминокислот, такими как ацетиллейцин; и соли аммония. Например, DFO существует в виде дефероксаминметансульфоната или в виде других солей. DTPA существует как в свободной форме, так и в виде натриевой соли.
[0042] Конъюгат по настоящему изобретению, содержащий металл, можно использовать в различных контрастных средах и/или противоопухолевых терапевтических средствах и используется, например, в лекарственном средстве для использования в контрастной среде для МРТ и индикаторе ПЭТ.
[0043] Определенным вариантом осуществления «хелатирующего агента» для использования в контрастной среде для МРТ является сидерофор или хелатирующий агент, не являющийся сидерофором, описанный выше.
[0044] Определенным вариантом осуществления «хелатирующего агента» для использования в ПЭТ-трассере является сидерофор или хелатирующий агент, не являющийся сидерофором, описанный выше. Определенным вариантом является DFO или DOTA.
[0045] В конъюгате по настоящему изобретению хелатирующий агент может содержать металл. В настоящем описании «металл» означает ион парамагнитного металла или радиоизотоп металла. Металл особо ничем не ограничивается, при условии, что металл образует координационную связь с каждым хелатирующим агентом. Подходящая комбинация хелатирующего агента и металла выбирается в соответствии с целью использования конъюгата.
[0046] Ион парамагнитного металла подходящим образом используется в контрастной среде МРТ. Примеры вариантов осуществления ионов парамагнитного металла включают, но не ограничиваются ими, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+, Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+, и Mn2+. Определенный вариант осуществления представляет собой Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+, или Fe3+. Определенным вариантом осуществления является Mn3+ или Mn2+. В этом случае галоген или тому подобное можно использовать в качестве противоаниона в конъюгате. Альтернативно, противоанион может представлять собой C(=O)O- лиганда. Конъюгат может дополнительно иметь противокатион, такой как Na+.
[0047] Металлический радиоизотоп используется, например, в ПЭТ-индикаторе. Примеры определенного варианта осуществления радиоизотопа металла включают, но не ограничиваются ими, 89Zr, 51Mn, 52Fe, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In, и 177Lu. Определенным вариантом осуществления металлического радиоизотопа для использования в индикаторе ПЭТ является 89Zr, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, или 111In. Определенным вариантом осуществления является радиоизотоп циркония. Определенным вариантом осуществления является 89Zr. Определенным вариантом осуществления радиоизотопа металла для использования при лечении онкологического заболевания является 90Y или 177Lu.
[0048] Определенный вариант осуществления конъюгата по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DFO, имеющий координационную связь с 89Zr. Альтернативный вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, имеющий координационную связь с радиоизотопом металла, состоящим из 89Zr, 90Y, 67Ga, 68Ga и 177Lu. Альтернативный вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, имеющий координационную связь с ионом парамагнитного металла, состоящим из 89Zr, Gd3+ и Y3+. Альтернативный вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, имеющий координационную связь с ионом парамагнитного металла, состоящим из Gd3+ и Y3+.
[0049] 1-3. Пептидный линкер или связь (X)
В конъюгате по настоящему изобретению лиганд (Y) или спейсер (S1) и Fab могут быть связаны напрямую или могут быть связаны через пептидный линкер (X). Далее будет описан пептидный линкер, обозначенный «X» в формуле (I).
[0050] В настоящей спецификации «пептидный линкер» представляет собой линкер, содержащий пептид из 2-4 аминокислот и, при желании, может иметь спейсер Z1 или Z2, подходящий для связывания с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека. В этом контексте пептид, содержащийся в пептидном линкере, особо не ограничивается и предпочтительно представляет собой пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, каждая из которых выбрана из группы, состоящей из глицина (Gly), лизина (Lys), метионина (Met), изолейцина (Ile), фенилаланина (Phe), валина (Val), тирозина (Tyr), аргинина (Arg), аланина (Ala), глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp) , гистидина (His) и лейцина (Leu), более предпочтительно пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, каждая из которых выбрана из группы, состоящей из глицина, лизина, метионина, изолейцина, фенилаланина, валина, тирозина и аргинина. Конформация каждого аминокислотного остатка, отличного от глицина, является L-формой, если не указано иное.
[0051] Определенный вариант осуществления пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, содержащий 2-4-аминокислотный пептид и имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом почечной щеточной мембраны или лизосомным ферментом, и необязательно имеющий спейсер. Поскольку пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом почечной щеточной мембраны или лизосомным ферментом, специфически расщепляется этими ферментами, присутствующими в почках, сообщалось, что накопление метящей части в почках снижается. Например, Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep; 60 (12): 1319-28, Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec; 16 (6): 1610-6, и Cancer Res. 1999 Jan 1; 59 (1): 128-34 утверждают, что линкер глицин-лизин специфически расщепляется ферментом почечной щеточной мембраны, присутствующим в почках. В патенте Японии № 6164556 указано, что линкер глицин-фенилаланин-лизин специфически расщепляется ферментом почечной щеточной мембраны, присутствующим в почках. Кроме того, Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct; 13 (5): 985-95 утверждает, что линкер, содержащий последовательность глицин-лейцин-глицин-лизин, специфически расщепляется ферментом почечной щеточной мембраны, и Bioconjug Chem. 2013 Feb 20; 24 (2): 291-9 утверждает, что глицин-тирозиновый линкер специфически расщепляется этим ферментом. Также Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25 (11): 2038-45 утверждают, что линкер, содержащий последовательность метионин-изолейцин, специфически расщепляется лизосомным ферментом, присутствующим в почках. Определенный вариант осуществления пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Met-Ile, Gly-Lys, Gly-Phe-Lys, Met-Val-Lys, Gly-Tyr, Gly-Lys-Lys и Gly-Arg-Lys. Определенный вариант осуществления представляет собой пептидный линкер, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Gly-Lys и Met-Ile.
[0052] «Пептидный линкер» может произвольно содержать спейсер, подходящий для связывания с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека. В этом контексте спейсер, подходящий для связывания с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, представляет собой группу, которая образует химическую органическую связь между пептидным линкерным фрагментом и атомом азота аминогруппы или производной от дисульфидной связи тиольной группы антитела. Fab-фрагмент человеческого антитела MUC1. Определенный вариант осуществления представляет собой группу, которая на конце содержит группу производного малеимида (например, группу, представленную формулой (II), приведенной ниже) или группу производного изотиоцианата (-NH-C(=S)-). Определенный вариант осуществления представляет собой -NH-(CH2)2-Z1-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или -NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-. В этом контексте Z1 представлен формулой (II), приведенной ниже.
[0053] Спейсер связан с аминогруппой или карбоксильной группой концевой аминокислоты пептида, или с аминогруппой (например, в лизине), или с гидроксигруппой (например, в тирозине) в боковой цепи аминокислоты с образованием пептидного линкера. Примеры пептидного линкера, образованного посредством связывания спейсера с функциональной группой в боковой цепи концевой аминокислоты пептида, включают группу, представленную следующей формулой (III) в виде спейсера, интегрированного с Lys, который называется как -Lys-Z2- в настоящей спецификации.
[Химическая Формула 7]
[0054] В настоящем описании аналогичные группы, представленные следующей формулой (IV) и формулой (V), имеющие структуру, в которой спейсер связан с функциональной группой в боковой цепи концевой аминокислоты, обозначаются как -Tyr-CH2- и -Lys-C(=S)- , соответственно.
[Химическая Формула 8]
[0055] Определенным вариантом осуществления пептидного линкера, содержащего спейсер, является (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-, (2)-Gly-Lys-Z2-, (3)-Gly-Phe-Lys-Z2-, (4)-Met-Val-Lys-Z2-, (5)-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, (6)-Gly-Lys-Lys-Z2-, (7)-Gly-Arg-Lys-Z2-, (8)-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-. Определенным вариантом осуществления является (1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1- или (2)-Gly-Lys-Z2-. Определенный вариант осуществления представляет собой (8)-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или (9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.
[0056] 1-4. Спейсер или связь (S1)
В конъюгате по настоящему изобретению лиганд (Y) и пептидный линкер (X) или Fab могут быть связаны напрямую или могут быть связаны через спейсер.
[0057] В настоящем описании «спейсер», представленный S1, представляет собой группу, которая вводится для создания расстояния между лигандом и пептидным линкером или Fab или для связывания лиганда с пептидным линкером или Fab. Примеры определенного варианта осуществления включают -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4- фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)- и -C(=O)-(CH2)2-C(=O)-. Определенным вариантом осуществления S1 является -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -C(=O)-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)-, или связь. Определенный вариант осуществления S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)- или связь. Определенным вариантом осуществления S1 является связь. В конъюгате по настоящему изобретению, в котором Y представляет собой DOTA, DOTA и Fab-фрагмент (Fab) антитела против MUC1 человека может быть связан напрямую или через спейсер (-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-). Однако когда DOTA и Fab-фрагмент (Fab) антитела против MUC1 человека связываются через спейсер -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, конъюгат представлен следующей формулой (VI):
[Химическая Формула 9]
[0058] При производстве конъюгата по настоящему изобретению связывание между Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека и лигандом, спейсером и/или пептидным линкером, а также связывание между лигандом и спейсером и/или пептидным линкером могут быть надлежащим образом выполнены с помощью известного подхода специалистами в данной области.
[0059] В настоящем описании «метящая часть» представляет собой (i) лиганд и пептидный линкер (Y-S1-X, где S1 представляет собой связь, а X представляет собой пептидный линкер), (ii) лиганд (Y-S1- X, где каждый из S1 и X представляет собой связь), или (iii) лиганд, спейсер и пептидный линкер (Y-S1-X, где S1 представляет собой спейсер, а X представляет собой пептидный линкер). Определенный вариант осуществления представляет собой (i) лиганд и пептидный линкер или (ii) лиганд. Лиганд «метящей части» может дополнительно содержать металл. Определенный вариант осуществления представляет собой (i) лиганд и пептидный линкер или (ii) лиганд, содержащий металл, и, другими словами, представляет собой (i) лиганд, который образовал хелатный комплекс с металлом, и пептидный линкер, или (ii) лиганд, который образовал хелатный комплекс с металлом.
[0060] 1-5. Количество (p) связанной метящей части (Y-S1-X) с Fab-фрагментом (Fab) антитела против MUC1 человека
Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором одна или более метящих частей (Y-S1-X) связаны через атом азота одной или более аминогрупп или одной или более тиольных групп, полученных из дисульфидной связи, в Fab-фрагменте антитела против MUC1 человека (Fab). Конъюгат по настоящему изобретению может быть смесью конъюгатов, различающихся друг от друга количеством связанной метящей части. В формуле (I) Fab представляет собой любой Fab, связанный с 1-25 метящими частями (Y-S1-X), или их смесь. Определенный вариант осуществления конъюгата по настоящему изобретению содержит от 1 до 25 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант осуществления включает от 1 до 23 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант включает от 1 до 15 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант осуществления включает от 1 до 11 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант включает от 1 до 9 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант осуществления включает от 1 до 7 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант осуществления включает от 1 до 5 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. Определенный вариант осуществления включает от 1 до 4 метящих частей (Y-S1-X) на Fab. В частности, определенный вариант осуществления «p», который представляет количество связанной метящей части (Y-S1-X) на Fab, является натуральным числом от 1 до 25. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 23. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 15. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 11. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 9. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 7. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 5. Определенный вариант осуществления представляет собой натуральное число от 1 до 4.
[0061] 2. Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению
В определенном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, кодируется полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.
[0062] В определенном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.
[0063] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.
[0064] В одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.
[0065] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.
[0066] В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
[0067] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11.
[0068] В одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0069] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5.
[0070] Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, может быть синтезирован с использованием известного в данной области метода синтеза генов на основе нуклеотидных последовательностей, созданных из аминокислотных последовательностей фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека. Различные способы, известные специалистам в данной области, такие как способы синтеза гена антитела, описанные в международной публикации №. WO 90/07861, можно использовать в качестве таких способов синтеза генов.
[0071] 3. Экспрессирующий вектор для полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению
Экспрессирующий вектор полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению, включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.
[0072] Предпочтительные примеры экспрессирующего вектора включают экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0073] Такой экспрессирующий вектор особо ничем не ограничивается при условии, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению, может продуцироваться в различных клетках-хозяевах прокариотических клеток и/или эукариотических клеток. Примеры такого экспрессирующего вектора включают плазмидные векторы и вирусные векторы (например, аденовирусный и ретровирусный). Предпочтительно можно использовать pEE6.4 или pEE12.4 (LonzaLtd.).
[0074] Такой экспрессирующий вектор может содержать промотор, функционально связанный с геном, кодирующим фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь в полинуклеотиде, кодирующем Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в конъюгате по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии Fab-фрагмента в клетке-хозяине включают промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор PLλ, промотор lpp и промотор tac, когда клеткой-хозяином является бактерия рода Escherichia. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH. Примеры промотора для экспрессии в бактериях рода Bacillus включают промотор SL01, промотор SP02 и промотор penP. Их примеры включают промоторы, полученные из вирусов, таких как CMV, RSV и SV40, ретровирусный промотор, актиновый промотор, промотор EF (фактор элонгации) 1α и промотор белка теплового шока, когда хозяин представляет собой эукариотическую клетку, такую как клетка млекопитающего.
[0075] В случае использования бактерии, в частности, E.coli, в качестве клетки-хозяина, этот экспрессирующий вектор может дополнительно содержать старт-кодон, стоп-кодон, терминаторную область и реплицируемую единицу. С другой стороны, в случае использования дрожжей, животной клетки или клетки насекомого в качестве хозяина экспрессирующий вектор может содержать старт-кодон и стоп-кодон. В этом случае в нем могут содержаться последовательность энхансера, 5'- и 3'-нетранслируемые области гена, кодирующего фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь по настоящему изобретению, сигнальную последовательность секреции, соединение сплайсинга, сайт полиаденилирования или реплицируемую единицу и т. д. Кроме того, обычно используемый селективный маркер (например, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину, ген дигидрофолатредуктазы) может содержаться в нем в соответствии с назначением.
[0076] 4. Клетка-хозяин, подлежащая трансформации экспрессирующим вектором
Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, включает клетку-хозяин, выбранную из группы, состоящей из следующих (а)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека;
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела против MUC1 человека Fab-фрагмент; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.
[0077] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, представляет собой клетку-хозяин, трансформированную экспрессирующим вектором, выбранную из группы, состоящей из следующих (а)-(d):
(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6;
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0078] Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, особо ничем не ограничивается при условии, что она совместима с используемым экспрессирующим вектором и может быть трансформирована экспрессирующим вектором для экспрессии Fab-фрагмента. Их примеры включают различные клетки, такие как естественные клетки и искусственно созданные клетки, обычно используемые в области техники настоящего изобретения (например, бактерии (бактерии рода Escherichia и бактерии рода Bacillus), дрожжи (род Saccharomyces, род Pichia и т. д.), клетки животных и клетки насекомых (например, Sf9)) и линии клеток млекопитающих (например, культивируемые клетки, такие как клетки CHO-K1SV, клетки CHO-DG44 и клетки 293). Сама трансформация может быть выполнена известным способом, например, кальцийфлсфатным методом или методом электропорации.
[0079] 5. Способ получения Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению
Получение Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.
[0080] В одном варианте трансформированная клетка-хозяин, которую нужно культивировать для получения Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих (а)-(с):
(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению.
[0081] Определенная форма трансформированной клетки-хозяина, которая должна быть культивирована для получения Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих (а)-(с):
(а) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
[0082] Предпочтительно используемая трансформированная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяин, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, или клетку-хозяин, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению.
[0083] При получении Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, трансформированную клетку-хозяин можно культивировать в питательной среде. Питательная среда предпочтительно содержит источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимый для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу. Примеры неорганического источника азота или органического источника азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, кукурузный отвар, пептон, казеин, мясные экстракты, соевую муку и картофельные экстракты. Также при желании в них могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин и канамицин)).
[0084] Само культивирование трансформированной клетки-хозяина проводят известным способом. Условия культивирования, например, температура, pH среды и время культивирования, выбираются соответствующим образом. Когда хозяином является, например, клетка животного, то в качестве среды можно использовать среду MEM (Science; 1952; 122: 501), среду DMEM (Virology; 1959; 8: 396-97), среду RPMI1640 (J.Am.Med.Assoc.; 1967; 199: 519-24), среду 199 (Proc.Soc.Exp.Biol.Med.; 1950; 73: 1-8) или т. п., содержащую примерно от 5 до 20% фетальной телячьей сыворотки. РН среды предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 30 до 40 °С в течение приблизительно от 15 до 336 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является клетка насекомого, примеры среды включают среду Грейса (PNAS; 1985; 82: 8404-8), содержащую фетальную бычью сыворотку. Ее рН предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 40 °С в течение от 15 до 100 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяином является бактерия, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, то подходит, например, жидкая среда, содержащая источник питательных веществ, описанный выше. Предпочтительна среда с pH от 5 до 8. Когда хозяином является E.coli, предпочтительные примеры среды включают среду LB и среду M9 (Miller et al., Exp.Mol.Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431). В таком случае культивирование обычно можно проводить при температуре от 14 до 43 °С в течение приблизительно от 3 до 24 часов с аэрацией или перемешиванием, если необходимо. Когда хозяином является бактерия рода Bacillus, то культивирование обычно можно проводить при температуре от 30 до 40 °С в течение приблизительно от 16 до 96 часов с аэрацией или перемешиванием, если это необходимо. Когда хозяин представляет собой дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Burkholder (PNAS; 1980; 77: 4505-8). Желательно, чтобы ее рН составляло от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 35 °С в течение приблизительно от 14 до 144 часов, и при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание.
[0085] Получение Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате по настоящему изобретению, может включать стадию выделения, предпочтительно выделения или очистки, экспрессированного Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, в дополнение к стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека. Примеры метода выделения или очистки включают: методы, использующие растворимость, такие как высаливание и метод осаждения растворителем; методы, использующие разницу в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия; методы использования заряда, такие как ионообменная хроматография и гидроксилапатитная хроматография; методы, использующие специфическую аффинность, такие как аффинная хроматография; методы, использующие разницу в гидрофобности, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой; и способы, использующие разницу в изоэлектрической точке, такие как изоэлектрическое фокусирование.
[0086] 6. Способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению
Способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению может включать стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека с метящей частью (Y-S1-X). Связывание между компонентами метящей части (Y-S1-X) может быть соответствующим образом выполнено с помощью известного подхода специалистами в данной области. В качестве примера реакции лиганд (Y) связывается с пептидным линкером (X) напрямую или через спейсер (S1), а затем пептидный линкер может быть связан с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека. Альтернативно Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека может быть связан с пептидным линкером (X), а затем пептидный линкер и лиганд (Y) могут быть связаны напрямую или через спейсер (S1). Кроме того, лиганд, например DOTA, и Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека могут быть напрямую связаны с помощью известного подхода. Соединение лиганда, связанного со спейсером (S1) заранее, можно использовать в качестве исходного материала.
[0087] Способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению может также включать следующие стадии: культивирование трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с метящей частью (Y-S1-X). Способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению может также включать стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека; восстановление экспрессированного Fab-фрагмента; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с метящей частью (Y-S1-X). Способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению может дополнительно включать стадию добавления металла. В качестве хелатирующего агента, пептидного линкера, спейсера, количества метящих частей, металла и т.д. можно использовать те, которые описаны в настоящем описании.
[0088] Способ получения конъюгата по настоящему изобретению может быть выполнен как способ, включающий две или более стадий, определенных выше как последовательность стадий, или может быть выполнен как способ, включающий по меньшей мере одну из стадий, определенных выше. Например, способ, включающий стадию связывания Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека с метящей частью (Y-S1-X), и способ, включающий стадию координации Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, связанного с метящей частью (Y-S1-X), с металлом также включен в способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению. Кроме того, способ получения конъюгата по настоящему изобретению включает способ, имеющий различный порядок стадий. Например, способ, включающий координацию лиганда с металлом, а затем ковалентное связывание полученной метящей части (Y-S1-X) с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, также включено в способ получения конъюгата согласно настоящему изобретению.
[0089] 7. Композиция для диагностики и диагностический метод
Настоящее изобретение относится к композиции для диагностики, содержащей конъюгат настоящего изобретения, содержащий металл (в дальнейшем называемый детектируемым конъюгатом по настоящему изобретению). Композиция для диагностики по настоящему изобретению может содержать один или более конъюгатов по настоящему изобретению. В частности, композиция для диагностики по настоящему изобретению может содержать один конъюгат по настоящему изобретению или может содержать два или более конъюгатов по настоящему изобретению в комбинации. Детектируемый конъюгат по настоящему изобретению может быть включен в состав в соответствии с обычным методом и использоваться в качестве лекарственного средства для ранней диагностики или лекарственного средства для определения стадии (в частности, лекарственного средства для диагностики онкологического заболевания).
[0090] Под ранним диагностическим лекарственным средством понимается диагностическое лекарственное средство, предназначенное для выполнения диагностики, когда не наблюдается никаких состояний или на ранней стадии. Например, при онкологическом заболевании это означает диагностическое лекарственное средство, которое используется, когда не наблюдается состояния, либо на стадии 0 или стадии 1.
[0091] Стадийный препарат означает диагностическое лекарственное средство, позволяющее исследовать степень прогрессирования состояния. Например, для онкологического заболевания это диагностическое лекарственное средство, способное определить его стадию.
[0092] Онкологическое заболевание, которое, как ожидается, можно будет диагностировать с помощью композиции для диагностики по настоящему изобретению, представляет собой онкологическое заболевание, экспрессирующее человеческий MUC1. Примеры определенного варианта осуществления включают рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников и рак шейки матки. Предпочтительно онкологическое заболевание представляет собой рак молочной железы или рак мочевого пузыря.
[0093] Количество конъюгата по настоящему изобретению, добавляемого в состав композиции для диагностики по настоящему изобретению, различается в зависимости от степени симптомов или возраста пациента, лекарственной формы используемого препарата или титра связывания Fab-фрагмента и т. д. Например, приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг в расчете на массу Fab-фрагмента можно использовать на единицу массы тела пациента.
[0094] Примеры лекарственной формы композиции для диагностики по настоящему изобретению могут включать парентеральные агенты, такие как инъекции, и агенты для капельной инфузии. Введение может быть выполнено путем внутривенной инъекции, местной внутримышечной инъекции в ткань-мишень, подкожной инъекции, внутрипузырного введения или тому подобного. Для приготовления можно использовать носитель или добавку, подходящую для этих лекарственных форм, в фармацевтически приемлемом диапазоне. Тип фармацевтически приемлемого носителя или добавки конкретно ничем не ограничен, и можно использовать носитель или добавку, хорошо известные специалистам в данной области.
[0095] Настоящее изобретение также относится к применению детектируемого конъюгата по настоящему изобретению для производства композиции для ранней диагностики или композиции для определения стадии онкологического заболевания. Настоящее изобретение также относится к детектируемому конъюгату по настоящему изобретению для использования в ранней диагностике или определении стадии онкологического заболевания.
[0096] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу диагностики онкологического заболевания, включающему введение пациенту детектируемого конъюгата по настоящему изобретению. В этом контексте «пациент» - это человек или любое другое млекопитающее, нуждающееся в постановке диагноза. В определенном варианте осуществления - это человек, нуждающийся в постановке диагноза. Эффективное количество детектируемого конъюгата по настоящему изобретению в способе диагностики по настоящему изобретению может быть таким же, как эффективное количество конъюгата по настоящему изобретению для состава, описанного выше. В способе диагностики по настоящему изобретению детектируемый конъюгат по настоящему изобретению предпочтительно вводят путем местной внутримышечной инъекции в ткань-мишень, подкожной инъекции и т. п.
[0097] В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека по настоящему изобретению для получения конъюгата по настоящему изобретению. В определенном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека по настоящему изобретению для получения композиции для диагностики, содержащей конъюгат по настоящему изобретению.
[0098] В качестве варианта осуществления, в котором представлена композиция для диагностики по настоящему изобретению, содержащая радиоизотоп металла, она может быть помечена радиоизотопом металла непосредственно перед использованием или может быть представлена как композиция для диагностики, содержащая радиоизотоп металла.
[0099] 8. Фармацевтическая композиция и способ лечения
Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую один или более типов конъюгата по настоящему изобретению, содержащих радиоизотоп металла, такой как 90Y или 177Lu, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать один тип конъюгата по настоящему изобретению или может включать комбинацию двух или более типов конъюгатов по настоящему изобретению. Конъюгат по настоящему изобретению можно использовать при приготовлении фармацевтической композиции с помощью метода, обычно используемого с использованием носителя, обычно используемого в данной области, то есть фармацевтического вспомогательного вещества, фармацевтического носителя или тому подобного. Примеры лекарственных форм этих фармацевтических композиций включают парентеральные агенты, такие как инъекции и агенты для капельной инфузии. Введение может осуществляться внутривенной инъекцией, подкожной инъекцией, внутрипузырным введением и т. п. Для композиции вспомогательное вещество, носитель, добавка и т. п., подходящие для этих лекарственных форм, могут использоваться в фармацевтически приемлемом диапазоне.
[0100] Количество конъюгата по настоящему изобретению, добавляемого в состав, описанный выше, различается в зависимости от степени симптомов или возраста пациента, лекарственной формы используемого препарата или титра связывания Fab-фрагмента и т. д. Например, приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг в расчете на массу Fab-фрагмента можно использовать на единицу массы тела пациента.
[0101] Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по настоящему изобретению, может использоваться для лечения онкологического заболевания. Онкологическое заболевание, которое, как ожидается, можно лечить фармацевтической композицией, содержащей конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой онкологическое заболевание, экспрессирующее человеческий MUC1. Их примеры включают рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников и рак шейки матки.
[0102] Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для лечения рака молочной железы или рака мочевого пузыря, содержащую конъюгат по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способ лечения рака молочной железы или рака мочевого пузыря, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества конъюгата по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также включает способ индукции гибели опухолевых клеток рака молочной железы или рака мочевого пузыря, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества конъюгата по настоящему изобретению.
[0103] Фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания также может использоваться для диагностики онкологического заболевания. Например, фармацевтическая композиция для лечения рака молочной железы или рака мочевого пузыря также может использоваться при диагностике онкологического заболевания.
[0104] Настоящее изобретение также включает конъюгат по настоящему изобретению для использования при лечении рака молочной железы или рака мочевого пузыря. Настоящее изобретение дополнительно включает применение конъюгата по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции для лечения рака молочной железы или рака мочевого пузыря.
[0105] В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции, содержащей конъюгат по настоящему изобретению.
[0106] Настоящее изобретение в целом описано выше. Конкретные примеры будут предоставлены здесь для справки, чтобы получить дополнительное понимание. Однако они приведены в иллюстративных целях и не ограничивают настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ
[0107] (Пример 1: Получение Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека)
Были получены два Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, обозначенные как P10-1 Fab и P10-2 Fab.
[0108] Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи P10-1 Fab и P10-2 Fab были специально сконструированы как последовательности, которые, как ожидается, улучшат аффинность, а не ослабят аффинность даже за счет связывания метящей части, с использованием молекулярной модели гуманизированного антитела, сконструированного в соответствии с публикацией (Proteins, 2014 Aug; 82 (8): 1624-35) после гуманизации антитела 1B2, которое представляет собой полученное от мыши опухолеспецифичное антитело против MUC1 человека, со ссылкой на метод, описанный в публикации (Front Biosci., 2008 Jan 1; 13: 1619-33).
[0109] GS-вектор pEE6.4 (LonzaLtd.), содержащий вставку гена фрагмента тяжелой цепи, образованную путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 13)), с 5'-областью каждого гена вариабельной области тяжелой цепи P10-1 Fab или P10-2 Fab и получали соединение гена константной области человеческого Igγ1 (состоящего из нуклеотидной последовательности от положений нуклеотидов от 355 до 669 SEQ ID NO: 1 или 3) с его 3'-областью. Здесь, чтобы экспрессировать каждый Fab-фрагмент, стоп-кодон был вставлен ниже кодона Asp в положении 221 на основании индекса EU, предоставленного Kabat et al. (соответствует Asp в положении 222 в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 2 и 4, упомянутых ниже) в гене константной области тяжелой цепи. Кроме того, GS-вектор pEE12.4 (LonzaLtd.), содержащий вставку гена легкой цепи, образованную путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность (MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 14)), с 5'-областью гена общей вариабельной области легкой цепи P10-1 Fab и P10-2 Fab и с получением соединения гена константной области человеческой цепи κ (состоящего из нуклеотидной последовательности от положений нуклеотидов с 340 до 660 SEQ ID NO: 5) с его 3'-областью.
[0110] Экспрессию каждого Fab-фрагмента проводили методом транзиторной экспрессии. Клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), культивированные примерно до 2500000 клеток/мл в экспрессионной среде Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), трансфецировали GS-векторами фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи, упомянутых выше, с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) и культивировали в течение 8 дней. После экспрессии супернатант культуры очищали с использованием KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) для получения каждого Fab-фрагмента.
[0111] Нуклеотидная последовательность фрагмента тяжелой цепи P10-1 Fab представлена в SEQ ID NO: 1, а кодируемая им аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи P10-1 Fab представлена в SEQ ID NO: 7. Кодируемая таким образом аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 8.
[0112] Нуклеотидная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab P10-2 представлена в SEQ ID NO: 3. Кодируемая таким образом аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 4. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи P10-2 Fab представлена в SEQ ID NO: 9. Кодируемая таким образом аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 10.
[0113] Легкая цепь является общей в Fab P10-1 и Fab P10-2. Ее нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 5. Кодируемая таким образом аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи P10-1 Fab и P10-2 Fab представлена в SEQ ID NO: 11. Кодируемая таким образом аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 12.
[0114] (Пример 2: Анализ аминокислотной модификации Fab-фрагмента)
В результате анализа аминокислотной модификации очищенного Fab P10-2 было высказано предположение, что N-концевой глутамин тяжелой цепи был модифицирован в пироглутаминовую кислоту в подавляющем большинстве очищенных антител.
[0115] (Пример 3: Получение конъюгата Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека)
В этом примере Fab P10-1 использовали в качестве Fab-фрагмента (Fab) антитела против MUC1 человека.
В приведенных ниже примерах показано количество (Y-S1-X), связанного с Fab каждого конъюгата, которое может быть подтверждено анализом MS. Однако результаты не означают, что конъюгаты, имеющие количество связанного фрагмента, отличное от представленного, исключаются. Следует понимать, что остается возможность того, что присутствуют конъюгаты, имеющие такое количество связанного фрагмента, присутствие которого не может быть подтверждено с точки зрения точности инструментов анализа MS.
[0116] (Пример 3-1: Синтез образца № 1 ([DFO-C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2] p-Fab))
[Химическая Формула 10]
[0117] (i) Синтез N-(3-{[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
трет-Бутил N-(трет-бутоксикарбонил) глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинат (11,5 г) растворяли в анизоле (2,8 мл). К раствору по каплям добавляли трифторуксусную кислоту (далее сокращенно TFA) (58 мл) при комнатной температуре, и полученный продукт перемешивали в течение 2 часов. После подтверждения потребления исходного материала и получения целевого соединения с помощью ВЭЖХ растворитель в реакционном растворе концентрировали при пониженном давлении. Твердое вещество, осажденное добавлением к остатку диэтилового эфира (200 мл), фильтровали и промывали диэтиловым эфиром с получением глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинмоно(трифторацетата) (8,70 г). MS(ESI+); 284
[0118] Глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин моно (трифторацетат) (105 мг) и 1,1'-[1,3-фениленбис(карбонилокси)]ди (пирролидин-2,5-дион) (272 мг) растворяли в диметилформамиде (далее сокращенно DMF) (3 мл). К раствору постепенно добавляли триэтиламин (в дальнейшем сокращенно TEA) (0,07 мл) при комнатной температуре, и полученный продукт перемешивали в течение 20 минут. После подтверждения получения целевого соединения и потребления исходного материала с помощью LCMS, реакцию гасили добавлением водного раствора TFA и доводили pH до примерно 4. Полученный продукт очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракции, содержащие желаемое соединение, собирали, концентрировали и сушили вымораживанием с получением указанного титульного соединения (155 мг). MS(ESI +); 529
[0119] (ii) Синтез N-{3-[(3,14,25-тригидрокси-2,10,13,21,24-пентаоксо-3,9,14,20,25-пентаазатриаконтан-30-ил)карбамоил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
N-(3-{[(2,5-Диоксопирролидин-1-ил)окси]карбонил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин (141 мг) растворяли в DMF (5 мл). В раствор N4-{5-[ацетил(гидрокси)амино]пентил}-N1-(5-{4-[(5-аминопентил)(гидрокси)амино]-4-оксобутанамидо}пентил)-N1-гидроксибутандиамида добавляли монометансульфонат (177 мг) и TEA (0,075 мл) при комнатной температуре. Исходный материал был плохо растворим и вызывал помутнение белого цвета, поэтому его растворяли добавлением диметилсульфоксида (в дальнейшем сокращенно ДМСО) (5 мл), и полученный продукт перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. После подтверждения получения целевого соединения и потребления исходного материала с помощью LCMS, реакцию гасили добавлением водного раствора TFA и доводили pH до примерно 5. Полученный продукт очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракции, содержащие желаемое соединение, собирали, концентрировали и сушили при пониженном давлении в течение 2 часов с получением титульного соединения (150 мг). MS(ESI+); 975
[0120]
(iii) Очистка N-{3-[(3,14,25-тригидрокси-2,10,13,21,24-пентаоксо-3,9,14,20,25-пентаазатриаконтан-30-ил)карбамоил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
N-{3-[(3,14,25-Тригидрокси-2,10,13,21,24-пентаоксо-3,9,14,20,25-пентаазатриаконтан-30-ил)карбамоил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин (122 мг) растворяли в ДМСО (8 мл) и ДМФ (4 мл). Раствор очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракции, содержащие представляющее интерес соединение, собирали, концентрировали и сушили при пониженном давлении в течение 2 часов с получением титульного соединения (19 мг). MS(ESI-); 973
[0121] (iv) Синтез образца №1.
К раствору Fab, приготовленному с концентрацией 4 мг/мл с 0,1 М боратным буферным раствором, добавляли раствор 2-иминотиолана (2-IT), приготовленный с 0,1 М боратным буферным раствором, и полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Избыток 2-IT промывали три раза повторно ЭДТА-содержащим фосфатно-солевым буфером (pH 6) с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл (Merck Millipore) и, наконец, концентрировали и фильтровали.
[0122] К полученному фильтрату добавляли N-{3-[(3,14,25-тригидрокси-2,10,13,21,24-пентаоксо-3,9,14,20,25-пентаазатриаконтан-30-ил)карбамоил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин, разбавленный 0,1 М боратным буферным раствором (pH 8,5), а затем растворенный в ДМФ, и полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Избыток реагента промывали (что повторяли три раза) ЭДТА-содержащим фосфатно-солевым буфером (pH 6) с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл и, наконец, концентрировали и фильтровали.
[0123] Затем к полученному супернатанту добавляли раствор 2-йодацетамида, приготовленный с концентрацией 10 мг/мл с фосфатно-солевым буферным раствором (pH 6), и затем полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Избыток йодацетамида трижды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (pH 7) с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл, и, наконец, концентрировали и фильтровали с получением конъюгата, содержащего связанный Fab. Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DFO-C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2] (молекулярная масса : 1076), связанного с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), и конъюгата, содержащего две его связанные молекулы.
[0124] (Пример 3-2: Синтез образца № 2 ([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab))
[Химическая Формула 11]
[0125] (i) Синтез 3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензойной кислоты.
К смеси бензил(3-формилфенокси)ацетата (2,90 г) (Chemistry. 2015 Aug 24; 21 (35): 12421-30), 2-метилпропан-2-ола (60 мл) и воды (30 мл), добавляли 2-метилбут-2-ен (6 мл), гидрат дигидрофосфата натрия (1: 1: 2) (3,35 г) и хлорит натрия (3,64 г) при комнатной температуре, и полученный продукт перемешивали в течение 2 часов. К реакционному раствору добавляли этилацетат и 1 M хлороводородную кислоту (60 мл) с последующей экстракцией этилацетатом. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением титульного соединения (2,93 г). MS(ESI-); 285
[0126] (ii) Синтез трет-бутил-N-{3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензоил}глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
К смеси трет-бутилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (760 мг), 3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензойной кислоты (600 мг) и ДМФ (10 мл).), добавляли 1-(диметиламино)-N, N-диметил-1-[(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)окси]гексафторидофосфат метаниминия (1-) (800 мг) и диизопропилэтиламин (далее сокращенно DIPEA) (1 мл) при охлаждении льдом. После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 часа к смеси добавляли воду и этилацетат для отделения органического слоя. Затем водный слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали, а затем остаток очищали хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат=90/10-0/100) с получением титульного соединения (1,19 г). MS(ESI +); 662
[0127] (iii) Синтез трет-бутил-N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-L-лизината.
К смеси трет-бутил-N-{3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензоил}глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (1,18 г) и этилового спирта (20 мл) добавляли при комнатной температуре 10% углерода на носителе из палладия (содержащий 50% воды, 200 мг). Смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере водорода (1 атм). Смесь фильтровали через целит, а затем концентрировали с получением титульного соединения (804 мг). MS(ESI +); 438
[0128] (iv) Синтез трет-бутил-N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината.
К смеси трет-бутил-N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-L-лизината (600 мг), ДМФ (2 мл) и тетрагидрофурана (4 мл), добавляли метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилат (350 мг) и DIPEA (700 мкл) при комнатной температуре, и полученный продукт нагревали и перемешивали при 60°C. Через 9 часов к нему дополнительно добавляли DIPEA (500 мкл), и полученный продукт дополнительно перемешивали в течение ночи при 60°C. Полученному продукту давали охладиться до комнатной температуры, нейтрализовали TFA (600 мкл), концентрировали при пониженном давлении и непосредственно очищали на колоночной хроматографии с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракцию целевого соединения концентрировали при пониженном давлении и к остатку добавляли воду и этилацетат для разделения слоев и экстракции. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали, а затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении и сушили с получением титульного соединения (378 мг). MS(ESI +); 518
[0129] (v) Синтез трет-бутил-N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
К смеси монометансульфоната N4-{5-[ацетил(гидрокси)амино]пентил}-N1-(5-{4-[(5-аминопентил)(гидрокси)амино]-4-оксобутанамидо}пентил)-N1-гидроксибутандиамида (400 мг), трет-Бутил-N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (365 мг) и ДМФА (4 мл), добавляли 3-{[(этилимино)метилиден]амино}-N, N-диметилпропан-1-аминмоногидрохлорид (далее сокращенно EDC HCl) (240 мг), 1H-бензотриазол-1-ол (далее сокращенно HOBt) (165 мг) и DIPEA (500 мкл) при охлаждении льдом, и полученный продукт перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли смешанным раствором TFA (200 мкл) и воды (500 мкл) и очищали непосредственно колоночной хроматографией с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракции целевого соединения собирали, концентрировали при пониженном давлении и сушили вымораживанием с получением титульного соединения (285 мг). MS(ESI-); 1059
[0130] (vi) Синтез N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
К трет-Бутил-N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинату (370 мг), добавляли TFA (1,5 мл) при охлаждении льдом, и полученный продукт перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После концентрирования при пониженном давлении остаток разбавляли ДМФ (4 мл) и водой (500 мкл) и непосредственно очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой (YMC Triart C18, ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA). Фракции целевого соединения собирали, концентрировали при пониженном давлении и сушили вымораживанием с получением титульного соединения (194 мг). MS(ESI-); 1003
[0131] (vii) Синтез образца № 2.
Конъюгат получали таким же способом, как в (iv) Примера 3-1, с использованием соединения (vi). Конъюгат был подтвержден анализом МС как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2] (молекулярная масса: 1106), связанного с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), и конъюгата, содержащего две связанные его молекулы.
[0132] (Пример 3-3: Синтез образца № 3 ([DOTA-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)]p-Fab))
[Химическая Формула 12]
p-SCN-Bn-DOTA (Macrocyclics, Inc.) использовали для связывания хелатирующего агента DOTA с Fab. К раствору Fab добавляли фосфатно-солевой буфер (pH 7,4) и глицерин и, наконец, добавляли 0,1 М раствор карбоната натрия (pH 9,0), чтобы приготовить раствор 6 мг/мл в карбонате натрия, имеющий pH от 8,8 до 9,0. К нему добавляли p-SCN-Bn-DOTA, и полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 2 часов. После реакции конъюгат выделяли и очищали через центрифужный фильтр Amicon Ultra-0,5 мл. Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DOTA-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)] (молекулярная масса: 553), связанную с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), конъюгата, содержащего две его связанные молекулы, конъюгата, содержащего три его связанные молекулы, и конъюгата, содержащего четыре его связанные молекулы.
[0133] (Пример 3-4: Синтез образца № 4 ([DOTA] p-Fab))
[Химическая Формула 13]
Смешанный раствор 2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраил) тетрауксусной кислоты (DOTA) (16 мг) и воды (810 мкл) доводили pH до 6 добавлением 1 М водного раствора гидроксида натрия (80 мкл) при охлаждении льдом. К подготовленному раствору (239 мкл) добавляли 1-гидрокси-2,5-диоксопирролидин-3-сульфоната натрия (2,3 мг), растворенного в воде (117 мкл), при охлаждении льдом. Затем к нему добавляли водный раствор EDC HCl (8,3 мкл, 25 мг/мл), и полученный продукт перемешивали в течение 30 минут при охлаждении льдом с получением раствора N-гидроксисульфосукцинимидил DOTA. Перед добавлением к Fab pH раствора доводили до 7 добавлением 0,2 М раствора гидрофосфата натрия (pH 9) (40 мкл).
[0134] К 0,1 М раствору гидрофосфата натрия (198 мкл) 20,8 мг/мл Fab (27 мкл) добавляли приготовленный раствор N-гидроксисульфосукцинимидил DOTA (100 мкл) и полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 20 часов. Полученный продукт дважды промывали 10 мМ фосфатно-солевого буферного раствора (pH 7) с использованием Amicon Ultra, промывали 0,3 М буферным раствором ацетата аммония и, наконец, концентрировали и фильтровали с получением конъюгата. Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу DOTA (молекулярная масса: 387), связанную с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), и конъюгата, содержащего две связанные молекулы.
[0135] (Пример 3-5. Синтез образца № 5 ([DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab))
[Химическая Формула 14]
[0136]
(i) Синтез трет-бутил-N-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинат тетракис (трифторацетат)
К раствору трет-бутил-N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (1 г) в дихлорметане (12 мл), добавляли TFA (6 мл) при охлаждении льдом, и полученный продукт перемешивали в течение 2 часов при охлаждении льдом. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением моно (трифторацетата) трет-бутилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (1,1 г). MS(ESI +); 340,3
Смесь 2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраил)тетрауксусной кислоты (320 мг) и воды (12 мл) pH доводили до 6 добавлением 1 М водного раствора гидроксида натрия (1,58 мл) при охлаждении льдом. Затем добавляли 1-гидрокси-2,5-диоксопирролидин-3-сульфонат натрия (170 мг) и EDC HCl (150 мг) при охлаждении льдом, и полученный продукт перемешивали в течение 30 минут. PH доводили до 7 добавлением 0,2 М раствора гидрофосфата натрия (pH 9) (3 мл), а затем доводили до 8 добавлением трет-бутилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно (трифторацетата) (750 мг), 1 М водного раствора гидроксида натрия (672 мкл) и 0,2 М раствора динатрий гидрофосфата (pH 9) (800 мкл, и полученный продукт перемешивали в течение 2 часов при охлаждении льдом. Полученный продукт очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой на силикагеле (градиент растворителя; 0→100% ацетонитрил/вода (0,05% водный раствор TFA)) с получением титульного соединения (347 мг). MS(ESI-): 726,3
[0137] (ii) Синтез N-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин тетрагидрохлорида
Смешанный раствор трет-бутил-N-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината тетракис (трифторацетата) (347 мг) в 4 M хлороводород/диоксан (3 мл) и дихлорметане (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов, а затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией с обращенной фазой на силикагеле (градиент растворителя; 0→100% ацетонитрил/вода (0,05% водный раствор TFA)) с получением титульного соединения (168 мг). MS(ESI +): 670.
[0138] (iii) Синтез образца № 5.
К 5,2 мг/мл Fab в боратном буферном растворе (100 мкл) добавляли 2 мг/мл 2-IT в 0,1 М боратном буферном растворе (3,33 мкл), и полученный продукт инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Избыток 2-IT промывали три раза подряд ЭДТА-содержащим 0,1 М фосфатно-солевым буфером (pH 6) с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл и, наконец, концентрировали и фильтровали.
[0139] К полученному фильтрату добавляли новый линкер 25 мг/мл (раствор ДМФ, 20 мкл), и полученный продукт разбавляли до 70 л 0,1 М боратным буферным раствором (pH 8,5) и инкубировали при 37°C или 2 часа. Полученный продукт промывали дважды 0,1 М ЭДТА-содержащим фосфатно-солевым буфером (pH 6), с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл, промывали фосфатно-солевым буфером (pH 7,0) и, наконец, концентрировали и фильтровали с получением конъюгата.
[0140] Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DOTA-Gly-Lys-Z2] (молекулярная масса: 772), связанную с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), и конъюгата, содержащего две его связанные молекулы.
[0141] (Пример 3-6. Синтез образца № 6 ([DOTA-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab))
[Химическая Формула 15]
[0142] (i) Синтез трет-бутил-N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
К смеси 3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензойной кислоты (460 мг), трет-бутилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата) (750 мг) и дихлорметана (15 мл), добавляли EDC HCl (380 мг), HOBt (110 мг) и TEA (700 мкл), и полученный продукт перемешивали при комнатной температуре 15 часов. Реакционный раствор концентрировали, а затем остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем (проявляющий растворитель; этилацетат) с получением титульного соединения (478 мг). MS(ESI +): 595.
[0143] (ii) Синтез моно(трифторацетата) трет-бутил-N-[3-(аминометил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината.
Смесь трет-Бутил-N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (478 мг) в TFA (1,5 мл) и дихлорметане (3 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении с получением титульного соединения (500 мг). MS(ESI +): 473.
[0144] (iii) Синтез трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинат тетракис (трифторацетата)
Титульное соединение (160 мг) получали таким же способом, как на стадии (i) примера 3-5, с использованием трет-бутил-N-[3-(аминометил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинат моно (трифторацетата) (489 мг). MS(ESI-): 857.
[0145] (iv) Синтез N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин тетрагидрохлорида
Титульное соединение (80 мг) получали таким же способом, как на стадии (ii) примера 3-5, с использованием трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинат тетракис (трифторацетата) (160 мг). MS(ESI +): 803.
[0146] (v) Синтез образца № 6.
Конъюгат получали таким же образом, как на стадии (iii) примера 3-5, с использованием соединения (iv). Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DOTA-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2] (молекулярная масса: 905), связанную с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа), конъюгата, содержащего две его связанные молекулы, и конъюгата, содержащего три его связанные молекулы.
[0147] (Пример 3-7. Синтез образца № 7 ([DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab))
[Химическая Формула 16]
[0148] (i) Синтез N-{[4,7,10-Трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида тетракис (трифторацетата)
Смесь 2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраил)тетрауксусной кислоты (330 мг) и воды (16 мл) pH доводили до 6 добавлением 1 М водного раствора гидроксида натрия (1,6 мл) при охлаждении льдом. Затем к смеси добавляли 1-гидрокси-2,5-диоксопирролидин-3-сульфонат (90 мг) и EDC HCl (80 мг) при охлаждении льдом, и полученный продукт перемешивали в течение 30 минут. pH доводили до 7 добавлением 0,2 М раствора гидрофосфата натрия (pH 9) (3 мл), а затем доводили до приблизительно 8 добавлением L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида моногидрохлорида (100 мг) (Bioconjug Chem. 2014 Nov 19; 25 (11): 2038-45) и 1 М водного раствора гидроксида натрия (570 мкл), и полученный продукт перемешивали в течение 2 часов при охлаждении льдом. Полученный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с обращенной фазой (ацетонитрил/0,05% водный раствор TFA) с получением титульного соединения (98 мг). MS(ESI-): 769.
[0149] (ii) Синтез образца № 7.
Конъюгат получали таким же образом, как на стадии (iii) примера 3-5, с использованием соединения (i). Конъюгат был подтвержден анализом MS как смесь конъюгата, содержащего одну молекулу [DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1] (молекулярная масса: 873), связанную с одним Fab (молекулярная масса: 47,5 кДа).), конъюгата, содержащего две его связанные молекулы, и конъюгата, содержащего три его связанные молекулы.
[0150] Соединения примеров получения № А1-А19, показанные в таблицах с 1-1 по 1-4, были синтезированы в соответствии со схемами синтеза, описанными ниже, с использованием методов, аналогичных методам в примерах, описанных выше, или способов, известных специалистам в данной области.
[Таблица 1-1]
[Таблица 1-2]
[Таблица 1-3]
[Таблица 1-4]
[0151] (Схема синтеза)
[Химическая Формула 17]
Пример получения № A1
[0152]
[Химическая Формула 18]
Пример получения № A2
[0153]
[Химическая Формула 19]
Пример получения № А3
[0154]
[Химическая Формула 20]
Пример получения № А4
[0155]
[Химическая формула 21]
Пример получения № А5
[0156]
[Химическая формула 22]
Пример получения № А6
[0157]
[Химическая формула 23]
Пример получения № А7
[0158]
[Химическая формула 24]
Пример получения № А8
[0159]
[Химическая формула 25]
Пример получения № А9
[0160]
[Химическая формула 26]
Пример получения № А10
[0161]
[Химическая формула 27]
Пример получения № А11
[0162]
[Химическая формула 28]
Пример получения № A12
[0163]
[Химическая формула 29]
Пример получения № А13
[0164]
[Химическая формула 30]
Пример получения № А14
[0165]
[Химическая формула 31]
Пример получения № А15
[0166]
[Химическая формула 32]
Пример получения № А16
[0167]
[Химическая формула 33]
Пример получения № А17
[0168]
[Химическая формула 34]
Пример получения № А18
[0169]
[Химическая формула 35]
Пример получения № А19
[0170] Конъюгат № B1-B19 из Таблицы 2 можно синтезировать тем же подходом, что и на стадии (iv) Примера 3-1, или на стадии (iii) Примера 3-3 или Примера 3-5, описанных выше, с использованием соответствующих соединений Примера получения. № A1-A19. В таблице p представляет собой натуральное число от 1 до 25 (в некоторых вариантах осуществления используется натуральное число от 1 до 4), 1,3-Ph представляет собой 1,3-фенилен, а 1,4-Ph представляет собой 1,4- фенилен.
[0171]
[Таблица 2]
[0172] (Пример 4: оценка активности связывания Fab-фрагмента)
Активность связывания против опухолеспецифичного MUC1 человека, сравнивали с Fab-фрагментом P10-1 Fab и Fab-фрагментом P10-2, экспрессируемым способом из Примера 1, с Fab-фрагментом химерного антитела 1B2 (в дальнейшем именуемым 1B2 Fab; полученным путем связывания домена CH1 IgG1 человека и домена цепи κ CL с доменом VH и доменом VL (информация об их последовательностях была взята из PTL 1), соответственно, антитела 1B2 (PTL 1); для удобства связывания домена CH1 и домена CL остаток аланина в положении 113 на основе индекса EU (Kabat et al.) в домене VH был заменен остатком серина, а остаток аланина в положении 109 на основании индекса EU (Kabat et al.) в VL домен был заменен остатком треонина) с помощью клеточного ИФА. В частности, клетки линии рака молочной железы T-47D (приобретенные в АТСС; HTB-133), экспрессирующие опухолеспецифический MUC1 человека, инокулировали из расчета 0,75х104 клеток на лунку в 96-луночный планшет для ИФА, покрытый коллагеном I, и культивировали в течение ночи. Затем клетки фиксировали в формалине, и с ними реагировали P10-1 Fab, P10-2 Fab или 1B2 Fab, описанные выше. Затем меченное пероксидазой хрена (HRP) козье антитело против человеческого Igκ (Southern Biotechnology Associates, Inc.) реагировало как вторичное антитело. К нему добавляли реагент ECL Prime для детектирования для вестерн-блоттинга (GE Healthcare Japan Corp.) для люминесценции и исследовали степень люминесценции. В результате, как показано на Фиг. 1, было подтверждено, что Fab P10-1 и Fab P10-2 обладают примерно в 10 или более раз большей активностью связывания против опухолеспецифического MUC1 человека по сравнению с Fab 1B2.
[0173] (Пример 5: Оценка активности связывания конъюгата Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека)
ИФА проводили для оценки активности связывания каждого конъюгата Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, полученного способом из Примера 3, против опухолеспецифичного MUC1 человека.
Образец № 5: [DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab.
Образец № 6: [DOTA-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab.
Образец № 7: [DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab.
Образец № 3: [DOTA-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)]p-Fab.
[0174] Пептид опухолеспецифичного MUC1 человека (PTL 1) иммобилизовали в концентрации 0,5 мкмоль/л на лунку на 384-луночном планшете для ИФА. Полученный продукт подвергали реакции с каждым конъюгатом Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, описанным выше (образец № 5, 6, 7 или 3), а затем подвергали реакции с меченным пероксидазой хрена козьим антителом против человеческого Igκ (Southern Biotechnology Associates, Inc.) в качестве вторичного антитела. К нему добавляли реагент ECL Prime для детектирования для вестерн-блоттинга (GE Healthcare Japan Corp.) для люминесценции и исследовали степень люминесценции. Результаты представлены в Таблице 3. Подтвердили, что конъюгаты образцов № 5, 6, 7 и 3 обладают активностью связывания в отношении пептида опухолеспецифного MUC1 человека, эквивалентной активности P10-1 Fab.
[0175]
[Таблица 3]
Образец 5 6 7 3 P10-1 Fab
EC50(нмоль/л) 0,31 0,3 0,31 0,49 0,23
[0176] Аналогичным образом, оценка активности связывания также проводилась в отношении конъюгатов Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, приведенных ниже. Результаты представлены в Таблицах 4 и 5.
Образец № 4: [DOTA] p-Fab.
Образец № 1: [DFO-C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab.
Образец № 2: [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab.
[0177]
[Таблица 4]
Образец 4 P10-1 Fab
EC50(нмоль/л) 0,35 0,17
[0178]
[Таблица 5]
Образец 1 2 P10-1 Fab
EC50(нмоль/л) 0,29 0,3 0,16
[0179] В результате также подтверждали, что конъюгаты образцов № 4, 1 и 2 обладают активностью связывания в отношении пептида опухолеспецифичного MUC1 человека, эквивалентной активности Fab P10-1.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0180] Конъюгат по настоящему изобретению обладает превосходной активностью связывания в отношении опухолеспецифичного MUC1 человека, и поэтому ожидается, что он будет полезен для диагностики и/или лечения онкологического заболевания.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СВОБОДНОЙ ФОРМЕ
[0181] SEQ ID NO: 1: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1.
SEQ ID NO: 2: аминокислотная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab P10-1.
SEQ ID NO: 3: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2.
SEQ ID NO: 4: аминокислотная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab P10-2.
SEQ ID NO: 5: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь антитела.
SEQ ID NO: 6: аминокислотная последовательность легкой цепи антитела.
SEQ ID NO: 7: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-1.
SEQ ID NO: 8: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab P10-1.
SEQ ID NO: 9: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-2.
SEQ ID NO: 10: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab P10-2.
SEQ ID NO: 11: нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела.
SEQ ID NO: 12: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела.
SEQ ID NO: 13: сигнальная последовательность тяжелой цепи.
SEQ ID NO: 14: сигнальная последовательность легкой цепи.
SEQ ID NO: 15: последовательность тандемных повторов внеклеточного домена MUC1.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> Комплекс, содержащий Fab-фрагмент антитела против MUC1
человека, пептидный линкер и/или лиганд
<130> A19005A00
<140> PCT/JP2019/019663
<141> 2019-05-17
<150> JP 2018-095461
<151> 2018-05-17
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 669
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая Fab-фрагмент тяжелой цепи P10-1
<400> 1
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 2
<211> 222
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Fab-фрагмент тяжелой цепи P10-1
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 3
<211> 669
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая Fab-фрагмент тяжелой цепи P10-2
<400> 3
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgactga 669
<210> 4
<211> 222
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Fab-фрагмент тяжелой цепи P10-2
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 5
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая легкую цепь антитела
<400> 5
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660
<210> 6
<211> 219
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь антитела
<400> 6
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 7
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 8
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 9
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354
<210> 10
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи
<400> 11
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339
<210> 12
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи антитела
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 13
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность тяжелой цепи
<400> 13
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 14
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность легкой цепи
<400> 14
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 15
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность тандемного повтора внеклеточного домена
MUC1
<400> 15
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20
<---

Claims (55)

1. Конъюгат, представленный следующей формулой (I), обладающий активностью связывания в отношении человеческого опухолеспецифического MUC1:
(Y-S1-X)p-Fab, (I)
где
Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, выбранный из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12;
X представляет собой пептидный линкер, где пептидный линкер включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Met-Ile, Gly-Lys, Gly-Phe-Lys, Met-Val-Lys, Gly-Tyr, Gly-Lys-Lys, и Gly-Arg-Lys, и пептидный линкер может произвольно иметь спейсер, подходящий для связывания с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, где спейсер представляет собой группу, которая образует химическую органическую связь между пептидным линкерным фрагментом и атомом азота аминогруппы, или произодной от дисульфидной связи тиольной группы Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека;
S1 представляет собой спейсер или связь, и связь является ковалентной;
Y представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (DOTA); и
p представляет собой натуральное число от 1 до 25.
2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
3. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 10 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12.
4. Конъюгат по п. 2, отличающийся тем, что Fab выбран из группы, состоящей из следующих (а) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6; и
(b) Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащего фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
5. Конъюгат по п. 4, отличающийся тем, что Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
6. Конъюгат по п. 4, отличающийся тем, что Fab представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, путем модификации глутамина в аминокислотном положении 1 SEQ ID NO: 4 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6.
7. Конъюгат по п. 6, отличающийся тем, что S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -C(=O)-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2)2-C(=O)-, или связь, и связь является ковалентной и
X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из следующих (1)-(9):
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2)-Gly-Lys-Z2-,
(3)-Gly-Phe-Lys-Z2-,
(4)-Met-Val-Lys-Z2-,
(5)-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6)-Gly-Lys-Lys-Z2-,
(7)-Gly-Arg-Lys-Z2-,
(8)-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, и
(9)-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
где Met представляет собой метионин, Ile представляет собой изолейцин, Gly представляет собой глицин, Lys представляет собой лизин, Phe представляет собой фенилаланин, Val представляет собой валин, Tyr представляет собой тирозин, Arg представляет собой аргинин, Z1 представляет собой группу, представленную следующей формулой (II), -Lys-Z2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (III), -Tyr-CH2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (IV), и -Lys-C(=S)- представляет собой группу, представленную следующей формулой (V):
[Химическая Формула 1]
8. Конъюгат по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что (Y-S1-X)p-Fab выбран из группы, состоящей из
[Химическая Формула 3]
и атом азота аминогруппы, содержащейся в Fab, связан с атомом углерода концевой C(=NH) группы X.
9. Конъюгат по п. 8, отличающийся тем, что p представляет собой натуральное число от 1 до 4.
10. Хелатный комплекс конъюгата по любому из пп. 1-9 с металлом для диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, или для лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, где металл представляет собой ион парамагнитного металла или радиоизотоп металла.
11. Хелатный комплекс по п. 10, отличающийся тем, что металл представляет собой радиоизотоп металла.
12. Хелатный комплекс по п. 11, отличающийся тем, что радиоизотоп металла представляет собой 89Zr, 51Mn, 52Fe, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In или 177Lu.
13. Хелатный комплекс по п. 12, отличающийся тем, что металл представляет собой 89Zr.
14. Хелатный комплекс по п. 12, который представляет собой ПЭТ-индикатор и радиоизотоп металла представляет собой 89Zr, 60Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc, или 111In.
15. Композиция для диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, содержащая один или более хелатных комплексов по любому из пп. 10-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. Композиция для диагностики по п. 15, которая представляет собой лекарственное средство для ранней диагностики или диагностическое лекарственное средство, способное определять стадию онкологического заболевания.
17. Композиция для диагностики по п. 15 или 16, отличающаяся тем, что онкологическое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников или рак шейки матки.
18. Фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, содержащая эффективное количество одного или более хелатных комплексов по любому из пп. 10-14 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. Фармацевтическая композиция по п. 18, отличающаяся тем, что онкологическое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичников или рак шейки матки.
20. Применение хелатного комплекса по любому из пп. 10-14 для получения композиции для диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, или фармацевтической композиции для лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1.
21. Способ диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, включающий введение пациенту диагностически эффективного количества хелатного комплекса по любому из пп. 10-14.
22. Способ лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества хелатного комплекса по любому из пп. 10-13.
23. Применение хелатного комплекса по любому из пп. 10-14 для диагностики онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1.
24. Применение хелатного комплекса по любому из пп. 10-13 для лечения онкологического заболевания, экспрессирующего человеческий MUC1.
RU2020141476A 2018-05-17 2019-05-17 КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА, ПЕПТИДНЫЙ ЛИНКЕР И/ИЛИ ЛИГАНД RU2814073C2 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-095461 2018-05-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2020141476A RU2020141476A (ru) 2022-06-20
RU2814073C2 true RU2814073C2 (ru) 2024-02-21

Family

ID=

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010050528A1 (ja) * 2008-10-28 2010-05-06 塩野義製薬株式会社 抗ｍｕｃ１抗体
WO2011012309A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Glycotope Gmbh Muc1 antibodies
WO2011135869A1 (ja) * 2010-04-28 2011-11-03 塩野義製薬株式会社 新規なｍｕｃ１抗体
WO2015166934A1 (ja) * 2014-04-28 2015-11-05 医化学創薬株式会社 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途
RU2017134275A (ru) * 2015-03-17 2019-04-05 Тилт Байотерапьютикс Ой Онколитические аденовирусы, кодирующие биспецифические антитела, а также способы и применения, связанные с ними

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010050528A1 (ja) * 2008-10-28 2010-05-06 塩野義製薬株式会社 抗ｍｕｃ１抗体
WO2011012309A1 (en) * 2009-07-31 2011-02-03 Glycotope Gmbh Muc1 antibodies
WO2011135869A1 (ja) * 2010-04-28 2011-11-03 塩野義製薬株式会社 新規なｍｕｃ１抗体
WO2015166934A1 (ja) * 2014-04-28 2015-11-05 医化学創薬株式会社 抗ｍｕｃ１抗体又はその抗原結合性断片及びその用途
RU2017134275A (ru) * 2015-03-17 2019-04-05 Тилт Байотерапьютикс Ой Онколитические аденовирусы, кодирующие биспецифические антитела, а также способы и применения, связанные с ними

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAKADA T. et al.: "Novel antibody drug conjugates containing exatecan derivative-based cytotoxic payloads", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2016, v. 26 (6): 1542-1545. LU J. et al.: "Linkers Having a Crucial Role in Antibody-Drug Conjugates", Int. J. Mol. Sci., 2016, v. 17 (4): 561. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7360766B2 (ja) 抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、ペプチドリンカー及び／又は配位子を含む複合体
RU2767793C2 (ru) НОВЫЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА
JP7414370B2 (ja) 配位子、スペーサー、ペプチドリンカーおよび生物分子からなる複合体
US11667724B2 (en) Anti-human CEACAM5 antibody Fab fragment
CN112839683A (zh) 含有标记部-抗人抗体Fab片段复合物的药物组合物
RU2814073C2 (ru) КОМПЛЕКС, СОДЕРЖАЩИЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА, ПЕПТИДНЫЙ ЛИНКЕР И/ИЛИ ЛИГАНД
RU2807081C2 (ru) Конъюгат, включающий лиганд, спейсер, пептидный линкер и биомолекулу
RU2779165C2 (ru) Новый fab-фрагмент антитела против ceacam5 человека
RU2800924C2 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс маркирующий сайт - fab-фрагмент античеловеческого антитела
TWI850308B (zh) 包含配位子、間隔區、胜肽連接子及生物分子之複合體