RU2800924C2

RU2800924C2 - Фармацевтическая композиция, содержащая комплекс маркирующий сайт - fab-фрагмент античеловеческого антитела

Info

Publication number: RU2800924C2
Application number: RU2021112023A
Authority: RU
Inventors: Дзумпей СУЕМИЦУ; Мегуми ИКЕДА; Мое КОХНО
Original assignee: Астеллас Фарма Инк.
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2019-10-09
Publication date: 2023-08-01

Abstract

Группа изобретений относится к стабильной фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. Фармацевтическая композиция содержит конъюгат маркирующего фрагмента формулы I

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к стабильной фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В частности, настоящее изобретение относится к стабильной фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против человеческого CEACAM5 или конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против человеческого MUC1. Настоящее изобретение также относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, и к способу стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Развитие технологии генетической модификации позволило использовать антитела, такие как иммуноглобулин, моноклональные антитела и гуманизированные антитела, в качестве лекарственных средств. Например, для диагностики и лечения рака используются антитела, связанные с противораковыми агентами, радиоизотопами металлов, флуоресцентными красителями и т.п. Известно, что целенаправленное воздействие с использованием антител имеет высокую специфичность к опухолевым клеткам и вызывает незначительные побочные эффекты. При таких обстоятельствах к настоящему времени были разработаны моноклональные антитела, меченные радиоизотопами металлов, и т.п. (Патентная литература 1).

[0003] Между тем, антитела обычно имеют длительный период полураспада в крови и требуют периода от 4 до 5 дней для достижения соотношения опухоль/кровь, которое обеспечивает соотношение сигнал/фон, достаточное для визуализации рака после введения в организм (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592). Кроме того, Fc-области антител вызывают фармакологический эффект антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Glycoconj. J.; 2013; 30: 227-236; and Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13: 609-614). Кроме того, антитела метаболизируются в печени и поэтому сильно накапливаются в печени, независимо от цели. Однако трудно обнаружить поражения печени метастазами колоректального рака с помощью антител, поскольку ранние метастазы колоректального рака локализуются в печени (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87: 586-592).

[0004] С другой стороны, фрагменты низкомолекулярных рекомбинантных антител, такие как Fab, легко достигают очагов поражения из-за их высокого проникновения в ткань, и можно ожидать получение по низкой цене с использованием экспрессионной системы в E. coli или дрожжах. Ожидается использование низкомолекулярных фрагментов рекомбинантных антител в качестве диагностического препарата из-за их короткого периода полураспада в крови и особенности почечной экскреции (Nat. Biotechnol.; 2005; 23: 1126-1136).

[0005] При таких обстоятельствах были проведены исследования по использованию конъюгатов Fab-фрагментов, в которых скоординирован радиоизотоп металла, а Fab-фрагменты связаны с флуоресцентным красителем, с целью диагностики рака.

[0006] До настоящего времени было проведено множество исследований способов стабильной консервации антител. Например, в Патентной литературе 2 раскрыт способ, в котором неионогенное поверхностно-активное вещество и сахарид добавляют к составу, содержащему гуманизированный Fab-фрагмент C4C1, и pH доводят до определенного диапазона для достижения стабилизации. Кроме того, в Патентной литературе 3 описан способ, в котором буферный агент добавляют к составу, содержащему человеческое антитело к IL-1β, и pH доводят до определенного диапазона для достижения стабилизации.

СПИСОК ЦИТИРОВАНИЯ

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

[0007]

ПТЛ 1: Японский перевод публикации международной заявки РСТ № 2013-510093

ПТЛ 2: Международная публикация № WO 00/66160

ПТЛ 3: Японский перевод публикации международной заявки РСТ № 2012-511540

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

[0008] Моновалентные Fab-фрагменты имеют молекулярную массу приблизительно 50 кДа, что меньше, чем у (приблизительно 150 кДа) антител, подвергаются почечной экскреции, а также имеют короткий период полураспада в крови. У них отсутствует область Fc, и поэтому они не вызывают ни ADCC, ни CDC. Исходя из этих особенностей, ожидается, что Fab-фрагменты, в которых скоординирван радиоизотоп металла, или Fab-фрагменты, связанные с флуоресцентным красителем, будут более эффективными в качестве диагностических препаратов по сравнению с антителами.

[0009] Однако Fab-фрагменты, связанные с лигандом или флуоресцентным красителем, имеют проблему, заключающуюся в том, что мультимеры или нерастворимые невидимые частицы легко образуются из-за теплового стресса или стресса вследствие воздействия светового излучения во время консервации, и проблему, заключающуюся в том, что нерастворимые невидимые частицы образуются в процессе размораживания и перемешивания перед использованием. Добавление различных соединений в консервирующий раствор для стабилизации может вызвать проблемы с эффективностью координации и ослаблением окраски флуоресценции.

[0010] Целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, которая позволяет подавить образование мультимеров или нерастворимых невидимых частиц во время хранения и т.п. Другой целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, которая позволяет подавить снижение эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду, когда лиганд используется в качестве маркирующего фрагмента. Еще одним объектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, которая позволяет подавить ослабление окраски флуоресцентного красителя, когда флуоресцентный краситель используется в качестве маркирующего фрагмента.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

[0011] Авторы настоящего изобретения провели значительные тщательные исследования состава фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, и, следовательно, обнаружили, что при добавлении лимонной кислоты, фосфорной кислоты, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты или трисгидроксиметиламинометана в качестве буферного агента, добавлении сахарозы или глицерина в качестве стабилизатора и при дополнительном добавлении неионогенного поверхностно-активного вещества для получения фармацевтической композиции, имеющей pH от 6,5 до 7,5, образование мультимеров или нерастворимых невидимых частицы в процессе консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела может быть подавлено, и снижение эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабление окраски флуоресцентного красителя могут быть подавлены. Таким образом настоящее изобретение было осуществлено.

[0012] В частности, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, который обладает превосходной стабильностью при консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела и делает возможным подавление снижения координационной эффективности металла по отношению к маркирующему фрагменту и ослабления окраски маркирующего флуоресцентного красителя. В одном варианте осуществления настоящее изобретение может быть следующим.

[0013] [1] Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, буферный агент, стабилизатор и неионогенное поверхностно-активное вещество и имеющая pH от 6,5 до 7,5,

причем буферный агент включает лимонную кислоту, фосфорную кислоту, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту или трисгидроксиметиламинометан,

стабилизатор включает сахарозу или глицерин.

[2] Фармацевтическая композиция по [1], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 до 112 в SEQ ID NO: 4; и

(b) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4, и

маркирующий фрагмент представляет собой группу, представленную следующей формулой (I):

[Химическая формула 1]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, где Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте антитела против CEACAM5 человека.

[3] Фармацевтическая композиция по [2], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и

(b) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[4] Фармацевтическая композиция по [1], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16; и

(b) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, и

[Химическая формула 2]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, где Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте антитела против MUC1 человека.

[5] Фармацевтическая композиция по [4], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10; и

(b) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[6] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[5], в которой неионогенное поверхностно-активное вещество включает полисорбат 80.

[7] Фармацевтическая композиция по любому из [2]-[6], в которой конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела дополнительно содержит ⁸⁹Zr.

[8] Фармацевтическая композиция по [7] для применения в диагностике колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака.

[9] Фармацевтическая композиция по [7] для применения в диагностике рака молочной железы или рака, возникшего в результате метастазирования рака молочной железы.

[10] Фармацевтическая композиция по [1], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

маркирующий фрагмент представляет собой группу, представленную следующей формулой (II):

[Химическая формула 3]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, где Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека связан с атомом углерода концевой C(=O)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте антитела против MUC1 человека.

[11] Фармацевтическая композиция по [10], в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[12] Фармацевтическая композиция по [10] или [11], в которой неионогенное поверхностно-активное вещество включает полисорбат 80.

[13] Фармацевтическая композиция по любому из пунктов [10]-[12] для применения в диагностике рака молочной железы или рака, возникшего в результате метастазирования рака молочной железы.

[14] Фармацевтическая композиция по [13], которая представляет собой интраоперационный диагностический препарат.

[15] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[14], в которой концентрация буферного агента составляет от 10 до 30 ммоль/л.

[16] Фармацевтическая композиция по любому из пунктов [1]-[15], в которой концентрация стабилизатора составляет от 5 до 30 масс./об.%.

[17] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[16], в которой концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,02 до 0,2 масс./об.%.

[18] Фармацевтическая композиция по любому из [1]-[17], которая представляет собой жидкий состав, замороженный состав или лиофилизированный состав.

[19] Способ получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, включающий стадии:

(a) получения и добавления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела;

(b) добавления лимонной кислоты, фосфорной кислоты, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты или трисгидроксиметиламинометана в качестве буферного агента;

(c) добавления сахарозы или глицерина в качестве стабилизатора;

(d) добавления неионогенного поверхностно-активного вещества; и

(e) доведения pH до 6,5-7,5.

[20] Способ стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, включающий стадии:

(a) добавления лимонной кислоты, фосфорной кислоты, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты или трисгидроксиметиламинометана в качестве буферного агента к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела;

(b) добавления сахарозы или глицерина в качестве стабилизатора к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела;

(c) добавления неионогенного поверхностно-активного вещества к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; и

(d) доведения pH раствора, содержащего конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, до 6,5-7,5.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ

[0014] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению полезна с точки зрения стабильности при хранении, транспортировке и применении, поскольку она обеспечивает подавление образования мультимеров или нерастворимых невидимых частиц во время консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела и позволяет подавить снижение эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабление окраски флуоресцентного красителя. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также полезна с точки зрения безопасности при введении человеку, поскольку фармацевтически приемлемые буферные агенты и лекарственные добавки используются с точки зрения безопасности.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0015] Далее настоящее изобретение будет описано подробно. Однако настоящее изобретение этим не ограничивается. Научные термины и технические термины, используемые в отношении настоящего изобретения, имеют значения, обычно понятные специалистам в данной области техники, если в данном документе не указано иное.

[0016] 1. Фармацевтическая композиция

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, буферный агент, стабилизатор и неионогенное поверхностно-активное вещество и имеющей pH от 6,5 до 7,5, причем буферный агент включает лимонную кислоту, фосфорную кислоту, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту или трисгидроксиметиламинометан, стабилизатор включает сахарозу или глицерин. Фармацевтическая композиция обеспечивает подавление образования мультимеров или нерастворимых невидимых частиц во время консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела и позволяет подавить снижение эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабление окраски флуоресцентного красителя. Таким образом, для фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно подавить агрегацию и т.д. во время хранения, транспортировки и применения конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела.

[0017] 1-1. Fab-фрагмент античеловеческого антитела

Основная структура молекулы антитела является общей для всех классов и состоит из тяжелых цепей с молекулярной массой от 50000 до 70000 и легких цепей с молекулярной массой от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот, имеет структуру, характерную для каждого класса, и называется γ-, μ-, α-, δ- и ε-цепями, соответствующими IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. IgG дополнительно имеет IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые называются γ1, γ2, γ3 и γ4 соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 220 аминокислот, и известна как два типа, L- и K-типы, которые называются λ- и κ-цепями соответственно. Что касается пептидной конфигурации основной структуры молекулы антитела, две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидными связями (S-S-связями) и нековалентными связями с образованием молекулярной массы от 150000 до 190000. Две легкие цепи могут образовывать пару с любой из тяжелых цепей. Индивидуальная молекула антитела постоянно состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.

[0018] Четыре (или пять для μ- и ε-цепей) и две внутрицепочечные S-S-связи присутствуют в тяжелой цепи и легкой цепи соответственно, и каждая составляет одну петлю на 100-110 аминокислотных остатков. Эта конформация аналогична у петель и называется структурной единицей или доменом. Как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи домен, расположенный на N-концевой стороне, не имеет постоянной аминокислотной последовательности даже у препаратов из одних и тех же классов (подклассов) животных одного вида, и поэтому называется вариабельной областью. Соответствующие домены называются вариабельной областью тяжелой цепи (домен V_Т) и вариабельной областью легкой цепи (домен V_Л). Аминокислотная последовательность на C-концевой стороне от него почти постоянна для класса или подкласса и называется константной областью. Соответствующие домены представлены C_Т1, C_Т2, C_Т3 и C_Л.

[0019] Специфичность связывания антитела с антигеном зависит от аминокислотной последовательности фрагмента, состоящего из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с комплементами или различными клетками, отражает разницу в структуре между константными областями Ig соответствующих классов. Известно, что вариабельность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи существенно ограничивается тремя небольшими гипервариабельными участками, присутствующими в обеих цепях. Эти области называются областями, определяющими комплементарность (CDR; CDR1, CDR2 и CDR3 по порядку от N-концевой стороны). Остальные части вариабельной области называются каркасными областями (FR) и являются относительно постоянными.

[0020] Область между доменом C_Т1 и доменом C_Т2 константной области тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью. Эта область богата остатками пролина и содержит множество межцепочечных S-S-связей, которые соединяют две тяжелые цепи. Например, шарнирные области человеческих IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 содержат 2, 4, 11 и 2 остатка цистеина, соответственно, которые образуют S-S-связи между тяжелыми цепями. Шарнирная область представляет собой область, очень чувствительную к протеолитическим ферментам, таким как папаин или пепсин. В случае переваривания антитела папаином тяжелые цепи отщепляются на N-концевой стороне S-S-связей между тяжелыми цепями шарнирной области и, таким образом, распадаются на два Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего вариабельную область тяжелой цепи, домен C_Т1 и часть шарнирной области. Fab-фрагмент содержит вариабельные области и обладает антиген-связывающей активностью.

[0021] Определенный вариант осуществления Fab-фрагмента античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека. Определенный вариант осуществления Fab-фрагмента античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека.

[0022] 1-1-1. Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека

CEACAM5 (молекула 5 адгезии клеток, связанных с карциноэмбриональным антигеном) является одним из онкомаркеров и редко экспрессируется в нормальных тканях, но экспрессируется в желудочно-кишечном тракте плода или при колоректальном раке (BBA; 1990; 1032: 177-189; и Mol. Pathol.; 1999; 52: 174-178). Известно, что CEACAM5 также экспрессируется при раке молочной железы и тому подобном (Diagn. Cytopathol.; 1993; 9: 377-382; Cancer Res.; 1990; 50: 6987-6994; Histopathology; 2000; 37: 530-535). Концентрация CEACAM5 в крови выше у пациентов с колоректальным раком, чем у здоровых людей (J. Exp. Med.; 1965; 121: 439-462), и CEACAM5 используется в качестве онкомаркера. Согласно гистологическим исследованиям пациентов с колоректальным раком, CEACAM5 высоко экспрессируется в 90% или более тканей (British J. Cancer; 2013; 108: 662-667).

[0023] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает Fab-фрагмент, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4.

[0024] Любая константная область Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 и т.д. может быть выбрана в качестве константной области тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащаяся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой константную область Ig1 человека.

[0025] Любая константная область Igλ или Igκ может быть выбрана в качестве константной области легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащаяся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой константную область человеческой Igκ.

[0026] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой следующий Fab-фрагмент:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[0027] Известно, что в случае экспрессии антитела, содержащего Fab-фрагмент, в клетках, это антитело подвергается посттрансляционной модификации. Примеры посттрансляционной модификации включают расщепление C-концевого лизина тяжелой цепи карбоксипептидазой, модификацию N-концевого глутамина или глутаминовой кислоты тяжелой и легкой цепей в пироглутаминовую кислоту посредством пироглутамилирования, гликозилирования, окисления, дезамидирования и гликирования. Известно, что такая посттрансляционная модификация встречается в различных антителах (J. Pharm. Sci., 2008; 97: 2426-2447).

[0028] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, также может включать Fab-фрагмент, полученный в результате посттрансляционной модификации. Примеры Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, который может быть результатом посттрансляционной модификации, включают Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий пироглутамилированную на N-конце тяжелую цепь. В данной области техники известно, что такая посттрансляционная модификация N-концевым пироглутамилированием не оказывает заметного влияния на активность антитела (Anal. Biochem., 2006; 348: 24-39).

[0029] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4.

[0030] В другом варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[0031] Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также включает Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 31 по 35 в SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 50 по 66 в SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 99 по 110 в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 24 по 38 в SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 54 по 60 в SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 93 по 101 в SEQ ID NO: 4.

[0032] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, связывается с CEACAM5 человека. Способ измерения связывающей активности полученного Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека с CEACAM5 человека включает такие методы, как анализ поверхностным плазмонным резонансом (SPR) и ELISA. В случае использования, например, анализа посредством SPR, константа скорости ассоциации (ka), константа скорости диссоциации (kd) и константа диссоциации (K_D) могут быть измерены с помощью Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corp.), набора для иммобилизации Biotin CAPture Kit (GE Healthcare Japan Corp.) и биотинилированного CEACAM5 человека на сенсорном чипе и добавления к нему серийно разведенного Fab-фрагмента.

[0033] Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть легко получен специалистами в данной области техники с использованием способа, известного в данной области техники, на основе информации о последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, раскрытой в настоящем документе. Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть получен в соответствии со способом, но не ограничиваясь им конкретно, описанным, например, в <4-4. Способе получения Fab-фрагмента античеловеческого антитела>, упомянутом позже.

[0034] 1-1-2. Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека

Муцин 1 (MUC1) представляет собой связанный с мембраной гликопротеин, который экспрессируется на стороне просвета эпителиальных клеток, составляющих эпителиальные ткани молочной железы, трахеи, желудочно-кишечного тракта и т.д. (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4 (1): 45-60). MUC1 сверхэкспрессируется в раковых клетках рака молочной железы и колоректального рака (Mod. Pathol.; 2005 Oct; 18 (10): 1295-1304, Int. J. Oncol.; 2000 Jan; 16 (1): 55-64). MUC1 полезен в качестве молекулы-мишени для обнаружения очага рака (Nat. Rev. Cancer; 2004 Jan; 4 (1): 45-60; и Pathol. Res. Pract.; 2010 Aug 15; 206 (8): 585-9).

[0035] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0036] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0037] Любая константная область Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 и т.д. может быть выбрана в качестве константной области тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой константную область человеческой Igγ1.

[0038] Любая константная область Igλ или Igκ может быть выбрана в качестве константной области легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой константную область человеческой Igκ.

[0039] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой следующий Fab-фрагмент:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0040] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0041] Известно, что в случае экспрессии антитела, содержащего Fab-фрагмент, в клетках, это антитело подвергается посттрансляционной модификации, как описано выше. Таким образом, Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, также может включать Fab-фрагмент, полученный в результате посттрансляционной модификации. Примеры Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, полученного в результате посттрансляционной модификации, включают Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий пироглутамилированную на N-конце тяжелую цепь. В данной области техники известно, что такая посттрансляционная модификация N-концевым пироглутамилированием не влияет на активность антитела, как описано выше.

[0042] В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0043] В определенном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 14 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0044] В альтернативном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0045] В определенном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела против MUC1, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, имеющий следующую особенность:

Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 8 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0046] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, связывается со специфичным для рака MUC1 человека. Способ измерения связывающей активности полученного Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека со специфичным для рака MUC1 человека включает такие методы, как ELISA и FACS. В случае использования, например, ELISA, раковые MUC1-положительные клетки человека (например, клетки T-47D) иммобилизуют на планшете для ELISA, к которым затем добавляют Fab-фрагмент, и он вступает в реакцию, а затем антитело против Igκ или подобное, меченное пероксидазой хрена или т.п., и оно вступает в реакцию. Затем связывание вторичного антитела идентифицируют путем измерения активности с использованием реагента для определения его активности (например, хемилюминесцентный субстрат пероксидазы хрена для метки пероксидазы хрена) или тому подобное.

[0047] Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть легко получен специалистами в данной области техники с использованием способа, известного в данной области техники, на основе информации о последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, раскрытой в настоящем документе. Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть получен в соответствии со способом, но не ограничиваясь им конкретно, описанным, например, в <4-4. Способе получения Fab-фрагмента античеловеческого антитела>, упомянутом позже.

[0048] 1-2. Маркирующий фрагмент

1-2-1. Маркирующий фрагмент, содержащий лиганд

В определенном варианте осуществления конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором маркирующая составляющая представляет собой лиганд и линкер. В настоящем описании "лиганд" представляет собой фрагмент, способный образовывать хелатный комплекс с металлом в конъюгате, и означает группу, образованную хелатирующим агентом. "Составная группа" представляет собой группу, имеющую связь путем удаления протона из хелатирующего агента. "Хелатирующий агент" представляет собой соединение, которое может образовывать координационную связь с металлом.

[0049] В определенном варианте осуществления примеры хелатирующего агента, составляющего лиганд, включают сидерофор и не сидерофор, когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой лиганд и линкер. Примеры определенного варианта осуществления включают MAG3 (меркаптоацетил-глицил-глицил-глицин, CAS №: 66516-09-4) и его известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофоров включают тип гидроксамовой кислоты, катехиновый тип и тип смешанного лиганда. Примеры сидерофоров типа гидроксамовой кислоты включают феррихром, дефероксамин (DFO), представленный следующей формулой:

[Химическая формула 4]

фузарин C, орнибактин, родоторуловую кислоту и их известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофоров катехинового типа включают энтеробактин, бациллибактин, вибриобактин и их известные реакционноспособные производные. Примеры сидерофоров типа смешанного лиганда включают азотобактин, пиовердин, иерсиниабактин и их известные реакционноспособные производные. В случае сидерофоров DFO может реагировать через его реактивную функциональную группу -NH₂ с линкером или фрагментом Fab, и сидерофор, отличный от DFO, также может реагировать через его реакционноспособную функциональную группу, такую как карбоксильная группа, гидроксильная группа или аминогруппа, с линкером или фрагментом Fab способом, обычно применяемым специалистами в данной области техники.

[0050] Примеры не сидерофоров включают DTPA (диэтилентриаминпентауксусную кислоту, CAS №: 67-43-6), DTPA-BMA (1,7-бис(метилкарбамоилметил)-1,4,7-триазагептан-1,4,7-триуксусную кислоту, CAS №: 119895-95-3), EOB-DTPA (этоксибензил-DTPA, 2-[[(2S)-2-[бис(карбоксиметил)амино]-3-(4-этоксифенил)пропил]]-[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]амино]уксусную кислоту), TTHA (триэтилентетрамингексауксусную кислоту, CAS №: 869-52-3), DO3A (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусную кислоту, CAS №: 217973-03-0), HP-DO3A (10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусную кислоту, CAS №: 120041-08-9), DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту, CAS №: 60239-18-1) и их известные реакционноспособные производные.

[0051] Когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой лиганд и линкер, "хелатирующий агент", составляющий лиганд, предпочтительно представляет собой DFO.

[0052] "Линкер" представляет собой группу, которая создает расстояние между Fab-фрагментом античеловеческого антитела и лигандом. В определенном варианте осуществления, когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтическом композиции по настоящему изобретению, представляет собой лиганд и линкер, примеры линкера, который создает расстояние между Fab-фрагментом античеловеческого антитела и лигандом, включают следующую формулу:

[Химическая формула 5]

(в дальнейшем обозначается как -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-), -CH₂-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- и -C(=O)-(C_1-20 алкилен)-C(=O)-. В данном контексте "C_1-20 алкилен" представляет собой линейный или разветвленный алкилен, содержащий от 1 до 20 атомов углерода. Определенный вариант осуществления C_1-20 алкилена представляет собой C_1-10 алкилен или C_1-2 алкилен. Определенный вариант осуществления C_1-20 алкилена представляет собой этилен. Примеры реагента, который можно использовать для образования линкера, включают HO-C(=O)-(C_1-20 алкилен)-C(=O)-OH, янтарную кислоту и п-фенилендиизотиоцианат.

[0053] Когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой лиганд и линкер, "линкер" предпочтительно представляет собой -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.

[0054] Когда маркирующий фрагмент представляет собой лиганд и линкер, конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть получен путем взаимодействия хелатирующего агента, образующего лиганд, с веществом, полученным в результате реакции Fab-фрагмента античеловеческого антитела с линкером. Конъюгат также может быть получен путем взаимодействия Fab-фрагмента античеловеческого антитела с веществом, полученным в результате реакции линкера с хелатирующим агентом, образующим лиганд. В качестве примера реакции вещество, полученное в результате реакции аминогруппы хелатирующего агента с линкером, реагирует с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой боковой цепи лизина) Fab-фрагмента античеловеческого антитела. Когда маркирующий фрагмент представляет собой лиганд, он может быть получен путем взаимодействия хелатирующего агента, образующего лиганд, с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В качестве примера реакции хелатирующий агент взаимодействует с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой боковой цепи лизина) Fab-фрагмента античеловеческого антитела. Реакция синтеза тиомочевины путем добавления изотиоцианата к амину, реакция синтеза амида путем добавления карбоновой кислоты к амину и т.п. может быть использована в получении конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Реакцию можно проводить с применением способа, известного специалистам в данной области техники. Соединение лиганда, связанного с линкером заранее, можно использовать в качестве исходного вещества. Примеры соединения лиганда, связанного с линкером, включают п-SCN-Bn-DFO (DFO, замещенный п-изотиоцианофениламинотиокарбонильной группой, CAS №: 1222468-90-7), представленный следующей формулой:

[Химическая формула 6]

,

DTPA, замещенный п-изотиоцианобензильной группой (п-SCN-Bn-DTPA, CAS №: 102650-30-6), DOTA, замещенный п-изотиоцианобензильной группой (п-SCN-Bn-DOTA, CAS №: 127985-74-4) и п-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA ([(R)-2-амино-3-(4-изотиоцианатофенил)пропил]-транс-(S,S)-циклогексан-1,2-диамин-пентауксусную кислоту, CAS №: 157380-45-5).

[0055] В определенном варианте осуществления, конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором маркирующий фрагмент представляет собой лиганд и линкер, представленные следующей формулой (I):

[Химическая формула 7]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, где Fab-фрагмент античеловеческого антитела связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте античеловеческого антитела.

[0056] Как описано выше, когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой лиганд и линкер, хелатирующий агент, составляющий лиганд, может образовывать хелатирующий комплекс с радиоизотопом металла. В настоящем описании радиоизотоп металла представляет собой, например, тот, который используется для следовой ПЭТ-визуализации и т.д., и его примеры включают ⁸⁹Zr, ⁵¹Mn, ⁵²Fe, ⁶⁰Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ^99mTc и ¹¹¹In. ⁸⁹Zr является предпочтительным. То есть конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может не содержать радиоизотопа металла или может содержать ⁸⁹Zr в качестве радиоизотопа металла.

[0057] Что касается формы, в которой предоставляется фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, она может быть предоставлена в форме, не содержащей радиоизотоп металла, и быть меченой радиоизотопом металла непосредственно перед использованием, или может быть предоставлена в виде содержащей радиоизотоп металла фармацевтической композиции, применяемой для диагностики. Например, в случае применения радиоизотопа металла с коротким периодом полураспада (например, ⁸⁹Zr (период полураспада: 3,3 дня)), предпочтительно, чтобы композиция была представлена в форме, не содержащей радиоизотоп металла, и была мечена радиоизотопом металла непосредственно перед применением.

[0058] 1-2-2. Маркирующий фрагмент, содержащий флуоресцентный краситель

В определенном варианте осуществления, когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой флуоресцентный краситель, краситель, имеющий максимум поглощения и максимум излучения в ближней инфракрасной области спектра (650-1000 нм), обычно применяемый в фотолитографии, можно использовать в качестве флуоресцентного красителя. Примеры определенного варианта флуоресцентного красителя включают соединения цианина и индоцианина. Примеры определенного варианта осуществления включают IRDye800CW (LI-COR, Inc.), Cy (Molecular Probes, Inc.), Alexa Fluor, BODIPY и DyLight (Thermo Fisher Scientific Inc.), CF790 (Biotium, Inc.), DY (Dyomics GmbH), HiLyte Fluor 680 и HiLyte Fluor 750 (AnaSpec Inc.) и PULSAR650 и QUASAR670 (LGC Biosearch Technologies).

[0059] Когда маркирующий фрагмент конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой флуоресцентный краситель, флуоресцентный краситель предпочтительно представляет собой IRDye800CW (LI-COR Biosciences), представленный следующей формулой:

[Химическая формула 8]

Флуоресцентный краситель может вступать в реакцию через его карбоксильную группу, гидроксигруппу, аминогруппу и т.п. или через активную группу, введенную способом, обычно используемым специалистами в данной области техники, с Fab-фрагментом античеловеческого антитела или линкером, связанным с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. Определенный вариант осуществления флуоресцентного красителя, имеющего введенную активную группу, представляет собой флуоресцентный краситель, этерифицированный N-гидроксисукцинимидной (NHS) группой. Например, NHS-сложные эфиры IRDye800CW являются коммерчески доступными, и их можно использовать.

[0060] В определенном варианте осуществления, конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором маркирующий фрагмент представляет собой флуоресцентный краситель, представленный следующей формулой (II):

[Химическая формула 9]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, где Fab-фрагмент античеловеческого антитела связан с атомом углерода концевой C(=O)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте античеловеческого антитела.

[0061] В конъюгате маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащемся в фармацевтической композиции, связывание Fab-фрагмента античеловеческого антитела с маркирующим фрагментом может быть соответствующим образом выполнено специалистами в данной области техники с применением известного подхода. Например, маркирующий фрагмент может быть связан с одной или более аминогруппами (например, N-концевой аминогруппой и аминогруппой в боковой цепи аминокислоты), одной или более тиольными группами (например, тиольной группой в боковой цепи аминокислоты) или одной или более карбоксильными группами (например, карбоксильными группами на С-конце и в боковой цепи аминокислоты) Fab-фрагмента античеловеческого антитела. Определенный вариант осуществления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором маркирующий фрагмент связан с одной или более аминогруппами Fab-фрагмента античеловеческого антитела.

[0062] 1-3. Конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. Определенный вариант осуществления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, в котором Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[Химическая формула 10]

[0063] Определенный вариант осуществления Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в конъюгате маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[0064] Определенный вариант осуществления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, в котором Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(b) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, полученную из вариабельной области тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, посредством модификация глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, и

[Химическая формула 11]

[0065] Определенный вариант осуществления Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[0066] Определенный вариант осуществления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, в котором Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[Химическая формула 12]

[0067] Определенный вариант осуществления Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в конъюгате маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, представляет собой один или более, выбранных из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

[0068] Конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, в котором один или более маркирующих фрагментов связаны с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека. Определенный вариант осуществления конъюгата Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-25 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-23 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-16 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-11 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-10 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 1-9 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-23 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-16 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-10 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 4-9 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-23 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-16 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-10 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный с 3-9 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, связанный по меньшей мере с одним маркирующим фрагментом, дополнительно содержащим металл.

[0069] Конъюгат, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, представляет собой конъюгат, содержащий один или более маркирующих фрагментов и Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-27 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-23 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-15 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-11 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-9 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-7 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-5 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный с 1-4 маркирующими фрагментами. Определенный вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, связанный по меньшей мере с одним маркирующим фрагментом, дополнительно содержащим металл.

[0070] Конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает его свободные формы и соли, если не указано иное. В данном контексте "его соль" представляет собой соль, которая может быть образована соединением или конъюгатом, который может образовывать кислотно-аддитивную соль или соль с основанием, в зависимости от типа заместителя в конъюгате. Их конкретные примеры включают: кислотно-аддитивные соли с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота, или с органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота, лимонная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; соли с неорганическими основаниями, такими как натрий, калий, магний, кальций и алюминий, или органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин и орнитин; соли с различными аминокислотами и производными аминокислот, такими как ацетиллейцин; и аммониевые соли. Например, DFO существует в виде метансульфоната дефероксамина или существует в виде других солей.

[0071] Концентрация конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела в фармацевтической композиции по настоящему изобретению особо не ограничивается, если это концентрация, позволяющая проявить диагностически или терапевтически эффективное действие, и концентрация составляет предпочтительно от 1 до 100 мг/мл, более предпочтительно от 5 до 20 мг/мл.

[0072] 1-4. Буферный агент

В качестве буферного агента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно использовать лимонную кислоту, фосфорную кислоту, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту или трисгидроксиметиламинометан с точки зрения поддержания pH в диапазоне, как описано ниже, для подавления воздействий на эффективность координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду. Концентрация буферного агента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению различается в зависимости от типа буферного агента и целевого pH и предпочтительно составляет от 10 до 30 ммоль/л.

[0073] Определенным вариантом осуществления буферного агента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является лимонная кислота, и ее концентрация составляет от 10 до 30 ммоль/л, предпочтительно от 15 до 25 ммоль/л. Определенным вариантом осуществления буферного агента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является фосфорная кислота, и ее концентрация составляет от 10 до 30 ммоль/л, предпочтительно от 15 до 25 ммоль/л.

[0074] 1-5. Стабилизатор

В качестве стабилизатора в фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно использовать сахарозу или глицерин с точки зрения подавления образования мультимеров, кислотных заряженных вариантов или нерастворимых невидимых частиц из-за теплового стресса, стресса вследствие воздействия светового излучения, стресса при встряхивании или тому подобного во время консервирования, а также подавления снижения эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабления окраски флуоресцентного красителя. Концентрация стабилизатора в фармацевтической композиции по настоящему изобретению различается в зависимости от типа используемого стабилизатора и предпочтительно составляет от 5 до 30% масс./об.

[0075] Определенным вариантом осуществления стабилизатора в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является сахароза, и ее концентрация составляет от 5 до 30% масс./об., предпочтительно от 15 до 25% масс./об. Определенным вариантом осуществления буферного агента в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является глицерин, и его концентрация составляет от 5 до 30% масс./об., предпочтительно от 15 до 25% масс./об.

[0076] 1-6. Неионогенное поверхностно-активное вещество

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть использовано неионогенное поверхностно-активное вещество. В качестве неионогенного поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно использовать полисорбат 80, полисорбат 20, полисорбат 60 или полоксамер 188 с точки зрения подавления образования нерастворимых невидимых частиц, а также подавления снижения эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабления окраски флуоресцентного красителя. Полисорбат 80, который также называют сложным эфиром полиоксиэтилен(20)сорбитана и олеиновой кислоты, представляет собой простой полиоксиэтиленовый эфир безводного сорбита, имеющий несколько гидроксильных групп, этерифицированных с олеиновой кислотой, и имеет структуру, в которой около 20 моль этиленоксидных групп являются эфирно-связанными с 1 молем моноолеата сорбитана. Концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции по настоящему изобретению различается в зависимости от его типа и предпочтительно составляет от 0,02 до 0,2% масс./об.

[0077] Определенным вариантом осуществления неионогенного поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции по настоящему изобретению является полисорбат 80, и его концентрация составляет от 0,02 до 0,2% масс./об., предпочтительно от 0,04 до 0,1% масс./об.

[0078] 1-7. pH

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению pH составляет от 6,5 до 7,5, более предпочтительно от 6,5 до 7,0, с точки зрения подавления образования мультимеров, кислотных заряженных вариантов или нерастворимых невидимых частиц из-за теплового стресса, стресса вследствие воздействия светового излучения, стресса при встряхивании или тому подобного во время консервирования, а также подавления снижения эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабления окраски флуоресцентного красителя.

[0079] Предпочтительная форма фармацевтической композиции по настоящему изобретению содержит конъюгат Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека или Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, упомянутые выше, в концентрации от 5 до 20 мг/мл в качестве конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, лимонную кислоту в количестве от 15 до 25 ммоль/л в качестве буферного агента, сахарозу в количестве от 15 до 25% масс./об. в качестве стабилизатора и полисорбат 80 в концентрации 0,04-0,1% масс./об. в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества и имеет pH от 6,5 до 7,0.

[0080] 1-8. Фармацевтическая композиция для применения в диагностике

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в диагностике, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. Когда конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержит лиганд в качестве маркирующего фрагмента, координация радиоизотопа металла (например, ⁸⁹Zr) делает конъюгат детектируемым. Когда конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержит флуоресцентный краситель в качестве маркирующего фрагмента, конъюгат является детектируемым конъюгатом. Эти поддающиеся обнаружению конъюгаты можно использовать в качестве препарата для ранней диагностики, препарата для определения стадии заболевания или препарата для интраоперационной диагностики (особенно для диагностики рака). Препарат для интраоперационной диагностики означает диагностический препарат, способный идентифицировать распространенность поражения и исследовать его свойства во время операции, такой как хирургическая операция или эндоскопическая операция. Когда фармацевтическую композицию для применения в диагностике согласно настоящему изобретению применяют в качестве препарата для интраоперационной диагностики, фармацевтическую композицию для применения в диагностике вводят пациенту, например, за 2-32 часа до операции, определенный вариант осуществления Фармацевтической композиции вводят пациенту за 6-24 часа до операции, а другую форму фармацевтической композиции вводят пациенту за 2 часа до операции.

[0081] Препарат для ранней диагностики означает диагностический препарат, предназначенный для постановки диагноза, когда состояние не обнаружено или во время ранней стадии болезненного состояния. Например, для раковых заболеваний препарат для ранней диагностики означает диагностический препарат, который используется, когда заболевание не обнаружено или на стадии 0 или стадии 1.

[0082] Препарат для определения стадии заболевания означает диагностический препарат, способный исследовать степень прогрессирования состояния. Например, для рака это диагностический препарат, способный исследовать его стадию.

[0083] Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, ее можно применять для диагностики рака, экспрессирующего CEACAM5 человека. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, определенный вариант ее осуществления предпочтительно применяется для диагностики колоректального рака, рака молочной железы, рака легких, рака щитовидной железы или рака, возникшего в результате их метастазирования и, в частности, применение для диагностики колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака, является предпочтительным. Рак, возникший в результате метастазирования колоректального рака, особо не ограничивается, и его примеры включают метастатический рак печени.

[0084] Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, ее можно применять для диагностики рака, экспрессирующего MUC1 человека. Когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, определенный вариант ее осуществления предпочтительно применяется для диагностики рака молочной железы, рака легких, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рака кожи, рака щитовидной железы, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака почки, рака яичников или рака шейки матки, и, в частности, применение для диагностики рака молочной железы или рака мочевого пузыря является предпочтительным.

[0085] 1-9. Дозированные формы и добавки фармацевтической композиции

Дозированная форма фармацевтической композиции по настоящему изобретению особо не ограничивается, и ее определенный вариант осуществления представляет собой жидкий состав, замороженный состав или лиофилизированный состав. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может применяться, например, в качестве парентерального агента, такого как инъекция или агент для капельной инфузии, и введение предпочтительно осуществляется внутривенной инъекцией, местной внутримышечной инъекцией в мишень, подкожной инъекцией или тому подобным. Доза детектируемого конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела в фармацевтической композиции по настоящему изобретению различается в зависимости от возраста или массы тела пациента, дозированной формы применяемого состава или титра связывания Fab-фрагмента и т.д. Например, приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг, основываясь на массе Fab-фрагмента, может быть использовано на единицу массы тела пациента.

[0086] К фармацевтической композиции по настоящему изобретению медицинские добавки, такие как суспендирующий агент, солюбилизатор, регулятор тоничности, консервант, ингибитор адсорбции, эксципиент, успокаивающее средство, серосодержащий восстановитель и антиоксидант или тому подобное, могут быть добавлены в случае необходимости.

Примеры суспендирующего агента включают метилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гуммиарабик, порошкообразный трагакант, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и монолаурат полиоксиэтиленсорбитана или тому подобное.

Примеры солюбилизатора включают полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло, амид никотиновой кислоты, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана, макрогол и сложный этиловый эфир жирной кислоты касторового масла или тому подобное.

Примеры регулятора тоничности включают хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция или тому подобное.

Примеры консерванта включают метилпараоксибензоат, этилпараоксибензоат, сорбиновую кислоту, фенол, крезол, хлоркрезол и бензиловый спирт или тому подобное.

Примеры ингибитора адсорбции включают сывороточный альбумин человека, лецитин, декстран, сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло и полиэтиленгликоль или тому подобное.

Примеры эксципиента включают ксилит или тому подобное.

Примеры успокаивающего средства включают инозитол, лидокаин или тому подобное.

Примеры серосодержащих восстановителей включают те восстановители, которые имеют сульфгидрильную группу, такие как N-ацетилцистеин, N-ацетилгомоцистеин, тиоктовую кислоту, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерин, тиосорбитол, тиогликолевую кислоту и ее соли, тиосульфат натрия, глутатион и тиоалкановую кислоту, имеющую от 1 до 7 атомов углерода.

Примеры антиоксиданта включают эриторбиновую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферолацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, L-аскорбилпальмитат, L-аскорбилстеарат, гидросульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, триамилгаллат и хелатирующие агенты, такие как динатрий этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), пирофосфат натрия и метафосфат натрия.

[0087] 2. Использование фармацевтической композиции для применения в диагностике и диагностическом способе

Настоящее изобретение относится к применению конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела для получения фармацевтической композиции для применения в ранней диагностике рака, фармацевтической композиции для применения в определении стадии заболевания или фармацевтической композиции для применения в интраоперационной диагностике. В определенном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, для применения в ранней диагностике, определении стадии или интраоперационной диагностике рака.

[0088] Настоящее изобретение также относится к способу диагностики рака, включающему предоперационное или интраоперационное введение субъекту фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В данном контексте "субъектом" является человек или любое другое млекопитающее, нуждающееся в постановке диагноза. Определенный вариант осуществления представляет собой человека, нуждающегося в диагностике. Эффективное количество фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, в способе диагностики различается в зависимости от возраста или массы тела пациента, дозированной формы применяемого состава или титра связывания Fab-фрагмента и т.д. Например, приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг, основываясь на массе Fab-фрагмента, может быть использовано на единицу массы тела пациента. В способе диагностики введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, предпочтительно проводят путем местной внутримышечной инъекции в ткань-мишень, подкожной инъекции или тому подобного. В случае предоперационного введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению в способе диагностики конъюгат вводят пациенту, например, за 2-48 часов до операции, определенный вариант осуществления конъюгата вводят пациенту за 6-24 часа до операции, а другую форму конъюгата вводят пациенту за 2 часа до операции.

[0089] В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела для получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

[0090] 3. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, и способ стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела

В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В частности, в определенном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, включающий стадии (a) получения и добавления конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; (b) добавления лимонной кислоты, фосфорной кислоты, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты или трисгидроксиметиламинометана в качестве буферного агента; (c) добавления сахарозы или глицерина в качестве стабилизатора; (d) добавления полисорбата 80 в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества; и (e) доведения pH до 6,5-7,5. Порядок добавления особо не ограничен.

[0091] В определенном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В настоящем описании термин "стабильная консервация" относится к подавлению образования мультимеров или нерастворимых невидимых частиц во время консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела. В определенном варианте осуществления термин "стабильная консервация" в контексте настоящего описания представляет концепцию, включающую в себя подавление снижения эффективности координации радиоизотопа металла по отношению к лиганду и ослабления окраски флуоресцентного красителя. В частности, в определенном варианте осуществления настоящее изобретение предоставляет способ стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, включающий стадии: (a) добавления лимонной кислоты, фосфорной кислоты, 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновой кислоты или трисгидроксиметиламинометана в качестве буферного агента к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; (b) добавления сахарозы или глицерина в качестве стабилизатора к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; (c) добавления полисорбата 80 в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; и (d) доведения pH раствора, содержащего конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, до 6,5-7,5. Порядок добавления особо не ограничен.

[0092] Для способа получения и способа стабильной консервации структуры Fab-фрагмента античеловеческого антитела и маркирующего фрагмента, структура конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела и тому подобное являются такими как описано в разделе "1. Фармацевтический состав". Диапазоны концентраций, диапазоны pH и тому подобное буферного агента, стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества ялвяются также такими, как описано в разделе "1. Фармацевтическая композиция". Стадии можно выполнять в любом порядке.

[0093] Когда конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела содержит лиганд в качестве маркирующего фрагмента в способе получения и способе, определенный вариант осуществления может включать стадию координации радиоизотопа металла. Тип радиоизотопа металла и тому подобное описаны в разделе "1. Фармацевтическая композиция".

[0094] Кроме того, в способе получения и способе определенный вариант осуществления может включать стадию выполнения замораживания или стадию выполнения лиофилизации. В качестве способа замораживания или способа лиофилизации можно использовать известный способ.

[0095] 4. Способ получения маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела

4-1. Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент античеловеческого антитела

Когда конъюгат, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержит Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, определенный вариант осуществления полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела человека, включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека.

[0096] В определенном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4.

[0097] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность из положений нуклеотидов с 1 по 363 в SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот с 1 до 112 в SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность из положений нуклеотидов с 1 по 336 в SEQ ID NO: 3.

[0098] В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[0099] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3.

[0100] Когда конъюгат, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержит Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, определенный вариант осуществления полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела человека, включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.

[0101] Определенный вариант осуществления полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 14.

[0102] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13.

[0103] В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8.

[0104] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5. Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, включает полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7.

[0105] В определенном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0106] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15.

[0107] В предпочтительном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0108] Примеры полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, включают полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9.

[0109] Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может быть синтезирован с использованием известного в данной области техники способа синтеза генов на основе нуклеотидных последовательностей, созданных исходя из аминокислотных последовательностей фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела против человеческого CEACAM5 или Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека. В качестве таких способов синтеза генов можно использовать различные способы, известные специалистам в данной области техники, такие как способы синтеза гена антитела, описанные в международной публикации № WO 90/07861.

[0110] 4-2. Вектор экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела человека

Вектор экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека в конъюгате, содержащемся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи антитела против CEACAM5 человека Fab-фрагмент, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека.

[0111] Предпочтительный вектор экспрессии включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотными положениями с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4.

[0112] Более предпочтительный вектор экспрессии, кодирующий Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[0113] Вектор экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека в конъюгате, содержащемся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека.

[0114] Предпочтительный вектор экспрессии включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0115] Более предпочтительный вектор экспрессии включает вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0116] Эти векторы экспрессии особо не ограничиваются при условии, что полипептид, кодируемый полинуклеотидом, может продуцироваться в различных клетках-хозяевах прокариотических клеток и/или эукариотических клеток. Примеры таких векторов экспрессии включают плазмидные векторы и вирусные векторы (например, аденовирус и ретровирус) или тому подобное. Предпочтительно могут быть использованы pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza Group AG).

[0117] Эти векторы экспрессии могут содержать промотор, функционально связанный с геном, кодирующим фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь в полинуклеотиде, кодирующем Fab-фрагмент античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии Fab-фрагмента, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в клетке-хозяине включают промотор Trp, промотор lac, промотор recA, промотор λPL, промотор lpp и промотор tac или тому подобные, когда клетка-хозяин представляет собой бактерию рода Escherichia. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH или тому подобные. Примеры промотора для экспрессии в бактериях рода Bacillus включают промотор SL01, промотор SP02 и промотор penP или тому подобные. Его примеры включают промоторы, полученные из вирусов, таких как CMV, RSV и SV40, промотор ретровируса, промотор актина, промотор EF (фактора элонгации) 1α и промотор теплового шока или тому подобные, когда хозяином является эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающего.

[0118] В случае использования бактерии, в частности E.coli, в качестве клетки-хозяина, этот вектор экспрессии может дополнительно содержать стартовый кодон, стоп-кодон, терминаторную область и реплицируемую единицу. С другой стороны, в случае использования дрожжей, животной клетки или клетки насекомого в качестве хозяина, вектор экспрессии, кодирующий Fab-фрагмент античеловеческого антитела, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может содержать стартовый кодон и стоп-кодон. В этом случае энхансерная последовательность, 5'- и 3'-нетранслируемые области гена, кодирующего фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь, содержащиеся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, последовательность сигнала секреции, сплайсинговое соединение, сайт полиаденилирования или реплицируемая единица и т.д. могут содержаться в нем. Кроме того, обычно используемый селективный маркер (например, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину и ген дигидрофолатредуктазы) может содержаться в нем в соответствии с назначением.

[0119] 4-3. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии

Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, включает клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

[0120] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, представляет собой клетку-хозяин, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной положениями аминокислот с 1 по 112 в SEQ ID NO: 4.

[0121] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, представляет собой клетку-хозяин, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4.

[0122] Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, включает клетку-хозяин, трансформированную вектором экспрессии, выбранным из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

[0123] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой клетку-хозяин, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16.

[0124] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, представляет собой клетку-хозяин, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):

(а) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8;

(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10;

(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10; и

(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10.

[0125] Клетка-хозяин, которая должна быть трансформирована, особо не ограничивается при условии, что она совместима с используемым вектором экспрессии и может быть трансформирована вектором экспрессии для экспрессии Fab-фрагмента. Ее примеры включают различные клетки, такие как естественные клетки и искусственно созданные клетки, обычно используемые в области техники настоящего изобретения (например, бактерии (бактерии рода Escherichia и бактерии рода Bacillus), дрожжи (рода Saccharomyces, рода Pichia и т.д.), клетки животных и клетки насекомых (например, Sf9, и т.д.) и линии клеток млекопитающих (например, культивируемые клетки, такие как клетки CHOK1SV, клетки CHO-DG44 и клетки 293 и т.д.)). Сама трансформация может быть проведена известным способом, например, способом с использованием фосфата кальция или способом электропорации.

[0126] 4-4. Способ получения Fab-фрагмента античеловеческого антитела

Способ получения Fab-фрагмента антитела античеловеческого антитела, предпочтительно способ получения Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека или Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента антитела античеловеческого антитела.

[0127] В способе получения Fab-фрагмента антитела античеловеческого антитела трансформированная клетка-хозяин может культивироваться в питательной среде. Питательная среда предпочтительно содержит источник питательных веществ, такой как источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимые для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу или тому подобное. Примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, кукурузный экстракт, пептон, казеин, экстракты мяса, соевую муку и экстракты картофеля или тому подобное. Также в случае необходимости в нем могут содержаться другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин, канамицин и т.д.) и т.д.).

[0128] Культивирование самой трансформированной клетки-хозяина проводят известным способом. Условия культивирования, например, температура, pH среды и время культивирования, выбираются соответствующим образом. Когда хозяин представляет собой, например, клетку животного, в качестве среды можно использовать среду MEM (Science; 1952; 122: 501), среду DMEM (Virology; 1959; 8: 396-97), среду RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199: 519-24), среду 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73:1-8) или тому подобную, содержащую приблизительно от 5 до 20% фетальной бычьей сыворотки. pH среды предпочтительно составляет приблизительно от 6 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 30 до 40°C в течение приблизительно от 15 до 336 часов, при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяин представляет собой клетку насекомого, ее примеры включают среду Грейса (PNAS; 1985; 82: 8404-8) или тому подобную, содержащую фетальную бычью сыворотку. Ее pH предпочтительно составляет приблизительно от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 40°C в течение от 15 до 100 часов, при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание. Когда хозяин представляет собой бактерию, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, например, подходит жидкая среда, содержащая источник питательных веществ, описанный выше. Предпочтительной является среда с pH от 5 до 8. Когда хозяин представляет собой E.coli, предпочтительные примеры среды включают среду LB и среду M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972: 431) или тому подобную. В таком случае культивирование обычно может быть проведено при температуре от 14 до 43°C в течение приблизительно от 3 до 24 часов с аэрацией или перемешиванием, если это необходимо. Когда хозяин представляет собой бактерию рода Bacillus, оно обычно может быть проведено при температуре от 30 до 40°C в течение приблизительно от 16 до 96 часов с аэрацией или перемешиванием, если необходимо. Когда хозяин представляет собой дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Беркхолдера (PNAS; 1980; 77: 4505-8). Желательно, чтобы ее pH составлял от 5 до 8. Культивирование обычно проводят при температуре приблизительно от 20 до 35°C в течение приблизительно от 14 до 144 часов, при необходимости также можно проводить аэрацию или перемешивание.

[0129] Способ получения Fab-фрагмента античеловеческого антитела может включать стадию восстановления, предпочтительно выделения или очистки, экспрессированного Fab-фрагмента античеловеческого антитела, в дополнение к стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела. Примеры метода выделения или очистки включают: методы, использующие растворимость, такие как высаливание и метод осаждения растворителем или тому подобное; методы, использующие разницу в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация и электрофорез в геле додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле или тому подобное; методы, использующие заряд, такие как ионообменная хроматография и хроматография с гидроксилапатитом или тому подобное; методы, использующие специфическую аффинность, такие как аффинная хроматография или тому подобное; методы, использующие различие в гидрофобности, такие как обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с или тому подобное; и методы, использующие различие в изоэлектрической точке, такие как изоэлектрическая фокусировка или тому подобное; или тому подобное.

[0130] 4-5. Способ получения конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела

Способ получения конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента античеловеческого антитела с маркирующим фрагментом. Способ получения конъюгата может также включать следующие стадии: культивирование трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с маркирующим фрагментом. Способ получения конъюгата может также включать следующие стадии: культивирование трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; восстановление экспрессированного Fab-фрагмента; и ковалентное связывание Fab-фрагмента с маркирующим фрагментом. В качестве линкера, лиганда или флуоресцентного красителя и т.д. можно использовать те, что описаны в разделе "1. Фармацевтическая композиция".

[0131] Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; и связывание Fab-фрагмента с лигандом через линкер. Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; восстановления экспрессированного Fab-фрагмента; и связывания Fab-фрагмента с лигандом через линкер.

[0132] Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; и i) связывания Fab-фрагмента через линкер с лигандом или ii) ковалентного связывания Fab-фрагмента непосредственно с лигандом. Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела, восстановления экспрессированного Fab-фрагмента; и i) связывания Fab-фрагмента через линкер с лигандом или ii) ковалентного связывания Fab-фрагмента непосредственно с лигандом.

[0133] Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела; и i) связывания Fab-фрагмента через линкер с флуоресцентным красителем или ii) ковалентного связывания Fab-фрагмента непосредственно с флуоресцентным красителем. Определенный вариант осуществления способа получения конъюгата представляет собой способ, включающий стадии: культивирования трансформированной клетки-хозяина для экспрессии Fab-фрагмента античеловеческого антитела, восстановления экспрессированного Fab-фрагмента; и i) связывания Fab-фрагмента через линкер с флуоресцентным красителем или ii) ковалентного связывания Fab-фрагмента непосредственно с флуоресцентным красителем.

[0134] Настоящее изобретение в целом описано выше. Конкретные примеры будут предоставлены в настоящем описании для сведения, чтобы получить дальнейшее понимание. Однако они даны для иллюстративных целей и не ограничивают настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ

[0135] Эксперимент 1-1: Получение Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека

Антитело, имеющее вариабельные области, которые, как ожидается, не будут уменьшать аффинность даже за счет связывания маркирующего фрагмента, разработали с использованием молекулярной модели гуманизированного антитела, сконструированного в соответствии с литературой (Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics; 2014; 82: 1624-1635) после гуманизации полученного от мыши антитела Т84.66 против CEACAM5 человека со ссылкой на способ, описанный в литературе (Protein Eng. Des. Sel.; 2004; 17: 481-489).

[0136] Ген, кодирующий сигнальную последовательность (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 17), связывали с 5'-стороной гена фрагмента тяжелой цепи (SEQ ID NO: 1) антитела, и этот ген фрагмента тяжелой цепи вставляли в GS-вектор pEE6.4 (Lonza Group AG). Кроме того, ген, кодирующий сигнальную последовательность (MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 18)), связывали с 5'-стороной гена легкой цепи (SEQ ID NO: 3) антитела, и ген легкой цепи вставляли в GS-вектор pEE12.4 (Lonza Group AG). Вышеупомянутые векторы pEE, соответственно содержащие как вставки генов фрагмента тяжелой цепи, так и легкой цепи антитела, расщепляли рестрикционными ферментами NotI и PvuI и лигировали с использованием набора для лигирования TAKARA Ligation Kit Версия 2.1 (Takara Bio Inc.) для конструирования вектора GS, имеющего как вставки генов фрагмента тяжелой цепи, так и легкой цепи.

[0137] Антитело экспрессировали двумя типами методов, транзиентной экспрессией и конститутивной экспрессией, с использованием вышеупомянутого вектора GS, имеющего как вставки генов фрагмента тяжелой цепи, так и легкой цепи. Для транзиентной экспрессии клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), культивированные примерно до получения 3000000 клеток/мл в экспрессионной среде Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), трансфицировали вышеупомянутым GS-вектором, имеющим как вставки генов фрагмента тяжелой цепи, так и легкой цепи, с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) и культивировали в течение 5-7 дней. Культуральный супернатант очищали с использованием KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) с получением Fab-фрагмента. Для конститутивной экспрессии клетки CHOK1SV (Lonza Group AG) трансфицировали линейным вектором, полученным с помощью CHOK1SV из вышеупомянутого GS-вектора, имеющего как вставки генов фрагмента тяжелой цепи, так и легкой цепи, путем электропорации с использованием Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, Inc.). На следующий день после трансфекции к ним добавляли метионинсульфоксимин с последующим культивированием в течение 5-7 дней. Клетки инокулировали в полутвердую среду, содержащую метилцеллюлозу. После образования колонии клетки с высоким уровнем экспрессии Fab-фрагмента получали с использованием ClonePix FL (Molecular Devices, LLC). Культурный супернатант клеток очищали с помощью Capto L (GE Healthcare Japan Corp.), Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corp.) и BioPro S75 (YMC Co., Ltd.) с получением Fab-фрагмента.

[0138] Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи полученного Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека (обозначенного как PB009-1), показана в SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO.: 2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь в PB009-1, показана в SEQ ID NO: 3, а кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 4. Вариабельная область тяжелой цепи в PB009-1 состоит из аминокислотной последовательности из аминокислотных положений с 1 по 121 в SEQ ID NO: 2, а CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей из аминокислотных положений с 31 по 35, с 50 по 66 и с 99 по 110 в SEQ ID NO: 2 соответственно. Вариабельная область легкой цепи в PB009-1 состоит из аминокислотной последовательности из аминокислотных положений с 1 до 112 в SEQ ID NO: 4, а CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей из аминокислотных положений с 24 по 38, с 54 по 60 и с 93 по 101 в SEQ ID NO: 4 соответственно.

[0139] Вариабельные области и последовательности CDR определяли согласно нумерации Kabat (Kabat с соавт., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., Служба здравоохранения США, Национальный институт здравоохранения, Бетесда).

[0140] Эксперимент 1-2: Введение метки в хелатирующй агент Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека

п-SCN-Bn-DFO (DFO, замещенный п-изотиоцианофениламинотиокарбонильной группой) (Macrocyclics, Inc.) использовали для связывания хелатирующего агента DFO с Fab-фрагментом PB009-1 антитела против CEACAM5 человека. 1/5 количества 0,1 М раствора карбоната натрия (pH 9,0) добавляли к раствору Fab-фрагмента, доведенному до 1 мг/мл с помощью фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). К нему добавляли п-SCN-Bn-DFO до конечной концентрации 1 мг/мл и проводили реакцию при 37°C в течение 1,5 часов. После реакции конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, связанный с DFO через линкер ((-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-) (обозначен как PB009-2), очищали с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra 3K объемом 0,5 мл (Merck Millipore).

[0141] Количество лигандов, состоящих из DFO, связанных с PB009-2, подтверждали масс-спектрометрией. PB009-2 обессоливали с использованием микроколонки для обессоливания MassPREP Micro Desalting Column (Waters Corp.), и измерения проводили с использованием масс-спектрометра SYNAPT G2 (Waters Corp.). В результате была подтверждена молекула, в которой по меньшей мере от 3 до 10 лигандов, состоящих из DFO, были связаны с одним PB009-1.

[0142] Эксперимент 1-3: Исследование влияния pH на стабилизацию конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека (влияние на образование мультимеров и образование заряженных аналогов с кислотной группой в боковой цепи)

Для жидкого состава, содержащего PB009-2, оценивали влияние pH на стабилизацию PB009-2. В данном испытании образцы №№ с A-1 по A-6, показанные в таблице 1, получали путем добавления буферного агента и неионогенного поверхностно-активного вещества к жидкой композиции, содержащей PB009-2, таким образом, чтобы конечная концентрация PB009-2 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0143] [Таблица 1]

№ Образца	Буферный агент	pH	Неионогенное поверхностно-активное вещество
A-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	5,0	0,1% масс./об. Полисорбата 80
A-2		6,0
A-3		7,0
A-4	20 ммоль/л Трис (Трис(гидроксиметил)аминометана)	7,0
A-5		7,5
A-6		8,0

[0144] Для оценки стабильности жидкого состава проводили эксперимент на термостабильность для каждого образца в нормально помещенном состоянии. В эксперименте на термостабильность стабильность PB009-2 после хранения при 25°C в течение 1 недели оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ), и количества кислотных заряженных вариантов, измеренного методом визуализации капиллярного изоэлектрического фокусирования (метод icIEF). Условия анализа следующие.

[0145] [Метод эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ)]

При измерении SE-ВЭЖХ G3000SWXL (TOSOH CORPORATION) подключали к системе ВЭЖХ, и подвижную фазу, имеющую в составе фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия в концентрации 400 ммоль/л (pH 7,0), подавали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 50 мкг в пересчете на PB009-2 (например, 10 мкл в случае 5 мг/мл). Температуру колонки устанавливали на 30°C, температуру образца устанавливали на 5°C, и детектирование выполняли в УФ при 280 нм.

[0146] [Метод визуализации капиллярного изоэлектрического фокусирования (метод icIEF)]

При измерении icIEF картридж cIEF (Protein Simple, Inc.) подключали к системе iCE3 и выполняли измерение. 188 мкл матрицы образца, состоящей из мочевины, метилцеллюлозы, Pharmalyte 3-10, pI-маркера 5.12 и pI-маркера 9.77, смешивали с 12 мкл образца, разбавленного до концентрации PB009-2 5 мг/мл сверхчистой водой с получением образца для измерения. Предварительную фокусировку выполняли при 1500В в течение 1 минуты, а фокусировку выполняли при 3000В в течение 6 минут.

[0147] После измерения SE-ВЭЖХ площадь обнаруженных мультимеров измеряли с помощью метода автоматического анализа для определения количества мультимеров (%). Количество мультимеров (%) определяли в процентах (%) путем измерения общей площади пиков мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площадей всех пиков, включая площадь основного пика. Здесь основной пик относится к пику активного основного вещества (PB009-2, который не является мультимеризованным).

[0148] Площадь кислотных заряженных вариантов, обнаруженных методом icIEF, измеряли методом автоматического анализа для определения количества кислотных заряженных вариантов (%). Количество кислотных заряженных вариантов (%) определяется в процентах (%) путем измерения общей площади пиков заряженных аналогов с кислотной группой в боковой цепи, обнаруженных методом icIEF с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площади всех пиков, включая площадь основного пика. Здесь основной пик относится к пику активного основного вещества (PB009-2, который не является вариантами).

[0149] В таблице 2 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ и метода icIEF в данном эксперименте. Результаты показывают, что количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%) после хранения при 25°C в течение 1 недели имело тенденцию к увеличению с понижением pH и становилось минимальным при pH около 7,0. Количество кислотных заряженных вариантов (%) после хранения при 25°C в течение 1 недели имело тенденцию к уменьшению с уменьшением pH. Всесторонняя оценка приведенных выше результатов показала, что оптимальный pH жидкого состава, содержащего PB009-2, составлял около 7,0 с точки зрения стабильности.

[0150] [Таблица 2]

№ Образца	Буферный агент	pH	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)		Количество заряженных аналогов с кислотной группой в боковой цепи в icIEF (%)
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели
A-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	5,0	2,6	12,3	46,2	37,6
A-2		6,0	2,5	6,9	42,0	41,6
A-3		7,0	2,6	5,2	45,2	45,6
A-4	20 ммоль/л Трис	7,0	2,3	4,8	42,8	44,5
A-5		7,5	2,3	5,1	45,4	42,6
A-6		8,0	2,4	5,9	45,0	45,6

[0151] Эксперимент 1-4: Исследование влияний стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека (влияние на образование мультимеров и образование заряженных аналогов с кислотной группой в боковой цепи)

Для жидкого состава, содержащего PB009-2, оценивали влияние различных стабилизаторов или неионогенных поверхностно-активных веществ на стабилизацию PB009-2. В данном эксперименте образцы №№ с B-1 по B-10, показанные в таблице 3, получали путем добавления буферного агента и добавки к жидкой композиции, содержащей PB009-2, таким образом, чтобы конечная концентрация PB009-2 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0152] [Таблица 3]

№ Образца	Буферный агент	pH	Добавка
B-1	20 ммоль/л Трис	7,0	0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-2			140 мМ Аргинина, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-3			140 мМ Гистидина, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-4			140 мМ Аспарагиновой кислоты, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-5			280 мМ Глицина, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-6			280 ммоль/л Сахарозы, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-7			280 ммоль/л Сорбитола, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-8			140 ммоль/л Ацетата натрия, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-9			140 ммоль/л Хлорида натрия, 0,1% масс./об. Полисорбата 80
B-10			20% масс./об. Глицерина, 0,1% масс./об. Полисорбата 80

[0153] Для оценки стабильности жидкого состава проводили испытание на термическую стабильность на каждом образце в нормально помещенном состоянии. В испытании на термическую стабильность оценивали стабильность PB009-2 после хранения при 25°C в течение 1 недели на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ, и количества кислотных заряженных вариантов, измеренного методом icIEF. Экспериментальная процедура метода SE-ВЭЖХ следующая.

[0154] [Метод эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ)]

При измерении SE-ВЭЖХ колонку AdvanceBio SEC 300A (Agilent Technologies) подключали к системе ВЭЖХ, и подвижную фазу, имеющую в составе фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия в концентрации 400 ммоль/л (pH 7,0), подавали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 50 мкг в пересчете на PB009-2 (например, 10 мкл в случае 5 мг/мл). Температуру колонки устанавливали на 30°C, температуру образца устанавливали на 5°C, и детектирование выполняли в УФ при 280 нм.

[0155] После измерения SE-ВЭЖХ площадь обнаруженных мультимеров измеряли с помощью метода автоматического анализа для определения количества мультимеров (%). Количество мультимеров (%) определяли в процентах (%) путем измерения общей площади пиков мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площадей всех пиков, включая площадь основного пика. В данном контексте основной пик относится к пику активного основного вещества (PB009-2, который не является мультимеризованным).

[0156] Условия анализа методом icIEF такие же, как и в эксперименте 1-3.

[0157] В таблице 4 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ и метода icIEF в данном эксперименте. Во-первых, увеличение количества мультимеров в SE-ВЭЖХ (%) после хранения при 25°C в течение 1 недели имело тенденцию к подавлению в образцах, содержащих гистидин, сахарозу и глицерин соответственно. Количество кислотных заряженных вариантов (%) после хранения при 25°C в течение 1 недели увеличивалось в образцах, содержащих гистидин и аспарагиновую кислоту соответственно. Всесторонняя оценка приведенных выше результатов показала, что сахароза или глицерин являются желательными в качестве стабилизатора жидкого состава, содержащего PB009-2, с точки зрения стабильности.

[0158] [Таблица 4]

№ Образца	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)		Количество заряженных аналогов с кислотной группой в боковой цепи в icIEF (%)
№ Образца	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели
B-1	1,4	4,0	44,0	45,7
B-2	1,4	3,6	42,7	46,2
B-3	1,4	3,1	41,4	53,3
B-4	1,3	3,7	48,5	54,9
B-5	1,5	4,0	40,2	44,8
B-6	1,4	3,1	42,1	46,1
B-7	1,4	3,4	44,8	46,1
B-8	1,4	3,4	39,4	46,0
B-9	1,6	4,0	42,7	44,4
B-10	1,2	2,6	40,4	43,0

[0159] Эксперимент 1-5: Исследование действия поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека (влияние на образование нерастворимых невидимых частиц)

В виде жидкого состава, изготовленного с содержанием PB009-2 в концентрации 10 мг/мл и лимонной кислоты в концентрации 20 ммоль/л и с pH 7,0, получали образцы, содержащие полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества в концентрации от 0 до 0,6 масс./об.% (Образцы № с C-1 по C-7: см. таблицу 5). pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0160] [Таблица 5]

№ Образца	Буферный агент	pH	Добавка
C-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	7,0	0% масс./об. Полисорбата 80
C-2			0,02% масс./об. Полисорбата 80
C-3			0,05% масс./об. Полисорбата 80
C-4			0,1% масс./об. Полисорбата 80
C-5			0,2% масс./об. Полисорбата 80
C-6			0,4% масс./об. Полисорбата 80
C-7			0,6% масс./об. Полисорбата 80

[0161] Для каждого образца количество нерастворимых невидимых частиц после встряхивания и после замораживания и размораживания измеряли с использованием метода подсчета количества частиц в режиме светотени. Испытание на встряхивание проводили путем встряхивания образца при 150 об/мин в течение 24 часов. Испытание на замораживание и размораживание проводили путем проведения в общей сложности трех процессов, каждый из которых включал замораживание образца при -80°C в течение 4 часов или более, а затем размораживание образца при 5°C в течение 4 часов или более. Условия анализа метода подсчета количества частиц в режиме светотени являются следующими.

[0162] [Метод подсчета количества частиц в режиме светотени]

0,2 мл образца вводили в систему HIAC (Pacific Scientific Company) для измерения количества нерастворимых невидимых частиц, имеющих размер 1,2 мкм или более, в 1 мл образца.

[0163] В таблице 6 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода подсчета количества частиц в режиме светотени в данном эксперименте. Было показано, что количество нерастворимых невидимых частиц увеличивалось из-за встряхивания, замораживания и размораживания, но добавление полисорбата 80 в концентрации 0,02 масс./об.% или более подавляло это увеличение. Было подтверждено, что добавление полисорбата 80 в концентрации 0,05 масс./об.% к жидкой композиции, содержащей PB009-2, было желательным с точки зрения подавления образования нерастворимых невидимых частиц.

[0164] [Таблица 6]

№ Образца	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)
№ Образца	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания
C-1	1950	Н/Д (неизмеримо)	61335
C-2	440	2910	3713
C-3	283	2433	8115
C-4	1743	470	11648
C-5	683	4293	15065
C-6	65	228	5938
C-7	275	793	5275

[0165] Эксперимент 1-6: Выбор оптимального pH для стабилизации конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека

Для составов с включением PB009-2 в концентрации 10 мг/мл и с включением лимонной кислоты в концентрации 20 ммоль/л или HEPES (2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновой кислоты) в концентрации 20 ммоль/л в качестве буферного агента, сахарозы в концентрации 10% масс./об. в качестве стабилизатора и полисорбата 80 в концентрации 0,05% масс./об. в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества (образцы № с D-1 по D-8), образцы получали с pH от 6,1 по 7,9. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой. После этого для каждого образца оценивали стабильность PB009-2 после хранения при 25°C в течение 1 недели в нормально помещенном состоянии на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ. Метод SE-ВЭЖХ выполняли так же, как в эксперименте 1-4.

[0166] Таблица 7 показывает результаты оценки, полученные методом SE-ВЭЖХ в данном эксперименте. Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%) после хранения при 25°C в течение 1 недели имело тенденцию к увеличению в образцах с высоким и низким pH и становилось наименьшим при pH около 6,7. Таким образом, было обнаружено, что оптимальным pH является pH 6,7, и лимонная кислота при 20 ммоль/л была особенно предпочтительной в качестве буферного агента для надлежащего поддержания оптимального pH.

[0167] [Таблица 7]

№ Образца	Буферный агент	pH	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели
D-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,1	1,7	3,0
D-2		6,4	1,6	2,9
D-3		6,7	1,5	2,9
D-4		7,0	1,6	3,2
D-5	20 ммоль/л HEPES	7,0	1,6	3,1
D-6		7,3	1,6	3,3
D-7		7,6	1,7	4,0
D-8		7,9	1,9	4,6

[0168] Эксперимент 1-7: Исследование оптимизации концентрации стабилизатора для стабилизации конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека

Из жидкого состава, содержащего PB009-2 в концентрации 10 мг/мл, лимонную кислоту в концентрации 20 ммоль/л и полисорбат 80 в концентрации 0,05% масс./об. и имеющего pH 6,7 (образцы № с E-1 по E-5), получали образцы, содержащие сахарозу или глицерин в количестве от 0 до 20% масс./об. После получения в соответствии с составами и композициями каждый образец подвергали асептической фильтрации через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и заливали в количестве 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой. Если необходимо, соляную кислоту и/или гидроксид натрия добавляли в качестве регулятора pH во время приготовления буферного агента таким образом, чтобы получить заранее определенный pH. После этого для каждого образца стабильность PB009-2 после хранения при 25°C в течение 1 недели в нормально помещенном состоянии оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ. Метод SE-ВЭЖХ выполняли так же, как в эксперименте 1-4.

[0169] Таблица 8 показывает результаты оценки, полученные методом SE-ВЭЖХ в данном эксперименте. Результаты показали, что после хранения при 25°C в течение 1 недели увеличение количества мультимеров в SE-ВЭЖХ (%) подавляли увеличением концентрации добавленной сахарозы или глицерина. Не было разницы во влиянии на стабильность сахарозы и глицерина. Приведенные выше результаты показали, что сахароза в концентрации 10% масс./об. была особенно предпочтительной в качестве фармацевтической добавки для жидкого состава, содержащего PB009-2, с точки зрения соотношения осмотического давления.

[0170] [Таблица 8]

№ Образца	Стабилизатор	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Стабилизатор	В начале испытания	После хранения при 25°C в течение 1 недели
E-1	Нет	1,0	3,7
E-2	10% масс./об. Сахарозы	1,0	2,9
E-3	20% масс./об. Сахарозы	0,9	2,6
E-4	10% масс./об. Глицерина	1,0	3,0
E-5	20% масс./об. Глицерина	1,0	2,6

[0171] Эксперимент 1-8: Исследование мечения с помощью ⁸⁹Zr в стабилизированном жидком составе, содержащем конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека

Для жидкого состава, содержащего PB009-2 в концентрации 10 мг/мл и имеющего составы, описанные в таблице 9 ниже, оценивали эффективность мечения с помощью ⁸⁹Zr после хранения при -80°C.

⁸⁹Zr получали в виде ⁸⁹Zr-оксалата, растворенного в 1М водном растворе щавелевой кислоты в Центре перспективных научных исследований Университета Окаяма, Департамент радиационных исследований, Лаборатория Шикада (Advanced Science Research Center Okayama University, Department of Radiation Research, Shikada Laboratory). 40 мкл ⁸⁹Zr-оксалата нейтрализовали с помощью 20 мкл 2М водного раствора карбоната натрия и разбавляли 190 мкл сверхчистой воды. Затем добавляли 150 мкл жидкого состава PB009-2 (10 мг/мл), содержащего полисорбат 80 в концентрации 0,05% масс./об., сахарозу в концентрации 10% масс./об. или глицерин в концентрации 30% масс./об. и лимонную кислоту в концентрации 20 ммоль/л, и смесь реагировала при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученную реакционную смесь очищали с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra 0,5 мл (Merck Millipore) с получением интересующего ⁸⁹Zr-меченного PB009-2. Этот конъюгат ⁸⁹Zr-DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека обозначен как PB009-3. Раствор PB009-3 до и после очистки измеряли с помощью ТСХ (тонкослойной хроматографии) и метода SE-ВЭЖХ для определения скорости реакции ⁸⁹Zr. Условия анализа следующие.

[0172] ТСХ выполняли, нанося небольшое количество образца на алюминиевый лист для ТСХ (Merck KGaA, 1-05560-0001) и используя 0,1 М раствор ЭДТА (pH: 7,0) в качестве проявляющего раствора. Скорость реакции ⁸⁹Zr рассчитывали по формуле:

(количество излучения вокруг источника a)/(общее количество излучения b) × 100

[0173] [Метод эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ)]

При измерении SE-ВЭЖХ G3000SWXL (TOSOH CORPORATION) подключали к системе ВЭЖХ, и подвижную фазу, имеющую в составе фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л, хлорид натрия в концентрации 150 ммоль/л и 5% ацетонитрила (pH 7,0), подавали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Температуру колонки устанавливали на 30°C, и детектирование проводили в УФ при 280 нм и при помощи РИ.

[0174] Результаты испытаний показали, что оба исследуемых состава давали высокую скорость реакции около 90% (до очистки) (таблица 9), и сравнение между пиком PB009-3, наблюдаемым в УФ-детекторе и РИ-детекторе, и пиком PB009-2, наблюдаемым в УФ-детекторе, показал, что времена удерживания этих пиков эквивалентны друг другу. Таким образом, было подтверждено, что в конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека была введена метка ⁸⁹Zr. Было показано, что как композиция с сахарозой, так и композиция с глицерином имели небольшую способность ингибировать реакции мечения ⁸⁹Zr.

[0175] [Таблица 9] Скорость реакции, определенная по результатам ТСХ

Состав	Измерение скорости реакции по ТСХ (%)
Состав	До очистки	После очистки
20 ммоль/л Лимонной кислоты, pH 6,7 10% масс./об. Сахарозы 0,05% масс./об. Полисорбата 80	87,3	98,9
20 ммоль/л Лимонной кислоты, pH 6,7 30% масс./об. Глицерина 0,05% масс./об. Полисорбата 80	89,1	96,7

[0176] Эксперимент 1-9: Исследование стабильности во время хранения состава, содержащего конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека

Образец F-1, показанный в таблице 10, получали путем добавления лимонной кислоты, сахарозы и полисорбата 80 к жидкому составу, содержащему PB009-2, таким образом, чтобы конечная концентрация PB009-2 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Образец подвергали асептической фильтрации через фильтр с размером пор 0,22 мкм и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0177] [Таблица 10]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество
F-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,7	10% масс./об. Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80

[0178] Для оценки стабильности жидкого состава проводили испытание на стабильность при хранении каждого образца в нормально помещенном состоянии. В тесте на стабильность при хранении стабильность PB009-2 после хранения при -20°C или 5°C в течение от 1 до 6 месяцев оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ. Метод SE-ВЭЖХ выполняли так же, как в эксперименте 1-4.

Таблица 11 показывает результаты оценки, полученные методом SE-ВЭЖХ в данном эксперименте. Результаты показали, что не было проблем со стабильностью при хранении в течение как минимум 6 месяцев при -20°C. Было подтверждено, что при хранении при 5°C стабильность при хранении до 1 месяца была эквивалентна стабильности при хранении при -20°C в течение того же периода.

[0180] [Таблица 11]

№ Образца	Температура хранения	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Температура хранения	В начале испытания	После хранения в течение 1 месяца	После хранения в течение 3 месяцев	После хранения в течение 6 месяцев
F-1	-20°C	1,4	2,1	2,3	3,0
F-1	5°C	1,4	2,2	3,1	5,1

[0181] Эксперимент 2-1: Получение Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека

Получали два Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека, обозначенные как P10-1 Fab и P10-2 Fab. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи P10-1 Fab и P10-2 Fab специально разрабатывали как последовательности, которые, как ожидается, улучшат аффинность, а не будут уменьшать аффинность даже за счет связывания маркирующего фрагмента, путем использования молекулярной модели гуманизированного антитела, сконструированного в соответствии с литературой (Proteins, 2014 Aug; 82 (8): 1624-35) после гуманизации антитела 1B2, которое представляет собой полученное от мыши антитело против специфичного для рака MUC1 человека, со ссылкой на метод, описанный в литературе (Front Biosci., 2008 Jan 1; 13: 1619-33).

[0182] Получали GS-вектор pEE6.4 (Lonza Group AG), имеющий вставку гена фрагмента тяжелой цепи, образованного путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность (MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (SEQ ID NO: 17)), с 5'-стороной гена фрагмента тяжелой цепи в Fab P10-1 и Fab P10-2 (SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7 соответственно). Кроме того, получали GS-вектор pEE12.4 (Lonza Group AG), имеющий вставку гена легкой цепи, образованного путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность (MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO: 18)), с 5'-стороной гена общей легкой цепи (SEQ ID NO: 9) в Fab P10-1 и Fab P10-2.

[0183] Экспрессию каждого Fab-фрагмента проводили методом временной экспрессии. Клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), культивированные примерно до получения 2500000 клеток/мл в экспрессионной среде Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), трансфицировали упомянутыми выше GS-векторами фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) и культивировали в течение 8 дней. После экспрессии культуральный супернатант очищали с использованием KappaSelect (GE Healthcare Japan Corp.) с получением каждого Fab-фрагмента.

[0184] Нуклеотидная последовательность фрагмента тяжелой цепи P10-1 Fab показана в SEQ ID NO: 5, а аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 6. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи P10-1 Fab показана в SEQ ID NO: 11. Аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 12.

[0185] Нуклеотидная последовательность фрагмента тяжелой цепи P10-2 Fab показана в SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 8. Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи P10-2 Fab показана в SEQ ID NO: 13. Аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 14.

[0186] Легкая цепь является общей в Fab P10-1 и Fab P10-2. Ее нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID NO: 9. Аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 10. Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи Fab P10-1 и Fab P10-2 показана в SEQ ID NO: 15. Аминокислотная последовательность, кодируемая таким образом, показана в SEQ ID NO: 16.

[0187] В результате анализа аминокислотной модификации очищенного P10-2 Fab было высказано предположение, что глутамин на N-конце тяжелой цепи был модифицирован в пироглутаминовую кислоту в подавляющем большинстве очищенных антител.

[0188] Эксперимент 2-2: Введение метки в Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека с помощью хелатирующего агента

п-SCN-Bn-DFO (DFO, замещенный п-изотиоцианофениламинотиокарбонильной группой) (Macrocyclics, Inc.) использовали для связывания хелатирующего агента DFO с Fab-фрагментом P10-2 антитела против MUC1 человека. К раствору Fab-фрагмента, доведенному до 12,5 мг/мл с помощью фосфатно-солевого буфера (pH 7,4), добавляли 100 ммоль/л водного раствора карбоната натрия в концентрации 10 ммоль/л для доведения pH до 9,0. К нему добавляли п-SCN-Bn-DFO до конечной концентрации 1 ммоль/л и проводили реакцию при 37°C в течение 2 часов. Поскольку п-SCN-Bn-DFO имеет изотиоцианатную группу, он быстро реагирует с Lys Fab-фрагмента. Его восстанавливали посредством центрифужного фильтра Amicon Ultra 10K-0,5 мл для очистки конъюгата DFO c Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, связанного с DFO через линкер ((-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-) (обозначен как PB010-3).

[0189] Эксперимент 2-3: Исследование влияния pH на стабилизацию конъюгата DFO с Fag-фрагментом антитела против MUC1 человека (влияние на образование мультимеров и образование нерастворимых невидимых частиц)

Для жидкого состава, содержащего PB010-3, оценивали влияние pH на стабилизацию PB010-3. В данном испытании образцы №№ с G-1 по G-6, показанные в таблице 12, получали путем добавления буферного агента, стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества к жидкой композиции, содержащей PB010-3, таким образом, чтобы конечная концентрация PB010-3 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0190] [Таблица 12]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество
G-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,1	10% масс./об. Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80
G-2		6,4
G-3		6,7
G-4		7,0
G-5	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	7,0
G-6	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	7,3

[0191] Для оценки стабильности жидкого состава проводили эксперимент на термостабильность каждого образца в нормально помещенном состоянии. В эксперименте на термостабильность стабильность PB010-3 после хранения при 40°C в течение 1 недели оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ), и количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом подсчета количества частиц в режиме светотени. Условия анализа следующие.

[0192] [Метод SE-ВЭЖХ]

При измерении SE-ВЭЖХ BioSep SEC s3000 (Phenomenex Inc.) подключали к системе ВЭЖХ, ФСБ (pH 7,4) использовали в качестве подвижной фазы и подавали со скоростью 0,5 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 20 мкг в пересчете на PB010-3 (например, 10 мкл в случае 2 мг/мл). Температуру колонки устанавливали на 30°C, температуру образца устанавливали на 10°C, и детектирование выполняли в УФ при 280 нм.

[0193] [Метод подсчета количества частиц в режиме светотени]

0,2 мл образца вводили в систему HIAC (Pacific Scientific Company) для измерения количества нерастворимых невидимых частиц размером 1,2 мкм или более.

[0194] Площадь мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ, измеряли методом автоматического анализа для определения количества мультимеров (%). Количество мультимеров определяется в процентах (%) путем измерения площади пиков мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площадей всех пиков, включая площадь основного пика. Здесь основной пик относится к пику активного основного тела (PB010-3, который не является мультимеризованным).

[0195] В таблице 13 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ и метода подсчета количества частиц в режиме светотени, в данном эксперименте. Результаты показали, что количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%) после хранения при 40°C в течение 1 недели имеет тенденцию к увеличению с увеличением pH. Количество нерастворимых невидимых частиц размером 1,2 мкм или более после хранения при 40°C в течение 1 недели имеет тенденцию к увеличению с уменьшением pH. Всесторонняя оценка приведенных выше результатов показала, что оптимальный pH жидкого состава, содержащего PB010-3, составлял примерно от 6,5 до 7,0 с точки зрения стабильности.

[0196] [Таблица 13]

№ Образца	Буферный агент	pH	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)		Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 1 недели	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 1 недели
G-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,1	0,5	3,4	718	74568
G-2		6,4	0,5	4,1	4970	5660
G-3		6,7	0,5	5,0	1605	4625
G-4		7,0	0,5	6,1	1498	3185
G-5	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	7,0	0,5	6,3	1708	2143
G-6	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	7,3	0,5	9,1	920	2288

[0197] Эксперимент 2-4: Исследование влияний стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека (влияние на образование мультимеров и образование нерастворимых невидимых частиц)

Для жидкого состава, содержащего PB010-3, оценивали влияние различных стабилизаторов на стабильность PB010-3. В данном исследовании образцы №№ с H-1 по H-4, показанные в таблице 14, получали путем добавления буферного агента, стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества к жидкой композиции, содержащей PB010-3, таким образом, чтобы конечная концентрация PB010-3 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0198] [Таблица 14]

№ Образца	Буферный агент	pH	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Стабилизатор
H-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,7	Нет	Нет
H-2			0,05% масс./об. Полисорбата 80	Нет
H-3			0,05% масс./об. Полисорбата 80	10% масс./об. Сахарозы
H-4			0,05% масс./об. Полисорбата 80	30% масс./об. Глицерина

[0199] Для оценки стабильности жидкого состава для каждого образца проводили испытание на хранение и испытание на встряхивание. Испытание на хранение проводили путем статического хранения каждого образца в условиях от 5°C до -20°C. Испытание на встряхивание проводили путем встряхивания образца при 150 об/мин в течение 24 часов. Стабильность PB010-3 до и после каждого испытания оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ), и количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом подсчета количества частиц в режиме светотени. Условия анализа такие же, как в эксперименте 2-3.

[0200] Таблицы 15 и 16 показывают результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ и метода подсчета количества частиц в режиме светотени, в данном эксперименте. Результаты показали, что для состава без добавления полисорбата 80 и состава с добавлением сахарозы или глицерина в дополнение к полисорбату 80 подавляющее действие на увеличение количества мультимеров проявлялось даже после хранения при 5°C или -20°C в течение 3 месяцев. С другой стороны, для состава без добавления полисорбата 80 количество нерастворимых невидимых частиц заметно увеличивалось после испытания на встряхивание. Приведенные выше результаты показали, что был желателен состав с добавлением сахарозы или глицерина в дополнение к полисорбату 80, и, кроме того, с точки зрения соотношения осмотического давления сахароза в концентрации 10% масс./об. была особенно предпочтительной в качестве фармацевтической добавки для жидкого состава, содержащего PB010-3.

[0201] [Таблица 15]

№ Образца	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	В начале испытания	После хранения при 5°C в течение 1 месяца	После хранения при 5°C в течение 3 месяцев	После хранения при -20°C в течение 1 месяца	После хранения при -20°C в течение 3 месяцев
H-1	0,5	0,6	1,0	0,6	0,7
H-2	0,5	0,7	1,4	0,9	1,3
H-3	0,5	0,6	1,2	0,6	0,9
H-4	0,5	0,6	1,1	0,6	0,8

[0202] [Таблица 16]

№ Образца	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)
№ Образца	В начале испытания	После встряхивания
H-1	1988	99380
H-2	1145	1998
H-3	1605	2335
H-4	330	1045

[0203] Эксперимент 2-5: Исследование влияния поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата DFO с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека (влияние на образование нерастворимых невидимых частиц)

Для жидкого состава, содержащего PB010-3, оценивали влияние поверхностно-активного вещества на стабильность PB010-3. В данном испытании образцы №№ с I-1 по I-4, показанные в таблице 17, получали путем добавления буферного агента, стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества к жидкой композиции, содержащей PB010-3, таким образом, чтобы конечная концентрация PB010-3 составляла 10 мг/мл, и регулирования pH. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0204] [Таблица 17]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество
I-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,7	10% масс./об. Сахарозы	0% масс./об. Полисорбата 80
I-2				0,02% масс./об. Полисорбата 80
I-3				0,05% масс./об. Полисорбата 80
I-4				0,1% масс./об. Полисорбата 80

[0205] Для оценки стабильности жидкого состава для каждого образца проводили испытание на встряхивание и испытание на замораживание и размораживание. Испытание на встряхивание проводили путем встряхивания образца при 150 об/мин в течение 24 часов. Испытание на замораживание и размораживание проводили путем проведения в общей сложности трех процессов, каждый из которых включал замораживание образца при -80°C в течение 4 часов или более, а затем размораживание образца при 5°C в течение 4 часов или более. Стабильность PB010-3 до и после каждого испытания оценивали на основе количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом подсчета количества частиц в режиме светотени. Условия анализа такие же, как в эксперименте 2-3.

[0206] Таблица 18 показывает результаты оценки, полученные методом подсчета количества частиц в режиме светотени в данном эксперименте. Результаты показали, что полисорбат 80 в концентрации 0,02% масс./об. или более оказывал подавляющее действие на увеличение количества нерастворимых невидимых частиц во время встряхивания, замораживания и размораживания.

[0207] [Таблица 18]

№ Образца	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)
№ Образца	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания
I-1	12923	77135	18425
I-2	1340	2615	1633
I-3	1933	2168	985
I-4	703	1383	3310

[0208] Эксперимент 2-6: Исследование мечения с помощью ⁸⁹Zr в стабилизированном жидком составе, содержащем конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для жидкого состава, содержащего PB010-3 в концентрации 10 мг/мл и имеющего составы, описанные в таблице 9 ниже, оценивали эффективность мечения с помощью ⁸⁹Zr после хранения при -80°C.

⁸⁹Zr получали в виде ⁸⁹Zr-оксалата, растворенного в 1М водном растворе щавелевой кислоты в Центре перспективных научных исследований Университета Окаяма, Департамент радиационных исследований, Лаборатория Шикада (Advanced Science Research Center Okayama University, Department of Radiation Research, Shikada Laboratory). 40 мкл ⁸⁹Zr-оксалата нейтрализовали с помощью 20 мкл 2М водного раствора карбоната натрия и разбавляли 190 мкл сверхчистой воды. Затем добавляли 150 мкл жидкого состава PB010-3 (10 мг/мл), содержащего полисорбат 80 в концентрации 0,05% масс./об., сахарозу в концентрации 10% масс./об. или глицерин в концентрации 30% масс./об. и лимонную кислоту в концентрации 20 ммоль/л, и смесь реагировала при комнатной температуре в течение 60 минут. Полученную реакционную смесь очищали с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra 0,5 мл (Merck Millipore) с получением интересующего ⁸⁹Zr-меченного PB010-3. Этот ⁸⁹Zr-меченный P10-2 Fab-DFO (PB010-3) обозначен как PB010-4. Раствор PB010-4 до и после очистки измеряли с помощью ТСХ (тонкослойной хроматографии) и метода SE-ВЭЖХ для определения скорости реакции ⁸⁹Zr. Условия анализа для методов ТСХ и SE-ВЭЖХ такие же, как в эксперименте 1-8.

[0209] Результаты испытаний показали, что оба исследуемых состава давали высокую скорость реакции около 90% (до очистки) (таблица 19), и сравнение пика PB010-4, наблюдаемого в УФ-детекторе и РИ-детекторе, с пиком PB010-3, наблюдаемым в УФ-детекторе, показал, что времена удерживания этих пиков эквивалентны друг другу. Таким образом, было подтверждено, что в PB010-3 была введена метка ⁸⁹Zr. Было показано, что оба исследованных состава имели небольшую способность препятствовать реакции мечения ⁸⁹Zr.

[0210] [Таблица 19]

Состав	Измерение скорости реакции по ТСХ (%)
Состав	До очистки	После очистки
20 ммоль/л Лимонной кислоты, pH 6,7 10% масс./об. Сахарозы 0,05% масс./об. Полисорбата 80	91,2	96,5
20 ммоль/л Лимонной кислоты, pH 6,7 30% масс./об. Глицерина 0,05% масс./об. Полисорбата 80	90,8	99,0

[0211] Эксперимент 2-7: Исследование стабильности во время хранения состава, содержащего конъюгат DFO с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для жидкого состава, содержащего PB010-3, оценивали стабильность при хранении в холодильнике и замораживании. В данном испытании готовили образец J-1 на основе таблицы 20 путем добавления буферного агента, стабилизатора и неионогенного поверхностно-активного вещества к жидкой композиции, содержащей PB010-3, таким образом, чтобы конечная концентрация PB010-3 была 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0212] [Таблица 20]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество
J-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,7	10% масс./об. Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80

[0213] Для оценки стабильности жидкого состава каждый образец статически хранили в условиях от 5°C до -20°C. Стабильность PB010-3 после хранения оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ, количества свободных Fab-тел (%), измеренного методом обращенно-фазовой хроматографии (метод ОФ-ВЭЖХ), и количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом подсчета количества частиц в режиме светотени. Условия анализа следующие.

[0214] [Метод SE-ВЭЖХ]

Метод выполняли в тех же условиях, что и в эксперименте 2-3.

[0215] [Метод ОФ-ВЭЖХ]

При измерении ОФ-ВЭЖХ Intrada WP-RP (Imtakt Corporation) подключали к системе ВЭЖХ и выполняли измерение. 0,1% ТФУК и 0,1% ТФУК/ацетонитрил подключали к линии подвижной фазы A и линии подвижной фазы B, соответственно, и подавали со скоростью потока 1,0 мл/мин, поддерживая соотношение, как показано в таблице ниже. Количество вводимого образца составляло 20 мкг в пересчете на PB010-3 (например, 20 мкл в случае 1 мг/мл). Применяли градиентную программу ОФ-ВЭЖХ из таблицы 21. Температуру колонки устанавливали на 60°C, температуру образца устанавливали на 10°C, и детектирование выполняли в УФ при 214 нм.

[Таблица 21]

Время (мин)	A%	B%
0,0	76	24
39,0	63	37
39,1	0	100
41,5	0	100
41,6	76	24
45,0	76	24

[0216] Площадь мультимеров, обнаруженных методом ОФ-ВЭЖХ, измеряли методом автоматического анализа для определения количества свободных Fab-тел (%). Количество свободных Fab-тел определяется в процентах (%) путем измерения площади пиков свободных Fab-фрагментов, обнаруженных методом ОФ-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму всех площадей пиков, включая площадь основного пика. В данном контексте основной пик относится к пику активного основного вещества.

[0217] [Метод подсчета количества частиц в режиме светотени]

[0218] В таблице 22 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ, метода ОФ-ВЭЖХ и метода подсчета количества частиц в режиме светотени в данном эксперименте. Результаты показали, что не было проблем со стабильностью при хранении в течение 3 месяцев или меньше.

[0219] [Таблица 22]

№ Образца	Параметр оценки	В начале испытания	После хранения при 5°C в течение 1 месяца	После хранения при 5°C в течение 3 месяцев	После хранения при -20°C в течение 1 месяца	После хранения при -20°C в течение 3 месяцев
J-1	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)	0,5	0,6	1,2	0,6	0,9
	Количество свободных Fab-тел в ОФ-ВЭЖХ (%)	6,6	6,4	6,8	6,4	6,6
	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)	1605	1775	3883	6383	3353

[0220] Эксперимент 3-1: Флуоресцентное мечение Fab-фрагмента антитела против MUC1 человека

Флуоресцентный краситель вводили в Fab P10-2, полученный в эксперименте 2-1. В частности, раствор каждого Fab-фрагмента, доведенный до приблизительно 1 мг/мл с помощью фосфатно-солевого буфера (pH 7,4), доводили до pH 8,5 путем добавления 1/10 количества 1М раствора дикалий гидрофосфата (pH 9). К нему добавляли сложный эфир IRDye800CW-NHS (LI-COR, Inc.) до конечной концентрации 310,8 мкг/мл, и полученный продукт перемешивали при комнатной температуре при затемнении в течение 2 часов. Сложный эфир IRDye800CW-NHS имеет N-гидроксисукцинимидную группу и поэтому немедленно реагирует с Lys Fab-фрагмента. Его выделяли посредством центрифужного фильтра Amicon Ultra 3K объемом 0,5 мл (Merck Millipore) для очистки конъюгата IRDye800CW с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека (обозначенного как PB010-2).

[0221] Эксперимент 3-2: Влияние pH на стабилизацию конъюгата IRDye800CW с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для жидкого состава, содержащего PB010-2, оценивали влияние pH на стабилизацию PB010-2. В данном испытании концентрация PB010-2 составляла 10 мг/мл, и образцы №№ с K-1 по K-5 получали на основе таблицы 23. pH регулировали путем добавления соответствующего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0222] [Таблица 23]

№ Образца	Буферный агент	pH
K-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,0
K-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты	7,0
K-3	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	6,0
K-4		7,0
K-5		8,0

[0223] Для оценки стабильности жидкого состава проводили эксперимент на термостабильность каждого образца в нормально помещенном состоянии. В эксперименте на термостабильность стабильность PB010-2 после хранения при 40°C в течение 1 недели оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ), и количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом визуализации микропотоков. Условия анализа следующие.

[0224] [Метод эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ)]

При измерении SE-ВЭЖХ G2000SWXL (TOSOH CORPORATION) подключали к системе ВЭЖХ, и подвижную фазу, имеющую в составе фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия в концентрации 1000 ммоль/л (pH 7,0), подавали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 50 мкг в пересчете на PB010-2 (например, 10 мкл в случае 5 мг/мл). Температуру колонки устанавливали на 30°C, температуру образца устанавливали на 5°C, и детектирование выполняли в УФ при 280 нм.

[0225] Площадь мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ, измеряли методом автоматического анализа для определения количества мультимеров (%). Количество мультимеров определяется в процентах (%) путем измерения площади пиков мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площадей всех пиков, включая площадь основного пика. В данном контексте основной пик относится к пику активного основного вещества.

[0226] [Метод визуализации микропотоков]

650 мкл образца вводили в систему визуализации микропотоков (Protein Simple, Inc.) для измерения количества нерастворимых невидимых частиц, имеющих размер 1,2 мкм или более, в 1 мл образца.

[0227] В таблице 24 показаны результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ и метода визуализации микропотоков в данном эксперименте. Результаты показали, что количество мультимеров в SE-ВЭЖХ после хранения при 40°C в течение 1 недели имеет тенденцию к увеличению с увеличением pH. Количество нерастворимых невидимых частиц размером 1,2 мкм или более после хранения при 40°C в течение 1 недели имеет тенденцию к увеличению с уменьшением pH. Всесторонняя оценка приведенных выше результатов показала, что оптимальное значение pH составляло от 6,5 до 7,5.

[0228] [Таблица 24]

№ Образца	Буферный агент	pH	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)		Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,2 мкм/мл)
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 1 недели	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 1 недели
K-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,0	1,4	2,3	10766	163020
K-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты	7,0	1,3	3,5	3599	38886
K-3	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	6,0	1,3	1,6	13605	130887
K-4		7,0	1,3	4,0	4223	58559
K-5		8,0	1,5	9,9	4318	25668

[0229] Эксперимент 3-3: Влияние стабилизатора или неионогенного поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата IRDye800CW с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для жидкого состава, содержащего PB010-2, оценивали влияние различных стабилизаторов на стабильность PB010-2. В данном испытании образцы №№ с L-1 по L-6 получали на основе таблицы 25 путем добавления буферного агента и добавки к жидкой композиции, содержащей PB010-2, таким образом, чтобы конечная концентрация PB010-2 составляла 10 мг/мл. pH регулировали добавлением подходящего количества соляной кислоты или гидроксида натрия. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой.

[0230] [Таблица 25]

№ Образца	Буферный агент	pH	Добавка
L-1	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	7,0	Нет
L-2			140 мМ Аргинина
L-3			280 ммоль/л Сахарозы
L-4			140 ммоль/л Хлорида натрия
L-5			0,1% масс./об. Полисорбата 80
L-6			280 ммоль/л Глицерина

[0231] Для оценки стабильности жидкого состава проводили испытание на встряхивание, испытание на замораживание и размораживание, испытание на термостабильность и испытание на воздействие светового излучения на каждый образец. Испытание на встряхивание проводили путем встряхивания образца при 150 об/мин в течение 24 часов. Испытание на замораживание и размораживание проводили путем проведения в общей сложности трех процессов, каждый из которых включал замораживание образца при -80°C в течение 4 часов или более, а затем размораживание образца при 5°C в течение 4 часов или более. Испытание на термостабильность проводили путем хранения образца при 40°C в течение 2 недель. Испытание на воздействие светового излучения проводили путем хранения образца в горизонтально помещенном состоянии и освещения 1000 люкс в течение 96 часов с использованием белой люминесцентной лампы. Стабильность PB010-2 до и после каждого испытания оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ), соотношения краситель-антитело, измеренного методом обращенно-фазовой хроматографии (метод ОФ-ВЭЖХ), и количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом визуализации микропотоков. Условия анализа следующие.

[0232] [Метод эксклюзионной хроматографии (метод SE-ВЭЖХ)]

При измерении SE-ВЭЖХ AdvanceBio SEC 300A (Agilent Technologies) подключали к системе ВЭЖХ, и подвижную фазу, имеющую в составе фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л и хлорид натрия в концентрации 1000 ммоль/л (pH 7,0), подавали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 50 мкг в пересчете на PB010-2 (например, 10 мкл в случае 5 мг/мл). Температуру колонки устанавливали на 30°C, температуру образца устанавливали на 5°C, и детектирование выполняли в УФ при 280 нм.

[0233] Площадь мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ, измеряли методом автоматического анализа для определения количества мультимеров (%). Количество мультимеров определяется в процентах (%) путем измерения площади пиков мультимеров, обнаруженных методом SE-ВЭЖХ с использованием метода автоматического анализа, и деления на сумму площадей всех пиков, включая площадь основного пика. В этом контексте основной пик относится к пику активного основного вещества.

[0234] [Метод обращенно-фазовой хроматографии (метод ОФ-ВЭЖХ)]

При измерении ОФ-ВЭЖХ Intrada WP-RP (Imtakt Corporation) подключали к системе ВЭЖХ, и выполняли измерение. 0,1% трифторуксусную кислоту/воду и 0,1% трифторуксусную кислоту/ацетонитрил подключали к линии подвижной фазы A и линии подвижной фазы B, соответственно, и подавали со скоростью потока 1,0 мл/мин. Количество вводимого образца составляло 10 мкг в пересчете на PB010-2 (например, 10 мкл в случае 1 мг/мл). Применяли градиентную программу ОФ-ВЭЖХ из таблицы 26. Время анализа составляло 45 минут, детектирование проводили при длине волны УФ-излучения 280 или 780 нм. Температуру колонки устанавливали на 75°C, а температуру образца устанавливали на 5°C.

[0235] [Таблица 26]

Время (мин)	Подвижная фаза B%
0,0	20
39,0	60
39,1	100
41,5	100
41,6	20
45,0	20

[0236] Общую площадь пиков при длине волны УФ-излучения 780 нм и общую площадь пиков при длине волны УФ-излучения 280 нм, которые были обнаружены методом ОФ-ВЭЖХ, коэффициент поглощения PB010-1 (1,42 мл/мг∙см^-1), молекулярную массу PB010-1 (47527,43) и молярный коэффициент поглощения IRDye800CW в ФСБ (240000 мл/ммоль∙см^-1) применяли к следующей формуле расчета для определения соотношения краситель-антитело.

[Выражение 1]

[0237] [Метод визуализации микропотоков]

650 мкл образца вводили в систему визуализации микропотоков (Protein Simple, Inc.) для измерения количества нерастворимых невидимых частиц, имеющих размер 1,0 мкм или более, в 1 мл образца.

[0238] Таблицы 27-29 показывают результаты оценки, полученные с помощью метода SE-ВЭЖХ, метода ОФ-ВЭЖХ и метода визуализации микропотоков в данном эксперименте. В составе с добавлением аргинина и составе с добавлением сахарозы увеличение количества мультимеров после хранения при 40°C в течение 2 недель, как правило, подавлялось. В составе с добавлением аргинина соотношение краситель-антитело уменьшалось после хранения при 40°C в течение 2 недель. Кроме того, в составе с добавлением хлорида натрия и в составе без добавления добавки количество нерастворимых невидимых частиц после замораживания и размораживания имело тенденцию к увеличению по сравнению с другими составами. Всесторонняя оценка приведенных выше результатов показала, что сахароза желательна в качестве стабилизатора и регулятора тоничности для жидкого состава, содержащего PB010-2.

[0239] [Таблица 27]

№ Образца	Добавка	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Добавка	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
L-1	Нет	1,9	2,2	2,5	9,3	3,8
L-2	140 ммоль/л Аргинина	1,9	2,4	2,0	6,2	3,5
L-3	280 ммоль/л Сахарозы	1,8	2,1	1,9	7,9	3,2
L-4	140 ммоль/л Хлорида натрия	1,9	2,3	2,1	9,6	3,7
L-5	0,1% масс./об. Полисорбата 80	2,1	2,4	2,4	9,4	3,8
L-6	280 ммоль/л Глицерина	1,9	2,2	1,9	9,0	3,6

[0240] [Таблица 28]

№ Образца	Добавка	Соотношение краситель-антитело
№ Образца	Добавка	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
L-1	Нет	2,4	2,4	2,4	1,9	2,3
L-2	140 ммоль/л Аргинина	2,4	2,2	2,4	0,3	1,8
L-3	280 ммоль/л Сахарозы	2,4	2,4	2,4	1,8	2,2
L-4	140 ммоль/л Хлорида натрия	2,5	2,4	2,4	1,8	2,3
L-5	0,1% масс./об. Полисорбата 80	2,4	2,4	2,5	1,9	2,3
L-6	280 ммоль/л Глицерина	2,4	2,4	2,4	1,9	2,2

[0241] [Таблица 29]

№ Образца	Добавка	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,0 мкм/мл)
№ Образца	Добавка	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
L-1	Нет	1895	16242	30603	12393	3625
L-2	140 ммоль/л Аргинина	1763	2587	13173	8473	3592
L-3	280 ммоль/л Сахарозы	2868	7700	8052	8396	5246
L-4	140 ммоль/л Хлорида натрия	2188	4518	74934	2785	2498
L-5	0,1% масс./об. Полисорбата 80	1486	4679	11087	5281	3813
L-6	280 ммоль/л Глицерина	2354	12898	13639	7941	3630

[0242] Эксперимент 3-4: Выбор оптимального pH для стабилизации конъюгата IRDye800CW с Fag-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для составов, в которых лимонную кислоту в концентрации 20 ммоль/л или фосфорную кислоту в концентрации 20 ммоль/л используют в качестве буферного агента в жидком составе, содержащем PB010-2 (образцы №№ с M-1 по M-10), образцы получали при pH от 6,6 до 7,4. В образце конечная концентрация PB010-2 составляла 10 мг/мл, и, если необходимо, добавляли соляную кислоту и/или гидроксид натрия в качестве регулятора pH во время приготовления буферного агента, чтобы получить заранее определенный pH. Каждый образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой. Стабильность каждого образца после испытания на встряхивание, испытания на замораживание и размораживание, испытания на термостабильность и испытания на воздействие светового излучения оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ, и соотношения краситель-антитело, измеренного с помощью ОФ-ВЭЖХ. Метод SE-ВЭЖХ и метод ОФ-ВЭЖХ проводили таким же образом, как в эксперименте 3-3.

[0243] Таблицы 30 и 31 показывают результаты.

Что касается количества мультимеров и соотношения краситель-антитело, стабильность повышалась при снижении pH (при высоком pH стабильность снижалась из-за теплового стресса и стресса вследствие воздействия светового излучения). С другой стороны, было обнаружено, что pH 6,8 был особенно предпочтительным, потому что риск образования невидимых частиц из-за снижения растворимости увеличивался, когда pH приближался к 6,0.

[0244] [Таблица 30]

№ Образца	Буферный агент	pH	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания	После хранения при 40°C в течение 1 недели	После воздействия светового излучения
M-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,6	1,8	2,0	1,2	2,9	2,2
M-2		6,8	1,7	2,0	1,2	3,1	2,4
M-3		7,0	1,9	1,9	1,2	3,6	2,4
M-4		7,2	1,7	1,9	1,2	4,0	2,6
M-5		7,4	1,7	1,9	1,2	4,5	2,7
M-6	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	6,6	1,8	2,1	1,3	3,4	2,6
M-7		6,8	1,8	2,0	1,3	3,8	2,7
M-8		7,0	1,8	2,0	1,5	4,1	2,7
M-9		7,2	1,7	1,9	1,5	4,5	2,8
M-10		7,4	1,8	2,0	1,4	5,4	3,1

[0245] [Таблица 31]

№ Образца	Буферный агент	pH	Соотношение краситель-антитело
№ Образца	Буферный агент	pH	В начале испытания	После встряхивания	После замораживания и размораживания	После хранения при 40°C в течение 1 недели	После воздействия светового излучения
M-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,6	1,48	1,48	1,48	1,32	1,36
M-2		6,8	1,49	1,48	1,49	1,30	1,36
M-3		7,0	1,49	1,48	1,49	1,26	1,35
M-4		7,2	1,49	1,47	1,48	1,23	1,34
M-5		7,4	1,49	1,47	1,48	1,19	1,33
M-6	20 ммоль/л Фосфорной кислоты	6,6	1,50	1,50	1,49	1,34	1,39
M-7		6,8	1,50	1,49	1,50	1,31	1,38
M-8		7,0	1,51	1,50	1,49	1,27	1,37
M-9		7,2	1,51	1,49	1,49	1,24	1,35

[0246] Эксперимент 3-5: Влияния буферного агента и поверхностно-активного вещества на стабилизацию конъюгата IRDYE800CW с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Для составов с содержанием PB010-2 и с добавлением лимонной кислоты в концентрации 20 ммоль/л (pH 6,8) или фосфорной кислоты в концентрации 20 ммоль/л (pH 6,8) и сахарозы в концентрации 280 ммоль/л получали образцы с добавлением полисорбата 80 в концентрации 0,05% масс./об. в качестве поверхностно-активного вещества и образцы без добавления полисорбата 80 (образцы №№ с N-1 по N-4). Конечная концентрация PB010-2 составляла 10 мг/мл. После получения в соответствии с составами и композициями каждый образец подвергали асептической фильтрации через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали в количестве 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл). Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой. Если необходимо, соляную кислоту и/или гидроксид натрия добавляли в качестве регулятора pH во время приготовления буферного агента, чтобы получить заранее определенный pH.

[0247] Образец хранили при -20°C или 5°C в течение 1 месяца, а испытание на термостабильность проводили путем хранения образца в нормально помещенном состоянии при 40°C в течение 2 недель или при 25°C в течение 1 месяца. Испытание на воздействие светового излучения проводили путем хранения образца в горизонтально помещенном состоянии и освещения 1000 люкс в течение 96 часов с использованием белой люминесцентной лампы. Стабильность PB010-2 до и после каждого испытания оценивали на основе количества мультимеров, измеренного методом SE-ВЭЖХ, количества нерастворимых невидимых частиц, измеренного методом визуализации микропотоков, интенсивности флуоресценции, измеренной методом SE-ВЭЖХ, и антиген-связывающей активности, измеренной методом иммуноферментного анализа на основе использования фермент-связанного иммуносорбента (ELISA). Метод SE-ВЭЖХ и метод визуализации микропотоков проводили в соответствии с методами, описанными в эксперименте 3-3. Интенсивность флуоресценции оценивали, применяя интенсивность флуоресценции в обнаруженном основном пике по следующей формуле.

[Выражение 2]

[0248] [Метод ELISA]

Раствор фосфатного буфера, содержащий антиген hMUC-1 (PEPTIDE INSTITUTE, INC.) в концентрации 0,8 нМ, добавляли в аналитический планшет и обрабатывали при 2-8°C в течение 18 часов, а затем антиген иммобилизовали с использованием трис-забуференного физиологического раствора (TBS), содержащего 20% Blocking One (nacalai tesque) и Твин-20 в концентрации 0,05% масс./об. Раствор PB010-2 постепенно разбавляли с помощью TBS, содержащего 5% Blocking One и Твин-20 в концентрации 0,05% масс./об., в диапазоне концентраций от 0 до 100000 нг/мл, и добавляли в планшет, содержащий иммобилизованный антиген. Планшет инкубировали при 25°C в течение 60 минут и затем в планшет добавляли антитело козы к каппа-HRP человека (Southern Biotech, Inc.), разведенное в 4000 раз. Планшет инкубировали при 25°C в течение 60 минут, а затем трижды промывали. В планшет добавляли 100 мкл ТМБ+Субстрат-Хромоген (Dako), затем проводили инкубацию при 25°C в течение 20 минут и добавляли серную кислоту в концентрации 1 моль/л для остановки реакции. После этого с использованием Spectra Max 190 (Molecular Devices, LLC) исследовали УФ-поглощение при 450 нм для оценки связывающей активности. Связывающую активность рассчитывали как связывающую активность относительно активности PB010-2, которая определяется как 100%.

[0249] Таблицы 32-35 демонстрируют результаты.

Было обнаружено, что использование полисорбата 80 в концентрации 0,05% масс./об. в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества было особенно предпочтительным, поскольку в составах с добавлением полисорбата 80 подавлялось увеличение количества нерастворимых невидимых частиц после испытания на термостабильность и испытания на воздействие светового излучения. Было обнаружено, что использование лимонной кислоты в качестве буферного агента было особенно предпочтительным, поскольку в составах с добавлением лимонной кислоты тенденция к увеличению количества мультимеров после хранения при 40°C была меньше по сравнению с составами с добавлением фосфорной кислоты. Ни в одном из составов и условий хранения не наблюдалось снижения антиген-связывающей активности или интенсивности флуоресценции.

[0250] [Таблица 32]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После хранения при 25°C в течение 1 месяца	После воздействия светового излучения
N-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0% масс./об. Полисорбата 80	2,1	5,6	3,6	3,4
N-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты			0,05% масс./об. Полисорбата 80	2,1	5,7	3,8	3,5
N-3	20 ммоль/л Фосфорной			0% масс./об. Полисорбата 80	2,1	6,6	4,1	3,8
N-4	20 ммоль/л Фосфорной			0,05% масс./об. Полисорбата 80	2,2	6,7	4,3	3,9

[0251] [Таблица 33]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Количество нерастворимых мелких частиц (≥1,0 мкм/мл)
№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После хранения при 25°C в течение 1 месяца	После воздействия светового излучения
N-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0% масс./об. Полисорбата 80	1318	30588	38922	54915
N-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты			0,05% масс./об. Полисорбата 80	3737	11258	7085	4850
N-3	20 ммоль/л Фосфорной			0% масс./об. Полисорбата 80	7532	31998	37638	32926
N-4	20 ммоль/л Фосфорной			0,05% масс./об. Полисорбата 80	5228	7911	14801	7486

[0252] [Таблица 34]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Интенсивность флуоресценции
№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После хранения при 25°C в течение 1 месяца	После воздействия светового излучения
N-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0% масс./об. Полисорбата 80	0,0526	0,0540	0,0558	0,0521
N-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты			0,05% масс./об. Полисорбата 80	0,0539	0,0530	0,0546	0,0551
N-3	20 ммоль/л Фосфорной			0% масс./об. Полисорбата 80	0,0536	0,0540	0,0551	0,0537
N-4	20 ммоль/л Фосфорной			0,05% масс./об. Полисорбата 80	0,0528	0,0532	0,0546	0,0548

[0253] [Таблица 35]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Антиген-связывающая активность (%)
№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	В начале испытания	После воздействия светового излучения	После хранения при -20°C в течение 1 месяца	После хранения при 5°C в течение 1 месяца	После хранения при 25°C в течение 1 месяца
N-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0% масс./об. Полисорбата 80	117,29	99,94	93,37	100,00	113,16
N-2	20 ммоль/л Лимонной кислоты			0,05% масс./об. Полисорбата 80	99,00	91,59	93,61	104,03	104,86
N-3	20 ммоль/л Фосфорной			0% масс./об. Полисорбата 80	99,24	96,52	109,16	99,43	122,22
N-4	20 ммоль/л Фосфорной			0,05% масс./об. Полисорбата 80	99,59	85,06	108,81	92,74	105,92

[0254] Эксперимент 3-6. Исследование стабильности во время хранения состава, содержащего конъюгат IRDye800CW с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека

Образец состава, показанного в таблице 36, получали путем добавления PB010-2 в концентрации 10 мг/мл, сахарозы в концентрации 280 ммоль/л и полисорбата 80 в концентрации 0,05% масс./об. к приготовленному раствору, доведенному до pH 6,8 с использованием лимонной кислоты в концентрации 20 ммоль/л, и образец асептически фильтровали через фильтр, имеющий размер пор 0,22 мкм, и наливали в количестве 1,2 мл в стеклянный флакон (объемом 3 мл), и лиофилизировали. Стеклянный флакон закрывали резиновой пробкой и покрывали и закупоривали алюминиевой крышкой. После этого оценивали стабильность PB010-2 после испытания на термостабильность или испытания на воздействие светового излучения.

[0255] [Таблица 36]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество
O-1 (лиофилизированный продукт)	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80

[0256] Испытание на термостабильность проводили путем хранения образца в нормально помещенном состоянии при 40°C в течение 2 недель. Испытание на воздействие светового излучения проводили путем хранения образца в горизонтально помещенном состоянии и освещения 1000 люкс в течение 96 часов с использованием белой люминесцентной лампы. Стабильность PB010-2 до и после каждого испытания оценивали на основе количества мультимеров и интенсивности флуоресценции, измеренных методом SE-ВЭЖХ, и соотношения краситель-антитело, измеренного методом ОФ-ВЭЖХ. Метод SE-ВЭЖХ и метод ОФ-ВЭЖХ проводили в соответствии с экспериментом 3-3. Оценку интенсивности флуоресценции проводили так же, как в эксперименте 3-5.

[0257] Таблицы 37-39 демонстрируют результаты. Было показано, что описанные выше составы гарантируют, что PB010-2 остается стабильным либо после хранения при 40°C в течение 2 недель, либо после воздействия светового излечения.

[0258] [Таблица 37]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Количество мультимеров в SE-ВЭЖХ (%)
					В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
O-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80	2,0	2,1	2,2

[0259] [Таблица 38]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Соотношение краситель-антитело
					В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
O-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80	1,46	1,46	1,45

[0260] [Таблица 39]

№ Образца	Буферный агент	pH	Стабилизатор	Неионогенное поверхностно-активное вещество	Интенсивность флуоресценции
					В начале испытания	После хранения при 40°C в течение 2 недель	После воздействия светового излучения
O-1	20 ммоль/л Лимонной кислоты	6,8	280 ммоль/л Сахарозы	0,05% масс./об. Полисорбата 80	0,0548	0,0573	0,0558

УКАЗАТЕЛЬ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0261] SEQ ID NO: 1: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab PB009-1

SEQ ID NO: 2: Аминокислотная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab PB009-1

SEQ ID NO: 3: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь Fab PB009-1

SEQ ID NO: 4: Аминокислотная последовательность легкой цепи Fab PB009-1

SEQ ID NO: 5: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1

SEQ ID NO: 6: Аминокислотная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab P10-1

SEQ ID NO: 7: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2

SEQ ID NO: 8: Аминокислотная последовательность фрагмента тяжелой цепи Fab P10-2

SEQ ID NO: 9: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая легкую цепь Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 10: Аминокислотная последовательность легкой цепи Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 11: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-1

SEQ ID NO: 12: Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab P10-1

SEQ ID NO: 13: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-2

SEQ ID NO: 14: Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи Fab P10-2

SEQ ID NO: 15: Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 16: Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 17: Сигнальная последовательность тяжелой цепи для Fab PB009-1, Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 18: Сигнальная последовательность легкой цепи для Fab PB009-1, Fab P10-1 и Fab P10-2

SEQ ID NO: 19: Последовательность тандемных повторов внеклеточного домена MUC1

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Астеллас Фарма Инк.

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ КОМПЛЕКС МАРКИРУЮЩИЙ

САЙТ – FAB-ФРАГМЕНТ АНТИЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНТИТЕЛА

<130> FA1535-19221

<150> JP 2018-191605

<151> 2018-10-10

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 678

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab PB009-1

<220>

<221> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(678)

<400> 1

gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr

20 25 30

tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc 192

Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac 240

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt 288

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc 336

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg 480

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct 528

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg 576

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac 624

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt 672

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

gac tga 678

Asp

225

<210> 2

<211> 225

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент тяжелой цепи Fab PB009-1

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp

225

<210> 3

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь Fab PB009-1

<220>

<221> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(657)

<400> 3

gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc 48

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc 144

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc 192

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser

50 55 60

aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc 240

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac 288

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt 336

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag 384

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 432

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 480

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc 528

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa 576

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc 624

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 657

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 4

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Fab PB009-1

<400> 4

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 669

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1

<400> 5

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120

cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180

aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300

ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgactga

669

<210> 6

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

<210> 7

<211> 669

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2

<400> 7

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120

cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180

aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300

ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc 360

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540

tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660

tgtgactga

669

<210> 8

<211> 222

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

<210> 9

<211> 660

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая легкую цепь Fab P10-1 и Fab P10-2

<400> 9

gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60

atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120

tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180

agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300

tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 360

ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420

ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480

tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540

agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600

gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660

<210> 10

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь Fab P10-1 и Fab P10-2

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-1

<400> 11

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120

cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180

aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300

ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354

<210> 12

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-1

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-2

<400> 13

caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct 120

cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac 180

aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac 240

atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc 300

ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca 354

<210> 14

<211> 118

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-2

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 339

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи Fab P10-1 и

Fab P10-2

<400> 15

gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60

atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg 120

tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc 180

agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc 300

tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt 339

<210> 16

<211> 113

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи Fab P10-1 и Fab P10-2

<400> 16

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 17

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнальная последовательность тяжелой цепи для Fab PB009-1,

P10-1 и P10-2

<400> 17

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 18

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сигнальная последовательность легкой цепи для Fab PB009-1,

P10-1 и P10-2

<400> 18

Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Asp Ala Arg Cys

20

<210> 19

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Последовательность тандемных повторов внеклеточного домена

MUC1

<400> 19

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Ala Pro Pro Ala

20

<---

Claims

1. Фармацевтическая композиция для диагностики раковых заболеваний, экспрессирующих CEACAM5 человека, содержащая конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, буферный агент, стабилизатор и неионогенное поверхностно-активное вещество и имеющая pH от 6,5 до 7,5, где

Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранный из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(a) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4, и

(b) Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2, посредством модификации глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 2 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4,

маркирующий фрагмент представлен следующей формулой (I):

[Химическая формула 1]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом антитела против CEACAM5 человека, где Fab-фрагмент антитела против CEACAM5 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте антитела против CEACAM5 человека;

указанное неионогенное поверхностно-активное вещество содержит полисорбат 80;

концентрация указанного неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,02 до 0,2% масс./об.;

указанный буферный агент содержит лимонную кислоту;

концентрация указанного буферного агента составляет от 10 до 30 ммоль/л;

указанный стабилизатор включает сахарозу или глицерин; и

концентрация указанного стабилизатора составляет от 5 до 30% масс./об.

2. Фармацевтическая композиция для диагностики раковых заболеваний, экспрессирующих MUC1 человека, содержащая конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, буферный агент, стабилизатор и неионогенное поверхностно-активное вещество и имеющая pH от 6,5 до 7,5, в которой Fab-фрагмент античеловеческого антитела представляет собой один или более, выбранный из группы, состоящей из следующих (a) и (b):

(b) Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека, содержащий фрагмент тяжелой цепи, полученный из фрагмента тяжелой цепи, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, посредством модификации глутамина в аминокислотном положении 1 в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 в пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10, и

[Химическая формула 2]

где волнистая линия представляет связывание с Fab-фрагментом антитела против MUC1 человека, где Fab-фрагмент антитела против MUC1 человека связан с атомом углерода концевой C(=S)-группы маркирующего фрагмента через аминогруппу в Fab-фрагменте антитела против MUC1 человека;

3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где

концентрация конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела составляет от 5 до 20 мг/мл,

диапазон рН составляет от 6,5 до 7,0,

концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет от 0,04 до 0,1% масс./об., и

концентрация буферного агента составляет от 15 до 25 ммоль/л.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, где стабилизатор представляет собой сахарозу.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, где концентрация конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела составляет 10 мг/мл,

рН составляет 6,7,

концентрация неионогенного поверхностно-активного вещества составляет 0,05% масс./об.,

концентрация буферного агента составляет 20 ммоль/л, и

концентрация стабилизатора составляет 10% масс./об.

6. Фармацевтическая композиция по п.3, где стабилизатор представляет собой глицерин.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где концентрация конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела составляет 10 мг/мл,

рН составляет 6,7,

концентрация стабилизатора составляет 30% масс./об.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-7, в которой конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела дополнительно содержит ⁸⁹Zr.

9. Применение фармацевтической композиции по п.8 в диагностике колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака.

10. Применение фармацевтической композиции по п.8 в диагностике рака молочной железы или рака, возникшего в результате метастазирования рака молочной железы.

11. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-10, которая представляет собой жидкий состав, замороженный состав или лиофилизированный состав.

12. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, по п.1 или 2, включающий стадии:

(b) добавления лимонной кислоты в концентрации от 10 до 30 ммоль/л в качестве буферного агента;

(c) добавления сахарозы или глицерина в концентрации от 5 до 30% масс./об. в качестве стабилизатора;

(d) добавления полисорбата 80 в концентрации от 0,02 до 0,2% масс./об. в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества; и

(e) доведения pH до 6,5-7,5.

13. Способ стабильной консервации конъюгата маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела, содержащегося в фармацевтической композиции по п.1 или 2, включающий стадии:

(a) добавления лимонной кислоты в концентрации от 10 до 30 ммоль/л в качестве буферного агента к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела;

(b) добавления сахарозы или глицерина в концентрации от 5 до 30% масс./об. в качестве стабилизатора к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела;

(c) добавления полисорбата 80 в концентрации от 0,02 до 0,2% масс./об. в качестве неионогенного поверхностно-активного вещества к раствору, содержащему конъюгат маркирующего фрагмента с Fab-фрагментом античеловеческого антитела; и