JP6599238B2 - ムチン４（ｍｕｃ４）糖ペプチドに対する抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、抗体分野の技術に関する。より特定するとムチン４（MUC4）糖ペプチドに対する抗体およびこれを用いた悪性腫瘍の診断技術及び予防及び／又は治療技術に関する。
[関連出願の相互参照]
本出願は、２０１４年２月６日出願の日本特願２０１４−２０８６９号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。

ムチンは、気管、胃腸などの消化管、生殖腺などの内腔を覆う粘液の主要な糖タンパク質である。ムチンは、O-グリコシド結合を介してポリペプチド（コアタンパク質）に結合した無数の糖鎖をもつ。ムチンのコアタンパク質は様々なムチン遺伝子（MUC遺伝子）によりコードされている。ムチンの重要な役割は粘膜の保護や水和、潤滑作用にあるが、さらに上皮の分化と再生や、細胞接着、免疫反応、細胞シグナル伝達などの調節にも関与している。近年、多くのムチンのコアタンパク質をコードする遺伝子がクローニングされ、全配列、あるいは部分配列が明らかにされている。ほとんどのムチンが多くの反復配列ドメイン（タンデムリピート）を持っている。これらのタンデムリピートは、長さが様々なアミノ酸配列（タンデムユニット）の反復からなり、セリン残基、スレオニン残基、プロリン残基に富む。このセリン残基あるいはスレオニン残基に多様な構造のO-結合型糖鎖が多数付加し、完成されたムチンでは、O-グリコシル化された残基とされない残基（naked peptide）が一定割合で混在している。一般的に、糖鎖はN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース(Gal)、フコース(Fuc)、シアル酸(SA)、マンノース(Man)などから構成される。ムチンには上皮細胞などが産生する分泌型ムチンと、疎水性の膜貫通部位を持ち細胞膜に結合した状態で存在する膜結合型ムチンがある。

ムチンのコアタンパク質は総称してMUCと呼ばれており、発見順に番号が振られている。このコアタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトでは19種類（MUC1, 2, 3A, 3B, 4, 5AC, 5B, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19）が報告されており、そのうち、11種が膜貫通型ムチン、7種が分泌型ムチンである[非特許文献1]。

MUC4は、気管、結腸、胃、子宮頸膣部、肺などの上皮組織に存在する[非特許文献1]。さらに、MUC4は、様々な疾病、例えば癌と関係していることも知られている。

ヒトMUC4の細胞外ドメインは、７箇所の潜在的なO-グリコシル化部位を有する16アミノ酸残基のタンデムユニットを様々な数において含有する。O-グリカンにおいて、コアタンパク質のセリン、スレオニン残基にO-結合で最初に転移される糖は、GalNAcの場合が最も多く、ついでMan、Fuc、GlcNAcなどがある。O-グリカンは、癌細胞において不完全に処理されて、癌に一般的な糖抗原Tn（GalNAcα-１-Ser/thr）、STn（NeuAcα2-6 GalNAcα1-O-Ser/Thr）、及びT（Galβ1-3 GalNAcα-１-O-Ser/Thr）の発現をもたらす。最初の糖の後に次から次へと糖が転移され、O-グリカン糖鎖が伸長していく。最初にGalNAcが転移されたO-グリカンのコア構造は多種知られ、番号が付けられているが、以下にこれまで知られる主なコア構造を示す。この構造を元にして更に複雑な構造の糖鎖が伸長していく。
コア０（Tn antigen） GalNAc
コア１（T antigen） Galβ1-3GalNAc
コア２： Galβ1-3(GlcNAcβ1-6) GalNAc
コア３： GlcNAcβ1-3GalNAc
コア４： GlcNAcβ1-3(GlcNAcβ1-6) GalNAc
コア５： GalNAcα1-3GalNAc
コア６： GlcNAcβ1-6GalNAc
コア７： GalNAcα1-6GalNAc
コア８： Galα1-3GalNAc
コア９： Galβ1-3(Galβ1-6) GalNAc
コア１０： GalNAcβ1-3GalNAc
コア１１： GalNAcβ1-3(GalNAcβ1-6) GalNAc
コア１２： Galβ1-3(Glcβ1-6) GalNAc
コア１３： Galβ1-3(Glcβ1-4) (Glcβ1-6) GalNAc

ムチンコアタンパク質のO-グリコシル化による糖鎖付加は、上皮細胞表層の保護、免疫反応、細胞接着、炎症反応、及び癌化、癌転移に重要な役割を果たしている。ムチンのうちMUC１ムチンに関する研究は数多くなされ、癌化によるMUC1の過剰発現や、O-グリコシル化の劇的な変化と癌化及び癌転移との関連性が報告されている。更に、MUC1に対するモノクローナル抗体は、肺癌や卵巣癌を対象とした診断薬及び治療薬としての研究開発が進められている[非特許文献2、特許文献1、2]。

MUC4に関しては、癌化にともなってコアタンパク質の発現が著しく変動することが報告されている[非特許文献1]。更に、膵癌や食道癌において過剰発現したMUC4は、癌増殖及び転移を亢進することが認められている [非特許文献1]。一方、癌細胞のMUC4遺伝子発現抑制によって、癌細胞の増殖は著しく抑制されるとともにin vivoの検討において細胞遊走、細胞接着及び凝集を亢進することが明らかとなり、MUC4の機能を抑えることができれば、転移性癌の進行や転移を抑制することが可能であるとの知見が示されている。[非特許文献3]。更に最近、膵癌などの癌転移にはMUC4とガレクチンの相互作用が重要であることが認められてきた[非特許文献4、5]。

特許文献１：WO2010/050528
特許文献２：WO2011/135869
特許文献３：特開2006-111618号公報
特許文献４：WO2011/054359

非特許文献１：Chaturvediら、FASEB J. 22: 966-981 (2008)
非特許文献２：Beatsonら、Immunotherapy 2: 305-327 (2010)
非特許文献３：Singhら、Cancer Res. 64: 622-630 (2004)
非特許文献４：Liu and Rabinovich、Nature Rev. Cancer 5: 29-41 (2005)
非特許文献５：SanapatiらClin Cancer Res 17:267-274 (2011)
非特許文献６：Moniauxら、J. Histochem. Cytochem. 52: 253-261(2004)
非特許文献７：Zhangら、J. Cellular Physiol. 204: 166-177 (2005)
非特許文献８：Matsushitaら、Biochemistry 52:402-414 (2013)
非特許文献９：Hashimotoら、Chem. Eur. J. 17: 2393-2404 (2011)
非特許文献１０：Ohyabuら、J. Am. Chem.Soc. 131: 17102-17109 (2009)
非特許文献１１：Matsusitaら、Biochim. Biophy. Acta 1840: 1105-1116 (2014)
非特許文献１２：Sanapatiら、Clin Cancer Res 17:267-274 (2011)

過去に、構造が特定されない精製MUC4、MUC4遺伝子の組み換え型のペプチド及び合成ペプチドに対するいくつかのモノクローナル抗体が製造されてきた。例えばMUC4βユニットペプチドに対するモノクローナル抗体として8G7[非特許文献7]、MUC4のタンデムデムユニットペプチドSTGDTTPLPVTDTSSVに対するモノクローナル抗体として1G8[非特許文献6]が得られ、研究用のツールとして用いられている。MUC4に由来する糖ペプチドに対するモノクローナル抗体については、4D9、3C9、6E3, 6C11の報告［特許文献４］がある。しかし、いずれも認識するMUC4ペプチドに対する糖修飾の位置、数が特定されない特異性の低い抗体であった。

そこで本発明は、癌細胞に高発現する糖鎖構造を有するMUC4に特異性を有する抗体、この抗体作製に適した抗原となる糖ペプチド、並びに前記抗体による癌の診断と予防及び／又は治療の新たな手段及び方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、抗体のエピトープ領域では側鎖に結合する糖鎖の構造特異的に主鎖ペプチドのコンフォメーション変化が誘起されていることをNMRにより証明し、ペプチドのコンフォメーションが特定のアミノ酸残基での糖鎖修飾により敏感に変化しており、これが抗原構造を規定していることを抗MUC1抗体で明らかにした。[非特許文献8]また、ムチン由来の合成糖ペプチドの３次元構造の変化をMS及びNMRを用いて解析した結果、糖ペプチドのコンフォメーションが、ペプチドに数個存在するスレオニン残基への糖鎖修飾によって影響され、特定位置の糖鎖修飾がペプチド主鎖の安定したコンフォメーションをもたらすという新知見を示した[非特許文献9]。一方、糖鎖の多様な構造と機能を解明するために、[特許文献3]記載の化合物を初め多くのO-結合型糖アミノ酸及び糖ペプチドを合成してきた。

更に、抗体の特異性解析及びエピトープマッピングを正確に実施することができる、高感度・高性能の糖ペプチド固定化マイクロアレイを開発し、真のエピトープ構造を決定する新たな方法を確立した[非特許文献10、11]。

本発明者は、糖鎖及び糖ペプチドに関して本発明者らが得た新しい技術と知見を応用して、上記課題を解決するために、各種癌細胞に発現するMUC4の特定の領域の糖ペプチドを合成し、これを抗原に用いてモノクローナル抗体を作製した。１つの抗原からいくつか得られた抗MUC4抗体は、抗原に用いた糖ペプチドを含む各種ムチンの特定領域に由来する糖ペプチドを搭載したマイクロアレイを用いて抗体の特異性解析を行い、抗体の特性を検討した。更にこれらの抗体は、各種癌細胞に発現したMUC4への結合・集積、癌患者血清に対する反応、癌細胞増殖抑制作用、癌転移抑制作用などについて検討した。これら検討の結果に基づいて本発明は完成された。

本発明は、以下の通りである。
［１］
糖ペプチドに対するモノクローナル抗体であって、
前記糖ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトMUC4のタンデムユニットペプチド及びO-結合型糖鎖からなり、
前記O-結合型糖鎖は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）であり、かつ前記タンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニンに結合する、前記抗体。
［２］
下記i)〜iii)に示す結合特性を有するモノクローナル抗体。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず、
iii) MUC1、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しないか、結合しても弱い結合である。
［３］
受託番号NITE BP-01777として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-04である、［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体。
［４］
下記i)〜iv)に示す結合特性を有するモノクローナル抗体。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず、
iii) MUC2及びMUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに強く結合し、
iv) MUC1のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しない。
［５］
受託番号NITE BP-01774として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-01である、［１］又は［４］に記載のモノクローナル抗体。
［６］
受託番号NITE BP-01775として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-02である、［１］又は［４］に記載のモノクローナル抗体。
［７］
下記i)〜iii)に示す結合特性を有するモノクローナル抗体。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドにも結合し、
iii) MUC1、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しない。
［８］
受託番号NITE BP-01776として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-03である、［１］又は［７］に記載のモノクローナル抗体。
［９］
MUC4検出に用いるための［１］〜［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
［１０］
抗ヒトMUC4モノクローナル抗体の作製に用いるための糖ペプチドであって、
前記糖ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトMUC4のタンデムユニットペプチド又は配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペプチド及びO-結合型糖鎖からなり、
前記O-結合型糖鎖は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）であり、かつ前記タンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニンに結合する、前記糖ペプチド。
［１１］
ヒト体液サンプル中のMUC4を検出する方法であって、
(a) 上記サンプルを［１］〜［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と接触させ、
(b) 接触後のサンプルにおける抗体−抗原複合体の形成を測定することを含む、前記方法。
［１２］
前記体液サンプル中の、MUC4の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いるための［１１］に記載の方法。
［１３］
前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、［１２］に記載の方法。
［１４］
(a) ［１］〜［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と、
(b) 抗体−抗原複合体を測定するための試薬を含む、［１１］〜［１３］のいずれか1項に記載の方法に使用するためのキット。
［１５］
［１］〜［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防及び／又は治療用の医薬組成物。
［１６］
前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、［１５］に記載の組成物。
［１７］
［１］〜［８］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体及び化学療法剤または分子標的薬を有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防及び／又は治療用の医薬組成物。
［１８］
前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］
前記モノクローナル抗体及び化学療法剤または分子標的薬は、互いに異なる投与スケジュールで用いられる［１７］又は［１８］に記載の医薬組成物。

本発明により、MUC4に由来する抗原糖ペプチドの糖鎖コア構造を特異的に認識して結合する抗MUC4抗体及び抗体を作成するための抗原糖ペプチドが提供される。本発明の抗MUC4抗体を用いることにより、特異的かつ高感度に、信頼性をもって、かつ簡便にMUC4タンパク質を検出することができ、正常対照に対してMUC4発現の変化が認められる悪性腫瘍や炎症疾患を判定することが可能になる。
更に本発明の抗MUC4抗体で癌の進行や転移を抑えることによって、癌の予防及び／又は治療薬として用いることが可能であることが示された。

MUC4由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 MUC1由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 MUC2由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 MUC16由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル。 糖ペプチド固定化マイクロアレイのレイアウト及び各抗体の反応特異性評価を示す。(A) MUC4由来糖ペプチド固定化アレイ。 糖ペプチド固定化マイクロアレイのレイアウト及び各抗体の反応特異性評価を示す。(B) MUC1由来糖ペプチド固定化アレイ、(C) MUC2由来糖ペプチド固定化アレイ、(D) MUC16由来糖ペプチド固定化アレイ。 実施例６で得たSN-01の膵癌細胞BxPC-3集積の免疫蛍光染色画像。 実施例７で得た細胞増殖阻害（SN-01の乳癌細胞OCUB-Mに対する増殖阻害）実験の結果を示す。 実施例９で得たSN-01とゲムシタビンの併用による膵癌細胞増殖阻害実験の結果を示す。 実施例９で得たSN-01とドセタキセルの併用による乳癌細胞増殖阻害実験の結果を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
１．抗原糖ペプチド及び抗体
本発明に係わる抗体は、下記糖ペプチドに対するモノクローナル抗体である。
前記糖ペプチドは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトMUC4のタンデムユニットペプチド及びO-結合型糖鎖からなる。
さらに前記O-結合型糖鎖は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）であり、かつ前記タンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニンに結合する。

１−１．抗原糖ペプチド
「MUC4」は、ムチン糖タンパク質の一種である。MUC4の膜貫通型は細胞表層の保護などに、分泌型は潤滑作用、異物・病原体の捕捉による管腔表面の保護などにそれぞれ関与していると考えられている。MUC4のコアタンパク質をコードする遺伝子MUC4は、ヒト気管気管支粘膜のcDNAライブラリーやヒト膵癌細胞株からクローニングされている[非特許文献1]。MUC4コアタンパク質は550〜930kDaの分子サイズがあり、短いN末端領域、アミノ酸の反復配列からなる中央領域、及びC末端領域の3領域からなる。C末端領域は、MUC4の様々な機能に関与するCT-1〜CT12の12ドメインからなり、膜貫通ドメイン及び短い細胞質尾部を有する。N末端領域、中央領域及びC末端の一部を含む細胞外の巨大ユニットはMUC4αサブユニット、それ以外の膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むC末端ユニットはMUC4βサブユニットに区分される。ヒトMUC4は、16アミノ酸からなるタンデムユニットが特徴的である。

配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトMUC4のタンデムユニットペプチドは、下記アミノ酸配列を有する（配列番号１）。
Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser
但し、抗体作製においては、上記タンデムユニットペプチドをキャリアタンパク質と結合させるために、Cysを付加した下記糖ペプチド（配列番号２）及びO-結合型糖鎖からなる糖ペプチドを抗原として用いた。
Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys

前記O-結合型糖鎖は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）である。さらに、前記O-結合型糖鎖は、前記タンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニン（Thr）に結合する。

8番目のスレオニン（Thr）に、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）を有するペプチド(配列番号1) を以下の(a)に示す。配列番号2のペプチドにおいても同様である。
(a) Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser

抗原糖ペプチドの合成は、本発明者らが開発した、マイクロ波と酵素合成法とGlycoblotting法を高度に活用した合成技術により行うことができる。より具体的には、例えば、非特許文献１１や特許文献1〜3記載の方法に準じて実施できる。詳細な合成例は、実施例１に記載した。

１−２．抗体
本発明の抗体は、上記糖ペプチドを抗原として用いて常法により調製できる。
実施例に示した方法により合成した抗原糖ペプチドを用いて、抗MUC4モノクローナル抗体を作製することができる。抗原性を高めるためキャリアタンパク質と結合させても良く、その場合、上記糖ペプチドにキャリアタンパク質との結合に必要なCysを付加したものを合成し、抗原糖ペプチドとして用いることができる。キャリアタンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）、オボアルブミン（OVA）などがあり、当技術分野では公知であり市販のキットも販売されている。抗原を哺乳類、例えばマウス、ウサギ、ラットなどに投与する。免疫は主として静脈内、皮下、腹腔内、足蹠に注入することにより行われる。また免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜５回の免疫を行う。最終の免疫日から数日から90日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、リンパ節細胞、脾臓細胞、末梢血細胞などが挙げられる。ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。ミエローマ細胞は、一般に入手可能な株化細胞を用いることができる。使用する細胞としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生育できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが望ましい。ミエローマ細胞としては、例えばSP2、P3X63-Ag.8.UI(P3UI)、NS-1などのミエローマ細胞株が挙げられる。

細胞融合後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、細胞懸濁液をウシ胎児血清含有RPM-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまく。各ウエルに選択培地（例えばHAT培地）を加え、以後適当に選択培地を交換して細胞培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10〜30日程度で生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。次に、ハイブリドーマの上清を、MUC4に反応する抗体が存在するか否かについて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）等を用いてスクリーニングする。融合細胞のスクリーニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。

樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法などを採用することができる。抗体の精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることによって精製することができる。

本発明において使用可能なモノクローナル抗体のグロブリンタイプは、特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDのいずれでも良いが、IgG及びIgMが好ましい。

本発明の抗MUC4モノクローナル抗体はマウス抗体であるが、これらは公知の幾つかの確立された技法を用いて、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体に変換し製造することができる。

本発明のモノクローナル抗体の具体例は、実施例にも記載されているSN-01〜SN-04であり、これらのモノクローナル抗体は、ブダペスト条約に基づき独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）（〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に2013年12月5日に受託番号NITE BP-01774〜 NITE BP-01777として寄託されたハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ分泌される、モノクローナル抗体である。

モノクローナル抗体SN-01は、下記i)〜iv)に示す結合特性を有する。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず、
iii) MUC2及びMUC１６のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに強く結合し、
iv) MUC１のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しない。

モノクローナル抗体SN-02は、下記i)〜iv)に示す結合特性を有する。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず、
iii) MUC2及びMUC１６のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合し、
iv) MUC１のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しない。

モノクローナル抗体SN-03は、下記i)〜iii)に示す結合特性を有する。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドにも結合し、
iii) MUC１、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しない。

モノクローナル抗体SN-04は下記i)〜iii)に示す結合特性を有する。
i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cysに強く結合し、但し、Tnは、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）からなるO-結合型糖鎖を示す、
ii) 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有するペプチド（naked peptide）及び配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、かつ抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず、
iii) MUC1、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しないか、結合しても弱い結合である。

２−１．ヒト体液サンプル中のMUC4を検出する方法
本発明は、ヒト体液サンプル中のMUC4を検出する方法を包含し、この方法は以下の(a)及び(b)の工程を含む。
(a) 上記サンプルを本発明のモノクローナル抗体と接触させる、
(b) 接触後のサンプルにおける抗体−抗原複合体の形成を測定する。

２−２．ヒトMUC4の免疫学的測定用キット
本発明のキットは、上記本発明のヒトMUC4検出方法に使用するためのキットであって、
(a) 本発明のモノクローナル抗体と、
(b) 抗体−抗原複合体を測定するための試薬とを含む。

上記キットに用いられる本発明の本発明のモノクローナル抗体（抗MUC4抗体と呼ぶこともある）は、担体に固定化することができる。担体は、抗原が付着し得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、担体は、マイクロタイタープレートの試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切な膜であり得る。あるいは、担体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック物質）であり得る。担体はまた、磁性粒子または光学繊維センサーであり得る。

本発明の抗MUC4抗体は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、または目視判定可能な簡易測定法などでは金コロイドや着色ラテックスなどにより標識され得る。標識に用いられる放射性同位元素としては、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどであり、特に、¹²⁵Ｉが好適に用いられる。これらは、クロラミンＴ法、ペルオキシダーゼ法、Ｉｏｄｏｇｅｎ法、ボルトハンター法などにより、モノクローナル抗体に結合され得る。標識に用い得る酵素としては、例えば、βガラクトシダーゼ（βＧＡＬ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などを含む。これらは常法によりモノクローナル抗体に結合され得る。標識に用いる蛍光物質としては、フルオレセイン、フルオレサミン、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートなどがある。標識に用いる発光物質としては、ルシフェリン、ルミノール誘導体、アクリジニウムエステルなどがある。簡易測定法などでは、金コロイドや着色ラテックスを用いてもよい。

抗体−抗原複合体を測定するための試薬は、用いられる免疫学的測定方法に応じて適宜決定できる。ヒト体液サンプル中にヒトMUC4が含まれる場合に形成される抗体−抗原複合体を検出し得る公知の試薬を用いることができる。

本発明において、「ヒト体液サンプル」とは、例えば、ヒトの血漿、血清、血液、尿、唾液、癌組織分泌物などのヒトMUC4を含む可能性がある試料である。
などである。

本発明の検出方法は、抗体として本発明のモノクローナル抗体を用いること以外は、従来公知の免疫学的測定方法を用いて実施できる。従来公知の免疫学的測定方法としては、例えば、免疫組織化学染色法及び免疫電顕法、並びに免疫アッセイ[酵素免疫アッセイ（ELISA、EIA）、蛍光免疫アッセイ、放射性免疫アッセイ（RIA）、免疫クロマト法、免疫凝集法及びウエスタンブロット法等]等を挙げることができる。工程(b)における接触後のサンプルに形成された抗体−抗原複合体形成を測定する方法は、免疫学的測定方法に応じて適宜選択できる。

免疫学的測定法についてより詳細に説明する。本発明のモノクローナル抗体（第１のモノクローナル抗体）を固相に固定し、抗原を含む試料と共にインキュベートする工程、さらに標識した第２のモノクローナル抗体を加えて、得られた混合物をインキュベートする工程、および混合物中の生成した標識された抗原抗体複合体を検出する工程を包含するサンドイッチ免疫学的測定法が例示される。また、本発明の免疫学的測定法では、試料と、固相化した第１のモノクローナル抗体および標識した第２のモノクローナル抗体とを同時にインキュベートしてもよい。サンドイッチ免疫学的測定法としては、その検出方法により、サンドイッチ放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、サンドイッチ酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、サンドイッチ蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、サンドイッチ発光免疫測定法（ＣＬＩＡ法）、サンドイッチ発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、サンドイッチ法に基づく免疫クロマトグラフ法などの全てのサンドイッチ免疫測定法が応用しうる。定量のためには、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法が好ましい。

好ましい実施態様によれば、サンドイッチＲＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＲＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体（本発明のモノクローナル抗体）を固相したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、例えば¹²⁵Ｉで標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃〜４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体／抗体複合体を形成する（第２反応）。洗浄後、ビーズに結合した抗原抗体複合体の放射活性をガンマーカウンターなどで検出することによりの量を測定し得る。他の好ましい実施態様によれば、サンドイッチＥＩＡ法が行われ得る。サンドイッチＥＩＡ法は、具体的には、標準溶液または試料に、第１のモノクローナル抗体を固定したビーズを加えて混和し、４℃から４５℃、好ましくは２５℃から３７℃で、１から４時間、好ましくは２時間インキュベートする（第１反応）。洗浄後、酵素標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した第２のモノクローナル抗体を含む溶液を加え、４℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で、１〜４時間好ましくは２時間インキュベートし、ビーズ上に抗体−抗体からなる免疫複合体を形成する（第２反応）。ビーズ上の酵素活性を、酵素に特異的な基質、例えば、標識酵素がＨＲＰであればテトラメチルベンヂチン（ＴＭＢ）を介して比色法により測定し、それによりビーズ上の捕獲された量を測定し得る。比色定量は、通常の分光光度計などで行われ得る。

２−３．ヒトMUC4の検出
本発明の方法は、体液サンプル中のMUC4の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いることができる。MUC4の異常な発現がみられる悪性腫瘍としては、例えば、膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである。本発明の抗体は、上述したように、MUC4と特異的に反応するために、ヒトMUC4に関連する、膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌などの悪性腫瘍の検出に有効である。

MUC4の異常な発現が結腸、膵、乳房、卵巣などの悪性腫瘍において報告されている。MUC4は正常な膵や慢性膵炎では発現が認められないが、膵癌及び膵癌細胞株の大部分で発現が認められる。同様に、MUC4は化生性膵管に発現しているが悪性度の高い上皮内癌で発現が増加する。また、MUC4の発現は、卵巣癌、肺癌、胆道癌、悪性度の高い食道異形成及び食道癌において、正常組織や細胞に比べて亢進される[非特許文献1]。

MUC4のVNTRs領域に見られるO-糖鎖修飾は、正常上皮組織では通常8−10個の単糖ユニットを含むポリラクトサミン型の長鎖及び分岐鎖糖で構成される。正常MUC4は細胞外領域がこのような沢山の糖鎖で修飾されることで、粘膜の保護や水和、潤滑作用、細菌や異物の攻撃からの保護作用、細胞間及び細胞マトリックス間相互作用の調節作用を示す。又、MUC4は正常細胞では細胞頂端（apical）に発現するが、癌細胞では頂端発現が無くなり無極性発現となり、細胞表層全体にMUC4が表出する。その際に、VNTR領域のO-糖鎖修飾のパターンは一変し、正常細胞に見られた長鎖及び分岐鎖で構成される複雑な糖鎖に変わって、単純で短い糖鎖によるO-糖鎖修飾が認められる。癌化に伴うMUC4の無極性発現及び低糖鎖修飾は、正常な潜在的（cryptic）ペプチドエピトープの露出及び新規炭水化物エピトープを創出させる。従って、MUC4のこれらのエピトープに特異的に反応する本発明の抗体は、正常及び癌のMUC4を区別して認識することができ、ヒトMUC4に関連する悪性腫瘍の検出において用いることができる。更に癌細胞に陽性のMUC4のみを攻撃することも可能になる。

本発明の免疫学的測定用キットは、上述した抗MUC4抗体を含むものである。従って、本発明のキットを用いて、疾患への罹患又は障害の存在が疑われる被検体から採取したサンプル中に含まれるヒトMUC4を検出することによって、該被験体の疾患または障害の存在を迅速かつ簡便に判定することができる。このような免疫学的測定方法を利用した疾患又は障害の判定用試薬は周知であり、当業者であれば、抗体以外の適当な成分を容易に選択することができる。また本発明の免疫学的測定用キットは、免疫学的測定方法を行うための手法であればいずれの方法においても利用することができる。

本発明は、本発明の抗体を用いる癌の診断法、本発明の抗体を含む診断剤、あるいは抗体を含む診断キットを提供することもできる。本発明の癌の診断法、診断剤または診断キットにおいて含まれる抗体は、上述した本発明の抗体である。本発明の抗体は、前述の特定の癌に特異的に結合することから、これらの癌の診断に使用されうる。

本発明の抗体は、前述した悪性腫瘍の診断のためまたは患者における疾患の進行をモニターするためのマーカーとして使用され得る。１つの実施態様において、患者の癌は、患者から得られる生物学的サンプルを、MUC4レベルについて、あらかじめ決定されたカットオフ値と比較して評価することにより診断され得る。

上記(b)で得られた測定結果と対照サンプルに於いて同様の(a)及び(b)の工程を経て得られた測定結果とを比較して、測定された体液サンプルにおける悪性腫瘍の有無の検出に用いることができる。対照サンプルは、健常人から入手した体液サンプルであることができる。

癌の存在または非存在を決定するために、固相支持体に結合して留まるレポーター基から検出されるシグナルは、一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの実施態様において、カットオフ値は、固定された抗体が癌を有さない患者からのサンプルとともにインキュベートされた場合に得られるシグナルの平均値である。一般に、あらかじめ決定されたカットオフ値を上回る３つの標準偏差であるシグナルを生じるサンプルは、癌について陽性であると考えられる。カットオフ値は、例えば、診断試験結果のそれぞれの可能なカットオフ値に対応する真の陽性の割合（すなわち、感受性）および偽陽性の割合（100％−特異性）の組のプロットから決定され得る。上部左隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最大領域を含む値）は最も正確なカットオフ値であり、そして本発明の方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、プロットに沿って、偽陽性の割合を最小にするために左にシフトし得るか、または偽陰性の割合を最小にするために右にシフトし得る。一般に、本方法により決定されるカットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルは、その癌について陽性であるとされる。

３．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、モノクローナル抗体を有効成分として含有する悪性腫瘍の予防及び／又は治療用の医薬組成物であり、任意で医薬的に許容される担体を含むことかできる。前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである。

本発明の抗MUC4抗体は、MUC4が関わる疾患の予防及び／又は治療に用いることができる。MUC4が関わる疾患としては、膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌などの悪性腫瘍がある。これらの悪性腫瘍の患者においては、MUC4の発現の異常、MUC4の糖鎖構造の異常及びそれによる機能の異常が認められるので、本発明の抗MUC4抗体は悪性腫瘍を抑制する作用によって、悪性腫瘍を予防及び／又は治療することが可能である。

本発明の抗MUC4抗体は、MUC4発現の異常、MUC4の糖鎖構造の異常及びそれによる機能の異常が認められる膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌に対し、それらの異常によって生起される細胞増殖の亢進や癌細胞転移などを抑制することによって、癌の予防及び／又は治療をすることが可能である。

更に最近、膵癌などの癌転移にはMUC4とガレクチンの相互作用が重要であることが認められてきた。癌細胞が浸潤や転移する際には、原発部位を離れ周辺の細胞外マトリックス及び内皮細胞に浸潤し、血管及びリンパ管に浸透して、最終的に２次部位に付着し増殖する。癌細胞を循環から転移部位への遊出は、(i)循環する癌細胞の停止及び癌細胞と血管内皮細胞との一過性の弱い接触（ドッキング）(ii)種々の接着受容体（インテグリンやカドヘリンなど）とそのリガンドの発現／局在の変化の誘導、及びそれに続く(iii)癌細胞の血管内皮細胞への強い付着（ロッキング）のプロセスを踏むが、これら３つのプロセスにMUC4とガレクチン３の相互作用が主要な役割を果たしていることが分かってきた。ガレクチンは、β-ガラクトシド構造を認識して結合あるいは糖鎖同士を架橋するタンパク質を総称するが、ガレクチン３は15種あるガレクチンの1種で、内皮細胞や免疫細胞の細胞質内、核、細胞表面、細胞外マトリックス等に存在することが知られている。非特許文献12は、癌細胞のMUC4がガレクチン３に結合すること、転移癌患者の血中ガレクチン３濃度は、正常対照に比べて上昇していること、循環癌細胞の血管内皮細胞への接着が癌細胞のMUC4発現及び内皮細胞の細胞外ガレクチン３の存在に依存すること、細胞外ガレクチン３の癌細胞MUC4への結合によってMUC4の細胞表層の局在が著しく変化し癌細胞と血管内皮細胞の結合が強くなることなどを証明し、血中ガレクチンとMUC4の相互作用が癌細胞の遠隔臓器への転移に重要な基本的分子機構であることを明らかにしている。従って、MUC4とガレクチン３との結合をブロックすることができれば、上記の癌転移プロセスの(i)〜(iii)はいずれも抑止され、癌転移は抑制されることが可能になると考えられる。

後述の実施例において、本発明の抗体が、MUC4とガレクチン３の結合を阻害することを示した。従って、本発明の抗体を用いて、膵癌、卵巣癌、肺癌などの癌化によりMUC4を過剰発現する癌の転移の予防及び／又は治療が可能であることが示唆された。

本発明の抗MUC4モノクローナル抗体はマウス抗体である。本発明の医薬組成物に用いる抗体は、マウス抗体をキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体に変換したものであることが好ましい。マウス抗体のキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体への変換は公知の方法を用いて行うことができる。

本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を有効成分として、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。また、リポソームも細胞送達のために該薬剤をカプセル化するために使用可能である。

投与は、経口又は非経口であり、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。

本発明の抗体の用量および投与方法は、患者の年齡、体重、性別、治療すべき症状の性質もしくは重篤度等により適宜選択することができる。本抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の年齢、体重、性別、症状などにより変動するが、当事者であれば適宜選択することが可能である。

本発明の医薬組成物の別の態様は、本発明の抗体と化学療法剤又は分子標的薬とを有効成分として含有する悪性腫瘍の予防及び／又は治療用組成物である。本発明の抗体と化学療法剤又は分子標的薬とを併用することによって、化学療法剤が悪性腫瘍を抑制する作用を強めることができる。化学療法剤又は分子標的薬に本発明の医薬組成物を併用することによって化学療法剤の用量を減少させることができ、化学療法剤又は分子標的薬の効果を減ずることなく副作用を減少させて治療濃度域を広げることが可能になる。本発明の抗体と化学療法剤又は分子標的薬の投与は、一時に行うこともできるし、別々に行うこともできる。別々に投与する場合（互いに異なる投与スケジュールで用いる場合）は、間を空けず連続して投与することも、所定の時間を空けて投与することもできる。

本発明の医薬組成物において、本発明の抗体と併用することができる化学療法剤及び分子標的薬は、特に制限はないが、例えば、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、テガフール、テガフール・ウラシル 、TS-1、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバジド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、アクチノマイシンD 、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、アナストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタジン、ビカルタミド、トレミフェン、フルタミド、ブレドニゾロン、ホスフストロール、ミトタン、メチルテストステロン、リュープロレリン、レトロゾール、メチルメドロキシプロゲストロン、メピオスタチン、イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブなどが挙げられる。

本発明の医薬組成物において、本発明の抗体と化学療法剤及び分子標的薬の併用量は、特に制限はなく、本発明の抗体の使用量は、前述のように、抗体を単独で使用する場合の用量を参照して決定する事ができる。また、化学療法剤及び分子標的薬の使用量は、それぞれの薬剤の規定の用量に応じて、あるいはそれを減じて(本発明の抗体の併用効果を見込んで)使用することができる。

以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。

糖ペプチドの合成
抗体の特異性評価のための糖ペプチドの合成法を以下に示した。いずれの化合物にも特異性評価に用いるための架橋用のケトンを、また化号物１〜９にはＣｙｓを結合させた配列の化合物を合成した。

5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH ₂ （化合物１）の合成
ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol,ラップポリマー社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５，ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１を得た(9.0mg,収率11%)。

5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr(Tn)-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH ₂ （化合物２）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，１００mg, ２４μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（９６μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９６μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（９６μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ：Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−３,４,６−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル｝−Ｌ−スレオニン（２９μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５，ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物２を得た (6.4mg,収率14%)。

5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr(Tn)-Asp-Thr-Ser-Cys-NH ₂ （化合物４）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，１００mg, ２４μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（９６μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９６μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（９６μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（２９μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物４を得た(10.0mg,収率21%)。

5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr(Tn)-Ser-Cys-NH ₂ （化合物５）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，１００mg, ２４μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（９６μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９６μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（９６μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（２９μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（２９μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（２９μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物５を得た(14.4mg,収率31%)。

5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH ₂ （化合物６）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，５０mg, １２μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物６を得た (6.3mg,収率22%)。

5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Tn)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH ₂ （化合物７）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，１００mg, ３６μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１４４μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１４４μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１４４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２１６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（４３μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４３μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４３μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１０８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（４３μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４３μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物７を得た(13.3mg,収率15%)。

5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH ₂ （化合物８）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、N-α-Fmoc-O-［2',3',4',6'-テトラ-O-アセチル-D-ガラクトピラノシル-β(1→3)-2-アセトアミド-2-デオキシ-４,６-ジ- O-アセチル-α-Ｄ-ガラクトピラノシル］-L-スレオニン（５８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物８を得た (22.0mg,収率17%)。

5-oxohexanoyl-Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr(Sialyl-T)-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser- Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH ₂ （化合物９）の合成
化合物８（１０ｍＭ, ３００μｌ, water）を１０００ ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０, ３０μｌ）, １０００ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０, ３０μｌ）, １０００ｍＭ ＭｎＣｌ₂（６μｌ）, １５０ｍＭ ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ（６０μｌ）, １．４Ｕ／ｍＬ α２,３−（Ｏ）−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, Ｒａｔ, Ｒｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ, Ｓ. ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（３０μｌ, Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）, ｗａｔｅｒ（７４μｌ）を混合した反応液に混合した。２５℃で２４時間インキュベート後、反応液を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物９を得た(5.5 mg,収率60%)。

5-oxohexanoyl-Pro-Pro-Thr-Thr-Thr-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-Thr-Thr-Leu-Pro-Pro-Thr-NH ₂ （化合物１０）の合成
ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４８mmol/g，２５mg, １２μmol,バイオタージ社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で９分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５, ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１０を得た(7.2mg,収率30%)。

5-oxohexanoyl-Pro-Pro-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Pro-Ser-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Leu-Pro-Pro-Thr-NH ₂ （化合物１１）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４８mmol/g，２５mg, １２μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（４８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（４８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で９分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（１４μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（１４μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（１４μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３６μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＰｙＢＯＰ（１４μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（１４μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水：トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５, ｖ／ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１１を得た(4.7mg,収率14%)。

5-oxohexanoyl-Val-Gly-Pro-Leu-Tyr-Ser-Gly-Cys-Arg-Leu-Thr(Tn)-Leu-Leu-Arg-Pro-Glu-Lys-His-Gly-Ala-Ala-NH ₂ （化合物１２）の合成
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてRink Amide-ChemMatrix resin（０．４８mmol/g，５０mg, ２４μmol）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（９６μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９６μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（９６μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で９分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（２８μｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（２８μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（２８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７２μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＰｙＢＯＰ（２８μｍｏｌ）とＨＯＡｔ（２８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で１時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物１２を得た(9.0mg,収率15%)。

実施例１ 化合物３の合成5-oxohexanoyl-Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH ₂ （化合物３）
糖ペプチド固相合成は、固相担体としてTentaGel S RAM resin（０．２４mmol/g，２００mg, ４８μmol,ラップポリマー社製）を用いた。アミノ酸伸長反応は、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体（１９２μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９２μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１９２μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２８８μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で６分間反応した。糖鎖置換アミノ酸伸長反応は、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ａｃ３ＧａｌＮＡｃα）−ＯＨ（５８μｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１４４μｍｏｌ）のＤＭＦ溶液でマイクロ波照射下１０分間反応した。さらに、ＨＢＴＵ（５８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５８μｍｏｌ）を加えてマイクロ波照射下１０分間反応した。無水酢酸／ＤＩＥＡ／ＤＭＦ（１０：５：８５, ｖ／ｖ／ｖ）溶液で室温下１分間処理して未反応のアミノ基のアセチル化を実施した。続いて、マイクロ波照射（４０Ｗ、２４５０ＭＨｚ、５０℃）の条件下、２０％ピペリジン／ＤＭＦで３分間処理してＦｍｏｃ基を脱保護した。糖ペプチドの合成は、これら３工程（１）各種Ｆｍｏｃアミノ酸での伸長、（２）アセチル化処理、（３）脱Ｆｍｏｃ化を順次繰り返した。得られた固相樹脂をトリフルオロ酢酸：水（９５：５, ｖ／ｖ）で２時間処理した。反応液を濾過しエーテルを加えて沈殿させて、粗結晶を得た。粗生成物をメタノールに溶解して、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ１２．０−１２．５に調整して室温下１時間処理した。１０％酢酸を加えてｐＨ７付近に調整した後、溶媒を留去した。得られた残渣を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製を行い、凍結乾燥粉末として化合物３を得た(13.0mg,収率14%)。

化合物１〜１２の同定データを以下にまとめて記載する。
MUC4由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図１）
(a) 化合物1, m/z calcd for C₇₃H₁₈₁N₂₀O₂₈S [M + Na]⁺ 1777.804, found 1777.910;
(b) 化合物2, m/z calcd for C₈₁H₁₃₁N₂₁O₃₃S [M + Na]⁺ 1980.884, found 1980.994;
(c) 化合物3, m/z calcd for C₈₁H₁₃₁N₂₁O₃₃S [M + Na]⁺ 1980.884, found 1981.045;
(d) 化合物4, m/z calcd for C₈₁H₁₃₁N₂₁O₃₃S [M + Na]⁺ 1980.884, found 1981.054;
(e) 化合物5, m/z calcd for C₈₁H₁₃₁N₂₁O₃₃S [M + Na]⁺ 1980.884, found 1980.996
MUC1由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図２）
(a) 化合物6, m/z calcd for C₁₀₀H₁₆₀N₃₀O₃₄S [M + H]⁺ 2358.151, found 2358.383;
(b) 化合物7, m/z calcd for C₁₀₈H₁₇₃N₃₁O₃₉S [M + H]⁺ 2561.231, found 2561.457;
(c) 化合物8, m/z calcd for C₁₁₄H₁₈₃N₃₁O₄₄S [M + H]⁺ 2723.283, found 2723.504;
(d) 化合物9, m/z calcd for C₁₂₅H₂₀₀N₃₂O₅₂S [M + H]⁺ 3014.379, found 3014.640
MUC2由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図３）
(a) 化合物10, m/z calcd for C₉₀H₁₄₄N₂₀O₃₁ [M + Na]⁺ 2024.020, found 2024.111;
(b) 化合物11, m/z calcd for C₁₂₂H₁₉₆N₂₄O₅₁ [M + Na]⁺ 2836.338, found 2836.501
MUC16由来糖ペプチドのMALDI-TOFMSスペクトル（図４）
(a) 化合物12, m/z calcd for C₁₁₃H₁₈₇N₃₂O₃₃S [M + H]⁺ 2552.366, found 2552.588

実施例２
Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Serを抗原として用いたモノクローナル抗体の作製
Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-SerのN末端にキャリアータンパク質結合に必要なCysを付加した化合物Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr(Tn)-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys-NH ₂ （８５μｇ）をキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）とコンジュゲートし、マウスBDF（登録商標）-1テールベースに投与し免疫反応を惹起した。17日後に同様の方法で化合物３の追加免疫を行い、3日後に採血して腸骨リンパ節を採集した。採集した細胞はミエローマ細胞SP2と細胞融合後、HAT選択培地で培養し抗体産生細胞を選択した。次に、得られたハイブリドーマの培養上清をELISAプレート上にまき、化合物３との結合反応でスクリーニングした。

融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体SN-01、SN-02、SN-03及びSN-04をそれぞれ産生するハイブリドーマ株2D5-2E12（独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）特許微生物寄託センター（NPMD）受託番号NITE BP-01774）、2D5-1E7（NPMD受託番号NITE BP-01775）、3G8-2D10（NPMD受託番号NITE BP-01776）及び4A9-2B6（NPMD 受託番号 NITE BP-01777）を樹立した。

実験例３ モノクローナル抗体（SN-01、SN-02、SN-03又はSN-04）産生細胞株の培養と、抗体の精製取得
培養法：SN-01を産生するハイブリドーマ株2D5-2E12を、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI-1640培地で増殖させた。回収した8.1×10⁶個の細胞に対し、22 mlの無血清培地 Panserin H4000（PAN-Biotech）を加えて懸濁し、培養することにより、この培地への馴化を行った。馴化した細胞を同培地で1.0×10⁸個程度まで増殖させ、5.0×10⁵/mlとなるように継代した。これを2週間静置培養した後に、遠心分離により培養上清を得た。各ハイブリドーマ株2D5-1E7、3G8-2D10及び4A9-2B6についても同様な方法で培養した。

精製法：培養したハイブリドーマ株2D5-2E12、2D5-1E7、3G8-2D10及び4A9-2B6から、おのおのSN-01〜04を以下の方法で精製した。培養上清200ｍｌを0.45μmのフィルターでろ過し、抗体精製の材料とした。または培養上清に硫酸アンモニウムを加えて50%飽和とし、10000 g、20分間の遠心分離により沈殿を回収した。これを10 mlのPBSに溶解し、さらに同溶液に対して透析したものを精製材料として、HiTrap Protein G HPカラム（GEヘルスケア）によるアフィニティークロマトグラフィーに供した。AKTA explorer 100（GEヘルスケア）に接続したHiTrap Protein G HPカラムを、20 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）で平衡化し、培養上清を添加した。同緩衝液でカラムに結合しない不要な成分を洗浄した後に、抗体を0.1 M グリシン塩酸緩衝液（pH 2.5）で溶出し、少量の1 M トリス塩酸緩衝液（pH 9.0）の添加により中和した。また、カラムを通過した画分を繰り返しカラムに添加、溶出することにより、抗体の回収率が向上した。ここまでの作業を通して、SN-01、SN-02、SN-03及びSN-04をそれぞれ0.65mg、1.1mg、0.3mg 及び1.1mg得ることができた。

実施例４ 抗体との反応特異性評価
糖ペプチド固定化アレイの作製
糖鎖固定化アレイ用基板（住友ベークライト社製）を２Ｍ ＨＣｌで３７℃、２時間処理し、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）の脱保護を行った。水で2回洗浄後、乾燥させ、基板表面にアミノオキシ基を作製した。表１に示した各合成糖ペプチドにスポッティング溶液（25mM AcOH/Pyridine, 0.005%Triton X-100, pH 5.4）を加え溶解し、スポッター（BioChip Arrayer、Cartesian社製)、スポットピン (CMP, ピン径0.4mm、Arraylt社)を用いて基板にスポッティングし、８０℃、１時間反応させ、基板に糖ペプチドを固定化した。水で１回洗浄後、１０ｍｇ/ｍＬの無水コハク酸に浸漬させ、室温で３時間反応し、未反応のアミノオキシ基の保護を行った。水で２回洗浄し、乾燥した。

培養上清を下記反応溶液で１０倍希釈した。糖ペプチド固定化アレイにハイブリカバー（住友ベークライト社製）を被せ、希釈溶液７０μLを展開し、室温で２時間反応した。ハイブリカバーを外し下記洗浄溶液及び水で一回ずつ基板を洗浄した。基板を乾燥させた後、ハイブリカバーをかぶせ、Anti-IgG(H＋L), Mouse, Goat-Poly, Cy3（ロックランドイムノケミカルズ社製）を下記溶液で１μｇ／ｍＬに調製したものを基板上に展開し、室温で１時間反応した。反応後、前記洗浄液で洗浄。測定はスキャナ（Typhoon TRIO+ 、GEヘルスケア)を用いてＣｙ３の蛍光強度を測定した。蛍光応答のデジタル画像はArray Vision^TM Software version 8（GEヘルスケア）を用いて作成した。結果を図５に示す。
反応溶液：50mM Tris・HCl (pH 7.4)、100mM NaCl、1mM CaCl₂、MnCl₂、MgCl₂、0.05% Tween 20
洗浄溶液：50mM Tris・HCl (pH 7.4)、100mM NaCl、1mM CaCl₂、MnCl₂、MgCl₂、0.05% Triton X-100

SN-01〜04の抗体の特徴
抗体SN-01〜04は、MUC4に由来する抗原糖ペプチドの糖鎖コア構造を特異的に認識し結合するとともに、それぞれの抗体において各種糖ペプチドとの反応に下記のような固有のパターンを示した。

・SN-01
(i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cysに強く結合し
(ii) Ser-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cys（naked peptide、配列番号２）、配列番号１で示されるアミノ酸配列）及び抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず
(iii) MUC2及びMUC１６のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに強く結合し
(iv) MUC1のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しなかった。

・SN-02
(i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cysに強く結合し
(ii) （naked peptide、配列番号２）及び抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず
(iii) MUC2及びMUC１６のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドに結合し
(iv) MUC１のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しなかった。

・SN-03
(i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cysに強く結合し
(ii) （naked peptide、配列番号２）及び抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドにも結合し
(iii) MUC1、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しなかった。

・SN-04
(i) 抗原に用いたMUC4由来の糖ペプチドSer-Ala-Ser-Thr-Gly-His-Ala-(Tn)Thr-Pro-Leu-Pro-Val-Thr-Asp-Thr-Ser-Cysに強く結合し
(ii) （naked peptide、配列番号２）及び抗原に用いた糖ペプチドとはTnが異なる位置に修飾されている糖ペプチドには結合せず
(iii) MUC1、MUC2、MUC16のタンデムユニットペプチドにTnが修飾された糖ペプチドには結合しないか、結合しても弱い結合であった。

実施例５ 患者血清中のMUC4糖ペプチドの検出
SN-01、SN-02、SN-03、及びSN-04を用いて、膵癌、卵巣癌、及び肺癌検体血清中に抗原糖ペプチドが検出されるかを検討した。検体数は、臨床的に明らかに該疾患と診断された患者血清5〜10例、陰性コントロールとして正常血清数例とした。正常血清では抗原糖ペプチドが検出されなかったが、患者血清では抗原糖ペプチドが検出された。

実施例６ 免疫蛍光染色による当該抗体のMUC4 発現細胞への集積
８ウエル型チェンバースライドに、RPMI-1640（10% FBS）に浮遊させた膵臓癌細胞 BxPC-3 を9.6x10³個ずつ添加し、５％CO₂雰囲気下、３７℃で１６時間培養した。培地を吸引除去し、細胞が2 mm浸る程度の4% 冷メタノールin PBSを加えた。細胞を１５分間固定した。固定液を吸引除去し、PBSで各５分間、３回洗浄した。ブロッキングバッファー（5% BSA含有PBS）で１時間ブロッキングをおこなった。ブロッキング液を吸引除去し、当該抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。Cy^TM-5ラベル化抗マウスIgG抗体を添加し、暗室、室温で１時間インキュベートした。2次抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。オールインワン蛍光顕微鏡 BZ-9000(KEYENCE)で観察したところ、細胞表面への染色が確認された。

実施例７ 細胞増殖阻害実験
９６ウエル型PrimeSurfaceR（住友ベークライト）に、乳癌細胞OCUB-M （1000 cells/well）100mL及びSN-01（3.47 mg/mL）10mL (34.7 mg)を加え、５％CO₂雰囲気下、３７℃で９６時間培養した。Cell Titer 96^R Aqueous One Solution Proliferation Reagent （Promega）を添加して更に１．５時間培養した後、SpectraMaxM5（Molecular Devices）にて490 nmの吸光度で生細胞数を測定した。結果を図７に示す。SN-01存在下で培養した乳癌細胞OCUB-Mの生細胞数は、SN-01非存在下で培養した生細胞数に比べて28％の減少を認めた。

実施例８ ガレクチン３結合阻害実験
８ウエル型チェンバースライドに、RPMI-1640（10% FBS）に浮遊させた膵臓癌細胞 BxPC-3を4.8x10³個ずつ添加し、５％CO₂雰囲気下、３７℃で１６時間培養した。培地を吸引除去し、細胞が2 mm浸る程度の4% ホルムアルデヒド in PBSを加えた。細胞を１５分間固定化した。固定液を吸引除去し、PBSで各５分間、３回洗浄した。ブロッキングバッファー（5% BSA含有PBS）で１時間ブロッキングをおこなった。ブロッキング液を吸引除去し、当該抗体のみ、様々な濃度の当該抗体とガレクチン３とを混合し、４℃で２時間インキュベートした。抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。Cy5ラベル化抗マウスIgG抗体を添加し、暗室、室温で１時間インキュベートした。2次抗体を吸引除去した後、PBSで各５分間、３回洗浄した。オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000(KEYENCE)で観察したところ、当該抗体濃度依存的にガレクチン３とMUC4との結合阻害が認められた。

実施例９ 化学療法剤との併用による癌細胞増殖阻害実験
（１）膵癌細胞
RPMI-1640に浮遊させた膵癌細胞BxPC3を９６ウエルプレートに1x10³ cells/wellずつ添加し、５％CO₂雰囲気下３７℃で４８時間培養した。４８時間後、ゲムシタビン（終濃度1mM）単独添加、ゲムシタビン（終濃度1mM）及びSN-01（終濃度0.35 mg/mL）併用添加、無添加の3群に分けて５％CO₂雰囲気下３７℃で４８時間培養した。Cell Titer 96^R Aqueous One Solution Proliferation Reagent （Promega）を各ウエルに添加して更に１．５時間培養した後、SpectraMaxM5（Molecular Devices）にて490 nmの吸光度で生細胞数を測定した。結果を図8に示す。ゲムシタビンとSN-01の併用にて最も生細胞数が減少し（コントロールの５９％）併用による細胞増殖阻害が認められた。

（２）乳癌細胞
RPMI-1640に浮遊させた乳癌細胞OCUB-Mを９６ウエルプレートに1x10³ cells/wellずつ添加し、５％CO2雰囲気下３７℃で４８時間培養した。４８時間後、ドセタキセル（終濃度50μM）単独添加、ドセタキセル（終濃度50μM）及びSN-01（終濃度0.35 mg/mL）併用添加、無添加の3群に分け、５％CO2雰囲気下３７℃で４８時間培養した。Cell Titer 96^R Aqueous One Solution Proliferation Reagent （Promega）を各ウエルに添加して更に１．５時間培養した後、SpectraMaxM5（Molecular Devices）にて490 nmの吸光度で生細胞数を測定した。結果を図9に示す。ドセタキセルとSN-01の併用にて最も生細胞数が減少し（コントロールの７９％）併用による細胞増殖阻害が認められた。

本発明により、MUC4由来のペプチドにコンフォメーショナルエピトープを形成させる糖鎖修飾を施した糖ペプチドに対する抗体が提供される。本発明の抗MUC4抗体を用いることで、コンフォメーショナルエピトープ特異的に、高感度に、信頼性をもって、かつ簡便にMUC4の存在を検出することができ、MUC4に関連する疾患として悪性腫瘍を判定することが可能になるので、医療診断分野において有用と考えられる。更に、本発明の抗MUC4抗体は、MUC4が関わる癌細胞の機能に影響を与えることにより、癌治療など医薬分野において有用であると考えられる。

配列番号１：ヒトMUC4のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列
配列番号２：ヒトMUC4のタンデムユニットペプチドのＣ末端にＣｙｓを付加したペプチドのアミノ酸配列
配列番号３：ヒトMUC1のタンデムユニットペプチドのＣ末端にＣｙｓを付加したペプチドのアミノ酸配列
配列番号４：ヒトMUC2のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列
配列番号５：ヒトMUC16のタンデムユニットペプチドのアミノ酸配列

Claims (11)

1. 糖ペプチドに対するモノクローナル抗体であって、前記糖ペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むヒトＭＵＣ４のタンデムユニットペプチド及びO-結合型糖鎖からなり、前記O-結合型糖鎖は、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）であり、かつ前記タンデムユニットペプチドの8番目のアミノ酸であるスレオニンに結合し、
   前記モノクローナル抗体は
   受託番号NITE BP-01774として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-01、
   受託番号NITE BP-01775として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-02、
   受託番号NITE BP-01776として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-03、及び
   受託番号NITE BP-01777として寄託されたハイブリドーマ細胞系により分泌される、モノクローナル抗体SN-04からなる群から選択される、抗体。
2. MUC4検出に用いるための請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ヒト体液サンプル中のMUC4を検出する方法であって、
   (a) 前記サンプルを請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させ、
   (b) 接触後のサンプルにおける抗体−抗原複合体の形成を測定することを含む、前記方法。
4. 前記体液サンプル中の、MUC4の異常な発現がみられる悪性腫瘍の有無の検出に用いるための請求項３に記載の方法。
5. 前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、請求項４に記載の方法。
6. (a) 請求項１に記載のモノクローナル抗体と、(b) 抗体−抗原複合体を測定するための試薬を含む、請求項３〜５のいずれか1項に記載の方法に使用するためのキット。
7. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防及び／又は治療用の医薬組成物。
8. 前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、請求項７に記載の組成物。
9. 請求項１に記載のモノクローナル抗体及び化学療法剤または分子標的薬とを有効成分として含有する、悪性腫瘍の予防及び／又は治療用の医薬組成物。
10. 前記悪性腫瘍が膵癌、卵巣癌、乳癌、胆道癌、食道癌、結腸癌及び肺癌からなる群より選択されるものである、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記モノクローナル抗体及び化学療法剤または分子標的薬は、互い異なる投与スケジュールで用いられる請求項９又は１０に記載の医薬組成物。