KR101994266B1

KR101994266B1 - 유방암 진단용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101994266B1
Application number: KR1020170138423A
Authority: KR
Inventors: 김홍진; 김형진; 문병인; 이준우
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단; 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2017-10-24
Filing date: 2017-10-24
Publication date: 2019-06-28
Also published as: KR20190045626A

Abstract

본 발명은 유방암 진단 및 예후 예측을 위한 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈중 CA15-3의 N-당화 반응이 유방암 마커임을 최초로 확인함에 따라, 항-CA15-3 항체로 혈중 CA15-3을 포획하고 포획된 CA15-3의 당화 반응을 ConA(Concanavalin A) 렉틴을 이용하여 검출함으로써 유방암을 진단하는 방법으로, 상기 진단방법은 유방암에 대한 우수한 특이도와 민감도로 나타내는 것이 확인됨에 따라, 유방암 환자의 조기 진단에 활용하여 유방암 환자의 치료 효율 향상 및 유방암으로 인한 사망률 감소에 기여할 수 있다.

Description

유방암 진단용 조성물 및 이의 용도{Composition for breast cancer diagnosis and uses thereof}

본 발명은 CA15-3의 당화 반응 검출을 통한 유방암 진단 및 예후 예측용 조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.

유방암은 전 세계적으로 두 번째로 빈번하게 발생하는 암이며, 여성암 중 25%로 가장 높은 발병율을 나타낸다. 유방암의 원인은 유전적인 요인 및 후천적인 요인(환경적인 요소)가 있을 것으로 추정되나 아직까지 정확한 원인은 규명되지 않았으며, 최근에는 여성호르몬인 에스트로겐이 유방암의 주요 원인으로 작용할 것이라 지목되고 있다.

2012년 통계에 따르면 168만 명의 유방암환자가 발생하였고 52만 명이 유방암으로 사망하였다. 유방암 환자의 5년 생존율은 암 발견 당시 유방암의 중증도와 높은 연관이 있다. 0기 및 1기 유방암의 경우 5년 생존율은 98%에 이르고 2기의 경우 5년 생존율은 85% 정도이다. 그러나 3기 환자의 경우 5년 생존율이 60%로 크게 감소하고 4기 환자의 경우 5년 생존율이 20%에 불과하다. 따라서 유방암을 조기에 진단하는 것은 환자의 치료 효율 및 생존율과 밀접한 연관성을 가지고 있어 그 중요도가 높은 것으로 인식되고 있다.

유방촬영술(mammography)은 유방암을 진단하는데 가장 보편적으로 사용되고 있는 방법으로, 유방촬영술의 도입은 유방암으로 인한 사망을 15 - 25% 감소시킨 것으로 조사되었다. 그러나 유방촬영술의 경우 밀도가 높은 유방조직에서 진단의 정확도가 감소한다는 문제점이 보고됨에 따라, 여러 연구들을 통해 유방암환자의 선별을 위한 혈액 마커가 제시되었으나 이들 마커들 역시 충분한 수준의 검출 민감도와 특이도를 제공하지 못하고 있는 실정이다.

CA15-3은 MUC1(transmembrane mucin)의 수용성 형태로 MUC1은 거의 모든 상피세포에서 발현된다. 과발현된 MUC1은 대장암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암의 발병과 관련이 있는 것으로 보고되어 졌으며, 혈액 내 CA15-3의 수준과 유방암과의 연관성에 관하여 많은 연구가 진행된 바 있다. 그러나 이들 연구에서 유방암과 관련한 혈중 CA15-3의 수준은 일관성 있는 결과를 보여주지 못하였으며, 초기 단계의 유방암 및 전이가 진행되지 않은 유방암에서의 CA15-3 혈중 수준은 유방암을 검출하는데 적합하지 않다는 것이 확인되었다. 이러한 이유로 미 연방 임상 암학회(American Society of Clinical Oncology, ASCO)는 CA15-3을 암 선별 검사, 진단 및 수술 후 예후 평가를 위해 권장하지 않고 있다.

한편, CA15-3의 N-글리칸(glycan)과 O-글리칸(glycan)은 생합성 경로와 구조에서 차이점이 있는데, N-당화(glycosylation)는 단백질의 Asn-X-Ser/Th(X는 특정되지 않은 아미노산을 의미) 부위에 부착되는 반면 O-당화는 Ser 또는 Thr 부위에 부착된다[11].

또한, 단백질에서의 N-당화는 소포체(endoplasmic reticulum; ER)에서 시작하여 골지(Golgi)를 거처 완성되며 높은 수준의 만노스(high-mannose) 타입 또는 혼합 글리칸(hybrid glycan) 형태로 완료된다. 반면, O-당화는 골지에서 시작하여 O-GalNAc을 포함한 형태로 완료된다.

단백질 상의 N-당쇄(glycan)는 펩타이드-N-글리코시다아제 F (peptide-N-glycosidase F; PNGase F)를 사용하여 절단이 가능하며 절단된 N-당쇄를 표지하여 분석이 가능한 반면, O-당쇄 분석에는 환원된 알칼라인 β-제거 (reductive alkaline β-elimination)을 통한 절단이 요구된다.

또한, CA15-3의 당화 반응은 대부분 O-당화 반응으로 이루어져 있으나, 유방암 환자에서 CA15-3의 O-당쇄는 비정상적인 형태를 가진다는 것은 선행 연구를 통해 밝혀진 바 있는데, 유방암 환자의 CA15-3 O-당쇄는 높은 수준의 시알산화(sialylation)를 가지며 미완성의 절단된 형태를 가지는 것으로 확인되었다. 반면, CA15-3의 N-당화 반응에 대해서는 그 구조 및 암환자에서의 변화가 구체적으로 연구된 바 없다.

대한민국공개특허 제2013-0102693호 (2013.09.23 공개)

앞서 전술한 바와 같이 여성암 중 가장 높은 비율을 차지하는 암인 유방암은 조기 진단이 5년 생존율을 결정하는 중요한 요소이나, 아직까지 유방암 환자를 높은 수준의 정확도로 검출할 수 있는 혈액 마커가 존재하지 못함에 따라, 본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당화 반응이 유방암 마커임을 최초로 확인하고 상기 CA15-3의 N-당쇄 검출을 통한 유방암 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후예측용 조성물을 제공한다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 플레이트에 항-CA15-3 항체를 고정시키는 단계; 상기 항체가 고정된 플레이트에 블로킹제를 처리하여 고정된 항체 및 플레이트 표면을 블로킹하는 단계; 상기 블로킹된 플레이트 내 블로킹제 및 고정된 항체의 당쇄를 산화시키는 단계; 상기 당쇄가 산화된 플레이트 및 항체에 시료를 처리하여 시료 내 CA15-3과 항체를 결합시키는 단계; 상기 항체와 결합된 CA15-3에 광학적 표지 물질이 부착된 ConA를 처리하여 CA15-3의 N-당쇄에 ConA를 결합시키는 단계; 및 상기 CA15-3의 N-당쇄와 결합한 ConA 수준을 광학적 표지 물질로 확인하는 단계를 포함하는 유방암 진단 또는 예후 예측 방법을 제공한다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당화 반응이 유방암 마커임을 최초로 확인함에 따라, 항-CA15-3 항체로 혈중 CA15-3을 포획하고 포획된 CA15-3의 당화 반응을 ConA(Concanavalin A) 렉틴을 통하여 검출하는 유방암 진단하는 방법으로, 상기 진단방법은 유방암에 대한 우수한 특이도와 민감도로 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 유방암 환자의 조기 진단에 활용하여 유방암 환자의 치료 효율 향상 및 유방암으로 인한 사망률 감소에 기여할 수 있다.

도 1은 혈중 CA15-3의 당화 반응(glycosylation) 검출을 위한 샌드위치 분석법의 개념도이다.
도 2는 블로킹을 위해 사용한 rFBS (regular fetal bovine serum) 및 코팅 항체인 항-CA15-3의 렉틴(lectin) 결합 특성 및 이들의 산화반응에 의한 렉틴 결합의 감소 효과를 확인한 결과로, 블로킹 시약과 코팅 항체의 렉틴 반응을 산화 과정을 통해 차단함으로서 CA15-3 당화를 특이적으로 검출할 수 있다.
도 3은 항-CA15-3을 코팅한 후 유방암 환자 혈액을 적용시킨 후 12종의 렉틴을 반응시켜 CA15-3의 당화 반응을 검출한 결과로, ConA (Concanavalin A)를 적용하였을 경우 가장 우수한 반응성이 확인되었다.
도 4은 양성(benign), 유방암 stage I 및 stage III의 환자 혈청을 희석하여 적용하였을 때 반응성의 선형(linearity)을 평가한 결과로, 상기 분석에서는 CA15-3의 N-당화를 ConA를 사용하여 확인하였으며, 각 그룹의 R² 값이 0.9 이상을 나타내어 우수한 직선성을 나타내었다.
도 5는 양성 그룹과 유방암 그룹(stage I, II, 및 III 포함)의 CA15-3 N-당화 수준을 확인한 결과이다.
도 6는 양성, stage 0, stage I, stage IIA, stage IIB 및 stage III 그룹의 CA15-3 N-당화 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 양성 그룹으로부터 유방암 stage I, stage IIA, stage IIB 및 stage III 검출을 위한 ROC(receiver operating characteristic) 곡선 및 AUC 값을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 유방암 환자의 혈중 CA15-3의 수준을 분석하기 위한 방법으로 두 가지 타입의 단클론 항체를 사용하는 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 혈중 CA15-3의 N-당화 반응(glycosylation)을 ConA 렉틴을 사용하여 검출하는 방법을 발견하였고, 이를 이용하여 혈중 CA15-3을 타겟으로 하여 유방암을 효과적으로 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제는 ConA (Concanavalin A)일 수 있다.

상기 ConA는 렉틴의 한 종류로, 렉틴은 탄수화물에 선택적으로 결합하는 단백질로 식물, 미생물, 바이러스, 무척추동물, 척추동물 등에서 분리·정제되어 각종 질병관련 연구의 재료로 널리 활용되고 있으며, 현재까지 약 300 여종이 보고되어 있다.

이러한 렉틴은 적혈구를 응집시켜 침강시키는 작용이 잘 알려져 있고 혈액형을 분류하기도 하며, 최근에는 암세포를 특이적으로 응집시키는 기능이 밝혀지는 등 다양한 기능을 갖는 것으로 보고되어 졌는데 이는 렉틴이 가지고 있는 특정 구조가 당과 결합하며, 렉틴성 물질을 갖고 있는 세포와 그것에 결합하는 당을 가지고 있는 세포간의 선택적 정보교환을 가능하게 한다.

본 발명의 ConA는 CA15-3의 만노실화된 N-당쇄에 특이적으로 결합할 수 있으며, 상기 CA15-3의 N-당쇄는 정상인에 비해 유방암 환자의 혈액 내에서 발현량이 증가될 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후예측용 키트를 제공할 수 있으며, 상기 제제는 ConA (Concanavalin A)일 수 있다.

또한, 본 발명은 플레이트에 항-CA15-3 항체를 고정시키는 단계; 상기 항체가 고정된 플레이트에 블로킹제를 처리하여 고정된 항체 및 플레이트를 블로킹하는 단계; 상기 블로킹된 플레이트 내 블로킹제 및 고정된 항체의 당쇄를 산화시키는 단계; 상기 당쇄가 산화된 플레이트 및 항체에 시료를 처리하여 시료 내 CA15-3과 항체를 결합시키는 단계; 상기 항체와 결합된 CA15-3에 광학적 표지 물질이 부착된 ConA를 처리하여 CA15-3의 N-당쇄에 ConA를 결합시키는 단계; 및 상기 CA15-3의 N-당쇄와 결합한 ConA 수준을 광학적 표지 물질로 확인하는 단계를 포함하는 유방암 진단 또는 예후 예측 방법을 제공할 수 있다.

상기 시료는 혈액일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

상기 블로킹제는 소에서 유래한 혈청(regular fetal bovine serum, rFBS), 소 혈청 알부민, 소에서 유래된 밀크 및 동물에서 유래된 혈청으로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 혈청 내 CA15-3의 당화 검출을 위해 수행되는 샌드위치 분석법은 혈청 내 CA15-3의 당화만을 검출해야 하지만 코팅된 항-CA15-3 항체와 플레이트의 블로킹을 위해 적용된 rFBS와 같은 블로킹제에 의한 다수 당화를 포함할 수 있기 때문에 혈액시료 내 혈중 CA15-3을 적용하기 전에 항-CA15-3 항체 및 rFBS에 포함된 당화 반응를 수행할 수 있는 부분을 미리 산화시켜 ConA 렉틴에 의한 플레이트에 코팅된 항체 및 rFBS 간의 당화반응을 원천적으로 차단하는 과정이 필수적으로 필요하다. 이의 목적으로 당질을 제거할 수 있는 글리코시다아제(glycosidase)를 적용할 수 있다.

이에 따라, rFBS와 코팅된 항-CA15-3 항체에 대하여 12종의 렉틴에 대한 반응 및 산화 과정에 의한 렉틴 반응 감소 효과를 확인한 결과, 도 2와 같이 ConA, SNA, RCA I, MAA 및 Jacalin가 처리된 rFBS에서 높은 반응이 나타났으며, 항-CA15-3 항체는 ConA, SNA, RCA I, AAL, LCA, AOL 및 Jacalin 처리 시 높은 반응이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

또한, rFBS의 경우 산화 반응 후 ConA 및 RCA I 처리군에서 반응이 현저하게 감소하였지만 SNA, MAA 및 Jacalin에서는 완전한 반응 감소가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 항-CA15-3 항체의 경우, 대부분 렉틴반응이 산화 반응 후 감소하였으나, Jacalin는 완전한 반응감소가 일어나지 않았다.

한편, N-당화의 만노실화(mannosylation)를 인식하여 반응하는 것으로 알려진 ConA의 반응성 분석 결과, ConA의 rFBS 및 항-CA15-3 항체에 대한 반응이 산화 과정에서 효과적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 바탕으로 항-CA15-3 항체의 코팅단계, 블로킹 단계, 산화반응 단계 및 혈청시료 적용 단계를 거친 후 12종의 렉틴을 적용한 후 반응 수치를 확인한 결과, 도 3과 같이 ConA에서 매우 우수한 수준의 반응이 확인됨에 따라, 유방암 환자의 혈액 내 CA15-3의 당화반응 검출을 위한 렉틴으로 ConA가 가장 적합한 것으로 확인되었다.

이하 실시예는 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> rFBS와 코팅 항-CA15-3 항체의 렉틴( lectin ) 반응성 및 산화에 의한 렉틴 반응성 확인

항-CA15-3 단클론 항체(10-C03E, mouse anti-CA15-3 antibody, Fitzgerald, USA)는 100 ng/well로 phosphate-buffered saline (PBS)를 이용하여 96 웰 ELISA 플레이트 (Greiner Bio One, Austria)에 4℃에서 16시간 코팅하였다. rFBS(GenDEPOT, USA)는 PBS로 최종 농도 10%가 되게 준비한 후 상기 방법으로 코팅하였다. 이후 96 well에 코팅된 항-CA15-3 단클론 항체 및 rFBS는 50 mM 아세트산 나트륨(sodium acetate), 50 mM 메타과요오드산나트륨(sodium metaperiodate) pH 4.0 용액으로 상온에서 1시간 산화반응 시켰다. 상기 산화반응이 완료된 웰에 1% 트윈 20이 포함된 TBS(Tris-buffered saline)을 이용하여 상온에서 3시간 블로킹한 후 비오틴이 부착된 렉틴 12종을 각각 1 μg/ml로 희석하여 상온에서 1시간 처리하였다. 렉틴 희석 시에는 0.1% 트윈 20이 포함된 TBS (TBS-T)를 사용하였다.

렉틴을 반응시킨 웰에 HRP(poly-horseradish peroxidase)가 부착된 스트렙타아비딘(streptavidin; Thermo Scientific Pierce, USA)을 1/10,000 희석하여 37℃에서 40분 처리하고 발색반응을 올소-페닐렌디아민(o-phenylenediamine; Sigma, USA)을 사용하여 492nm에서 측정하였다. 각 반응 간에는 TBS-T를 사용하여 웰을 3 - 5회 세척하였다.

< 실험예 2> CA15-3의 N- glycosylation 검출을 위한 sandwich assay

본 plate 반응: 항-CA15-3 단클론 항체(10-C03E)를 PBS를 이용하여 96 웰 플레이트에 100 ng/well로 코팅하였다. 이후 10% rFBS를 상온에서 3시간 적용하여 웰을 블로킹하였으며, rFBS는 TBS-T에 희석하여 준비하였다.

이후 상온에서 50 mM 아세트산나트륨, 50 mM 메타과요오드산나트륨 pH 4.0 용액을 웰에 1시간 처리하여 코팅된 항-CA15-3 항체와 rFBS의 당화를 산화시켰다. 상기 산화과정 후 0.8 - 1% 산화된 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)를 웰에 주입하고 상온에서 3시간 동안 블로킹을 추가로 더 진행하였다.

또한, 50 mM 아세트산나트륨, 50 mM 메타과요오드산나트륨 pH 4.0 용액에 BSA를 최종 5%가 되도록 용해시킨 후 4℃에 2 - 4 시간 방치하여 산화시켰다. 이후 산화된 BSA를 TBT-T에 이틀간 투석하여 잔여 메타과요오드산나트륨를 제거하였다.

혈청 샘플은 산화된 BSA 1%가 포함된 TBS-T 용액에 희석한 후 37℃에서 두 시간동안 반응시켰다.

그 후 혈청의 희석을 위해 별도로 준비된 96-웰 플레이트 상에서 산화된 BSA 1%가 포함된 TBS-T 용액에 1/100 또는 1/300 비율로 희석하여 1차 준비한 후 상기 항-CA15-3 항체가 코팅된 웰에 옮겨 적용하여 최종 희석비율이 1/1000 이상이 되도록 하였다.

이후 바이오틴이 표지된 렉틴 또는 바이오틴이 표지된 ConA를 1 μg/ml이 되도록 TBS-T에 희석하여 적용한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. CA15-3과 결합한 바이오틴이 표지된 ConA에 HRP가 부착된 스트렙타아비딘을 1/10,000 희석하여 37℃에서 40분간 적용하였다. 발색 반응은 상기 실험예 1과 같은 방법으로 진행하였으며, 각 반응 간에 웰을 TBS-T를 사용하여 3-5회 세척하였다.

Mirror plate 반응: 항-CA15-3을 코팅하지 않은 플레이트를 따로 준비한 후 상기 과정을 모두 거친 후 발색반응까지 수행하였다.

모든 데이터 값은 상기 본 플레이트 반응에서 미러 플레이드 반응을 뺀 수치로 나타내었다.

< 실험예 3> 통계분석

그룹간 통계적 유의성은 Student’s t-test로 분석하였고 0.05 미만 수치를 유의성 있는 것으로 판단하였다. Receiver operating characteristic (ROC) curve 및 area under the curve (AUC) 수치는 GraphPad Prism 5.01을 사용하여 산출하였다.

< 실시예 1> 샌드위치 분석방법을 이용한 CA15-3 N- 당화 반응 확인

도 1은 혈청 내 CA15-3의 당화 검출을 위한 샌드위치 분석법으로, 상기 샌드위치 분석법은 혈청 내 CA15-3의 당화만을 검출해야 하지만 코팅된 항-CA15-3 항체와 웰의 블로킹을 위해 적용된 rFBS는 다량의 당화를 포함하기 때문에 혈청 CA15-3을 적용하기 전에 항-CA15-3 항체 및 rFBS에 포함된 당화를 산화시켜 렉틴이 코팅된 항체 및 rFBS의 당화와 결합하는 현상을 차단하는 과정이 필요하다.

이에 따라, rFBS와 코팅 항-CA15-3 항체에 대하여 12종의 렉틴에 대한 반응 및 산화 과정에 의한 렉틴 반응 감소 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 ConA, SNA, RCA I, MAA 및 Jacalin가 처리된 rFBS에서 높은 반응이 나타났으며, 항-CA15-3 항체는 ConA, SNA, RCA I, AAL, LCA, AOL 및 Jacalin 처리 시 높은 반응이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

rFBS의 경우 산화 반응 후 ConA 및 RCA I 처리군에서 반응이 현저하게 감소하였지만 SNA, MAA 및 Jacalin에서는 완전한 반응 감소가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 항-CA15-3 항체의 경우, 대부분 렉틴반응이 산화 반응 후 감소하였으나, Jacalin는 완전한 반응감소가 일어나지 않았다.

상기 결과들을 바탕으로 항-CA15-3 항체를 코팅하고 블로킹하는 단계, 산화반응 단계 및 혈청시료 적용 단계를 거친 후 12종의 렉틴을 적용한 후 반응 수치를 확인한 결과, 도 3과 같이 ConA에서 매우 우수한 수준의 반응이 확인되었다.

CA15-3의 당화 반응은 대부분 O-당화 반응이기 때문에 O-글리칸을 인식하는 렉틴인 SNA, PNA, UEA-I, AAL, MAA 및 Jacalin [Hashim et al., 2017. Lectins: an effective tool for screening of potential cancer biomarkers. Peer J Preprints]에서 높은 반응을 예상하였으나 PNA, UEA-I, AAL에서는 반응이 전혀 나타나지 않았고 SNA, MAA 및 Jacalin도 낮은 수준의 반응성을 나타내었다.

한편, 선행문헌에서는 CA15-3과 같이 O-글리칸을 다량으로 포함한 혈액 단백질의 경우 렉틴으로 O-글리칸을 검출하는 것이 어렵다는 것이 확인됨[Lee et al., 2016. Unmasking Heavily O-Glycosylated Serum Proteins Using Perchloric Acid: Identification of Serum Proteoglycan 4 and Protease C1 Inhibitor as Molecular Indicators for Screening of Breast Cancer. PLoS One. 11]에 따라, 상기 결과와 같이 CA15-3의 N-당화 검출을 위한 렉틴으로 ConA가 가장 적합한 것으로 제안될 수 있다.

< 실시예 2> 양성 및 악성 유방암의 혈중 CA15-3의 N- 당화 ( glycosylation ) 수준 확인

앞선 실험에서 확인된 ConA을 이용하여 양성 및 악성 유방암 환자의 혈중 CA15-3의 N-당화 수준을 샌드위치 분석 방법으로 확인하였다.

그 결과 도 4와 같이, 유방암 Ⅲ기, Ⅰ기 및 양성 유방종 환자의 혈청 희석비율에 따라 직선성이 나타났으며, 상기 세 그룹의 R² 값이 0.9 이상으로 우수한 직선성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5를 참고하면, 양성 유방종(Benign, n=47) 및 유방암 cases (stage 0, I, IIA, IIB, III 포함, n=128)의 수치를 확인한 결과, 유방암 그룹에서 CA15-3의 N-당화 수치가 현격하게 높은 것으로 확인되었다.

상기 항-CA15 항체 및 ConA를 이용한 샌드위치 분석방법으로 양성 유방종(n=47) 및 유방암 stage 0(n=6), I(n=48), IIA(n=36), IIB(n=12) 및 III(n=26)에 대한 CA15-3의 N-당화 수준을 분석한 결과, 도 6과 같이 병기 I, IIA, IIB 및 III는 양성 유방종 그룹에 비해 매우 높게 CA15-3의 N-당화 수준을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 도 6의 결과에 대한 ROC 곡선 및 AUC 값을 확인한 결과, 도 7과 같이 stage IIA, IIB 및 III 실험군 모두 0.8 이상의 AUC 값을 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 항-CA15 항체 및 ConA를 이용한 샌드위치 분석방법은 유방암 검출에 매우 우수한 방법임이 확인되었다.

< 실시예 3> 샌드위치 분석방법을 이용한 유방암 병기 I, IIA , IIB 및 III의 검출 특이도와 민감도 분석

상기 항-CA15 항체 및 ConA를 이용한 샌드위치 분석방법에 대한 유방암 검출의 특이도 및 민감도를 확인하기 위해, 앞선 실험에서 확인된 CA15-3의 N-당화 분석 결과로부터 유방암 병기 I, IIA, IIB 및 III 그룹의 민감도, 특이도 및 AUC를 표 1과 같이 나타내었다.

표 1을 참고하면, 상기 샌드위치 분석방법을 이용하여 CA15-3의 N-당화를 분석할 경우, 양성(benign) 유방종 그룹과 비교하여 유방암 stage IIA, IIB 및 III을 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있음이 확인되었다.

	민감도 %	특이도 %	AUC
Benign vs Stage I	31.3	89.4	0.60
Benign vs Stage IIA	80.6	89.4	0.89
Benign vs Stage IIB	83.3	80.6	0.87
Benign vs Stage III	69.2	87.2	0.84

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈중 CA15-3의 N-당쇄를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단용 바이오마커 조성물.
혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제는 ConA(Concanavalin A)인 것을 특징으로 하는 유방암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 ConA는 CA15-3의 만노실화된 N-당쇄에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 및 예후 예측용 조성물.
청구항 2에 있어서, 상기 CA15-3의 N-당쇄는 정상인에 비해 유방암 환자의 혈액 내에서 발현량이 증가되는 것을 특징으로 하는 유방암 진단 및 예후 예측용 조성물.
혈중 CA15-3의 N-당쇄를 검출할 수 있는 제제를 유효성분으로 함유하는 유방암 진단 또는 예후 예측용 키트.
플레이트에 항-CA15-3 항체를 고정시키는 단계;
상기 항체가 고정된 플레이트에 블로킹제를 처리하여 고정된 항체 및 플레이트를 블로킹하는 단계;
상기 블로킹된 플레이트 내 블로킹제 및 고정된 항체의 당쇄를 산화시키는 단계;
상기 당쇄가 산화된 플레이트 및 항체에 인간으로부터 분리된 시료를 처리하여 시료 내 CA15-3과 항체를 결합시키는 단계;
상기 항체와 결합된 CA15-3에 광학적 표지 물질이 부착된 ConA를 처리하여 CA15-3의 N-당쇄에 ConA를 결합시키는 단계; 및
상기 CA15-3의 N-당쇄와 결합한 ConA 수준을 광학적 표지 물질로 확인하는 단계를 포함하는 유방암 진단 또는 예후 예측을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 유방암 진단 또는 예후 예측을 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.