CN105940304A

CN105940304A - 酶的切割活性的检测

Info

Publication number: CN105940304A
Application number: CN201480067890.6A
Authority: CN
Inventors: P·戴维斯; G·帕尔克; J·绍藤
Original assignee: Morogi Ltd
Current assignee: Morogi Ltd; Mologic Ltd
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2014-10-23
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-10-23
Also published as: RU2016119422A; US20160238596A1; EP3060915B1; JP6496322B2; AU2014338709B2; MX371379B; CA2928308C; MX2016005313A; CN105940304B; US20200378963A1; GB201318728D0; EP3060915A2; WO2015059487A2; AU2014338709A1; WO2015059487A3; US10866236B2; BR112016008956A2; JP2016535282A; CA2928308A1

Abstract

本发明涉及检测酶的切割活性。本发明的各个方面包括用于检测或测量测试样品中能够切割底物的酶的活性的存在的酶检测装置、试剂盒、方法和用途。本发明还涉及可用于实施本发明的指示剂和结合分子。酶底物含有仅由酶切割后才揭示的隐藏的结合位点。

Description

酶的切割活性的检测

发明领域

本发明涉及检测酶的切割活性。本发明的各个方面包括用于检测或测量测试样品中能够切割底物的酶的活性的存在的酶检测装置、试剂盒、方法和用途。本发明还涉及可用于实施本发明的指示剂和结合分子。

发明背景

酶构成参与催化活生物体内化学反应的蛋白家族。由于其重要性，存在测量酶水平且重要的是酶活性是必要和/或有利的许多情况。

具体而言，已经发现酶活性的增加与特定病况和/或疾病相关。例如，上调的蛋白酶活性已经与癌症进展的许多方面相关。因此，取自具有特定病况或怀疑具有特定病况或疾病的个体的样品中的酶活性的测量可用于预后或诊断目的。

在酶家族内，存在通过促进底物切割起作用的许多酶类型。例如，肽酶和蛋白酶催化各自底物内的肽键的水解。在过去，在一些情况下，研究者已经寻求使用测量从初始酶底物释放片段或“离去基团”的试剂盒或装置测量该类型的活性。

已经改进基于该基本原理的测定法，使得在一些情况下，发明人已经描述了连接至报道部分的工程改造的底物分子。待检测的酶对底物的切割，如果存在的话，将导致所述报道分子的释放，这可以通过一定范围本领域技术人员可得的技术来检测。该类型的测定法描述于例如US2006/0003394。

其他人已经寻求开发用于基于区分酶底物的修饰和未修饰形式的原理测量酶活性的测定法。在这方面，WO2009/024805描述了利用携带可检测标记的“底物识别分子”(SRM)的酶检测装置，其中SRM特异性结合未修饰状态的酶底物，并且在这样做时呈现酶与底物的结合。

US 5,171,662描述了用于鉴定抑制HIV蛋白酶的化合物的方法。该方法基于竞争性结合放射免疫测定。US 2005/0164311描述了用于检测反应产物以表明反应产物诱导剂诸如酶的存在的方法。

发明描述

本发明起因于改进蛋白酶活性检测的灵敏度和/或特异性的尝试。具体而言，在某些测试样品诸如尿和环境样品中，蛋白酶可以极低浓度存在。本文描述的装置和方法目的在于允许检测较低水平或浓度的蛋白酶活性。已经发现，仅结合至切割的特定产物、但非未切割的指示剂分子的结合分子诸如抗体的使用，使得能够检测测试样品(特别是尿样品)中的低浓度的蛋白酶活性。在请求保护的流装置的背景下，可以进行特定测定，其中可以过量利用试剂，而不影响检测的特异性。本文还显示请求保护的流装置提供诊断上有用的结果，其中相当的酶免疫捕获和活性测定法则不提供。不受理论束缚，这可能是由于在整个不同过程中不同的结合效率。

因此，在一个方面，本发明提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测装置，所述装置包含：

(i)用于添加至测试样品的指示剂分子，所述指示剂分子包含

(a)包含至少一个切割位点的切割区，如果所述酶切割活性存在，则所述切割位点可以被所述酶切割；和

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(ii)接受所述测试样品的捕获带，其中所述捕获带包含捕获分子，所述捕获分子能够结合至指示剂分子的捕获位点，以固定化包括新型结合位点的指示剂分子；和

(iii)能够结合至新型结合位点的结合分子，其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

类似地，本发明提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测装置，所述装置包含：

(i)用于添加至测试样品的指示剂分子，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中至少一个切割位点的切割产生切割区的至少两个部分，其中至少一部分保持连接至捕获位点；

(ii)接受所述测试样品的捕获带，其中所述捕获带包含捕获分子，所述捕获分子能够结合至指示剂分子的捕获位点；和

(iii)结合分子，所述结合分子能够结合至所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一部分的部分，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

切割区的两个部分因此在切割位点彼此分开。在切割位点的切割事件产生新型结合位点。

本发明进一步提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(ii)将能够结合至新型结合位点的结合分子添加至所述测试样品，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生；

(iii)通过捕获带中的捕获分子结合至捕获位点而在所述捕获带捕获所述指示剂分子的含有新型结合位点的部分；和

(iv)通过确定所述结合分子结合至捕获带中捕获的指示剂分子的新型结合位点而检测所述至少一个切割位点的切割。

类似地，本发明还提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

(ii)向所述测试样品添加结合分子，所述结合分子能够结合至所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一部分的部分，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生；

(iii)通过捕获带中的捕获分子结合至捕获位点而在捕获带捕获所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一部分的部分；和

(iv)通过确定所述结合分子结合至捕获带中捕获的指示剂分子的部分而检测所述至少一个切割位点的切割。

本发明人已经显示本发明的装置和方法在呼吸病况的诊断领域中具有具体应用。因此，本发明进一步提供用于通过检测能够切割底物的酶的切割活性而诊断测试样品中的呼吸病况(的存在或不存在)的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(iv)通过确定所述结合分子结合至捕获带中捕获的指示剂分子的新型结合位点而检测所述至少一个切割位点的切割，其中与对照相比切割水平增加诊断呼吸病况。

本发明还提供用于通过检测能够切割底物的酶的切割活性而诊断测试样品中的呼吸病况(的存在或不存在)的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

(iv)通过确定所述结合分子结合至捕获带中捕获的指示剂分子的部分而检测所述至少一个切割位点的切割，其中与对照相比切割水平增加诊断呼吸病况。

在具体实施方案中，所述呼吸病况是炎性呼吸病况。

在具体实施方案中，所述呼吸病况是慢性阻塞性肺病或作为囊性纤维化的结果的呼吸道(尤其是肺)的炎症。本发明人在本文中已经显示，本发明的装置和方法可以有效地应用于测量升高的切割活性作为呼吸病况的指标。为了考虑切割活性的背景水平，该方法涉及将测量的测试样品中的切割水平与对照进行比较。通常，对照代表健康受试者中的切割活性的相应水平。“健康受试者”意指未患有呼吸病症的受试者。对照可以处于取自匹配的健康对照的相应的测试样品中。或者，对照可以是通过测定一定范围的健康和患病的患者中的切割活性设置的切割的阈值水平。用于设置阈值的合适方法是本领域技术人员众所周知的。该阈值可以从患者数据的训练集进行数学推导。得分阈值因此根据呼吸病况的存在或不存在分离测试样品。该数量(即，截止阈值)的解释可以在从具有已知后果的患者的集合的开发或训练阶段进行推导。该阈值因此可以在进行请求保护的方法前通过本领域技术人员已知的方法从训练数据进行固定。

本发明的酶检测装置可以备用于立即使用的形式来提供。或者，基本组分可以任选连同用于组装酶检测装置的合适的试剂和/或说明书被提供为多部分的试剂盒(kit ofparts)。因此，在另一个方面，本发明提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)用于添加至测试样品的指示剂分子，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(ii)能够结合至指示剂分子的捕获位点的捕获分子；

(iii)固体支持物，捕获分子可以连接(即，可连接或连接)至所述固体支持物以形成捕获带以接受所述测试样品；和

(iv)能够结合至新型结合位点的结合分子，其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

在另一个方面，本发明提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包含：

(i)用于添加至测试样品的指示剂分子，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

(ii)能够结合至指示剂分子的捕获位点的捕获分子；

在相关方面，本发明还提供如本文描述和定义的酶检测装置用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。类似地，本发明还提供如本文描述和定义的方法用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。本发明进一步提供如本文描述和定义的酶检测试剂盒用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。在这些用途各自中，所述呼吸病况可以是慢性阻塞性肺病或作为囊性纤维化的结果的呼吸道的炎症。

因此，对于本发明的许多方面关键的是指示剂分子。所述指示剂分子包含切割区，所述切割区包含至少一个切割位点。所述切割位点被具有相关酶切割活性的测试样品中的任何一种或多种酶或酶切割。切割区为切割位点提供合适的背景，以确保如果所述酶存在于样品中，则切割是有效的。在具体实施方案中，所述切割区是肽。除了代表蛋白酶切割位点的肽键以外，肽中的额外氨基酸可以确保切割的特异性和灵敏度。在某些实施方案中，切割区可以含有多个切割位点，特别是其中指示剂分子在结构上受约束，例如，其中其还包含支架分子。

所述指示剂分子还包含捕获位点(意欲涵盖至少一个捕获位点)。捕获位点是指示剂分子的离散区域，其允许在捕获带固定化指示剂分子，无论是切割还是未切割的。本文下面更详细地讨论捕获位点。

所述指示剂分子还任选包含支架分子，如下面更详细地讨论。

指示剂分子的切割拆分指示剂分子以揭示或形成至少一个新型结合位点。切割区的两个部分因此在切割位点彼此分开。通常，所述新型结合位点包含作为切割的结果产生的构象表位。特异性结合至新揭示的一个或多个结合位点、但不特异性结合至切割前的指示剂分子的结合分子的使用使得能够特异性和灵敏性检测酶的切割活性。因此，在一些实施方案中，至少一个切割位点的切割产生指示剂分子(或指示剂分子的切割区)的至少两个部分，其中至少一部分含有(或保持连接至)捕获位点，且作为切割的结果，含有结合分子的结合位点，并且其中所述结合分子不能结合至结合位点，除非和直至切割已经发生。换言之，所述结合位点被隐藏或未形成，直至在切割位点的切割发生。

在一些实施方案中，至少一个切割位点的切割产生指示剂分子(的切割区)的至少两个分开的部分。因此，切割可以产生至少两个部分或片段；一个部分或片段含有或连接至捕获位点，且一个分开的部分或片段不含或未连接至捕获位点。所述结合分子结合至含有或包括捕获位点的指示剂分子的一个或多个部分上的新的结合位点。这允许通过结合至捕获分子而特异性检测在指示剂分子的捕获位点处的切割(即，在捕获带中检测结合分子的结合)。

然而，切割(在切割位点)产生至少两个完全分开的分子不是必需的，条件是切割产生所述结合分子的新型结合位点，并且其中所述结合分子不能结合至结合位点，除非和直至切割已经发生。因此，切割产生在切割位点分开的切割区的两个部分。因此，在一些实施方案中，至少一个切割位点的切割产生切割区的至少两个部分，其中至少两个部分保持或直接或间接地(对于各部分)连接至捕获位点。这示意显示于图16A中。在具体实施方案中，所述指示剂分子含有远离所述切割位点或所述切割区之外的进一步键或连接，使得所述至少一个切割位点的切割产生所述指示剂分子的切割区的至少两个部分，其保持与彼此连接。这不排除切割产生至少三个片段(其中至少一个不保持经由进一步键或连接而连接)的可能性。这特别是切割区可以包含多于一个切割位点的情况。这示意显示于图16B中。在一些实施方案中，进一步键或连接可以包含二硫键。已经发现，连接至指示剂分子的支架分子的使用提供指示剂分子内的进一步键或连接。此类支架分子可以充当结构约束，其可用于开发仅在切割已经发生之后才结合至指示剂分子的结合分子。不受理论束缚，所述结构约束据信帮助产生特异性和可重复的结合位点，所述结合位点不存在，除非和直至在切割位点的切割已经发生。该支架分子可以增强指示剂分子切割之前和之后之间的空间构象的差异，如本文更详细地讨论。在切割之后，该支架还可以将切割的指示剂分子约束于特定的空间构象中。这可以通过在切割(针对所述切割可以设计或产生结合分子)之后提供明确定义和不同的分子而帮助改进在结合分子区别切割和未切割的指示剂分子方面的检测的特异性。因此，在一些实施方案中，所述结合分子结合至切割的区域。在具体实施方案中，所述结合位点因此可以涵盖切割之后的切割位点的两侧(即，所述切割区的至少两个部分)。所述结合分子可以结合至切割之后的指示剂分子的两个部分。

本发明因此还提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的指示剂分子，所述指示剂分子包含：

(a)包含至少一个切割位点的切割区，如果所述酶切割活性存在，则所述切割位点可以被所述酶切割，

(b)捕获位点；和

(c)支架分子，其起作用以连接切割位点之外(诸如切割区之外)的指示剂分子的至少两个部分，

其中所述支架进一步起作用，以使得至少一个切割位点的切割产生结合分子结合的新型结合位点的方式在结构上约束指示剂分子，但其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

本发明还提供用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的指示剂分子，所述指示剂分子包含：

(a)包含至少一个切割位点的切割区，如果所述酶切割活性存在，则所述切割位点可以被所述酶切割以产生所述切割区的至少两个部分，

(b)捕获位点；和

(c)支架分子，其起作用以连接所述指示剂分子的至少两个部分，使得至少一个切割位点的切割产生所述指示剂分子的切割区的至少两个部分，其保持与彼此连接。

其中所述支架进一步起作用，以使得至少一个切割位点的切割产生结合分子结合的(新型)结合位点的方式在结构上约束指示剂分子，但其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

支架分子通常连接至远离切割位点的指示剂分子，使得酶的切割活性不受支架抑制。因此，所述切割区可以通过一个或多个接头或间隔区与支架分子分开。在一些实施方案中，那些接头或间隔区可以并入捕获位点。支架分子通常通过两个键连接至指示剂分子，尽管可能可以采用额外的键-例如3、4、5或6个等-键，这取决于使用的支架分子和指示剂分子的性质。也可能单一支架分子可以连接至多个指示剂分子。在支架分子含有多于两个卤素取代基(特别是溴甲基取代基，诸如4或6个溴甲基取代基)的实施方案中，支架分子可以为多种指示剂分子提供结构约束。可以连接每对取代基以连接切割区的至少两个部分。因此，支架有效连接(和结构上约束)多个分开的切割区。在具体实施方案中，指示剂分子包含多于一个约束肽(切割区)。切割区也可以是不同的，导致单一分子含有不同的可切割序列。此处，可能使用两个或更多个不同的结合分子(例如针对其切割的底物产生的抗体)来检测各单独的肽切割区的切割。因此，仅当两种或更多种蛋白酶存在时才需要测定信号的情况下，可能仅当已经切割所有不同的切割位点时结合分子(抗体)结合才发生。在该情况下，结合分子(抗体)将必须在被两种或更多种蛋白酶切割之后产生为指示剂分子的形式。

支架分子有助于约束指示剂分子(通常是肽)的切割末端或部分，以产生用于结合分子(通常是结合至新揭示或产生的表位(特别是构象表位)的抗体)的新型和特异性的结合位点。因此，结合分子可以特异性结合至指示剂分子的任一切割末端或部分或切割位点的两侧(即，切割区内切割位点任一侧)。在具体实施方案中，所述支架进一步起作用，以使得至少一个切割位点的切割产生含有结合分子结合的指示剂分子的切割区的两个部分的结合位点的方式在结构上约束指示剂分子，但其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。在具体实施方案中，所述结合位点包括切割位点。在具体实施方案中，所述结合位点代表指示剂分子的新型结构构象。切割可以产生至少一个新的构象表位。结合分子的新型结合位点可以包含指示剂分子的任何部分，条件是酶切割活性和捕获基本上不受阻碍。在某些实施方案中，所述结合位点包含切割区的至少一个部分。在具体实施方案中，所述结合位点包含支架分子的至少一个部分。

在大多数实施方案中，所述切割位点对于蛋白酶的切割是特异性的。然而，如本文所讨论，本发明的指示剂分子可以被其它酶切割，所述其它酶诸如氧化还原酶、水解酶和裂解酶，并且包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、碳水化合物酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神经氨酸酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亚类。在某些实施方案中，所述切割位点对于内肽酶的切割是特异性的。一种或多种不同的蛋白酶可以根据本发明进行检测。在某些实施方案中，所述切割位点对于基质金属蛋白酶(MMP)的切割是特异性的。这对于本发明的诊断应用(包括尿样品中的检测)是特别相关的。MMP是锌依赖的内肽酶。它们负责切割各种蛋白，包括细胞外基质蛋白。MMP包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27和MMP28。在其它实施方案中，所述切割位点对于弹性蛋白酶诸如(人)嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)是特异性的。在一些实施方案中，可以存在用于多种蛋白酶(诸如多种MMP和/或一种或多种MMP连同HNE)的切割位点。合适的HNE底物包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列组成或由以下氨基酸序列组成：

CQESIRLPGC(SEQ ID NO:3)

该底物形成本发明的一个单独方面。该底物可以含有促进固定化的额外残基，诸如酪氨酸残基，以提供苯基用于连接。具体而言，该底物可以含有排除半胱氨酸残基的额外氨基酸残基，使得可以使用替代固定化化学法。因此，该底物可以包含以下氨基酸序列：

YCQESIRLPGC(SEQ ID NO:4)

在一些实施方案中，所述至少一个切割位点可以针对特定蛋白酶的切割进行偏置(be biased for)。这允许利用本发明以检测测试样品中的特定蛋白酶活性。许多蛋白酶是已知的，且它们的优选切割位点是充分报道的。在某些实施方案中，至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。更具体地，在一些实施方案中，至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。至少一个切割位点可以针对MMP-13、9、2、12和8的切割进行偏置。该偏置可以同等针对MMP的组群，或者可以按该特定的优先顺序。如本文所示，可能在针对这些具体MMP(按特定的优先顺序)的切割偏置的指示剂分子内设计特定指示剂分子和切割位点。因此，在一些实施方案中，切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内。这可以被认为是指示剂分子的“切割区”的具体实例。在那些实施方案中，切割产生指示剂分子的切割区的含有氨基酸序列GPQG的部分和指示剂分子的切割区的含有氨基酸序列IFQG的部分。任一部分都可以是连接至捕获位点的部分。在具体实施方案中，指示剂分子包含氨基酸序列CGPQGIFGQC(SEQ ID NO:2)。半胱氨酸残基的包括提供代表各种支架分子的便利连接点的硫醇基团。在一些实施方案中，所述切割区可以通过一个或多个接头或间隔区与支架分子的连接点分开。因而，指示剂分子可以包含结构：

在一些实施方案中，捕获位点可以在间隔基中的一个或两个中找到。因此，本发明的指示剂分子可以包含位于或接近N和C末端的合适氨基酸以促进连接至支架分子。所述氨基酸可以包含硫醇基团。合适的残基包括半胱氨酸和硒。该支架分子可以经由硫醚键结合至指示剂分子。

用于将支架分子连接至肽的一定范围的合适的支架分子和方法在WO2004/077062和WO2008/013454(其相关公开内容在此通过引用并入)中讨论。本发明以新方式应用这些支架分子以便在切割之后呈现切割位点和产生新的结合位点，其允许检测测试样品中的酶切割活性(特别是蛋白酶活性)。

在某些实施方案中，该支架分子包含(杂)芳族分子。在更具体实施方案中，该(杂)芳族分子包含至少两个苄基卤素取代基。在一些实施方案中，所述支架分子是卤代甲基芳烃，诸如选自双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯和四(溴甲基)苯或其衍生物的卤代甲基芳烃。在具体实施方案中，所述支架选自邻-、间-和对-二卤代二甲苯和1,2,4,5四卤代四甲苯，诸如间-1,3-双(溴甲基)苯(m-T2)、邻-l,2-双(溴甲基)苯(o-T2)、对-l,4-双(溴甲基)苯(p-T2)、间-l,3-双(溴甲基)吡啶(m-P2)、2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯(T3)、间-l,3-双(溴甲基)-5-叠氮基苯(m-T3-N3)和/或1,2,4,5四溴四甲苯(T4)。

卤代甲基芳烃类的合适的衍生物包括邻、间和对双(溴甲基)苯类。更具体地1,2-双(溴甲基)苯、1,3-双(溴甲基)苯和1,4-双(溴甲基)苯。进一步取代的卤代甲基芳烃类包括1,3,5-三(溴甲基)苯、1,2,4,5-四(溴甲基)苯和1,2,3,4,5,6-六(溴甲基)苯。多环卤代甲基芳烃类包括2,7-双(溴甲基)-萘、1,4-双(溴甲基)-萘、1,8-双(溴甲基)-萘、1,3-双(溴甲基)-萘、1,2-双(溴甲基)-萘、2,3-双(溴甲基)-萘、2,6-双(溴甲基)-萘、1,2,3,4-四(溴甲基)-萘、9,10-双(溴甲基)-菲、5,10-双(溴甲基)-蒽和1-(溴甲基)-3-[3-(溴甲基)苄基]苯。甲基取代的卤代甲基芳烃类包括1,3-双(溴甲基)-5-甲基苯、2,5-双(溴甲基)-1,3-二甲基苯、2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲基苯、2,4-双(溴甲基)-1,3,5-三甲基苯和3,6-双(溴甲基)四甲苯。硝基取代的卤代甲基芳烃类包括3,4-双(溴甲基)-硝基苯和2,3-双(溴甲基)-硝基苯。羟基取代的卤代甲基芳烃类包括1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯，且氰基取代的卤代甲基芳烃类包括2,6-双(溴甲基)-苄腈。甲氧基取代的卤代甲基芳烃类包括1,3-双(溴甲基)-5-甲氧基苯、1,3-双(溴甲基)-2-甲氧基-5-甲基苯、1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯、2,3-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯和2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯。

用于本发明的指示剂分子中使用的一些合适的支架分子显示于图14中。图15中还显示许多特定合适的支架分子连同提出的命名。

由于它们的相对刚性和易于合成使用，卤代甲基芳烃衍生物是优选的候选物以充当本发明中的支架分子。它们特别便于生成约束的肽底物。然而，可以设想其它适当的化学法，其用于“环化”指示剂分子，诸如肽。在含有硫醇(例如：以半胱氨酸的形式)的肽的情况下，简单的二硫键形成或二环氧化物衍生物可以用于实现结构的共价闭合。另一种适当的化学法包括“点击化学(click chemistry)”方法，其涉及叠氮化物和炔烃之间的环加成反应，其形成稳定的三唑类。此处，例如，具有两个叠氮基赖氨酸氨基酸的肽可以通过二炔试剂分子内交联。此类反应可以由铜催化。然而，在一些实例(诸如使用约束的炔烃的实例)中，不需要催化剂。其它化学途径包括稳定腙形成的途径。含有两个苯肼部分的指示剂分子(特别是肽)可以是经由二醛试剂分子内交联。其它化学途径通过含有两个酪氨酸氨基酸的基于肽的指示剂分子是可能的。这些肽可以使用双(重氮)支架分子内交联，以形成相应的重氮加合物。

支架分子还可以包括进一步官能团或活性基团，以促进在切割位点的酶促切割之后生成新型结合位点。因此，在切割位点切割之后，存在指示剂分子的切割区的至少两个部分，其不再通过切割位点彼此连接。那些“游离”部分中的一个或多个可以通过与支架分子的相互作用变得进一步受约束。这可以产生整个分子的结构的显著变化。这进而允许生成特异性结合分子，其将不与切割前的指示剂分子交叉反应。因此，通过实例的方式，在支架分子约束的肽的情况下，可以设想切割位点的切割之后的特定的构象变化。得到的肽链的自由度可以允许它经由非共价相互作用以新的稳定构象自组装，形成对于分子独特且被结合分子识别(诸如针对切割的底物产生的抗体)的新的构象表位。这些非共价相互作用可以包含支架分子中的氨基酸侧链和芳环之间的疏水性相互作用。非共价相互作用在具有延长取代模式的支架中可以进一步增强，使得例如带负电荷的硝基取代基可以与切割区内包括的带正电荷的氨基酸诸如赖氨酸、精氨酸或组氨酸相互作用。氢键相互作用在甲氧基和/或羟基芳基取代基和许多氨基酸(包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)之间也是可能的。此外，在切割之后，切割区的两个切割肽部分可以与彼此自由地自组装，诱导二级结构诸如α螺旋或β链结构。在进一步实施方案中，如上所述的肽-肽相互作用和肽-支架相互作用两者的组合可以产生由结合分子识别的新型结合位点。此类相互作用起作用以区分其未切割的“封闭”形式和其切割之后的“开放”形式之间的三维空间中的结构，因此显著增强切割的指示剂分子和结合分子(例如针对切割的肽产物产生的抗体)之间的相互作用的特异性。所得的相互作用的高特异性对于样品内的酶切割活性的检测的灵敏度是有利的，因为其促进使用过量的指示剂分子，而没有结合分子结合至未切割的指示剂分子(例如，针对切割的肽产生的抗体结合至未切割的肽)的风险。

该支架不应阻止在一个或多个切割位点的切割。在一些实施方案中，该支架可以定向指示剂分子(的切割区)，以优化或改进在切割位点的切割效率。该支架可以有效地固定或约束切割区，以便以对于待检测的酶活性有利的方式呈现切割位点。支架分子对任何给定底物的切割的影响可以容易地通过简单的时程实验进行测试。测试可以确定在酶存在的情况下在合理时间(例如5-10分钟)内是否发生切割。该测试可以例如通过质谱分析进行定量，所述质谱分析任选与HPLC组合，因为其应当发展新的水解分子(具有不同的分子量)，其也应当在反相分析柱上差异保留。并入支架分子的那些指示剂分子可以，例如，然后制备为其纯化的切割形式的免疫原。这可以用于在合适的动物诸如绵羊中产生作为游离肽或缀合至载体蛋白的抗体。抗血清然后可以通过针对固定化的抗原的ELISA来表征，且抗原柱可用于亲和纯化和改善特异性针对切割的指示剂分子的多克隆响应。完整的指示剂分子然后可以根据本发明的方法进行测试。

本发明的特定指示剂分子显示于图中，且包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其中半胱氨酸残基的硫醇基团用于经由连接至卤代甲基芳烃基团来环化肽。因此，本发明的指示剂分子可以包含如下式I所述的结构(且显示于图23中)。

切割的形式显示于下式II中(且也显示于图23中)。

在一些实施方案中，指示剂分子缺乏式I和II中显示的酪氨酸残基。该酪氨酸残基对于HNE活性是不需要的。

本文公开用于本发明中使用的一定范围的合适的结合分子，其讨论在此处加上必要的更改适用。通常，该结合分子包含抗体。

为了避免疑问，这些指示剂分子可以用于本发明的任何其它方面(装置、试剂盒、方法、用途等)。

在作为整体的本发明的背景下，一个或多个切割位点可以在酶促可切割键的存在的任何位点。例如，该键可以存在于指示剂分子的邻近残基之间。此类残基可以选自核苷酸、单糖和氨基酸。指示剂分子通常包含肽切割区。因此，在一些实施方案中，切割区包含氨基酸序列。在本发明的一个优选实施方案中，切割位点是位于两个氨基酸残基之间的特定肽键。

在本发明的进一步实施方案中，至少一个切割位点位于肽、蛋白、碳水化合物、脂质或核酸切割区内。在某些实施方案中，可以工程改造指示剂分子，使得其包含酶的天然底物或其部分，使得所述酶用其天然切割位点、任选地以切割区内的其天然状态呈现。在某些其它实施方案中，可以工程改造指示剂分子，使得其包含人工或非天然切割位点和/或底物区域。例如，可以工程改造或突变指示剂分子中的切割位点，使得酶表现出的切割活性的速率或切割活性的特异性相对于在相当条件下针对酶的天然底物测量的酶的切割活性的速率和/或特异性增加(或降低)。

在本发明的某些实施方案中，切割区可以包括多个切割位点，其中在任一位点的切割产生切割区的至少两个部分，其中至少一个部分保持连接至捕获位点。在本发明的背景下，术语“多个”意指至少两个、至少三个、至少四个等等。在某些实施方案中，指示剂分子的切割区包括2、3、4、5至10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、100、500或1000个切割位点。在一些实施方案中，指示剂分子包括2至5、6、7、8、9或10个切割位点。

在一个实施方案中，多个切割位点可以都是相同的。在该构型中，对于如上所定义的一种酶或酶亚型，重复切割位点可以是相对非特异性的或可以是高度特异性的。此外，该类型的指示剂分子的使用可以有助于通过提供增加测试样品中内存在的切割位点的浓度的方式来增加酶检测装置的灵敏度。

在其它实施方案中，指示剂分子的切割区可以包含多个切割位点，其中在相同的指示剂分子内存在的至少两个不同的切割位点。在本发明的优选的实施方案中，指示剂分子可以包含至少三个、至少四个、至少五个且高达至少8个不同的切割位点。

在进一步优选的实施方案中，不同的切割位点被如上所定义的不同的酶或不同的酶的类别、亚类或亚型识别，从而使得本发明的装置可用于检测多种不同的酶的活性。可以将活性分组，使得酶活性的检测给出有用的结果。例如，一组酶可以参与疾病状态，使得一个或多个酶组的相关的检测是诊断上有用的。

多个切割位点(无论相同还是不相同的)的使用可以对于其中测试样品中待检测非常低水平的酶活性的情况是特别有用的。例如，具有如上所定义的多个切割位点的指示剂分子可用于检测含有低水平的蛋白酶的尿样品中的酶活性。当指示剂分子并入支架分子时，多个切割位点的使用也可以是特别适用的。

除了含有至少一个切割位点的切割区以外，所述指示剂分子包含捕获位点。捕获位点介导指示剂分子结合至捕获带内存在的捕获分子。因此，捕获位点是负责将指示剂分子保留或定位于捕获带内的指示剂分子的部分。指示剂分子的切割之后，捕获位点可以保持完整或基本上完整，使得该位点仍被装置的捕获带内存在的捕获分子识别和结合。在这些情况下，完整的指示剂分子和切割之后包含捕获位点的指示剂分子的部分两者均将结合至捕获带内的捕获分子。捕获位点可以包含任何合适的分子，例如生物素分子。支架分子也可能形成捕获位点的部分或全部，以允许将指示剂分子固定化在捕获带。例如，该捕获带可以包含针对支架分子产生的抗体，优选为连接至指示剂分子的形式。在这些实施方案中，支架分子基本上不参与结合至结合分子。对于指示剂分子的有效性关键的是经由在捕获带处的捕获位点和捕获分子之间的相互作用和在切割已经发生之后结合分子的同时结合的固定化。在其中支架分子定义用于切割之后的结合分子的结合位点的部分的那些实施方案中，捕获位点必须足够独特以防止结合事件之任一或两者受阻碍。

如上所示，切割位点在肽、蛋白、碳水化合物、脂质或核酸切割区内。在本发明的具体实施方案中，切割区和捕获位点通过肽或蛋白内的离散的氨基酸或氨基酸组定义。如本文所使用，术语“肽”意指不大于(约)20、30、40或50个氨基酸的氨基酸的长度。

或者，捕获位点可以存在于指示剂分子的区域中，所述区域与切割位点位于的区域是分开的。因此，在本发明的某些实施方案中，捕获位点可以存在于捕获区内，且切割位点可以存在于指示剂分子的分开的切割区内。在其中捕获位点处于指示剂分子与切割位点分开的区域中的实施方案中，捕获位点可以包含与分子的含有切割位点的区域中发现的材料或残基完全不同的材料或残基。例如，切割区可以包含氨基酸残基，而捕获位点可以包含生物素部分或由生物素部分组成。此外，在其中指示剂分子包含分开的具有切割位点和捕获位点的区域的实施方案中，所述区域可以通过本领域技术人员已知的任何方式来缔合。在一个优选的实施方案中，所述区域可以经由直接共价键缔合。所述区域可以是直接相邻，或者可以经由接头或间隔基(例如，聚乙二醇部分)分开。

待根据本发明检测的一种或多种酶必须能够在切割位点切割指示剂分子。需要该活性以便在切割位点处切割指示剂分子，以产生指示剂分子的切割区的至少两个部分，其中至少一个部分保持连接至捕获位点。因此，在本发明的一些实施方案中，待检测的一种或多种酶选自以下类别：-氧化还原酶、水解酶和裂解酶，并且包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、碳水化合物酶、磷酸酶、硫酸酯酶、神经氨酸酶、酯酶、DNA酶和RNA酶的亚类。在具体实施方案中，该酶是蛋白酶。在某些实施方案中，该蛋白酶包含内肽酶。一种或多种不同的蛋白酶可以根据本发明进行检测。在某些实施方案中，该蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)。MMP是锌依赖的内肽酶。它们负责切割各种蛋白，包括细胞外基质蛋白。MMP包括MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP21、MMP23A、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27和MMP28。在其它实施方案中，所述切割位点对于弹性蛋白酶诸如(人)嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)是特异性的。在一些实施方案中，可以存在用于多种蛋白酶(诸如多种MMP和/或一种或多种MMP连同HNE)的切割位点。合适的HNE底物包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成，并且可以并入指示剂分子，诸如显示于式I或II(包括缺乏酪氨酸残基的形式)。

如本文所讨论，所述至少一个切割位点可以针对特定蛋白酶的切割进行偏置。这允许利用本发明以检测测试样品中的特定蛋白酶活性。许多蛋白酶是已知的，且它们的优选切割位点是充分报道的。在某些实施方案中，至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。更具体地，在一些实施方案中，至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。至少一个切割位点可以针对MMP-13、9、2、12和8的切割进行偏置。该偏置可以同等针对MMP的组群，或者可以按该特定的优先顺序。如本文所示，可能在针对这些具体MMP(按特定的优先顺序)的切割偏置的指示剂分子内设计特定指示剂分子和切割位点。因此，在一些实施方案中，切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内，其因此形成切割区。在那些实施方案中，切割产生指示剂分子的含有氨基酸序列GPQG的部分和指示剂分子的含有氨基酸序列IFQG的部分。任一部分都可以是含有捕获位点的部分。如本文所示，本发明人已经产生结合分子，其特异性识别任一所得序列，但不识别原始(切割前)氨基酸序列。

在本发明的背景下，指示剂分子(经由捕获位点)可以相对高亲和力结合至捕获分子。在一些实施方案中，对于指示剂分子的解离常数(k_d)将相对低，且优选为0M至1x 10^-7M(取决于测定所需的灵敏度)。在本发明的某些实施方案中，对于指示剂分子的解离常数将为1x 10^-15M至1x 10^-9M。

在本发明的某些实施方案中，此类结合相互作用可以作为指示剂分子的捕获位点与捕获带中存在的捕获分子的直接结合的结果而实现。在该背景下，直接结合意指指示剂分子(经由捕获位点)与捕获分子的结合，而没有任何中间物。

在本发明的一些实施方案中，指示剂分子的捕获位点和捕获带中存在的捕获分子是结合对的两半。在该背景下，结合对由能够与彼此结合的两个分子或实体组成。在本发明的某些实施方案中，结合相互作用是特异性的，使得结合对的各成员仅能够结合其相应伴侣，或有限数目的结合伴侣。此外，如上所详述，优选结合对表现出相对高的亲和力。结合对可以是自然界中发现的结合对或人工生成的相互作用的分子或实体对。

在本发明的一些实施方案中，指示剂分子的捕获位点和捕获分子是结合对的两半，其中结合对选自以下：-抗原和抗体或其抗原结合片段；生物素和抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，中性抗生物素蛋白或凯普抗生物素蛋白(captavidin)；免疫球蛋白(或其适当的结构域)，蛋白A或G；碳水化合物和凝集素；互补的核苷酸序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅因子和酶；酶抑制剂和酶；纤维素结合结构域和纤维素纤维；固定化的氨基苯基硼酸和具有顺式-二醇的分子；和木葡聚糖和纤维素纤维及其类似物、衍生物和片段。

在本发明的具体实施方案中，结合对由生物素和链霉抗生物素蛋白组成。在本发明的一个进一步实施方案中，指示剂分子的捕获位点包含表位，且捕获分子包含特异性结合至第一捕获位点存在的表位的抗体。在本发明的背景下，术语抗体覆盖来自任何物种的天然免疫球蛋白，嵌合抗体，人源化抗体，F(ab')₂片段，Fab片段，Fv片段，sFv片段和高度相关的分子，诸如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的那些(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆或多克隆的。因此，在具体实施方案中，捕获分子包含抗体。在其它实施方案中，捕获位点包含生物素分子，且捕获带包含链霉抗生物素蛋白分子。

在本发明的某些实施方案中，指示剂分子的捕获位点与装置的捕获分子的结合可以是间接的。在本发明的背景下，“间接结合”意指能够桥接指示剂分子的捕获位点和捕获分子的一些中间实体(例如能够同时结合指示剂分子的捕获位点和捕获分子的“适配子”)介导的结合。

当指示剂分子与捕获分子的结合是间接的且由适配子介导时，对于多个指示剂分子可能结合至各捕获分子。在该背景下，多个意指至少两个、至少三个、至少四个等等。这可以通过并入多价适配子分子，例如，能够同时结合至多个含生物素的指示剂分子以及由生物素组成或包含生物素的捕获分子的链霉抗生物素蛋白分子，来实现。

其中多个指示剂分子结合至各捕获分子的装置的实施方案可以用于实现改进的测定精确度，如本文更详细描述。

本发明的另一关键分子是结合分子。本发明依赖于能够结合至切割后产生的新型结合位点或切割之后含有捕获位点的指示剂分子的部分的结合分子，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生。因此，在具体实施方案中，结合分子包含抗体。为了避免疑问，术语抗体覆盖来自任何物种的天然免疫球蛋白，嵌合抗体，人源化抗体，F(ab')₂片段，Fab片段，Fv片段，sFv片段和高度相关的分子，诸如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的那些(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆或多克隆的。本发明人已经产生抗体，其中仅识别切割后的切割区，因此不结合至指示剂分子(至任何显著成都)，除非和直至在切割位点的切割已经发生。抗体可以根据本领域中已知的技术产生。这可以依赖于用切割产物免疫动物诸如绵羊、兔或山羊。例如，免疫可以使用在切割之后保持连接至捕获位点的切割区的部分，任选包括捕获位点本身，来进行。多克隆抗体可以分离自血清并亲和纯化。单克隆抗体可以使用众所周知和表征的杂交瘤技术来产生。

因此，本发明还提供结合分子，通常为抗体，其结合至切割之后如本文所定义的指示剂分子。本发明提供结合分子，通常为抗体，其结合至作为切割的结果产生的指示剂分子中的新型结合位点，其中所述结合分子不能结合至指示剂分子，除非和直至切割已经发生。在一些实施方案中，结合分子在切割区中结合。在具体实施方案中，至少一个切割位点的切割产生指示剂分子的切割区的至少两个部分，其中至少一个部分保持连接至捕获位点，且作为切割的结果，含有结合分子的结合位点，并且其中所述结合分子不能结合至结合位点，除非和直至切割已经发生。在一些实施方案中，至少一个切割位点的切割产生指示剂分子的两个分开的部分，因此结合分子在切割之后结合至分开部分中的一个或两个。与此一致，本发明提供结合分子，任选为抗体，其结合至包含氨基酸序列GPQG的指示剂分子，但不结合至包含氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)(作为切割区)的指示剂分子。类似地，本发明提供结合分子，任选为抗体，其结合至包含氨基酸序列IFGQ的指示剂分子，但不结合至包含氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)(作为切割区)的指示剂分子。本发明进一步提供结合分子，任选为抗体，其仅当切割、特别是在异亮氨酸和精氨酸残基之间切割时结合至包含SEQID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的指示剂分子(即不结合至切割前的氨基酸序列)。指示剂分子可以通过连接至如本文所讨论的支架分子而约束。实例显示于图23中。

在本发明的其中指示剂分子在结构上受约束且其中至少一个切割位点的切割产生保持与彼此连接的指示剂分子的切割区的至少两个部分的那些实施方案中，结合分子可以结合至切割之后的切割区。在具体实施方案中，结合分子结合至切割之后的指示剂分子的切割区的两个部分。因此，结合分子可以结合切割之后的有效地跨越切割位点的区域。指示剂分子的结构约束，例如，使用如本文所讨论的支架分子，在切割之后为结合分子提供良好定义和稳定的结合位点。在具体实施方案中，结合分子结合的结合位点代表指示剂分子的新型结构构象。切割可以产生至少一个新的构象表位。用于结合分子的结合位点可以包含指示剂分子的任何部分。这可以附带以下条件：酶切割活性和/或指示剂分子的捕获基本上不受结合分子的结合阻碍。在某些实施方案中，结合位点包含切割区的至少一个部分和/或所接头或间隔区的至少一个部分，其连接至支架分子且将支架分子与切割区分离。在其它实施方案中，结合分子可以结合至包含支架分子的至少一个部分的新型结合位点。

结合分子可以用报道分子直接或间接标记，以允许检测结合分子与指示剂分子的结合。报道分子可以是适合于通过本领域技术人员可得的任何方式检测的任何物质或部分。因此，报道分子通常能够生成或产生信号。在本发明的某些实施方案中，报道分子选自以下：-金颗粒；色原；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见化合物；含有信号产生物质的的脂质体或其它囊泡；电活性物质；或酶及其底物的组合。用作报道部分的合适的酶-底物组合可以是酶碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。在本发明的一个具体实施方案中，报道部分是金颗粒。

本发明内还设想用报道分子间接标记结合分子。因此，报道分子可以连接至进一步结合分子，其进而结合至结合分子以提供标记。该间接结合可以通过能够同时结合结合分子和报道分子的适配子来介导。作为一个说明性实施方案，当结合分子是抗体时，间接标记可以通过以特异性方式结合至抗体结合分子的进一步抗体介导。进一步抗体可以用报道分子直接标记，所述报道分子诸如金颗粒；色原；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见化合物；含有信号产生物质的的脂质体或其它囊泡；电活性物质；或酶及其底物的组合。用作报道部分的合适的酶-底物组合可以是酶碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。在本发明的一个具体实施方案中，报道部分是金颗粒。

在本发明的其中报道分子凭借适配子分子结合至结合分子的实施方案中，在将测试样品添加至指示剂分子前，适配子可以与结合分子预复合，条件是适配子不阻止结合分子结合至切割的指示剂分子。

适配子可以是能够介导结合分子与报道分子的间接相互作用的任何物质或分子。在一些实施方案中，适配子是链霉抗生物素蛋白，且结合分子包含生物素分子。适配子也可以是“适配子结合对”，其中结合对包含：

(i)能够结合至结合分子的第一组分；和

(ii)能够结合至所述对的第一成员和报道分子的第二组分。在本发明的某些实施方案中，指示剂分子的检测区包含生物素，适配子结合对的第一成员是抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，适配子结合对的第二成员是生物素，且报道分子包含能够结合生物素的部分。

包括适配子分子或适配子结合对可以促进多个报道分子与各结合分子的结合。例如，使用多价链霉抗生物素蛋白作为适配子将允许同时结合含生物素的结合分子以及多个含生物素的报道分子。

在某些实施方案中，本发明可以在侧流或垂直流装置中进行。通常，因此，本发明依赖于某种形式的固体支持物。固体支持物可以限定用于样品的液流路径。在具体实施方案中，固体支持体包含层析介质或毛细流装置。在一些实施方案中，本发明可以测试条形式提供。一个代表性实例显示于图2中，且本文进一步详细描述。

在本发明的具体实施方案中，在固体支持物上形成捕获带。意欲涵盖捕获分子可以连接以形成捕获带的任何支持物。固体支持物可以采取例如珠(例如，琼脂糖或琼脂糖珠)或孔(例如，在微板中)的形式。因此，在某些实施方案中，装置包含捕获分子连接以形成捕获带的固体支持物。在本发明的试剂盒的情况下，可以提供未连接捕获分子的固体支持物。在那些实施方案中，在使用具有测试样品的装置前，试剂盒的使用者可以将捕获分子固定化在固体支持物上以形成捕获带。因此，试剂盒也可以包含用于将捕获分子固定化在固体支持物上的装置。固定化装置可以包含允许形成捕获带的任何合适的试剂。固体支持物可以用合适的固定化方式预先形成。例如，固体支持物可以包含布置成与形成捕获分子(的部分)的抗生物素蛋白(例如，链霉抗生物素蛋白)分子相互作用的生物素分子。当然，其它结合对相互作用可以用于将捕获分子固定化在固体支持物上以形成捕获带，如本文讨论且如本领域技术人员容易理解。

捕获带可以通过将能够结合至指示剂分子的捕获位点的捕获分子固定化在其中或其上而限定。捕获分子的固定化可以通过任何合适的方式实现。当装置是包含层析介质的流动装置时，捕获分子可以通过直接结合至介质而固定或经由结合至与介质缔合或结合的载体分子诸如蛋白间接固定化。

在进一步实施方案中，固体支持物进一步包含施用样品的样品施用带。样品施用带可以用指示剂分子预装，使得当施用测试样品时，样品中的任何酶对样品施用带内的指示剂分子的切割位点起作用。样品施用带可以含有屏障，其将样品保持于样品施用带预定时间段。这允许样品与指示剂分子相互作用足够时段，足以实现可测量的切割水平。这可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、60分钟或更长时间，这取决于待检测的酶，如本领域技术人员容易理解。在该时间段之后，屏障可以被样品降解或以其它方式去除，允许允许样品继续流过装置。或者，在将混合物添加至装置，诸如样品施用带之前，可以预混合或预孵育测试样品和指示剂分子。然而，当可以预混合或预孵育测试样品和指示剂分子时，可能省略样品施用带。此处，可能将混合物直接添加至捕获带，以允许通过与捕获分子的相互作用固定化指示剂分子。在一些实施方案中，可以将测试样品施用于捕获带下游的位置处的层析介质，使得其例如通过毛细作用、通过捕获带流出。层析介质可以由流体能够通过的任何材料(诸如流体通道或多孔膜)制成。在本发明的某些实施方案中，层析介质包含带或膜，例如硝酸纤维素带或膜。

结合分子必须在装置中以允许与指示剂分子相互作用(如果在切割位点处切割)的方式提供。因此，结合分子可以在施用于装置前与指示剂分子预混合。这可以在指示剂分子已经与测试样品混合之前或之后。其优选在之后，以避免结合分子可以对指示剂分子的切割位点处的酶活性(在测试样品中)具有的任何影响。结合分子也可以在装置上或中的捕获带上游的任何点提供，使得在固定化指示剂分子(经由指示剂分子的捕获位点和限定捕获带的捕获分子之间的相互作用)之前，结合分子遇到测试样品和指示剂分子。或者，在已经将测试样品和指示剂分子添加至捕获带之后，可以将结合分子添加至捕获带。这确保任何指示剂分子将已经固定化于捕获带，为结合分子提供(在切割的指示剂分子的情况下)结合位点，以产生信号。

取决于所检测的特定酶切割活性，可有必要将合适的酶抑制剂并入装置或方法。这可以对于防止酶对装置或方法的其它组分(诸如结合分子或捕获分子)起作用在是重要的。当测试样品与指示剂分子预孵育时，在孵育期结束时添加酶活性的抑制剂可以是有利的。这优选在结合分子与测试样品接触之前。或者，一种或多种酶活性抑制剂可以在结合分子上游的任何点包括于装置中，其中结合分子提供于装置上或中。这是捕获带(根据上文的讨论)的上游。可以将抑制剂简单地干燥或被动地吸附至装置上，使得测试样品当其通过装置时动员抑制剂。应当注意的是，抑制剂的使用不是必要的。例如，根据本发明检测的一些酶活性(诸如特定蛋白酶活性)可以是足够特异性的，使得蛋白酶不会对除了底物以外的装置或方法的任何其它成分起作用。特定酶的切割位点是本领域众所周知的，并且可用于设计装置和方法的各种组分。例如，可以进行在计算机芯片上筛选(例如，根据标准设置使用免费可得的工具诸如BLAST)证实待检测的酶的切割位点不含于任何相关分子(诸如结合分子和捕获分子)内。还可能通过将相关分子(例如结合分子和捕获分子)与待测试的酶活性孵育并检测切割是否发生来检查交叉反应性。在一些实施方案中，由于待检测的酶切割活性的性质而不会对相关分子起作用。作为一个实例，如果检测核酸酶活性，则这不应当显示与抗体结合分子或链霉抗生物素蛋白或抗体捕获分子相关的任何切割活性。

固体支持物可以进一步包含关于样品流的捕获带下游的对照带，和样品施用带(如果存在的话)，其含有进一步结合分子，其结合至结合分子，以表明使用该装置的测定的成功完成。或者，进一步结合分子可以结合至添加至样品或装置且与样品一起流过装置的进一步分子。进一步分子可以用如本文所定义的报道分子直接或间接地标记。优选地，为了便于检测，报道分子是与连接至结合分子相同的报道分子，尽管它可以是不同的。如果报道分子结合或固定化于各自分别的带中，则对照带与捕获带在空间上分开，例如，以产生两条分开的测试线。该对照带用于证实测试样品，包括结合分子，已经通过整个设装置，并证实装置正常操作。不依赖于样品中是否存在酶切割活性，在对照带处预期阳性信号。进一步结合分子基于结合至指示剂分子的切割位点的结合分子的性质或添加至样品的进一步分子的性质进行选择。结合分子和进一步结合分子或进一步分子和进一步结合分子可以形成如本文所定义的结合对。例如，如果结合分子是物种特异性抗体(例如，绵羊抗体)，则进一步结合分子可以是抗物种抗体(例如，抗绵羊抗体)。此外，如果进一步分子是来自不同物种(例如，鸡或山羊)的抗体，则进一步结合分子可以是适当的抗物种抗体。这允许凭借特异性相互作用将结合分子或进一步分子固定化于对照带处。进一步结合分子可以通过任何合适的方式，例如通过共价或非共价相互作用固定化于对照带处。

在本发明的所有方面，测试样品可以是已知或怀疑含有具有切割活性的酶的任何物质。测试样品可以源自任何来源。在某些实施方案中，测试样品可以源自生物来源，包括体液诸如血液(包括血清和血浆)，唾液，尿液，乳液，来自创伤的流体，腹水，腹膜液，羊水等等。在一些实施方案中，测试样品是创伤流体，且装置作为评价创伤愈合的状态和/或速率的方式而用于检测酶活性，优选蛋白酶活性。在具体实施方案中，测试样品是尿液，且装置用于检测尿液中的酶、特别是蛋白酶的活性。如本文所讨论的本发明的特定诊断应用可以特别适用于某些代表性样品类型，特别是尿液、唾液或痰。在其它实施方案中，样品可以是其中可以期望测试切割活性的环境样品。例如，样品可以是水、食物或灰尘样品。在食物和饮料样品的背景下，切割活性可以例如关于产品的保质期进行检测。样品也可以是实验室或工业样品，例如以测试作为污染物的蛋白酶或其它切割酶。污染物可以在各种实验室方法诸如蛋白纯化过程中或在工业方法诸如发酵中发现。

测试样品可以通过任何合适的方式收集，且以适合于与本发明一起使用的任何形式(包括固体或液体)呈现。此外，作为从其原始来源获得测试样品的部分，样品可以在使用本发明测试前经历一个或多个处理或预处理步骤。在一个实施方案中，可以处理固体样品，以便产生用于测试的溶液或悬浮液。此外，在某些实施方案中，可以将测试样品储存，例如冷冻于约-20℃，作为在使用本发明测试前将样品保存任何给定时间长度的方式。

应当注意的是，本发明通常基于分离的样品在体外进行。在一些实施方案中，本发明的方法可以包括获得样品用于测试的步骤。

附图简述

本发明现在将关于附图通过实例的方式进行描述：

图1是根据本发明的测定的四种不同形式的示意图。各形式依赖于固体支持物(1)、捕获分子(2)、含有捕获位点(3)和切割位点(4)的指示剂分子和仅在切割(6)已经发生之后才结合至指示剂分子的结合分子(5)的相同的基本组件。

图2是根据本发明的酶检测装置的示意图，并显示在酶切割活性不存在(图2A)存在(图2B)情况下的装置的操作。

图3显示随着增加测试样品中的MMP活性的水平的测定的视觉读出值(图2中所示)。

图4是根据本发明的一种酶检测装置的示意图。该图指定各卡组件的确切纵向尺寸和位置。

图5显示合成结构上约束的指示剂分子的一个实例。

在图5A中，最初合成线性肽(1)，例如使用固相Fmoc化学法。所述肽可以例如通过高效液相层析(HPLC)进行纯化。然后通过肽(2)和支架分子(3)上的硫醇基之间的反应约束或环化所述肽。该反应产生结构上约束的“夹(clipped)”肽(4)。

在图5B中，合成指示剂分子以包括捕获位点(1)，例如，通过在预装的生物素-PEG树脂上合成线性肽。

图6示意显示本发明中使用的结合分子专门结合至切割的指示剂分子的能力。在酶切割活性不存在的情况下，抗体结合分子(2)不结合结构上约束的指示剂分子(1)。该抗体使用切割的指示剂分子(3)作为抗原生成，因此仅结合至该分子的这种“开放”形式。

图7(图7A和7B)表明当用掺料的MMP-9缓冲样品运行时本发明的测定的灵敏度。在75μl的样品体积，MMP-9的可检测限值为约4ng/ml。图7A显示横跨MMP-9的整个浓度范围的读数值，而图7B是在0至15ng/ml的MMP-9浓度的放大视图。

图8表明，本发明的测定的特定版本使用对MMP13、MMP12、MMP9、MMP8和MMP2偏置的可切割的序列。本发明的测定的其它版本可以根据所需要的应用使用具有不同目标的序列。

图9表明，可测量量的活性蛋白酶(特别是MMP，包括MMP-9)可以在尿样品中发现，且更高水平存在于获得自具有呼吸疾病的患者的样品中。当与收集自健康对照的样品相比时，对于COPD样品观察到显著差异(P＝0.03)，且当与收集自健康对照的样品相比时，对于CF样品观察到显著差异(P＝0.01)。

图10是比较该测定在EDTA存在或不存在的情况下检测MMP活性的能力的图。该图显示将EDTA添加至创伤样品抑制读出值，证实样品中存在MMP，也证实该测定特异性测量活性MMP。

图11含有比较商业可得的活性MMP-9测定试剂盒和本发明的测定法检测MMP9的能力的图(图11A和11B)。图11A显示横跨MMP-9的整个浓度范围的读数值，而图11B是在0至50ng/ml的MMP-9浓度的放大视图。两个图表明，本发明的方法产生较陡峭的曲线。根据两种测定法，如由吸光度值显示的显色见于4ng/ml MMP9，测试的最低标准品。

图12显示使用ELISA和本发明的侧流实施方案的MMP9标准曲线。

图13显示可用于本文描述的指示剂分子中的一些支架分子。

图14显示可用于本文描述的指示剂分子中的一些支架分子，连同提出的命名。

图15显示支架分子对于指示剂分子的一些结合选项。图15A显示在单一切割位点处切割的产物，且图15B显示在两个分开的切割位点处切割的产品。

图16显示MOL386肽的分析型HPLC。

图17是MOL386肽的质谱。

图18是用PEG-生物素修饰的MOL386肽的质谱。

图19是环化的MOL386肽的质谱分析。

图20是用PEG-生物素修饰的环化的MOL386肽的质谱分析。

图21显示对于图1中显示的所有组合的MMP9标准曲线。

图22呈现源自图21中显示的结果的最佳组合的性能。

图23显示用于人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的消化前和经消化形式的环化的肽底物。

图24显示包括SEQ ID NO:3的氨基酸序列的环化的肽底物的蛋白酶消化的HPLC分析。图24A呈现原始图数据。图24B呈现显示产物随着时间的相对增加和底物随着时间的相对减少的时间过程。

图25呈现证实在单一位点处切割环化的SEQ ID NO:3底物的质谱数据。图25A是底物图，且图25B是水解的产物。

图26呈现用于生成免疫原以产生对于图23中显示的指示剂分子的切割形式特异性的抗体的一种路线。

图27呈现用于生成免疫原以产生对于图23中显示的指示剂分子的切割形式特异性的抗体的一种替代路线。

图28显示MOL488肽的质谱表征。

图29显示结合至支架分子(衍生自1,3-二溴甲基苯)之后MOL488肽的质谱表征。

图30显示使用HNE切割之后环化的MOL488肽(即连接至所述支架)的质谱表征。

优选实施方案的描述

在形式1和4中，捕获分子(2)是链霉抗生物素蛋白。此处，捕获分子(2)结合至指示剂分子内的生物素捕获位点(3)。在形式2和3中，捕获分子(2)是抗体。此处，捕获分子(2)结合至指示剂分子内的表位捕获位点(3)。该表位发现于衍生自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的替代长肽(ALP)。

一旦将本发明的指示剂分子添加至测试样品，则存在的特异性识别切割位点(4)的任何酶都可以切割指示剂分子(6)。该切割事件(6)产生用于特异性抗体结合分子(5)的结合位点。结合分子(5)直至切割(6)发生才能结合至指示剂分子。因此，在形式1和3中，抗体结合分子(5)结合至作为GPQGIFGQ序列的切割的结果而产生的氨基酸序列GPQG。在另一方面，在形式2和4中，抗体结合分子(5)结合至也作为GPQGIFGQ序列的切割的结果而产生的氨基酸序列QGFI。在各形式中，抗体结合分子(5)在切割前不结合至GPQGIFGQ序列(未显示)。

图2是根据本发明的酶检测装置的示意图，并显示在酶切割活性不存在(图2A)存在(图2B)情况下的装置的操作。测试条包括粘合剂衬垫(1)，其上组装该装置的其它组件。由右至左，样品施用带(2)呈吸收垫的形式。这放置为部分重叠缀合物垫(3)，所述缀合物垫(3)用标记的结合分子(7)浸渍。在替代实施方案中，标记的结合分子可以浸渍于样品施用带，并且这消除对于分开的缀合物垫的需要。缀合物垫(3)与硝酸纤维素膜(4)流体连接。硝酸纤维素膜(4)含有固定化的链霉抗生物素蛋白分子(5)，其限定捕获带。膜(4)还含有捕获带的下游的固定化的进一步结合分子(6)，其结合进一步标记的分子(11)，其与样品穿过装置并形成分开的对照区。或者，固定化的进一步结合分子可以结合至标记的结合分子(7)。该装置任选地还包含吸收垫(8)，以吸收到达该装置的末端的任何测试样品和试剂。

使用时，将指示剂分子(9)添加至测试样品，然后使测试样品与该装置的样品施用带(8)接触。如图2A中所示，在测试样品中不存在酶切割活性的情况下，指示剂分子(9)在切割位点处保持未切割。样品流入缀合物垫(3)后，结合分子(7)不能结合至指示剂分子(9)，因为切割位点的切割没有发生。指示剂分子经由链霉抗生物素蛋白(5)和指示剂分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用变得在捕获带结合。标记的结合分子(7)没有固定在捕获带，因为它们不能结合至指示剂分子(9)。因此，标记的结合分子流过对照区并超越。进一步标记的分子(11)也通过该装置至对照区，在对照区，它们通过结合至固定化的进一步结合分子(6)而固定。因此，酶切割活性的不存在表现为仅在对照区、但不在捕获带的信号。可能含有标记的结合分子(7)的过量样品流入吸收垫(8)。

如图2B中所示，在测试样品中存在酶切割活性的情况下，指示剂分子(9)在切割位点处切割。样品流入缀合物垫(3)后，结合分子(7)能够结合至指示剂分子(9)，因为切割位点的切割已经发生。指示剂分子经由链霉抗生物素蛋白(5)和指示剂分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用变得在捕获带结合。标记的结合分子(7)由于在切割位点结合至指示剂分子(9)而固定在捕获带。由于标记的结合分子(7)相比于在捕获带的结合位点的相对过量，一些标记的结合分子(7)仍然流过对照区并超越。进一步标记的分子(11)也通过该装置至对照区，在对照区，它们通过结合至固定化的进一步结合分子(6)而固定。因此，酶切割活性的存在表现为在捕获带和对照区两者的信号。可能含有不含生物素捕获位点(10)的指示剂分子的切割产物的过量样品流入吸收垫(8)。

应当注意的是，对照区是任选的。样品中酶切割活性的存在或不存在可以仅仅基于捕获带的相应信号的存在或不存在来监测。

图3显示随着增加测试样品中的MMP活性的水平的测定的视觉读出值(图2中所示)。如可以容易看到，随着MMP量增加，在对照区(1)的信号是恒定的。相反，随着MMP量增加，在捕获带(2)的信号也增加。这是由于MMP活性在切割位点切割指示剂分子。这揭示结合位点，其能够结合所述结合分子，这经由限定捕获带的捕获分子和指示剂分子的捕获位点之间的相互作用而在捕获带(2)进行检测。

图4是根据本发明的一种特定酶检测装置的示意图。下表提供该图的图注，并指定该具体实施方案的各卡组件的确切纵向尺寸和位置。当然，如本领域技术人员容易理解，尺寸和位置可以变化。

图5显示合成结构上约束的指示剂分子的一个实例。应当注意的是，切割区和支架分子的连接位点之间可以包括额外的间隔基或接头区域。

图13和14显示一定范围的用于本发明中使用的合适的支架分子。

图15以示意形式显示支架分子对于指示剂分子的一些结合选项。图15A显示在单一切割位点处切割的产物，且图15B显示在两个分开的切割位点处切割的产品。

人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶底物以本发明的指示剂分子的形式显示于图23中。该底物/指示剂分子的合成在下面实施例9和10中讨论。该底物含有氨基酸序列CQESIRLPGC(SEQ ID NO:3)，其使用适当的支架(在该情况下，1,3-二溴甲基苯)环化。环化利用由两个半胱氨酸残基提供的硫醇基团与支架连接。HNE对异亮氨酸和精氨酸残基之间的肽键的切割打开结构以揭示新的结合位点(或“隐位(cryptotope)”)。HNE在单一位点切割底物，以产生可靠的结合位点。额外的酪氨酸残基(参见SEQ ID NO:4)有利于连接至进一步部分诸如载体蛋白，如本文中所讨论。

本发明将参考下面实验例来进一步理解。

实施例

在整个实施例和附图中，本发明可被称为“终极ELTABA”。

实施例1：本发明的用于检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的侧流平台。

试剂盒包含以下组件：-

1)用于样品收集的装置(例如，对于尿)

2)侧流测试条，其被安装于塑料盒中。测试条具有包含多链霉抗生物素蛋白的捕获带作为穿过测试条的流路的第一检测线。可以包括在检测线的下游的作为穿过测试条的流路的对照线的包含吸附的抗鸡抗体的第二捕获带作为对照线。在塑料盒中存在观察窗，通过所述观察窗来查看测试线和对照线。在第一检测线的上游还存在集成的样品-接受垫。此外，该测试条在样品-接受垫的下游具有干燥入测试条的具有绵羊抗体(CF1522)的金颗粒，其可以通过添加样品进行重构。

3)管子，其中可以放置样品收集装置连同指示剂分子。

4)含有可切割序列(在本实施例中，(GPQGIFGQ))的指示剂分子，其携带经由聚乙二醇间隔基/接头连接的末端生物素基团，这使其与捕获线多链霉抗生物素蛋白形成复合物。

测试条

根据本发明构建用于检测样品中的蛋白酶活性的测试条，如下所述。该测定基于在各种MMP存在的情况下切割指示剂分子，以便将可见的表位暴露于缀合至金颗粒的绵羊抗体(CF1522)。

所使用的方法都是根据本领域中众所周知的标准程序。

A.CF1522:40nm金缀合物的制备

将亲和纯化的绵羊抗体CF1522(Ig Innovations,CF1522)缀合至在520nm给出5的OD的浓度的40nm金颗粒(BBI International,GC40)。以20mM BES缓冲液(pH 7.8)中15μg/ml的浓度装载该抗体。0.2％BSA(Sigma,A7906)用作封闭溶液以尽可能减少非特异性结合。

B.金浸渍的缀合物垫的制备

用Isoflow分配器(15mm喷射高度)用稀释于金干燥缓冲液(1M Tris，150mM氯化钠，20mM叠氮化钠，3％BSA，5％蔗糖，1％Tween 20(pH 9.4))的OD4的CF1522:40nm金缀合物(Mologic)以0.8μl/mm喷射玻璃纤维缀合物垫(Millipore,G041,17mm×300mm)。将处理的缀合物带在隧道式干燥器中在60℃以5mm/sec的速度进行干燥。将干燥的金缀合物浸渍的缀合物垫在室温干燥储存于具有干燥剂的密封箔袋中。

C.抗体浸渍的硝酸纤维素膜的制备

所有试剂都以0.1μl/mm的分配率在Unistart CN140膜(Sartorius,CN140,25mm×300mm)上成条带。1mg/ml的浓度的测试线多链霉抗生物素蛋白(BBI,Polystrep N01041048K)位于距膜的基底7mm处。将处理的膜在隧道式干燥器中在60℃以10mm/sec的速度进行干燥。将干燥的抗体-浸渍的硝酸纤维素膜在室温储存于具有干燥剂的密封箔袋中。

D.卡组装

根据以下程序且根据图4组装测试卡，所述图4指定各卡组件的确切纵向尺寸和位置。

·1.将图4中指定为1的充当背层板的具有释放衬垫保护的粘合剂的透明塑料膜的60×300mm片(G&L Precision Die Cutting,GL-48077)置于工作台的顶上。剥离释放衬垫以暴露粘合剂。

·2.将反应膜(如部分C中制备)连接在后盖的粘合剂侧的顶上，距下端20mm。

·3.将浸渍的缀合物垫(如部分B中制备)连接在后盖的顶上，在反应膜的顶上重叠2mm。

·4.将样品垫(MDI,FR-1,10×300mm)置于后盖的顶上，在缀合物垫的顶上重叠5mm。

·5.将吸收垫(凝胶印迹纸，Ahlstrom，222级，22×300mm)置于后盖的上侧的顶上，在反应膜的顶上重叠2mm。

将卡使用自动冲压切割机(Kinematic,2360)裁剪成5mm宽度条，并组装入塑料外壳(Forsite)。该装置使用在Mologic针对这些装置专门制造的启动装置夹钳进行封闭。

该表列出条组件和支撑卡上的各自定位。

组件	尺寸	距基准点的位置
			支撑卡(1)	60mm	0mm
硝酸纤维素膜(2)	25mm	20mm
			缀合物垫(3)	17mm	5mm
样品垫(4)	10mm	0mm
			吸收垫(5)	22mm	38mm

产生缓冲液标准品，其含有范围从1000ng/ml向下至1ng/ml的不同浓度的活性MMP-9(Alere San Diego)。

步骤1：将各标准品与定义量的肽(25ng/测试)置于收集装置中。剧烈旋转收集装置，以便使样品与底物溶液充分混合。将该反应混合物在环境温度下孵育定义时间段(例如10分钟)。

步骤2：在孵育期结束时，将定义体积的液体滴至样品收集垫上，随后使其与缀合物垫接触并重新水化连接至金颗粒的干燥CF1522抗体。完整指示剂分子不被金缀合物识别，并以未复合的状态朝向多链霉抗生物素蛋白测试线迁移，在多链霉抗生物素蛋白测试线，其经由连接至指示剂分子的生物素固定化。样品中存在的任何MMP-9都在切割位点切割指示剂分子，保留可识别的表位，因此使金缀合物与经切割的剩余部分(stub)形成复合物。

形成的线通过它们的相对强度进行评价。测试线的存在表明，测试样品中存在蛋白酶。阴性测试线表明低于可检测限值的蛋白酶的零或低水平。这些极限之间的阶段表明测试样品中的不同水平的蛋白酶。目视和用Forsite侧流装置读取器测量显色的线的强度。具有0-10的标度的半定量评分系统用于可视读数，其中1是最低可检测的颜色强度，且10是最高的观察到的颜色强度。

图7(图7A和7B)表明当用掺料的MMP-9缓冲样品运行时测定的灵敏度。在75μl的样品体积，MMP-9的可检测限值为约4ng/ml。图7A显示横跨MMP-9的整个浓度范围的读数值，而图7B是在0至15ng/ml的MMP-9浓度的放大视图。

读数单位显示于下表，其中高于400的值被认为是阳性结果：

ng/ml MMP9	读数值
		1000	6770
500	6729
		250	6225
125	5581
		62.5	3826
31.25	2029
		15.625	882
7.8125	524
		3.90625	413
1.953125	343
		0.9765625	338
0	312

实施例2本发明的侧流形式的基质金属蛋白酶(MMP)特异性

试剂盒和测试条合成如实施例1进行。

在缓冲液(50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、1％vol/vol Tween 20(pH8.0)的水溶液)中以0.5μg/ml制备各种MMP(Enzo)。

步骤1：将各MMP溶液与定义量的肽(25ng/测试)置于收集装置中。剧烈旋转收集装置，以便使样品与底物溶液充分混合。将该反应混合物在环境温度下孵育定义时间段(例如10分钟)。

步骤2：在孵育期结束时，将定义体积的液体滴至样品收集垫上，随后使其与缀合物垫接触并重新水化连接至金颗粒的干燥CF1522抗体。完整指示剂分子不被金缀合物识别，并以未复合的状态朝向多链霉抗生物素蛋白测试线迁移，在多链霉抗生物素蛋白测试线，其经由连接至指示剂分子的生物素固定化。样品中存在的任何MMP-9都在切割位点切割指示剂分子，保留可识别的表位，因此使金缀合物与经切割的剩余部分形成复合物。

图8表明，本发明的该版本使用对MMP13、MMP12、MMP9、MMP8和MMP2偏置的可切割的序列。本发明的其它版本可以根据所需要的应用使用具有不同目标的序列。

下表显示测试的MMP各自的读出值：

MMP	读数值
		1	477.5
2	1608.5
		3	336.5
7	373
		8	1140.5
9	3844
		10	444
11	279.5
		12	1252.5
13	6348.5

实施例3尿中酶活性的检测

试剂盒和测试条合成如实施例1进行。

样品收集自健康志愿者(9)和患有呼吸疾病的患者。样品由九位具有囊性纤维化(CF)的患者和七位具有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者捐献，并保存于-80℃，直至使用。

步骤1：将各样品与定义量的肽(25ng/测试)置于收集装置中。剧烈旋转收集装置，以便使样品与底物溶液充分混合。将该反应混合物在环境温度下孵育定义时间段(例如10分钟)。

图9表明，可测量量的活性蛋白酶(特别是MMP，包括MMP-9)可以在尿样品中发现，且更高水平存在于获得自具有呼吸疾病的患者的样品中。当与收集自健康对照的样品相比时，对于COPD样品观察到显著差异(P＝0.03)，且当与收集自健康对照的样品相比时，对于CF样品观察到显著差异(P＝0.02)。

实施例4创伤流体中酶活性的检测

试剂盒和测试条合成如实施例1进行。

在终极ELTABA装置上测试来自18个患者的创伤样品以测量该生物基质中的活性MMP。从MMP缓冲液(50mM Tris、100mM氯化钠、10mM氯化钙、50μM 20mM氯化锌、0.025％Brij35、0.05％叠氮化钠(pH 8.0)的水溶液)中的拭子(Copan,552C.US)提取样品，然后将其冷冻于-20℃，直至使用。螯合剂(5mM EDTA)的添加确定装置对于钙依赖性酶(例如MMP)的特异性。

步骤1：将各创伤样品以1/20稀释于MMP缓冲液中，且将75μl与定义量的肽(25ng/测试)置于收集装置中。剧烈旋转收集装置，以便使样品与底物溶液充分混合。将该反应混合物在环境温度下孵育定义时间段(例如10分钟)。

步骤2：在孵育期结束时，将定义体积的液体滴至样品收集垫上，随后使其与缀合物垫接触并重新水化连接至金颗粒的干燥生物素。完整指示剂分子不被金缀合物识别，并以未复合的状态朝向多链霉抗生物素蛋白测试线迁移，在多链霉抗生物素蛋白测试线，其经由连接至指示剂分子的生物素固定化。样品中存在的任何MMP-9都在切割位点切割指示剂分子，保留可识别的表位，因此使金缀合物与经切割的剩余部分形成复合物。

图10显示将EDTA添加至创伤样品抑制读出值，证实样品中存在MMP，也证实该测定特异性测量活性MMP。

实施例5本发明与商业MMP-9活性测定试剂盒的灵敏度的比较

商品试剂盒被设计用于特异性检测生物样品诸如培养基、血清、血浆、滑液和组织匀浆中的MMP-9。首先单克隆抗人MMP用于从混合物中拉下MMP的前体和活性形式两者，然后使用荧光共振能量转移(FRET)肽定量MMP9的活性。在试剂盒和本发明的侧流形式两者上以250ng/ml–4ng/ml的范围运行内部活化的MMP-9标准品AMPA。对于商业测定，将MMP-9稀释于试剂盒中供应的MMP缓冲液和用于侧流装置的Tris缓冲盐水1％Tween20中。

测流试剂盒和测试条合成如实施例1进行。

产生缓冲液标准品，其含有Tris缓冲盐水1％Tween(50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、1％vol/vol Tween 20(pH 8.0)的水溶液)中范围从250ng/ml向下至4ng/ml的不同浓度的活性MMP-9(Alere San Diego)。

图11(图11A和11B)是比较商业可得的活性MMP-9测定试剂盒和本发明的测定法检测MMP9的能力的图。图11A显示横跨MMP-9的整个浓度范围的读数值，而图11B是在0至50ng/ml的MMP-9浓度的放大视图。两个图表明，本发明的测定法产生较陡峭的曲线。根据两种测定法，如由吸光度值显示的显色见于4ng/ml MMP9，测试的最低标准品。

各测定的数值读出值显示于下表中：

ng/ml MMP9	参考测定	终极ELTABA
			250	204466.5	6225
125	162622	5581
			62.5	112706.5	3826
31.25	62301.5	2029
			15.625	31295	882
7.8125	13140.5	524
			3.90625	7601	413
0	3818.5	312

实施例6以ELISA和LF形式两者测试底物

ELISA形式

1)用于样品收集的装置(例如，对于尿)

2)用多链霉抗生物素蛋白包被的96孔板

3)管子，其中可以放置样品收集装置连同指示分子。

5)缀合至碱性磷酸酶(AP)的绵羊抗体CF1522

6)碱性磷酸酶底物对硝基苯基磷酸盐(pNPP)，其使得能够产生可在405nm读取的可溶性黄色反应产物。

步骤2：在孵育期结束时，将定义体积的样品添加至链霉抗生物素蛋白板(Nunc，442404)，并在环境温度再孵育1小时，其中生物素标记的指示剂分子变得被结合至板的链霉抗生物素蛋白固定化。

步骤3：将板在洗涤缓冲液中以100μl洗涤3次，所述洗涤缓冲液为Tris缓冲盐水0.1％Tween(50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％vol/vol Tween 20(pH 8.0)的水溶液)。

步骤4：将CF1522-AP(Mologic)1/500稀释于含1％BSA的PBST中，并在环境温度在板上孵育1小时。该抗体将与由样品中存在的任何MMP暴露的切割的剩余部分形成复合物，并且在切割的剩余部分不存在的情况下，将没有抗体的结合。

步骤5：将板在洗涤缓冲液中以100μl洗涤3次，所述洗涤缓冲液为Tris缓冲盐水0.1％Tween(50mM Tris、150mM氯化钠、20mM叠氮化钠、0.1％vol/vol Tween 20(pH 8.0)的水溶液)。

步骤6：将板与pNPP底物孵育，然后在37℃孵育30分钟后在405nm读取。用作参考的MMP9标准曲线表示于图14b中。孔的颜色表明图14b中由OD 405nm表示的测试样品中的蛋白酶的不同水平，

侧流形式

试剂盒和测试条合成如实施例1进行。

产生缓冲液标准品，其分别对于ELISA和测流装置含有范围从50ng/ml向下至0.39ng/ml和从62.5ng/ml向下至0.97ng/ml的不同浓度的活性MMP-9(Alere San Diego)。

形成的线通过它们的相对强度进行评价。测试线的存在表明，测试样品中存在蛋白酶。阴性测试线表明低于可检测限值的蛋白酶的零或低水平。这些极限之间的阶段表明测试样品中的不同水平的蛋白酶。目视和用NES侧流装置读取器测量显色的线的强度。

MMP9标准曲线的结果可见于图12中。图12表明由ELISA和测流产生的两种MMP9标准曲线是类似的，其中灵敏度低至4ng/ml。

来自两种测定的数值读出值也显示于下表中：

实施例7–一种实例指示剂分子的合成

使用Fmoc-化学法在固相上合成被称为MOL386的肽(氨基酸序列：CGPQGIFGQC)。简言之，在微波辅助的自动合成仪(CEM Liberty)上进行合成。用DMF中的Fmoc-Cys(Trt)预装的PEG-聚苯乙烯树脂上用十倍过量的氨基酸构建嵌段、HBTU活化剂和五倍过量的DIPEA碱实施偶联步骤。在5％哌嗪/DMF中实施脱保护步骤。将完成的肽树脂干燥，然后使用95％TFA、2.5％TIPS和2.5％水切割2小时。将TFA液在真空中干燥，并在乙醚中沉淀以得到无色肽固体。从50％乙腈冷冻干燥回收的肽，并将其使用C18反相柱和5％乙腈/水(0.1％TFA)至100％乙腈(0.1％TFA)的梯度通过HPLC纯化(图16)。合并分离的级分并将其冷冻干燥，并通过电喷雾质谱分析(图17)以鉴定目标肽(预期值MH+1010.17，测量值1010.3)。从预装的生物素-PEG-NovaTag树脂(Merck)合成生物素化形式(CGPQGIFGQC-PEG-生物素)(预期值MH+1438.76，测量值1439.7，图18)。生物素提供用于固定化指示剂分子的捕获位点。

支架分子的结合(环化肽的合成)

将肽(1mg)连同1mg 1,3-二溴甲基苯溶解于PBS 250ul中，并轻轻搅拌过夜。然后将反应物用1ml水稀释，并直接注射至HPLC上，用于使用C18反相柱和5％乙腈/水(0.1％TFA)至100％乙腈(0.1％TFA)的梯度纯化。将产物峰分离并冷冻干燥以得到无色固体(预期值MH+1112.30，测量值1112.8，图19)。相同程序用于生物素化的肽(预期值MH+1540.89，测量值1539.8，图20)。

实施例8-测试形式生成

生成识别切割肽序列的抗体。在本实施例(GPQGIFGQ)中，用于MMP消化的目标，用于免疫测定中以测量临床样品中的酶活性。使用本领域技术人员已知的方法产生针对肽KLH缀合物的抗体。生成识别切割的剩余部分‘IFGQ’的绵羊抗体CF1522和CF1523，而生成识别切割的剩余部分‘GPQG’的绵羊抗体CF1524和CF1525。将抗体使用它们针对产生的特定肽进行亲和纯化，然后通过ELISA分析，以确定最适当的测定形式以得到最佳灵敏度。

用连接至C-末端(分别为MOL038和PCL008-A2)或N-末端(分别为MOL310和MOL378)的生物素或聚乙二醇化的生物素合成含有可切割序列(GPQGIFGQ)的肽。

该肽可以经由生物素锚定至链霉抗生物素蛋白捕获，或经由ALP序列锚定至绵羊抗体CF1060捕获。评估图1中图示显示的提议形式。

ELISA形式

1)用于样品收集的装置(例如，对于尿)

2)用多链霉抗生物素蛋白(Nunc,442404)或CF1060(Nunc,Maxisorb)在环境温度包被过夜的96孔板

3)管子，其中可以放置样品收集装置连同指示分子。

4)含有可切割序列(在本实施例中，(GPQGIFGQ))的指示剂分子，其携带可以经由聚乙二醇间隔基/接头在N或C-末端连接的末端生物素基团。

5)缀合至碱性磷酸酶(AP)的绵羊抗体CF1522、CF1523、CF1524和CF1525

将活性MMP9(Alere San Diego)在MMP缓冲液(50mM Tris、100mM氯化钠、10mM氯化钙、50μM 20mM氯化锌、0.025％Brij 35、0.05％叠氮化钠(pH 8.0)的水溶液)中稀释至2、0.25、0.062、0.0156和0.039μg/ml。

步骤1：将各MMP9标准品与定义量的各肽(20ng/测试)置于收集装置中。剧烈旋转收集装置，以便使样品与底物溶液充分混合。将该反应混合物在环境温度下孵育定义时间段(例如30分钟)。

步骤2：在孵育期结束时，将定义体积的样品添加至链霉抗生物素蛋白板和CF1060敏化的板，并在环境温度再孵育1小时，其中肽变得被结合至板的链霉抗生物素蛋白或CF1060固定化。

步骤4：将缀合至碱性磷酸酶的绵羊抗体(Mologic)1/500稀释于含1％BSA的PBST中，并在环境温度在板上孵育1小时。该抗体将与由样品中存在的任何MMP9暴露的切割的剩余部分形成复合物，在切割的剩余部分不存在的情况下，将没有抗体的结合。

步骤6：将板与pNPP底物孵育，然后在37℃孵育30分钟后在405nm读取。对于所有组合，MMP9标准曲线表示于图21中。孔的颜色的差异表明由OD 405nm表示的测试样品中的蛋白酶的不同水平。

图21显示测试各形式的结果。对于链霉抗生物素蛋白捕获线，选择的肽是如预测与绵羊抗体CF1522结合的MOL378，和如预测与绵羊抗体CF1525结合的PCL008-A2。两种肽均含有减少任何空间位阻所需的PEG-Asp-AEEAc-AEEAc。对于CF1060捕获线，选择的肽是如预测与绵羊抗体CF1522结合的MOL038或PCL008-A2，和如预测与绵羊抗体CF1525结合的MOL378。最佳组合的性能显示于图22。此处，使用绵羊抗体CF1522与肽MOL378的形式4显示最有希望。

实施例9-人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶敏感的指示剂分子的合成

使用Fmoc-化学法在固相上合成被称为MOL 488的肽(氨基酸序列YCQESIRLPGC–SEQ ID NO:4)。简言之，在微波辅助的自动合成仪(CEM Liberty)上进行合成。在PEG聚苯乙烯树脂上用五倍过量的氨基酸构建嵌段DIC和Oxyma实施偶联步骤。在20％哌啶/DMF中实施脱保护步骤。将完成的肽树脂干燥，然后使用95％TFA、2.5％TIPS和2.5％水切割2小时。将TFA液在真空中干燥，并在乙醚中沉淀以得到无色肽固体。从50％乙腈冷冻干燥回收的肽，并将其使用C18反相柱和5％乙腈/水(0.1％TFA)至100％乙腈(0.1％TFA)的梯度通过HPLC纯化。合并分离的级分并将其冷冻干燥，并通过电喷雾质谱分析(预期值MH+1268.5，测量值1267.86±1.39)–参见图28。

支架分子的结合(环化肽的合成)

将肽(1mg)连同1mg 1,3-二溴甲基苯溶解于PBS 250ul中，并轻轻搅拌过夜。然后将反应物用1ml水稀释，并直接注射至HPLC上，用于使用C18反相柱和5％乙腈/水(0.1％TFA)至100％乙腈(0.1％TFA)的梯度纯化。将产物峰分离并冷冻干燥以得到无色固体(预期值MH+1370.6，测量值1371.9±3.8)；参见图29。

环化的MOL488的制备性酶促切割

将环化的肽(1mg)以5mg/ml的最终浓度溶解于切割缓冲液(100mM Tris pH 8.0,0.05％Brij)中。以U/ml的最终浓度添加酶人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(Leebio SolutionsInc.)。随着反应进行，将定时的等分试样在5倍体积的起始缓冲液(5％乙腈，0.1％TFA)中淬灭，并在HPLC上检查。新的产物峰随着时间逐步形成，且约三小时之后，停止反应，并通过HPLC纯化产物级分(预测值MH+1388.6，测量值1388.8±2.5)-参见图30。

还就类似底物而言遵循相同的程序，但在该情况下缺乏缺乏酪氨酸残基(SEQ IDNO:3)。

HPLC结果概述于图24中。从图24A可见，单一切割产物由HNE对所述肽的活性所导致。图24B呈现显示产物随着时间的相对增加和底物随着时间的相对减少的时间过程。

图25呈现证实在单一位点处切割底物且该底物否则保持完整的质谱数据。图25A是底物图，且图25B是水解的产物。

实施例10-缀合方法

为了将蛋白酶消化的肽产物缀合至载体蛋白以免疫和产生抗体，需要应用与Clip硫醇烷基化路线正交的化学法。三种不同的化学法(叠氮基、肟和三唑)的组合在这种情况下被认为实现缀合。在第一选项(图26)中，可以用突出的酪氨酸残基合成所述肽。异双官能试剂FBDP(Sigma)用于将氨基氧基接头(Berry Associates)缀合至酪氨酸的酚基上，生成突出的叠氮化物尾部。这进而可以缀合至用炔烃试剂标记的载体蛋白。或者，所述肽可以用氨基氧基末端来合成(图27)，然后这可以使用FBDP试剂直接交联至载体蛋白上的酪氨酸残基。

本发明不应通过本文描述的具体实施方案限制范围。事实上，除了本文描述的那些以外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言，从前面的描述和附图是显而易见的。此类改变意欲落入所附权利要求的范围之内。此外，本文描述的本发明的所有方面和实施方案都被认为是广泛适用的，并且可与任何和所有其它一致实施方案(包括适当时取自本发明的其它方面(包括分离中)的那些)组合。本文引用各种出版物，其公开内容以其整体通过引用并入。

Claims

1.用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测装置，所述装置包含：

(i)用于添加至所述测试样品的指示剂分子，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(ii)接受所述测试样品的捕获带，其中所述捕获带包含捕获分子，所述捕获分子能够结合至所述指示剂分子的捕获位点，以固定化包括新型结合位点的指示剂分子；和

(iii)能够结合至新型结合位点的结合分子，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

2.权利要求1的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述切割区的两个部分，其中至少一个部分保持连接至所述捕获位点，且其中所述结合分子能够结合至所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一个部分的部分。

3.权利要求1或2的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述指示剂分子的两个分开的部分。

4.权利要求1或2的酶检测装置，其中所述指示剂分子在结构上受约束，使得所述至少一个切割位点的切割产生保持与彼此连接的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

5.权利要求1至4中任一项的酶检测装置，其中所述结合分子结合至切割之后的切割区。

6.权利要求5的酶检测装置，其中所述结合分子结合至切割之后的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

7.权利要求1至6中任一项的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点包含位于两个氨基酸残基之间的肽键。

8.权利要求1至7中任一项的酶检测装置，其中能够切割底物的酶包含蛋白酶。

9.权利要求8的酶检测装置，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶。

10.权利要求1至9中任一项的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点针对特定蛋白酶的切割进行偏置。

11.权利要求1至10中任一项的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。

12.权利要求1至11中任一项的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。

13.权利要求1至12中任一项的酶检测装置，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13、9、2、12和8，任选以该优先顺序，的切割进行偏置。

14.权利要求1至13中任一项的酶检测装置，其中所述切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内，其在切割之后产生含有氨基酸序列GPQG的部分和含有氨基酸序列IFGQ的部分。

15.权利要求1至14中任一项的酶检测装置，其中所述结合分子包含抗体。

16.权利要求1至15中任一项的酶检测装置，其中所述捕获位点包含生物素分子，且所述捕获带包含链霉抗生物素蛋白分子。

17.权利要求1至16中任一项的酶检测装置，其中所述装置包含固体支持物，所述捕获分子连接至所述固体支持物以形成捕获带。

18.权利要求17的酶检测装置，其中所述固体支持物进一步包含施用样品的样品施用带。

19.权利要求17或18的酶检测装置，其中所述固体支持物进一步包含所述捕获带相对于所述样品施用带下游的对照带，其含有进一步结合分子，其结合至结合分子，以表明使用所述装置的测定的成功完成。

20.权利要求17至19中任一项的酶检测装置，其中所述固体支持物包含层析介质。

21.用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

22.用于通过检测能够切割底物的酶的切割活性而诊断测试样品中的呼吸病况的方法，所述方法包括：

(i)使指示剂分子与所述测试样品接触，所述指示剂分子包含

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

23.权利要求22的方法，其中所述呼吸病况是慢性阻塞性肺病或作为囊性纤维化的结果的呼吸道的炎症。

24.权利要求21至23中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述切割区的两个部分，其中至少一个部分保持连接至所述捕获位点，且其中所述结合分子能够结合至所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一个部分的部分。

25.权利要求21至24中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述指示剂分子的两个分开的部分。

26.权利要求21至24中任一项的方法，其中所述指示剂分子在结构上受约束，使得所述至少一个切割位点的切割产生保持与彼此连接的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

27.权利要求21至26中任一项的方法，其中所述结合分子结合至切割之后的切割区。

28.权利要求27的方法，其中所述结合分子结合至切割之后的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

29.权利要求21至28中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点包含位于两个氨基酸残基之间的肽键。

30.权利要求21至29中任一项的方法，其中能够切割底物的酶包含蛋白酶。

31.权利要求30的方法，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶。

32.权利要求21至31中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点针对特定蛋白酶的切割进行偏置。

33.权利要求21至32中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。

34.权利要求21至33中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。

35.权利要求21至34中任一项的方法，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13、9、2、8和12，任选以该优先顺序，的切割进行偏置。

36.权利要求21至38中任一项的方法，其中所述切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQID NO:1)内，其在切割之后产生含有氨基酸序列GPQG的部分和含有氨基酸序列IFGQ的部分。

37.权利要求21至36中任一项的方法，其中所述结合分子包含抗体。

38.权利要求21至37中任一项的方法，其中所述捕获位点包含生物素分子，且所述捕获带包含链霉抗生物素蛋白分子。

39.权利要求21至38中任一项的方法，其中所述装置包含固体支持物，所述捕获分子连接至所述固体支持物以形成捕获带。

40.权利要求39的方法，其中所述固体支持物进一步包含施用样品的样品施用带。

41.权利要求39或40的方法，其中所述固体支持物进一步包含所述捕获带相对于所述样品施用带下游的对照带，其含有进一步结合分子，其结合至结合分子，以表明使用所述装置的测定的成功完成。

42.权利要求35至37中任一项的方法，其中所述固体支持物包含层析介质。

43.权利要求35至38中任一项的方法，其中在将所述测试样品添加至所述固体支持物前混合所述测试样品和指示剂分子。

44.抗体，其结合至氨基酸序列GPQG，但不结合至氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)。

45.抗体，其结合至氨基酸序列IFGQ，但不结合至氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)。

46.用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包含：

(b)捕获位点；

其中所述至少一个切割位点的切割产生新型结合位点；

(ii)能够结合至所述指示剂分子的捕获位点的捕获分子；

(iii)固体支持物，所述捕获分子可以连接(即，可连接或连接)至所述固体支持物以形成捕获带以接受所述测试样品；和

(iv)能够结合至所述新型结合位点的结合分子，其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

47.权利要求46的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述切割区的两个部分，其中至少一个部分保持连接至所述捕获位点，且其中所述结合分子能够结合至所述指示剂分子的含有连接至捕获位点的切割区的至少一个部分的部分。

48.权利要求46或47的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点的切割产生所述指示剂分子的两个分开的部分。

49.权利要求46或47的酶检测试剂盒，其中所述指示剂分子在结构上受约束，使得所述至少一个切割位点的切割产生保持与彼此连接的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

50.权利要求46至49中任一项的酶检测试剂盒，其中所述结合分子结合至切割之后的切割区。

51.权利要求50的酶检测试剂盒，其中所述结合分子结合至切割之后的所述指示剂分子的切割区的两个部分。

52.权利要求46至51中任一项的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点包含位于两个氨基酸之间的肽键。

53.权利要求46至52中任一项的酶检测试剂盒，其中能够切割底物的酶包含蛋白酶。

54.权利要求53的酶检测试剂盒，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶。

55.权利要求46至54中任一项的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点针对特定蛋白酶的切割进行偏置。

56.权利要求46至55中任一项的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。

57.权利要求46至56中任一项的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。

58.权利要求46至57中任一项的酶检测试剂盒，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13、9、2、8和12，任选以该优先顺序，的切割进行偏置。

59.权利要求46至58中任一项的酶检测试剂盒，其中所述切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内，其在切割之后产生含有氨基酸序列GPQG的部分和含有氨基酸序列IFGQ的部分。

60.权利要求46至59中任一项的酶检测试剂盒，其中所述结合分子包含抗体。

61.权利要求46至60中任一项的酶检测试剂盒，其中所述捕获位点包含生物素分子。

62.权利要求46至61中任一项的酶检测试剂盒，其中所述捕获分子包含链霉抗生物素蛋白分子。

63.权利要求46至62中任一项的酶检测试剂盒，其中所述试剂盒包含固体支持物，所述捕获分子连接至所述固体支持物以形成捕获带。

64.权利要求46至63中任一项的酶检测试剂盒，其中所述固体支持物进一步包含施用样品的样品施用带。

65.权利要求46至64中任一项的酶检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含能够结合至所述结合分子的进一步结合分子。

66.权利要求65的酶检测试剂盒，其中所述固体支持物进一步包含所述捕获带相对于所述样品施用带下游的对照带，所述进一步结合分子可以连接至所述对照带。

67.权利要求46至66中任一项的酶检测试剂盒，其中所述固体支持物包含层析介质。

68.根据权利要求1至20中任一项的酶检测装置用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。

69.根据权利要求21至43中任一项的方法用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。

70.根据权利要求46至62中任一项的酶检测试剂盒用于诊断测试样品中的呼吸病况的用途。

71.权利要求68至70中任一项的用途，其中所述呼吸病况是慢性阻塞性肺病或作为囊性纤维化的结果的呼吸道的炎症。

72.用于检测测试样品中能够切割底物的酶的切割活性的存在的指示剂分子，所述指示剂分子包含：

(b)捕获位点；和

(c)支架分子，其起作用以连接所述至少一个切割位点之外，任选切割区之外，的指示剂分子的至少两个部分，

其中所述支架进一步起作用，以使得至少一个切割位点的切割产生结合分子结合的新型结合位点的方式在结构上约束所述指示剂分子，但其中所述结合分子不能结合至所述指示剂分子，除非和直至切割已经发生。

73.权利要求72的指示剂分子，其中所述新型结合位点代表所述指示剂分子的新型结构构象。

74.权利要求72或73的指示剂分子，其中所述新型结合位点包含所述切割区的至少一部分。

75.权利要求72至74中任一项的指示剂分子，其中所述新型结合位点包含所述支架分子的至少一部分。

76.权利要求72至75中任一项的指示剂分子，其中所述新型结合位点含有通过切割产生的所述指示剂分子的至少两个部分的两者的部分。

77.权利要求72至76中任一项的指示剂分子，其中所述新型结合位点包括所述切割位点。

78.权利要求72至77中任一项的指示剂分子，其中所述切割位点对于蛋白酶的切割是特异性的。

79.权利要求78的指示剂分子，其中所述蛋白酶是基质金属蛋白酶。

80.权利要求72至79中任一项的指示剂分子，其中所述至少一个切割位点针对特定蛋白酶的切割进行偏置。

81.权利要求72至80中任一项的指示剂分子，其中所述至少一个切割位点针对特定基质金属蛋白酶的切割进行偏置。

82.权利要求72至81中任一项的指示剂分子，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13和/或MMP-9的切割进行偏置。

83.权利要求72至82中任一项的指示剂分子，其中所述至少一个切割位点针对MMP-13、9、2、12和8，任选以该优先顺序，的切割进行偏置。

84.权利要求72至83中任一项的指示剂分子，其中所述切割位点在氨基酸序列GPQGIFGQ(SEQ ID NO:1)内，产生含有氨基酸序列GPQG的部分和含有氨基酸序列IFGQ的部分。

85.权利要求72至81中任一项的指示剂分子，其包含选自图14或15中显示的支架分子的支架分子。

86.权利要求72至85中任一项的指示剂分子，其中所述结合分子包含抗体。

87.权利要求72至86中任一项的指示剂分子，其中所述捕获位点包含生物素分子。

88.权利要求72至87中任一项的指示剂分子，其中所述支架分子包含(杂)芳族分子。

89.权利要求86的指示剂分子，其中所述(杂)芳族分子包含至少两个苄基卤素取代基。

90.权利要求72至89中任一项的指示剂分子，其中所述支架是卤代甲基芳烃。

91.权利要求90的指示剂分子，其中所述卤代甲基芳烃选自双(溴甲基)苯、三(溴甲基)苯和四(溴甲基)苯或其衍生物。

92.权利要求72至91中任一项的指示剂分子，其中所述支架选自邻、间和对双(溴甲基)苯类，任选地选自1,2-双(溴甲基)苯、1,3-双(溴甲基)苯和1,4-双(溴甲基)苯，或选自进一步取代的卤代甲基芳烃类诸如1,3,5-三(溴甲基)苯、1,2,4,5-四(溴甲基)苯和1,2,3,4,5,6-六(溴甲基)苯，或选自多环卤代甲基芳烃类诸如2,7-双(溴甲基)-萘、1,4-双(溴甲基)-萘、1,8-双(溴甲基)-萘、1,3-双(溴甲基)-萘、1,2-双(溴甲基)-萘、2,3-双(溴甲基)-萘、2,6-双(溴甲基)-萘、1,2,3,4-四(溴甲基)-萘、9,10-双(溴甲基)-菲、5,10-双(溴甲基)-蒽和1-(溴甲基)-3-[3-(溴甲基)苄基]苯，或选自甲基取代的卤代甲基芳烃类诸如1,3-双(溴甲基)-5-甲基苯、2,5-双(溴甲基)-1,3-二甲基苯、2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲基苯、2,4-双(溴甲基)-1,3,5-三甲基苯和3,6-双(溴甲基)四甲基苯，或选自硝基取代的卤代甲基芳烃类诸如3,4-双(溴甲基)-硝基苯和2,3-双(溴甲基)-硝基苯，或选自羟基取代的卤代甲基芳烃类诸如1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯，或选自氰基取代的卤代甲基芳烃类诸如2,6-双(溴甲基)-苄腈或选自甲氧基取代的卤代甲基芳烃类诸如1,3-双(溴甲基)-5-甲氧基苯、1,3-双(溴甲基)-2-甲氧基-5-甲基苯、1,3-双(溴甲基)-5-羟基苯、2,3-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯,和2,5-双(溴甲基)-1,4-二甲氧基苯。

93.权利要求1至20中任一项的酶检测装置，其并入如权利要求72至92中任一项所定义的指示剂分子。

94.权利要求21至43中任一项的方法，其并入如权利要求72至92中任一项所定义的指示剂分子。

95.权利要求46至67中任一项的酶检测试剂盒，其并入如权利要求72至92中任一项所定义的指示剂分子。

96.如权利要求72至92中任一项所定义的指示剂分子用于检测测试样品中的酶的切割活性的存在的用途。

97.如本文中参照附图所定义的酶检测装置。

98.如本文中参照附图所定义的方法。

99.如本文中参照附图所定义的酶检测试剂盒。

100.式I或II(任选缺乏酪氨酸残基)或如本文中参照附图所定义的指示剂分子。

101.如本文中参照附图所定义的结合分子。