KR20210055040A - 세균성 질염 진단법 - Google Patents

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몰로직 리미티드
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Abstract

본 발명은 (i) 시알릴화된 펩티드 및 포획 부위를 포함하는 지시약 분자(indicator molecule); (ii) 포획 분자를 포함하는 포획 구역; 및 (iii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 포함하는 시알리다제 효소 활성 검출 키트 또는 장치를 제공한다. 또한 특이적 지시약 분자 및 특이적 결합 분자뿐만 아니라 키트 또는 장치를 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

세균성 질염 진단법
본 발명은 세균성 질염(bacterial vaginosis)의 검출에서의 시알리다제 효소의 절단 활성 및 이의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출하는 데 유용한 특별하게-설계된 펩티드 및 지시약 분자(indicator molecule)를 제공한다. 본 발명의 다양한 다른 양태는 본 발명의 시험 샘플에서 지시약 분자를 절단할 수 있는 시알리다제 효소의 활성의 존재를 검출 또는 측정하는 데 유용한 효소 검출 장치, 키트, 방법 및 용도를 포함한다.
시알리다제 효소(달리 뉴라미니다제라고 공지됨)는 엑소 또는 엔도 (폴리-)시알산(각각 EC 3.2.1.18 및 EC 3.2.1.129)을 절단하는 2개의 주요 부류로 세분되는 글리코시드 가수분해효소이다. 시알산은 뉴라민산의 N- 또는 O-치환된 유도체이다(하기에 도시됨):
Figure pct00001
시알산은 일반적으로 당단백질 및 당지질(특히 강글리오시드)에서 자연적으로 발견된다. 바이러스, 박테리아 및 포유류 시알리다제는 모두 자연에서 공지되어 있다. 세균성 시알리다제 활성의 상승된 수준은 세균성 질염에 대한 진단 마커로 작용하는 것으로 공지되어 있다(문헌[BV; Briselden et. al., J. Clin. Microbiol., 1992, vol. 30, pages 663-666]). 이 이론은 질에서 발생할 수 있는 박테리아 불균형 및 락토바실러스(lactobacilli)가 많은 전형적인 건강한 환경에서부터 혐기성 구동 미생물군집(microbiome)으로의 전이에 기초한다(문헌[Petrova et. al., Front. Physiol., 2015, 6:81]). 특정 혐기성 세균은 시알리다제 효소를 배설하고, 질에서 자연 점액 장벽을 손상시킨다. 그럼에도 불구하고, BV에 대한 정확한 기전은 아직 완전히 확립되지 않았다. 증상이 있는 BV를 앓고 있는 환자는 상당한 불편함, 질 분비물, 불쾌한 냄새 및 더 일반적으로 질 건강에 대한 통제력 부족을 경험할 수 있다(문헌[Bilardi et. al., Plos One, 2013, vol. 8, e74378]). 치료 경로는 전형적으로 국소 또는 경구 항생제를 포함한다. 국소 프리바이오틱 치료(예를 들어, VH essentials®) 및 pH 젤(예를 들어, balance active BV)를 비처방약(over the counter)으로 구매할 수 있다. BV는 난치성일 수 있고, 환자는 항생제 치료 후 재발할 수 있다(문헌[Bilardi et. al., Plos One, 2013, vol. 8, e74378]). 난치성 사례 중 일부는 질내 생물막 형성과 관련이 있는 것으로 여겨진다(문헌[Verstraelen & Swidsinski, Curr. Opin. Infect. Dis., 2013, 26:86-89]). BV의 존재를 발견하지 못할 때의 위험은 성병(HIV 포함)에 대한 더 큰 감수성 및 조산의 관련 위험이다. 조산 위험은 자궁 경부 점액 장벽의 조기 약화와 관련이 있는 것으로 여겨진다(문헌[Lewis et. al., J. Biol. Chem., 2013, vol. 288, pages 12067-12079]). 현재 클리닉에서 BV 검사는 실험실에서의 분석을 위해 보내진 질 샘플 도말에 기초한다. 분석 방법은 클루(clue) 세포 찾기, 수산화칼륨(KOH) 냄새 시험 또는 Nugent 점수와 같은 설정된 기준 적용을 포함한다(문헌[Nash, Jungmann, & Gubert, BMJ Learning, 2015, 1-29]). 치료 시점에 신속한 시험을 사용하면 신속한 답변을 제공하고, 즉각적인 치료 계획을 세우고 결과를 제공하기 위한 전체 프로세스를 가속화함으로써 환자에게 도움이 될 것이다. 마찬가지로, 먼저 실험실로의 아웃소싱 및 관련 리소스 및 시간 비용을 회피하고, 환자의 시간을 단일 세션으로 줄임으로써 의료 서비스 제공자에게 잠재적인 이점이 있을 것이다.
BV 진단을 위한 2종의 주요 유형의 제품은 현재 미국 및 유럽에서 입수 가능하다. 하나의 제품 세트는 pH를 측정하는 색상 변경 면봉에 기초한다. 다른 제품 세트도 비색성이며, 시알리다제 활성 측정에 기초한다. pH-기반 제품은 현장 진료에서 사용할 수 있고, 처방전 없이 입수 가능하고, VS-SENSE PRO®(Common Sense에서 판매) 및 Canestest®(Canesten에서 판매)를 포함한다. 현재 시알리다제 검출에 기초하여 판매되는 주요 제품은 BV Blue(Sekisui Diagnostics 및 Gryphus Diagnostics에서 판매)이다. BV Blue는 면봉-기반 시험이며; 샘플 면봉이 샘플에서 시알리다제 활성의 존재를 나타내기 위해 색상이 변할 지시약 용액에 놓인다. 시험을 실행하는 데 약 15분이 걸린다.
다양한 조건이 질의 국소 pH를 변화시킬 수 있기 때문에 pH 기반 시험은 정확성이 부족하다(예를 들어, BV뿐만 아니라 칸디다증 및 트리코노미아증). 시알리다제 활성을 검출하는 BV Blue와 같은 공지된 시험은 감도가 부족하다.
본 발명은 시알리다제 활성 검출의 감도 및/또는 특이성을 개선시키려는 시도로부터 발생한다. 본 발명자들은 본 발명에 이르러서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출하는 데 유용한 펩티드 및 상응하는 지시약 분자를 특별하게 설계하였다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 각각의 펩티드는 갈락토실기를 통해 시알릴 기에 접합되며(따라서 시알리다제 효소에 대한 기질로 기능함), 여기서 펩티드 구조는 특별하게 설계되어, 시알릴 기가 샘플에 존재하는 1종 이상의 시알리다제 효소에 의해서 펩티드로부터의 절단되었을 때, 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체가 특이적 결합 분자(예를 들어, 항체)에 의해 인식되고 결합된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드는 프로테아제 절단에 대한 펩티드의 저항성을 향상시키는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 하기 구조식에 따른 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
(구조식 I)(서열번호 9)
식 중,
(i) Sial은 시알릴 기이고;
(ii) X3은 글리코실 받개(acceptor) 기를 포함하는 자연 또는 비-자연 아미노산이고;
(iii) X1, X2, X4 및 X5는 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택되되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이다.
펩티드는 구조식 I의 서열로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, "시알릴 기"는 시알산 치환체를 의미하며, 여기서 시알산은 뉴라민산의 N- 또는 O-치환된 유도체(예를 들어, N-아세틸뉴라민산; 'Neu5Ac' 또는 'NANA'라고 지칭)이다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, "Gal"은 갈락토실 치환체를 의미한다. 바람직한 실시형태에서, 갈락토실 치환체는 하기 구조의 라디칼이다:
Figure pct00002
특정 실시형태에서, 갈락토실 치환체는 β-갈락토스의 라디칼이다. 이러한 실시형태에서, 갈락토실 치환체는 시알릴 기에 O-연결된다. 모든 가능한 위치이성질체가 본 발명에 포함된다. 당업자는 또한 다른 당류, 예를 들어, 글루코스, 프룩토스, 락토스, 말토스 및 수 크로스의 라디칼이 갈락토실 기 대신 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 "갈락토실 치환체"에 대한 언급은 그에 따라 해석되어야 한다.
-Gal-Sial 기는 상기에 도시된 바와 같이 X3에 접합되며, 여기서 X3은 글리코실 받개 기를 포함하는 자연 또는 비-자연 아미노산이고; 즉, X3으로 표현된 아미노산의 측쇄는 Gal 치환체와 결합을 형성하는 친핵성 치환체(즉, 글리코실 주개(donor))를 포함한다. 예를 들어, 친핵성 치환체는 히드록실 또는 아민 치환체일 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에, X3은 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 히드록시리신(Hyl), 히드록시 프롤린(Hyp), 아스파라긴(Asn), 아르기닌(Arg) 및 포스포세린(SEP)으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, X3은 Ser이다.
화학식 I로부터 -Gal-Sial 기는 X3에만 결합된다는 것을 이해해야 한다(화학식 I에서 대괄호로 나타냄). 그것은 X3을 X4에 브리징시키지 않는다. 의심의 여지를 없애기 위해, 대안적인 그리고 동등한 구조식 (Ia)을 하기에 나타낸다:
Figure pct00003
(구조식 Ia)
따라서 -Gal-Sial 기는 펩티드 골격에서 분지화된다. 따라서 -Gal 치환체는 구조의 중앙에 위치하여 아미노산 X1, X2, X4 및 X5가 측접된다. 결과적으로, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 결합 분자(예를 들어, 항체)는 각각의 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 대해 매우 높은 친화성 및 특이성으로 생성될 수 있고, Gal 치환체와의 상호작용이 없는 주변 결합 분자(예를 들어, 항체)의 생성이 최소화된다.
X1, X2, X4 및 X5는 임의의 아미노산(자연 및 비-자연)으로부터 독립적으로 선택되되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 (i) 비-표준 아미노산 또는 (ii) 비-자연 아미노산이다. 비-표준 및 비-자연 아미노산은 서열 다양성을 추가하고, 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 대해 높은 친화성을 갖는 항체인 결합 분자를 생성하는 경우 숙주 유기체에서 면역 반응을 촉진시키는 데 도움을 준다. D-아미노산은 프로테아제에 대한 감수성을 줄이는 데 도움이 된다. 특정 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 2개, 3개 또는 4개 모두는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이다.
당업자는 "자연"및 "비-자연" 아미노산이라는 용어에 매우 익숙할 것이다. 의심의 여지를 없애기 위해 "자연" 아미노산은 자연에서 발견되는 아미노산이며 표준 및 비-표준 아미노산을 모두 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 표준 아미노산은 범용 유전자 코드에서 삼중항 코돈에 의해 직접 암호화된 아미노산이다. 반대로, 비-표준 아미노산은 자연에서 발견되지만 범용 유전 코드에서 삼중항 코돈에 의해 직접 암호화되지 않는 아미노산이다. "비-자연"아미노산은 자연에서 발견되지 않지만 인공 합성을 통해서만 존재하는 아미노산이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "D"또는 "L" 접두사가 없는 명칭에 의한 아미노산에 대한 언급은 D 및 L 입체이성질체 둘 다를 의미하도록 사용된다. "D" 또는 "L" 접두사의 사용은 특정 입체이성질체를 나타낸다.
펩티드 또는 지시약 분자의 "탈-시알릴화된 유도체"는 전형적으로 시알리다제 효소에 의해서 시알릴 기의 절단에 의해 펩티드 또는 지시약 분자로부터 생성된 생성물이다. 따라서, 펩티드 또는 지시약 분자의 "탈-시알릴화된 유도체"는 전형적으로 단지 시알릴 기의 부재와 관련해서 또는 단지 실질적으로 시알릴 기의 부재와 관련해서 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자와 상이하다. 따라서 펩티드 또는 지시약 분자의 "탈- 시알릴화된 유도체"에 대한 본 명세서의 모든 언급은 그 펩티드 또는 지시약 분자의 탈-시알릴화된 형태를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
펩티드 서열 토폴로지의 다양성을 추가로 증가시키는 것은 각각의 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 대해 매우 높은 친화성 및 특이성을 갖는 결합 분자의 생성을 추가로 촉진시키는 것으로 나타났기 때문에 이롭다. 이것은 특히 항체인 결합 분자와 관련이 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5는 적어도 2, 3 또는 4개의 상이한 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 소수성 아미노산이다. 예를 들어, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 알라닌(Ala), 발린(Val), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro), D-알라닌(DAla), 1-아미노시클로헥산-카르복실산(Cyc), β-알라닌(βAla), 노르류신(Nle), 노르발린(Nva), 2'-(아미노메틸)바이페닐-2-카르복실산(Bip) 및 시클로헥실알라닌(Cha)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Nle, Nva 및 Cha의 L-입체이성질체가 사용된다. 추가 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 2개 또는 3개는 소수성 아미노산이다. X1, X2, X4 및 X5 중 4개 전부는 소수성 아미노산일 수 있되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 소수성 아미노산은 Ala이다. 추가 실시형태에서, X1 및 X2 둘 다는 Ala이다. 바람직한 실시형태에서, Ala는 DAla 또는 βAla이다. 추가 실시형태에서, 각각의 소수성 아미노산은 DAla, βAla, Ile, Val, Pro, Nle, Nva, Cyc, Cha 및 Bip으로부터 선택된다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서 X1, X2, X4 및 X5 적어도 하나는 하전된 아미노산이다. 예를 들어, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아스파트산(Asp), 글루탐산(Glu), 오르니틴(Orn) 및 포스포세린(SEP)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Orn의 L-입체이성질체 및 Asp의 D-입체이성질체가 사용된다. 추가 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 2개 또는 3개는 하전된 아미노산이다. X1, X2, X4 및 X5 중 4개 전부는 하전된 아미노산일 수 있되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 각각의 하전된 아미노산은 Arg, Glu, DAsp, LOrn 및 SEP로부터 선택된다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서 X1, X2, X4 및 X5 적어도 하나는 극성 아미노산이다. 예를 들어, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln) 및 시스테인(Cys)으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, Ser의 D-입체이성질체가 사용된다. 추가 실시형태에서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 2개 또는 3개는 극성 아미노산이다. X1, X2, X4 및 X5 중 4개 전부는 극성 아미노산일 수 있되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이다. 특정 실시형태에서, 각각의 극성 아미노산은 LSer, DSer 및 Thr으로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 서열 토폴로지의 다양성을 최대화하기 위해, X1, X2, X4 및 X5는 소수성, 하전 된 및 극성 아미노산의 조합이다. 특히 Pro 및 βAla는 "힌지 기"로서 기능하여 전체 구조적 접힘에서 추가 자유도를 허용하여 펩티드 서열 토폴로지의 다양성을 더욱 증가시키기 때문에 본 발명의 펩티드에서 유용하다.
바람직한 실시형태에서, 펩티드는 5000 달톤 미만의 분자량을 갖는다. 이것은 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 결합하는 항체의 생성을 위해 숙주 유기체에서 면역 반응의 자극을 촉진한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 펩티드는 5 내지 20개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 9 내지 20개 아미노산 길이일 수 있다.
따라서, 관련된 양태에서, 본 발명은 하기 화학식에 따른 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
(구조식 II)(서열번호 10)
식 중,
Sial은 시알릴 기이고,
X1은 존재하지 않거나 Thr이고,
X2는 존재하지 않거나 DAla이고,
X3은 존재하지 않거나 Nle이고,
X4는 존재하지 않거나 Glu이고,
X5는 존재하지 않거나 DAla이고,
X6은 존재하지 않거나 Arg이고,
X7은 존재하지 않거나 Glu, Arg, Ser, Nva, βAla로부터 선택되고,
X8은 존재하지 않거나 DSer, DAla, SEP, Cyc으로부터 선택되고,
X9는 존재하지 않거나 Nva, BIP, DAla, βAla, Orn으로부터 선택되고,
X10은 Cyc, Ser, Ile, DAla, DSer으로부터 선택되고,
X11은 DAla, Pro, Orn, Nle으로부터 선택되고,
X12는 Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 SEP으로부터 선택되고,
X13은 DAla, BIP, βAla으로부터 선택되고,
X14는 Arg, DAsp, Nle, Orn, Nva로부터 선택되고,
X15는 존재하지 않거나 Phe, BIP, Ser, Glu, DAla, DSer으로부터 선택되고,
X16은 존재하지 않거나 DSer, Glu으로부터 선택되고,
X17은 존재하지 않거나 Val, Ser, Thr으로부터 선택되고,
X18은 존재하지 않거나 Cha이고,
X19는 존재하지 않거나 DSer이고,
X20은 존재하지 않거나 Val이다.
화학식 II로부터 -Gal-Sial 기는 X12에만 결합된다는 것을 이해해야 한다(화학식 II에서 대괄호로 나타냄). 그것은 X12를 X13에 브리징시키지 않는다. 의심의 여지를 없애기 위해, 대안적인 그리고 동등한 구조식 (IIa)을 하기에 나타낸다:
Figure pct00004
(구조식 IIa)
따라서 -Gal-Sial 기는 펩티드 골격에서 분지화된다. 따라서, -Gal 치환체는 아미노산 X10-11 및 X13-14뿐만 아니라 아미노산 X1-9 및 X15-20(존재하는 경우)이 측접되도록 위치된다. 결과적으로, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 결합 분자(예를 들어, 항체)는 각각의 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 대해 매우 높은 친화성 및 특이성으로 생성될 수 있고, Gal 치환체와의 상호작용이 없는 주변 결합 분자(예를 들어, 항체)의 생성이 최소화된다.
바람직한 실시형태에서, X12는 Ser이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 모든 양상에 따라서, 펩티드는 하기 서열을 포함하건, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지며:
(i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg(서열번호 11)
(ii) Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val(서열번호 12)
(iii) Arg-DAla-Bip-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser(서열번호 13)
(iv) Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu(서열번호 14)
(v) DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-Bip-Orn-DAla-Glu-Ser(서열번호 15); 또는
(vi) Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(서열번호 16);
이들 중 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg은 특히 바람직하다.
본 발명자들은 이러한 특정 펩티드가 시알리다제 활성을 검출하는 데 특히 유용하다는 것을 발견하였고, 이러한 펩티드는 실시예 부분에 추가로 기재되어 있다.
바람직하게는, Nle, Nva, Orn 및/또는 Cha(존재하는 경우)는 각각 LNle, LNva, LOrn 및 LCha이다.
일부 실시형태에서, -Gal Sial 기에 측접한 아미노산이 절단의 특이성 및 감도를 보장하도록 이에 따라 펩티드를 작제함으로써 펩티드는 하나 이상의 특이적 시알리다제에 의한 절단에 대해서 편향된다. 따라서 특이적 시알리다제 효소는 펩티드에 대해 서로 다른 친화성을 가질 수 있다. 이것은 본 발명이 시험 샘플에서 특이적 시알리다제 활성을 검출하기 위해 이용되는 것을 허용한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 세균성 질염을 검출하는 데 특히 유용하다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 1종 이상의 특이적 시알리다제는 박테리아 기원이다. 특히, 1종 이상의 특이적 시알리다제는 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데스(Bacteroides) 및/또는 모빌룬쿠스 종(Mobiluncus species) 및/또는 가드넬라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)로부터 유래될 수 있다.
관련 양태에서, 본 발명의 펩티드는 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하는데 사용하기 위해 지시약 분자에 혼입된다. 지시약 분자는 효소 검출 장치, 효소 검출 키트, 물질의 효소 검출 조성물 및 본 명세서에 추가로 기재된 시알리다제 효소의 절단 활성의 시험 샘플에서의 존재를 검출하기 위한 방법의 핵심 성분이다. 본 명세서에 기재된 지시약 분자는 절단된 생성물에 특이적으로 결합하는 효소 및 결합 분자의 절단 활성을 검출하는 데 사용하기 위한 지시약 분자의 일반적인 개념에 대한 본 발명자들의 초기 개시내용에 기초하여 BV 진단을 위한 시알리다제 활성 검출의 맥락에서 본 발명자들에 의해 구체적으로 개발되었다(본 명세서에 참고에 의해 포함된 PCT/GB2014/053171 참고). 따라서, 본 발명은 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하는데 사용하기 위해 지시약 분자를 제공하며, 지시약 분자는,
a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드; 및
b) 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의한 지시약 분자로부터의 시알릴 기의 절단 이후에 온전하게 남아있는 포획 부위를 포함한다.
포획 부위는 포획 구역 내에 존재하는 포획 분자에 대한 지시약 분자의 결합을 매개하는 지시약 분자의 구별되는 영역이다(아래에서 더 자세히 설명됨). 따라서, 포획 부위는 포획 구역 내에서 지시약 분자를 유지하거나 위치시키는 역할을 하는 지시약 분자의 부분이다. 지시약 분자의 절단 후, 포획 부위는 온전하거나 실질적으로 온전한 상태로 남아있을 수 있으므로, 그 부위는 장치의 포획 영역 내에 존재하는 포획 분자에 의해 여전히 인식되고 결합된다. 이러한 상황에서, 온전한 지시약 분자 및 절단 후 포획 부위를 포함하는 지시약 분자의 일부는 포획 영역 내의 분자를 포획하기 위해서 결합될 것이다. 포획 부위는 임의의 적합한 분자, 예를 들어 비오틴 분자 또는 옥심 모이어티를 포함할 수 있다. 포획 부위는 펩티드의 N-말단 또는 C- 말단에 있을 수 있다. 지시약 분자의 효과의 핵심은 포획 구역에서 포획 부위와 포획 분자 간의 상호작용을 통한 고정화 및 절단이 일어난 후 결합 분자에 의한 동시 결합이다.
따라서, 온전한 지시약 분자는 본 발명의 펩티드에 연결된 포획 부위 모이어티를 포함할 수 있으며, 이 펩티드는 제1 시알릴 기를 포함한다. 시알리다제 효소에 의한 지시약 분자의 절단은 포획 부위 모이어티 및 펩티드의 탈-시알릴화된 형태를 포함하는 단편을 생성한다. 단편(즉, 절단된 지시약 분자)은 온전한 지시약 분자에 존재하는 첫 번째 시알릴 기 없다는 점에서 온전한 지시약 분자와 구조적으로 상이하다. 이러한 첫 번째 시알릴 기의 결여는 온전한 지시약 분자에 없거나 숨겨져 있거나 접근할 수 없는 에피토프(새로운 결합 부위)를 단편에 드러내거나 노출시킨다. 따라서 온전한 지시약 분자는 잠적 에피토프(cryptic epitope)를 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 하기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 장치, 키트, 물질의 조성물 및 방법의 결합 분자는 이러한 에피토프에 특이적이고, 온전한 지시약과 비교하여 지시약 단편에만 또는 우선적으로 결합한다.
지시약 분자의 펩티드 및 포획 부위는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 회합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 및 포획 부위는 직접 공유 결합을 통해 결합될 수 있다. 펩티드 및 포획 부위는 바로 인접하거나 링커 또는 스페이서, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 링커를 통해 N- 또는 C-말단에서 비오틴 기에 연결된다. 링커 기(예를 들어, PEG)를 펩티드에 연결하기 위해 펩티드의 N- 또는 C-말단에 하나 이상의 추가 아미노산이 존재할 수 있다. 하나 이상의 추가 아미노산은 일부 실시형태에서 Asp를 포함할 수 있다. PEG 모이어티는 펩티드와 포획 부위를 서로에 연결하기 위한 합성 동안 펩티드의 말단 잔기 및/또는 포획 부위(예를 들어 비오틴 분자)와 반응할 수 있는 PEG 모이어티의 한쪽 또는 양쪽 단부에 작용기(예를 들어, 아민 기, 선택적으로 알킬아민 기)를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 지시약 분자는 다음 구조를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다:
(i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴(서열번호 11-PEG-비오틴)
(ii) 비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val (비오틴-PEG-Asp-서열번호 12)
(iii) 비오틴-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser (비오틴-PEG-Asp-서열번호 13)
(iv) 비오틴-PEG-Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu (비오틴-PEG-Asp-서열번호 14)
(v) 비오틴-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser (비오틴-PEG-Asp-서열번호 15); 또는
(vi) 비오틴-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val (비오틴-PEG-Asp-서열번호 16);
이들 중에서 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴(서열번호 11-PEG-비오틴)이 특히 바람직하다.
본 발명의 맥락에서 (포획 부위를 통해) 지시약 분자는 상대적으로 높은 친화도로 포획 구역(하기에 더 자세히 설명됨)에서 포획 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지시약 분자에 대한 해리 상수(kd)는 비교적 낮을 것이고 바람직하게는 0M 내지 1 x 10-7M(검정에 필요한 감도에 따라 다름)일 것이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 지시약 분자에 대한 해리 상수는 1 x 10-15M 내지 1 x 10-9M일 것이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 이러한 결합 상호작용은 지시약 분자의 포획 부위가 포획 구역에 존재하는 포획 분자에 직접 결합한 결과로 달성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 직접 결합은 지시약 분자가 매개체 없이 (포획 부위를 통해서) 포획 분자에 결합하는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 지시약 분자의 포획 부위 및 포획 구역에 존재하는 포획 분자는 결합 쌍의 두 반쪽이다. 이러한 맥락에서 결합 쌍은 서로 결합할 수 있는 두 개의 분자 또는 엔티티로 이루어진다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 결합 상호작용은 결합 쌍의 각각의 구성원이 각각의 파트너 또는 제한된 수의 결합 파트너에만 결합할 수 있도록 특이적이다. 더욱이, 상술된 바와 같이, 결합 쌍이 상대적으로 높은 친화성을 나타내는 것이 바람직하다. 결합 쌍은 자연에서 발견되는 결합 쌍이거나 상호작용하는 분자 또는 엔티티의 인공적으로 생성된 쌍일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 지시약 분자 및 포획 분자의 포획 부위는 결합 쌍의 2개의 반쪽이며, 여기서 결합 쌍은 하기로부터 선택된다: -항원 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 비오틴 및 아비딘, 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 캡타비딘; 면역글로불린(또는 이의 적절한 도메인) 및 단백질 A 또는 G; 탄수화물 및 렉틴; 상보성 뉴클레오티드 서열; 리간드 및 수용체 분자; 호르몬 및 호르몬 결합 단백질; 효소 보조 인자 및 효소; 효소 저해제 및 효소; 셀룰로스 결합 도메인 및 셀룰로스 섬유; 고정화된 아미노페닐 보론산 및 시스-디올 보유 분자; 및 자일로글루칸 및 셀룰로스 섬유 및 이의 유사체, 유도체 및 단편.
본 발명의 특정 실시형태에서, 결합 쌍은 비오틴 및 스트렙타비딘으로 이루어진다. 본 발명의 추가 실시형태에서, 지시약 분자의 포획 부위는 에피토프를 포함하고 포획 분자는 제1 포획 부위에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 항체는 임의의 종으로부터의 자연 면역글로불린, 키메라 항체, 인간화 항체, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv 단편, sFv 단편 및 특이적 결합 친화성을 유지하는 항체 도메인(예를 들어 단일 도메인 항체)에 기초한 것과 같은 고도로 관련된 분자를 포함한다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 포획 분자는 항체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 포획 부위는 비오틴 분자를 포함하고, 포획 구역은 스트렙타비딘 분자를 포함한다.
시험 샘플에서 본 명세서에 추가로 기재된 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 장치, 효소 검출 키트, 물질의 효소 검출 조성물 및 방법의 또 다른 핵심 성분은 결합 분자이다. 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 활성에 의해 지시약 분자로부터 시알릴 기가 절단된 후 형성된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 특이적으로 결합하도록 설계된다. 탈-시알릴화된 유도체의 형성은 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 새로운 결합 부위를 나타낸다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 결합 분자는 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 발생하지 않는 한 그리고 발생할 때까지 (임의의 인식 가능한 또는 검출 가능한 수준에서) 지시약 분자에 결합할 수 없다. 대안적인 실시형태에서, 결합 분자는 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자보다 탈-시알화된 유도체에 우선적으로 결합한다. 따라서, 결합 분자는 시알릴화된 형태와 비교할 때 탈-시알릴화된 유도체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다.
대안적으로 볼 때, 바람직한 실시형태에서, 결합 분자는 탈-시알릴화된 지시약 분자 (단편)에 특이적으로 결합할 수 있고 온전한(시알릴화된) 지시약 분자에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
당업자는 특정 결합 분자가 시알릴화된 형태보다 우선적으로 탈시알화된 유도체에 결합하는지 여부를 잘 결정할 수 있다. 예를 들어 이것은 상대적 해리 상수로 표현할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 결합 분자와 탈시알릴화된 유도체 사이의 결합 상호작용에 대한 해리 상수는 결합 분자와 시알릴화된 형태 사이의 결합 상호작용에 대한 해리 상수보다 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 100-, 200-, 500-, 1000-배(또는 그 초과) 낮다.
특정 실시형태에서, 결합 분자는 항체를 포함한다. 의심의 여지를 피하기 위해서, 용어 항체는 임의의 종으로부터의 자연 면역글로불린, 키메라 항체, 인간화 항체, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv 단편, sFv 단편 및 특이적 결합 친화성을 유지하는 항체 도메인(예를 들어, 단일 도메인 항체)에 기초한 것과 같은 고도로 관련된 분자를 포함한다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 본 발명자들은 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체만을 인식하고 따라서 시알릴 기의 절단이 발생하지 않는 한 그리고 발생할 때까지 지시약 분자에 결합하지 않을 항체를 생산해 왔다. 항체는 당업계에 공지된 기술에 따라 생산될 수 있다. 이는 양, 토끼 또는 염소와 같은 동물의 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 사용한 면역화에 의존할 수 있다. 대안적으로, 동물은 탈시알화된 펩티드로 면역화될 수 있다(즉, 포획 부위가 부착되지 않음). 다클론성 항체는 혈청에서 분리되고, 친화도 정제될 수 있다. 단클론성 항체는 널리 공지되어 있고, 특징규명된 하이브리도마 기술을 사용하여 생산될 수 있다.
따라서, 관련된 양태에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 본 발명의 펩티드의 탈시알릴화된 유도체 또는 본 명세서에 정의된 본 발명의 지시약 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공한다. 당업자가 본 명세서의 개시내용에 기초하여 인식할 바와 같이, 항체는 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자보다 탈시알릴화된 유도체에 우선적으로 결합할 수 있다. 따라서, 항체는 시알릴화된 형태와 비교할 때 탈-시알릴화된 유도체에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 당업자는 특정 항체가 시알릴화된 형태보다 우선적으로 탈시알화된 유도체에 결합하는지 여부를 잘 결정할 수 있다. 예를 들어 이것은 상대적 해리 상수로 표현할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 항체와 탈시알릴화된 유도체 사이의 결합 상호작용에 대한 해리 상수는 항체와 시알릴화된 형태 사이의 결합 상호작용에 대한 해리 상수보다 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 20-, 30-, 40-, 50-, 100-, 200-, 500-, 1000-배(또는 그 초과) 낮다. 특정 실시형태에서, 항체는 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자에 결합할 수 없다. 즉, 그것은 시알릴 기의 절단이 일어난 후에 탈-시알릴화된 유도체에만 결합할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 항체는 에피토프:
Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-비오틴(서열번호 11-PEG-비오틴의 탈-시알릴화된 형태)에; 특히 이 분자, Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg(서열번호 11의 탈-시알릴화된 형태)의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태(Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg, 즉, 서열번호 11)에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
또 다른 실시형태에서, 에피토프:
비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(비오틴-PEG-Asp-서열번호 12의 탈-시알릴화된 형태); 특히 이 분자에 존재하는 에피토프, 보다 특별하게는 이 분자의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
추가 실시형태에서, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다:
비오틴-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal]-DAla-DAsp-Ser(비오틴-PEG-Asp-서열번호 13의 탈-시알릴화된 형태); 특히 이 분자에 존재하는 에피토프, 보다 특별하게는 이 분자의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
추가 실시형태에서, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다:
비오틴-PEG-Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal]-DAla-Nle-Glu(비오틴-PEG-Asp-서열번호 14의 탈-시알릴화된 형태); 특히 이 분자에 존재하는 에피토프, 보다 특별하게는 이 분자의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
추가 실시형태에서, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다:
비오틴-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(비오틴-PEG-Asp-서열번호 15의 탈-시알릴화된 형태); 특히 이 분자에 존재하는 에피토프, 보다 특별하게는 이 분자의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
추가 실시형태에서, 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다:
비오틴-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(비오틴-PEG-Asp-서열번호 16의 탈-시알릴화된 형태); 특히 이 분자에 존재하는 에피토프, 보다 특별하게는 이 분자의 Gal 펩티드 모이어티에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 바람직하게는, 항체는 이 분자의 시알릴화된 형태에 결합할 수 없다(임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서).
추가 실시형태에서, 3개의 CDR을 갖는 중쇄 및 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 갖는 항체가 제공되며, 여기서 중쇄 CDR1은 서열번호 1을 갖고/갖거나; 중쇄 CDR2는 서열번호 2를 갖고/갖거나; 중쇄 CDR3은 서열번호 3을 갖고/갖거나; 경쇄 CDR1은 서열번호 4를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR2는 서열번호 5를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR3은 서열번호 6을 갖는다.
항체는 서열번호 7을 갖는 중쇄 및/또는 서열번호 8을 갖는 경쇄를 가질 수 있다.
바람직하게는, 항체는 분자 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 (임의의 인식 가능하거나 검출 가능한 수준에서) 분자 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg에 결합하지 않는다.
(탈-시알릴화된) 분자 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-옥심(서열번호 11-PEG-옥심의 탈-시알릴화된 형태) 항체는 100 nM 미만, 바람직하게는 80, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 nM 미만, 예를 들어, 약 7.9 nM의 KD를 가질 수 있다. 이러한 분자의 경우 그것은 약 54080M-1s-1의 Kon;
및 약 0.000427s-1의 Koff를 가질 수 있다.
결합 분자는 지시약 분자에 대한 결합 분자의 결합을 검출할 수 있도록 리포터 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합(즉, 표지)될 수 있다. 리포터 분자는 당업자에게 이용 가능한 임의의 수단에 의한 검출에 적합한 임의의 물질 또는 모이어티일 수 있다. 따라서 리포터 분자는 전형적으로 신호 생성 또는 생산이 가능하다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 리포터 분자는 다음으로부터 선택된다: -금 입자; 발색원; 발광 화합물; 형광 분자; 방사성 화합물; 가시적인 화합물; 신호 생성 물질을 포함하는 리포솜 또는 기타 소포; 전기활성 종; 또는 효소와 그 기질의 조합물. 리포터 모이어티로 사용하기에 적합한 효소-기질 조합은 효소 알칼리 포스파타제 및 기질 니트로 블루 테트라졸륨-5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 리포터 분자는 금 입자이다.
결합 분자와 리포터 분자의 간접적인 표지가 또한 본 발명에서 고려된다. 따라서, 리포터 분자는 표지를 제공하기 위해 차례로 결합 분자에 결합하는 추가 결합 분자에 부착될 수 있다. 이러한 간접 결합은 결합 분자와 리포터 분자를 동시에 결합할 수 있는 어댑터에 의해 매개될 수 있다. 예시적인 실시형태로서, 결합 분자가 항체인 경우, 간접적 표지는 특정 방식으로 항체 결합 분자에 결합하는 추가 항체에 의해 매개될 수 있다. 추가 항체는 리포터 분자, 예컨대, 금 입자; 발색원; 발광 화합물; 형광 분자; 방사성 화합물; 가시적인 화합물; 신호 생성 물질을 포함하는 리포솜 또는 기타 소포; 전기활성 종; 또는 효소와 그 기질의 조합물로부터 직접 표지될 수 있다. 리포터 모이어티로 사용하기에 적합한 효소-기질 조합은 효소 알칼리 포스파타제 및 기질 니트로 블루 테트라졸륨-5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 리포터 모이어티는 금 입자이다.
리포터가 금 입자인 실시형태에서, 금 입자-결합 분자 접합체는 적어도 4, 바람직하게는 적어도 5, 6 또는 7의 광학 밀도를 사용해야 하며, 가장 바람직하게는 적어도 또는 약 8, 9 또는 10이다.
리포터 분자가 어댑터 분자에 의해 결합 분자에 결합하는 본 발명의 실시양태에서, 어댑터는 시험 샘플을 지시약 분자에 첨가하기 전에 결합 분자와 미리 복합체화될 수 있되, 단 어댑터는 절단된 지시약 분자에 대한 결합 분자의 결합을 예방하지 않아야 한다.
어댑터는 결합 분자와 리포터 분자의 간접적인 상호작용을 매개할 수 있는 임의의 물질 또는 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터는 스트렙타비딘이고, 결합 분자는 비오틴 분자를 포함한다. 어댑터는 또한 "어댑터 결합 쌍"일 수 있으며, 여기서 상기 결합 쌍은 다음을 포함한다:
(i) 결합 분자에 결합할 수 있는 제1 구성원;
(ii) 쌍의 제1 구성원 및 리포터 분자에 결합할 수 있는 제2 구성원. 본 발명의 특정 실시형태에서, 지시약 분자의 검출 영역은 비오틴을 포함하고, 어댑터 결합 쌍의 제1 구성원은 아비딘 또는 스트렙타비딘이고, 어댑터 결합 쌍의 제2 구성원은 비오틴이고, 리포터 분자는 비오틴에 결합할 수 있는 모이어티를 포함한다.
전술한 관점에서, 상보적인 양태에서, 본 발명의 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체는 또한 본 발명의 일부를 형성하고 결합 분자, 특히 항체의 생성에 사용된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체를 생성하는데 사용하기 위한 펩티드를 제공하며, 여기서 펩티드는 본 발명에 따른 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체이고 항체는 본 발명의 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 펩티드는 하기이다:
(i) Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg(서열번호 11의 탈-시알릴화된 형태)
(ii) Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(서열번호 12의 탈-시알릴화된 형태)
(iii) Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal]-DAla-DAsp-Ser(서열번호 13의 탈-시알릴화된 형태)
(iv) Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal]-DAla-Nle-Glu(서열번호 14의 탈-시알릴화된 형태)
(v) Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(서열번호 15의 탈-시알릴화된 형태); 또는
(vi) Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(서열번호 16의 탈-시알릴화된 형태).
서열 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 펩티드가 특히 바람직하다.
특정 실시형태에서, 펩티드는 숙주 유기체에서 면역원성 및 이에 따른 항체 생산을 개선하기 위해 담체 단백질에 접합 될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)에 접합될 수 있다. 담체 단백질은 펩티드의 N-말단 또는 C- 말단에 있을 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명은 상기에 정의된 바와 같은 지시약 분자, 포획 분자 및 결합 분자를 혼입한 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 장치, 효소 검출 키트, 물질의 효소 검출 조성물 및 방법을 추가로 제공한다. 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에만 결합하고, 비절단된 지시약 분자에 결합하지 않는 결합 분자, 예컨대, 항체의 사용은 시험 샘플에서 낮은 농도의 시알리다제 활성의 검출을 가능하게 한다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물을 제공하며, 장치는,
(i) 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자;
(ii) 지시약 분자를 고정시키기 위해서, 시험 샘플을 제공받기 위한 포획 구역으로서, 포획 구역은 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 분자를 포함하는, 포획 구역; 및
(iii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 결합 분자를 포함한다.
본 발명은 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은,
(i) 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
(iii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
(iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 장치, 키트, 물질의 조성물 및 방법이 BV의 진단 분야에서 특정 응용을 갖는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출함으로써 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은,
(i) 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
(iii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 포획하는 단계; 및
(iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계로서, 대조군에 비해서 증가된 절단 수준이 세균성 질염을 진단하는, 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 지시약 분자는 (즉, 시험 샘플과의 접촉 전에) 포획 분자를 통해서 포획 구역에 (사전-)고정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은,
(i) 시험 샘플을 포획 분자를 포함하는 포획 구역에 첨가하는 단계로서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 상기 포획 분자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자의 포획 부위에 결합되어 있고, 상기 포획 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나는 지의 여부에 관계없이 포획 부위에 결합되어 유지되는, 단계;
(ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함한다.
유사하게, 본 발명은 또한 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출함으로써 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하는 방법을 제공하며, 이 방법은,
(i) 시험 샘플을 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 분자를 포함하는 포획 구역에 첨가하는 단계로서, 상기 포획 분자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자의 포획 부위에 결합되어 있고, 상기 포획 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나는 지의 여부에 관계없이 포획 부위에 결합되어 유지되는, 단계;
(ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계로서, 대조군에 비해서 증가된 절단 수준이 세균성 질염을 진단하는, 단계를 포함한다.
결과적으로, 지시약 분자가 방법의 단계 (i) 이전에, (즉, 시험 샘플과의 접촉 전에) 포획 분자를 통해서 포획 구역에 (사전-)고정되는 실시형태의 경우, 지시약 분자가 포획 분자를 통해서 포획 구역에 결합되도록 지시약 분자가 포획 구역에 첨가될 수 있다. 결합 분자의 첨가는 시험 샘플이 포획 구역에 첨가됨과 동시에 또는 첨가된 후에 일어날 수 있다. 따라서, 방법의 단계 (i) 및 단계 (ii)는 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법의 맥락에서, 결합 분자를 시험 샘플에 "첨가"하는 단계는 결합 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 임의의 단계를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 이 단계는 결합 분자를 포함하는 장치에 시험 샘플을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 결합 분자는 용액 중에 존재하거나, 담체 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자는 본 명세서의 다른 곳에서 논의된 "접합체 패드"일 수 있는 고체 지지체 상에 건조되거나 고체 지지체 내에 또는 그 상에 달리 함침될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 시험 샘플은 결합 분자가 건조된 고체 지지체와 접촉된다. 시험 샘플에 포함되고/되거나 담체에 첨가된 액체는 결합 분자가 재용매화되도록 한다.
결합 분자가 고체 지지체 상에서 건조되거나 고체 지지체 내에 또는 그 상에 달리 함침되는 실시양태에서, 고체 지지체는 바람직하게는 섬유 유리, 폴리에스테르 섬유 또는 유사한 특성을 갖는 물질을 포함하거나 그것으로 이루어진다. 고체 지지체는 바람직하게는 다음 특성 중 하나 이상을 가져야 한다: 평량 대략 75 g/m2; 캘리퍼 약 0.38 내지 0.43 mm; 위킹 속도 약 3 내지 5(s/2 cm); 및/또는 수분 흡수 약 63 내지 79 mg/cm2. 따라서 접합 패드는 이러한 특성을 가질 수 있다. 마찬가지로, 샘플 패드는 이러한 특성을 가질 수 있다.
바람직한 실시형태에서 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없지만, 일부 실시형태에서, 결합 분자는 본 명세서 다른 곳에 기재된 바와 같은 시알릴화된 형태보다 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 우선적으로 결합한다. 따라서, 시알릴화된 지시약 분자에 어느 정도의 결합이 발생할 수 있다(일부 경우 배경 신호로 간주될 수 있음). 그러나, 결합 분자가 탈-시알릴화된 유도체에 우선적으로 결합할 것이기 때문에, 시알릴화된 지시약 분자가 절단되지 않았거나 지시약 분자가 존재하지 않는 샘플에 비해 탈-시알릴화된 유도체를 포함하는 샘플에서 훨씬 더 큰 신호가 생성된다.
시알리다제 활성의 배경 수준(존재하는 경우)을 고려하기 위해, 방법은 일반적으로 시험 샘플에서 측정된 절단 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함한다. 일반적으로 대조군은 건강한 대상체에서 상응하는 수준의 시알리다제 활성을 나타낸다. "건강상 대상체"는 BV를 앓지 않은 대상체를 의미한다. 대조군은 일치하는 건강한 대조군에서 채취한 상응하는 시험 샘플에 존재할 수 있다. 대안적으로, 대조군은 다양한 건강한 환자 및 병이 있는 환자에서 시알리다제 활성을 결정함으로써 설정된 시알리다제 활성의 역치 수준일 수 있다. 역치를 설정하기 위한 적절한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 역치는 환자 데이터의 훈련 세트에서 수학적으로 파생될 수 있다. 따라서 점수 역치는 BV의 유무에 따라 시험 샘플을 분리한다. 이러한 양의 해석, 즉, 컷오프 역치는 알려진 결과를 갖는 일련의 환자로부터 개발 또는 훈련 단계에서 파생될 수 있다. 따라서 역치는 당업자에게 공지된 방법에 의해 훈련 데이터로부터 청구된 방법을 수행하기 전에 고정될 수 있다.
예를 들어, 실시예에서 입증된 바와 같이, 큐브 판독기, 예를 들어, 독일 D-12489 베를린 슈바르츠실트스트라쎄 1에 소재한 OpTricon GmbH(Chembio Diagnostic systems)의 Optricon 판독기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 사용된 검정에서 10 미만의 큐브 판독치는 시각 신호의 부재와 상관관계가 있고, 음성 결과로 간주되어 세균성 질염의 부재를 나타내고; 최소 30 단위의 큐브 판독은 강한 시각적 신호와 관련이 있으며, 양성 결과로 간주되어 세균성 질염의 존재를 나타낸다.
10 내지 20 단위의 큐브 판독치는 희미한 시각 신호와 관련이 있으며 확립된 세균성 질염이 없음을 나타낼 수 있지만, 세균성 질염의 낮은 수준의 감염(예를 들어, 초기 단계)을 나타낼 수 있는 결과로 간주된다.
특정 실시형태에서, 검출하고자 하는 시알리다제 효소는 프레보텔라, 박테로이데스 및/또는 모빌룬쿠스 종 및/또는 가드넬라 바지날리스로부터 유래된다.
본 발명의 효소 검출 장치 및 물질의 조성물은 즉시 사용할 수 있는 형식으로 공급될 수 있다. 대안적으로, 필수 성분은 선택적으로 적절한 시약 및/또는 효소 검출 장치의 조립을 위한 설명서와 함께 부품 키트로 제공될 수 있다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 키트를 제공하며, 키트는,
(i) 시험 샘플에 첨가하기 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 지시약 분자;
(ii) 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 분자;
(iii) 포획 분자가 부착되어 포획 구역을 형성하여 시험 샘플을 제공받는 고체 지지체; 및
(iv) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 분자로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 결합 분자를 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 또한 시험 샘플에서 BV를 진단하기 위해 본 명세서에 기재되고 정의된 바와 같은 효소 검출 장치 또는 물질의 조성물의 사용을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 또한 시험 샘플에서 BV를 진단하기 위해 본 명세서에 기재되고 정의된 바와 같은 방법의 사용을 제공한다. 본 발명은 시험 샘플에서 BV를 진단하기 위해 본 명세서에 기재되고 정의된 바와 같은 효소 검출 키트의 사용을 추가로 제공한다.
본 발명은 특정 실시형태에서 측면 유동 또는 수직 유동 장치에서 수행될 수 있다. 따라서 일반적으로 본 발명은 고체 지지체의 어떤 형태에 의존한다. 고체 지지체는 샘플에 대한 액체 유동 경로를 한정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 고체 지지체는 크로마토그래피 매질 또는 모세관 유동 장치를 포함한다. 본 발명은 일부 실시형태에서 시험 스트립 형식으로 제공될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시형태에서, 포획 구역은 고체 지지체 상에 형성된다. 포획 분자가 부착되어 포획 구역을 형성할 수 있는 임의의 지지체가 포함되도록 의도된다. 고체 지지체는 예를 들어, 비드(예를 들어, 세파로스 또는 아가로스 비드) 또는 웰(예를 들어, 마이크로플레이트)의 형태를 취할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서 장치는 포획 분자가 부착되어 포획 구역을 형성하는 고체 지지체를 포함한다. 본 발명의 키트의 경우, 고체 지지체는 부착된 포획 분자 없이 제공될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 키트의 사용자는 시험 샘플과 함께 장치를 사용하기 전에 포획 영역을 형성하기 위해 고체 지지체 상에 포획 분자를 고정시킬 수 있다. 따라서 키트는 또한 고체 지지체 상에 포획 분자를 고정하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 고정 수단은 포획 구역이 형성되도록 하는 임의의 적합한 시약을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 적합한 고정 수단으로 미리 형성될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 포획 분자(의 일부)를 형성하는 아비딘(예를 들어, 스트렙타비딘) 분자와 상호작용하도록 배열된 비오틴 분자를 포함할 수 있다. 물론, 본 명세서에서 논의되고 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 포획 구역을 형성하기 위해 고체 지지체 상에 포획 분자를 고정시키기 위해 다른 결합 쌍 상호작용이 사용될 수 있다.
포획 영역은 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 포획 분자의 내부 또는 그 상의 고정화에 의해 한정될 수 있다. 포획 분자의 고정은 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다. 장치가 크로마토그래피 매질을 포함하는 유동 장치인 경우, 포획 분자는 매질에 직접 결합함으로써 고정되거나, 매질과 결합되거나 또는 결합된 단백질과 같은 담체 분자에 대한 결합을 통해 간접적으로 고정될 수 있다.
추가 실시형태에서, 고체 지지체는 샘플이 적용되는 샘플 적용 구역을 추가로 포함한다. 샘플 적용 구역은 지시약 분자가 미리 로딩되어 시험 샘플이 적용될 때 샘플의 모든 효소가 샘플 적용 구역 내의 지시약 분자의 절단 부위에 작용한다. 샘플 적용 구역은 미리 결정된 기간 동안 샘플 적용 구역에 샘플을 고정하는 장벽을 포함할 수 있다. 이것은 샘플이 측정 가능한 수준의 절단을 달성하기에 충분한 기간 동안 지시약 분자와 상호작용할 수 있도록 한다. 이는 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이 검출할 시알리다제 효소에 따라 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 60분 또는 그 초과일 수 있다. 약 5 내지 15분, 5 내지 10분 또는 약 5분이 바람직하다. 장벽은 샘플에 의해 분해되거나 달리 제거되어, 이 시간 기간 후에, 샘플이 장치를 통해 계속 유동하도록 한다. 대안적으로, 시험 샘플 및 지시약 분자는 샘플 적용 구역과 같은 장치에 혼합물을 첨가하기 전에 사전 혼합되거나 사전 인큐베이션될 수 있다. 그러나, 시험 샘플과 지시약 분자가 사전 혼합되거나 사전 인큐베이션될 수 있는 경우 샘플 적용 구역이 생략될 수 있다. 여기서, 포획 분자와의 상호작용을 통해 지시약 분자의 고정화를 허용하기 위해 혼합물을 포획 구역에 직접 첨가하는 것이 가능할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 예를 들어, 모세관 작용에 의해 포획 구역을 통해 끌어 당겨지도록 포획 구역의 상류 부위에서 크로마토그래피 매질에 적용될 수 있다. 크로마토그래피 매질은 유체 채널 또는 다공성 막과 같이 유체가 통과할 수 있는 임의의 재료로 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 크로마토그래피 매질은 스트립 또는 막, 예를 들어 니트로셀룰로스 스트립 또는 막을 포함한다.
지시약 분자는 불활성 물질이어야 하며, 바람직하게는 다공성이어야 하는 담체 상에 존재할 수 있다. 이는 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 적합한 중합체일 수 있다. 예를 들어, 담체는 불활성 다공성 막 디스크 일 수 있다. 지시약 분자는 예를 들어, 담체 상에서 동결 건조되었을 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 시험 샘플 및 지시약 분자는 혼합물을 장치에 첨가하기 전에 사전 혼합되거나 사전 인큐베이션될 수 있다. 이는 바람직하게는 동결-건조된 형태의 지시약 분자를 포함하는 담체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 예를 들어, 튜브와 같은 용기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 샘플 및 지시약 분자는 적어도 3, 4 또는 5분 및 30분 이하, 바람직하게는 약 5 내지 15 분, 5 내지 10 분 또는 약 5분 동안, 예를 들어 3 내지 7분 또는 4 내지 6분 동안 인큐베이션된다.
당업자는 다양한 성분의 적절한 양과 농도를 결정할 수 있지만, 예를 들어 단일 검정 또는 단일 키트의 경우 지시약 분자의 포획 부위 분자는 바람직하게는 적어도 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 ng, 보다 바람직하게는 적어도 또는 약 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 또는 190 ng의 양으로 존재한다.
결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해 시알릴 기가 지시약 분자에서 절단되는 경우 지시약 분자와의 상호작용을 허용하는 방식으로 장치에 제공되어야 한다. 따라서 결합 분자는 장치에 적용하기 전에 지시약 분자의 포획 부위 분자와 미리 혼합될 수 있다. 이는 지시약 분자의 포획 부위 분자가 시험 샘플과 혼합되기 전 또는 후에 일어날 수 있다. 바람직하게는 결합 분자가 지시약 분자의 포획 부위 분자의 절단 부위에서 (시험 샘플에서) 효소 활성에 미칠 수 있는 임의의 효과를 회피하는 것이 바람직하다. 결합 분자는 바람직하게는 지시약 분자가 고정되기 전에 결합 분자가 시험 샘플 및 지시약 분자와 만나도록 (포획 영역을 한정하는 포획 분자와 지시약 분자의 포획 부 사이의 상호작용을 통해) 포획 구역의 상류 지점에서 장치 상에 또는 장치에 제공될 수 있다. 대안적으로, 결합 분자는 시험 샘플 및 지시약 분자가 포획 구역에 첨가된 후 포획 구역에 첨가될 수 있다. 이는 모든 지시약 분자가 이미 포획 영역에 고정되어, (절단된(즉, 탈-시알릴화된) 지시약 분자의 경우) 결합 부위에 결합 분자를 제공하여 신호를 생성하는 것을 보장한다.
고체 지지체는 샘플 유동과 관련하여 포획 영역의 하류에 제어 영역 및 존재하는 경우 본 명세서에서 "제어 검출 결합제"라고 지칭되는 추가 결합 분자를 함유하는 샘플 적용 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 이것은 결합 분자에 결합하여 장치를 사용하는 검정의 성공적인 완료를 나타낸다. 대안적으로, 추가 결합 분자(대조군 검출 결합제)는 샘플 또는 장치에 첨가되고, 장치를 통해 샘플과 함께 유동하는 본 명세서에서 "대조군 검출 분자"라고 지칭되는 추가 분자에 결합할 수 있다. 추가 분자(대조군 검출 분자)는 본 명세서에 정의된 바와 같은 리포터 분자로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 바람직하게는, 리포터 분자는 다를 수 있지만, 이것은 검출의 용이성을 위해 결합 분자에 부착된 것과 동일한 리포터 분자이다.
제어 구역은 포획 구역과 공간적으로 분리되어, 예를 들어 리포터가 각각의 구역에 결합되거나 고정되어있는 경우 두 개의 개별 시험 라인을 생성시킨다. 이러한 제어 영역은 결합 분자를 포함한 시험 샘플이 전체 장치를 통과했는지 확인하고 장치가 올바르게 작동하는지 확인하는 데 사용된다. 시알리다제 활성이 샘플에 존재하는지 여부와 관계 없이 대조군 영역에서 양성 신호가 예상된다. 추가 결합 분자는 지시약 분자의 포획 부위 분자의 절단 부위에 결합하는 결합 분자의 특성 또는 샘플에 첨가된 추가 분자의 특성에 기초하여 선택된다. 결합 분자 및 추가 결합 분자 또는 추가 분자 및 추가 결합 분자는 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 쌍을 형성할 수 있다. 예를 들어, 결합 분자가 종 특이적 항체(예를 들어, 양 항체)인 경우, 추가 결합 분자는 항-종 항체(예를 들어, 항-양 항체)일 수 있다. 예를 들어, 대조군 검출 분자는 닭 IgY 항체일 수 있고, 대조군 검출 결합제는 항-닭 IgY 항체일 수 있거나 그 반대일 수 있다. 대안적으로, 추가 분자가 다른 종, 예를 들어, 닭 또는 염소의 항체인 경우, 추가 결합 분자는 적절한 항-종 항체일 수 있다. 이것은 특정 상호작용에 의해 제어 구역에서 결합 분자 또는 추가 분자의 고정화를 허용한다. 추가 결합 분자는 임의의 적절한 수단, 예를 들어, 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 제어 구역에 고정될 수 있다.
본 발명의 모든 양태에 따르면, 시험 샘플은 질 샘플, 선택적으로 질 면봉 일 수 있다. 시험 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 수집될 수 있고 본 발명에 사용하기에 적합한 임의의 형태로 제공될 수 있다. 일반적으로 샘플은 멸균 면봉을 사용하여 수집된다. 더욱이, 본래 공급원으로부터 시험 샘플을 얻는 단계의 일부로 샘플은 본 발명을 사용하여 시험하기 전에 하나 이상의 처리 또는 전처리 단계를 거칠 수 있다. 일 실시형태에서, 샘플은 시험을 위한 용액 또는 현탁액을 생성하도록 처리될 수 있다. 더욱이, 특정 실시형태에서, 시험 샘플은 본 발명을 사용하여 시험하기 전에 임의의 주어진 시간 동안 샘플을 보존하는 수단으로서 예를 들어 약 -20℃에서 냉동 보관될 수 있다.
본 발명은 전형적으로 단리된 샘플에 기초하여 시험관내에서 수행된다는 것을 주목해야 한다. 본 발명의 방법은 일부 실시형태에서 예를 들어, 멸균 면봉을 사용하여 시험을 위한 샘플을 얻는 단계를 포함할 수 있다.
상기 관점에서, 본 발명은 하기 번호의 조항에 의해서 추가로 정의될 수 있다:
1. 하기 서열을 포함하는 펩티드:
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
식 중,
(i) Sial은 시알릴 기이고;
(ii) X3은 글리코실 받개 기를 포함하는 자연 또는 비-자연 아미노산이고;
(iii) X1, X2, X4 및 X5는 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택되되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산임.
2. 조항 1에 있어서, X3은 Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 포스포세린(SEP)으로부터 선택되는, 펩티드.
3. 조항 2에 있어서, X3은 Ser인, 펩티드.
4. 조항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 2개, 3개 또는 4개 모두는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산인, 펩티드.
5. 조항 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5는 적어도 2, 3 또는 4개의 상이한 아미노산을 포함하는, 펩티드.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 소수성 아미노산인, 펩티드.
7. 조항 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 Ala인, 펩티드.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, X1 및 X2는 둘 다 Ala인, 펩티드.
9. 조항 7 또는 8에 있어서, Ala는 DAla 또는 βAla인, 펩티드.
10. 조항 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 Ala인, 펩티드.
11. 조항 10에 있어서, 각각의 하전된 아미노산은 Arg, DAsp 및 LOrn으로부터 선택되는, 펩티드.
12. 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 극성 아미노산인, 펩티드.
13. 조항 12에 있어서, 각각의 극성 아미노산은 LSer, DSer 및 Thr으로부터 선택되는, 펩티드.
14. 하기 서열을 포함하는 펩티드:
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
식 중, Sial은 시알릴 기이고; X1은 존재하지 않거나 Thr이고; X2는 존재하지 않거나 DAla이고; X3은 존재하지 않거나 Nle이고,
X4는 존재하지 않거나 Glu이고; X5는 존재하지 않거나 DAla이고; X6은 존재하지 않거나 Arg이고; X7은 존재하지 않거나 Glu, Arg, Ser, Nva, βAla으로부터 선택되고; X8은 존재하지 않거나 DSer, DAla, SEP, Cyc으로부터 선택되고;
X9는 존재하지 않거나 Nva, BIP, DAla, βAla, Orn으로부터 선택되고,
X10은 Cyc, Ser, Ile, DAla, DSer으로부터 선택되고; X11은 DAla, Pro, Orn, Nle으로부터 선택되고;
X12는 Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 SEP으로부터 선택되고,
X13은 DAla, BIP, βAla으로부터 선택되고; X14는 Arg, DAsp, Nle, Orn, Nva로부터 선택되고,
X15는 존재하지 않거나 Phe, BIP, Ser, Glu, DAla, DSer으로부터 선택되고,
X16은 존재하지 않거나 DSer, Glu으로부터 선택되고;
X17은 존재하지 않거나 Val, Ser, Thr으로부터 선택되고; X18은 존재하지 않거나 Cha이고;
X19는 존재하지 않거나 DSer이고; X20은 존재하지 않거나 Val인, 펩티드.
15. 조항 14에 있어서, X12는 Ser인, 펩티드.
16. 조항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 펩티드는 하기 서열을 포함하는, 펩티드:
(i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg
(ii) Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val
(iii) Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser
(iv) Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu
(v) DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser; 또는
(vi) Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val.
17. 조항 15 또는 16 중 어느 하나에 있어서, Nle, Nva, Orn 및/또는 Cha(존재하는 경우)는 각각 LNle, LNva, LOrn 및 LCha인, 펩티드.
18. 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 펩티드는 하나 이상의 특이적 시알리다제에 의한 절단에 대해서 편향된, 펩티드.
19. 조항 18에 있어서, 1종 이상의 특이적 시알리다제는 박테리아 기원인, 펩티드.
20. 조항 19에 있어서, 박테리아는 프레보텔라, 박테로이데스 및/또는 모빌룬커스 종 및/또는 가드넬라 바지날리스인, 펩티드.
21. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하는데 사용하기 위한 지시약 분자로서, 지시약 분자는,
a) 조항 1 내지 20 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드; 및
b) 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의한 지시약 분자로부터의 시알릴 기의 절단 이후에 온전하게 남아있는 포획 부위를 포함하는, 지시약 분자.
22. 조항 21에 있어서, 포획 부위는 비오틴 분자 또는 옥심 모이어티를 포함하는, 지시약 분자.
23. 조항 21 또는 22에 있어서, 포획 부위는 펩티드의 N- 또는 C-말단에 존재하는, 지시약 분자.
24. 조항 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 포획 부위는 링커에 의해서 펩티드에 부착되는, 지시약 분자.
25. 조항 24에 있어서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함하는, 지시약 분자.
26. 조항 25에 있어서, 펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하거나 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진 링커를 통해 N- 또는 C-말단에서 비오틴 기에 연결되는, 지시약 분자.
27. 조항 21 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 지시약 분자는 하기 구조를 포함하는, 지시약 분자:
(i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴
(ii) 비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val
(iii) 비오틴-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser
(iv) 비오틴-PEG-Asp-Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu
(v) 비오틴-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser; 또는
(vi) 비오틴-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val.
28a. 항체로서, 조항 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체 또는 조항 21 내지 27 중 어느 한 하나에 따른 지시약 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 항체는 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자보다 탈-시알릴화된 유도체에 우선적으로 결합하는, 항체.
28b. 3개의 CDR을 갖는 중쇄 및 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 갖는 항체로서, 중쇄 CDR1은 서열번호 1을 갖고/갖거나; 중쇄 CDR2는 서열번호 2를 갖고/갖거나; 중쇄 CDR3은 서열번호 3을 갖고/갖거나; 경쇄 CDR1은 서열번호 4를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR2는 서열번호 5를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR3은 서열번호 6을 갖는, 항체.
28c. 서열번호 7을 갖는 중쇄 및/또는 서열번호 8을 갖는 경쇄를 갖는, 항체.
"조항 28"에 대한 임의의 언급은 조항 28a, 조항 28b 및 조항 28c를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
29. 조항 28에 있어서, 항체는 에피토프:
Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-비오틴, 보다 특별하게는 에피토프
Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg에 특이적으로 결합할 수 있는, 항체.
30. 조항 28 또는 29에 있어서, 항체는 리포터 분자에 접합되는, 항체.
31. 조항 30에 있어서, 리포터 분자는 금 입자인, 항체.
32. 조항 28에 따른 항체를 생성시키는 데 사용하기 위한 펩티드로서, 펩티드는 조항 1 내지 20 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체인, 펩티드.
33. 조항 32에 있어서, 펩티드는 면역원성을 개선시키기 위해서 담체 단백질에 접합되는, 펩티드.
34. 조항 33에 있어서, 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌에 접합되는, 펩티드.
35. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물로서, 장치는,
(i) 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자;
(ii) 지시약 분자를 고정시키기 위해서, 시험 샘플을 제공받기 위한 포획 구역으로서, 포획 구역은 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 포획 분자를 포함하는, 포획 구역; 및
(iii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 결합 분자를 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
36. 조항 35에 있어서, 장치, 키트 또는 물질의 조성물은 포획 분자가 부착되어 포획 구역을 형성하는 고체 지지체를 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
37. 조항 36에 있어서, 고체 지지체는 샘플이 적용되는 샘플 적용 구역을 더 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
38. 조항 36 또는 37에 있어서, 고체 지지체는 장치, 키트 또는 물질의 조성물을 사용한 검정의 성공적인 완료를 나타내기 위해서 결합 분자에 결합하는 추가 결합 분자를 함유하는, 샘플 적용 구역과 관련하여 포획 구역의 하류에 제어 구역을 더 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
39. 조항 36 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 고체 지지체는 크로마토그래피 매질을 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
40. 조항 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 지시약 분자는 포획 분자에 결합될 포획 부위를 통해서 포획 구역에 고정된, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
41. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
(i) 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
(iii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
(iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
42. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
(i) 시험 샘플을 포획 분자를 포함하는 포획 구역에 첨가하는 단계로서, 상기 포획 분자는 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자의 포획 부위에 결합되어 있고, 상기 포획 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나는 지의 여부에 관계없이 포획 부위에 결합되어 유지되는, 단계;
(ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
43. 조항 42에 있어서, 단계 (i) 이전에, 지시약 분자가 포획 분자를 통해서 포획 구역에 결합되도록 지시약 분자가 포획 구역에 첨가되는, 방법.
44. 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출함으로써 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하는 방법으로서,
(i) 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
(iii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
(iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계로서, 대조군에 비해서 증가된 절단 수준이 세균성 질염을 진단하는, 단계를 포함하는, 방법.
45. 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출함으로써 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하는 방법으로서,
(i) 시험 샘플을 포획 분자를 포함하는 포획 구역에 첨가하는 단계로서, 상기 포획 분자는 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자의 포획 부위에 결합되어 있고, 상기 포획 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나는 지의 여부에 관계없이 포획 부위에 결합되어 유지되는, 단계;
(ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 단계;
(iii) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계로서, 대조군에 비해서 증가된 절단 수준이 세균성 질염을 진단하는, 단계를 포함하는, 방법.
46. 조항 45에 있어서, 단계 (i) 이전에, 지시약 분자가 포획 분자를 통해서 포획 구역에 결합되도록 지시약 분자가 포획 구역에 첨가되는, 방법.
47. 조항 41 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 시알리다제 효소는 프레보텔라, 박테로이데스 및/또는 모빌룬쿠스 종 및/또는 가드넬라 바지날리스로부터 유래되는, 방법.
48. 조항 41 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 방법은 조항 35 내지 40 중 어느 하나에 청구된 바와 같은 장치, 키트 또는 물질의 조성물을 사용하여 수행되는, 방법.
49. 조항 41, 44 또는 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 조항 35 내지 39 중 어느 하나에 청구된 바와 같은 장치, 키트 또는 물질의 조성물을 사용하여 수행되고, 추가로 시험 샘플 및 지시약 분자는 시험 샘플을 장치, 키트 또는 물질의 조성물과 접촉되기 전에 혼합되는, 방법.
50. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 키트로서,
(i) 시험 샘플에 첨가하기 위한 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 지시약 분자;
(ii) 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 분자;
(iii) 포획 분자가 부착되어 포획 구역을 형성하여 시험 샘플을 제공받는 고체 지지체; 및
(iv) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는, 효소 검출 키트.
51. 조항 50에 있어서, 키트는 결합 분자에 결합할 수 있는 추가 결합 분자(대조군 검출 결합제)를 더 포함하는, 효소 검출 키트.
52. 조항 51에 있어서, 고체 지지체는 추가 결합 분자(대조군 검출 결합제)가 부착될 수 있는 샘플 적용 구역과 관련하여 포획 구역의 하류에 제어 구역을 더 포함하는, 효소 검출 키트.
53. 결합 분자는 조항 28 내지 31 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 항체를 포함하는, 조항 35 내지 40 중 어느 하나의 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물, 조항 41 내지 49 중 어느 하나의 방법 또는 조항 50 내지 52 중 어느 하나의 효소 검출 키트.
54. 포획 부위는 비오틴 분자를 포함하고, 포획 구역은 스트렙타비딘 분자를 포함하는, 조항 35 내지 40 또는 53 중 어느 하나의 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물, 조항 41 내지 49 또는 53 중 어느 하나의 방법 또는 조항 50 내지 53 중 어느 하나의 효소 검출 키트.
55. 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하기 위한, 조항 35 내지 40, 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물, 조항 41 내지 49, 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 방법 또는 조항 50 내지 54 중 어느 하나에 따른 효소 검출 키트.
56. 시험 샘플은 질 샘플, 선택적으로 질 면봉인, 조항 21 내지 27 중 어느 하나에 따른 지시약 분자, 조항 35 내지 40, 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물, 조항 41 내지 49, 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 방법, 조항 50 내지 54 중 어느 하나에 따른 효소 검출 키트 또는 조항 55에 따른 용도.
이제 본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 예로서 설명될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 검정의 한 형식의 개략도이다. 형식은 다음과 같은 기본 성분에 의존한다: 고체 지지체(1); 포획 분자(2); 포획 부위(3) 및 본 발명의 펩티드를 포함하는 지시약 분자(펩티드는 Gal-Sial 절단 부위(4)를 포함함); 및 절단(6)이 일어난 후에만 지시약 분자에 결합하는 결합 분자(5)를 포함한다. 지시약 분자 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴(서열번호 11-PEG-비오틴; 본 명세서에서 "MOL600c"라고도 지칭됨)이 예로서 제시된다.
도 2는 본 발명에 따른 효소 검출 장치의 개략도이며, 시알리다제 활성의 부재(도 2a) 또는 존재(도 2b)에서 장치의 작동을 나타낸다.
도 3은 시험 샘플에서 시알리다제 활성 수준이 증가함에 따른 검정의 시각적 판독치(도 2에 도시함)를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 효소 검출 장치의 개략도이다. 이 도면은 카드 성분의 실제 장축 치수 및 각각의 위치를 명시한다.
도 5는 본 발명의 펩티드를 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 커플링하는데 사용되는 2개의 접합 화학의 개략도이다: (A) 시스테인/말레이미드 커플링; (B) 히드라진/벤즈알데히드 커플링.
도 6은 본 발명의 펩티드의 설계 동안 사용된 비-표준 및 비-자연 아미노산의 일부를 도시한다.
도 7은 본 발명의 펩티드를 생산하기 위해 사용된 합성 접근법을 요약한 개략도이다.
도 8은 트랜스시알리다제 및 페투인(시알산 주개)을 사용하는 효소 경로를 통한 본 발명의 시알릴화된 펩티드의 생산을 도시한다.
도 9는 본 발명의 일부로서 합성된 다양한 펩티드 및 펩티드-단백질 접합체를 도시한다. (a) 합성된 펩티드 및 펩티드-단백질 접합체의 표 요약. (b) 합성된 펩티드 및 펩티드-단백질 접합체의 개략도.
도 10은 본 발명의 KLH-펩티드 접합체로의 양의 면역화 후 초기 ELISA 결과를 나타낸다. (a) 검출 방법의 개략도; (b) 내지 (d) 모든 양이 면역화에 반응했음을 나타내는, 첫 번째 채혈의 결과. 번호 1056, 1057, 1058, 1059, 1062, 1063, 1064, 1065, 1066 및 1067은 각각 특정 면역화된 양의 항혈청을 지정한다.
도 11a 내지 도 11c는 도 10에 기재된 양의 두 번째 채혈로부터의 ELISA 결과를 도시한다. 항혈청은 첫 번째 채혈에 비해 두 번째 채혈에서 반응이 증가한 것으로 나타났다.
도 12a 내지 도 12b는 양 CF1062-1067에 대해 비교된 3개의 채혈 모두를 도시한다.
도 13은 항혈청 CF1064가 MOL136 및 MOL136c에 대해 평가되었을 때 ELISA 결과를 도시한다. (a) 검출 방법의 개략도; (b) 시알릴화된 펩티드 MOL136c보다 우선적으로 갈락토실(즉, 탈-시알릴화된) 펩티드 MOL136에 대한 유의한 특이성을 나타내는 ELISA 결과.
도 14는 시알화된 펩티드 MOL136c 또는 음성 대조군(샘플에 펩티드가 포함되지 않음)과 관련하여 관찰된 신호가 거의/전혀 없는 측면 유동 검정을 통해 금-표지된 CF1064를 사용한 탈-시알화된 펩티드 MOL136의 검출을 도시한다.
도 15는 시알화된 펩티드 MOL136c 또는 음성 대조군(샘플에 펩티드가 포함되지 않음)과 관련하여 관찰된 신호가 거의/전혀 없는 측면 유동 검정을 통해 금-표지된 CF1064 및 CF1065를 사용한 탈-시알화된 펩티드 MOL136의 검출을 도시한다.
도 16은 건강한 질 면봉 추출물의 존재 하에서 금-표지된 CF1064의 MOL136 및 MOL136c 결합을 비교하는 측면 유동 검정을 도시한다.
도 17은 25 U/ml의 시알리다제의 존재 하에서 MOL136c의 측면 유동 검정을 도시한다.
도 18은 상이한 친화도 정제된 항혈청 분획 간의 비교를 보여주는 측면 유동 데이터를 도시한다. (a) 선 강도의 그래프 표현; (b) 관찰된 바와 같은 측면 유동 시험 스트립: (1) - 금-감작된 친화도 정제된 다클론성 항체, (2) 교차-반응성 항체가 제거된 금-감작된 친화도 정제된 다클론성 항체, (3) 친화도 정제로부터의 금-감작된 교차-반응성 항체.
도 19는 (a) ELISA에 의한 MOL136, MOL136c, MOL600 및 MOL600c 결합의 비교 및 (b) MOL136/136c와 비교하여 현저한 성능 개선을 보여주는 측면 유동 실험을 나타낸다(도 18 참고).
도 20은 상이한 저장 온도와 두 가지 상이한 열 건조 방법: 스피드 백(speed vac) 및 열 충격 방법(heat block method)에서 폴리프로필렌 튜브에서 열 건조된 MOL600c에 대한 안정성 데이터를 나타낸다. ELISA에서의 측정치를 탈시알릴화 백분율에 정규화하였는데, 그 이유는 그것이 항체에 의한 인식 및 신호 증가로 인해 야기될 것이기 때문이다.
도 21은 MOL600c 배치의 전형적인 데이터를 도시한다. (a) 분석 HPLC 트레이스; (b) 양이온 전기분무 MS 확인.
도 22는 상이한 세파로스 매트릭스를 사용한 항체 정제에 사용되는 컬럼 방법을 보여주는 개략도이다. MOL600 및 MPL600c와 관련하여 표시된 주황색 태그는 비오틴을 나타낸다. MOL615와 관련하여 표시된 자주색 태그는 옥심 기를 나타낸다.
도 23은 37℃에서 12주 동안 저장된 측면 유동 카세트의 안정성 데이터를 도시한다.
도 24는 펩티드 MOL600c와 함께 5분 동안 인큐베이션된 시알리다제 농도의 측면 유동 표준 곡선을 도시한다. 시험 라인을 큐브 판독기를 사용하여 정량하였다.
도 25는 플록 면봉(flock swab)에서 건강한 지원자 질 샘플의 측면 유동 시험을 도시한다. 샘플을 1ml의 샘플 완충액에서 추출하고, 다섯 가지 방식으로 분할하였다. (a) 펩티드가 없는 샘플; (b) MOL600c를 함유한 샘플; (c) 5분 동안 500U/ml에서 MOL600c 및 시알리다아제를 함유한 샘플; (d) 스핀 다운된 MOL600c를 함유한 샘플; (e) MOL600c를 함유하고, 동일한 시알리다제 인큐베이션된 스핀 다운된 샘플.
도 26은 MOL616의 화학식을 도시한다.
도 27은 시알릴화된 형태인 MOL600c와 비교하여 MOL600에 대한 항체 125.1의 특이성을 나타낸 실시예 13의 결과를 도시한다.
도 28은 다양한 상이한 시알리다제 농도를 사용한 검정 A 및 B의 비교를 도시한다. 각각의 시알리다제 농도에 대해, 좌측 막대는 검정 B에 대한 큐브 판독치를 나타내고, 우측 막대는 검정 A에 대한 큐브 판독치를 나타낸다.
도 29는 다양한 상이한 시알리다제 농도 및 판독 시간을 사용한 검정 A 및 B의 비교를 도시한다. 각각의 시알리다제 농도에 대해서, 막대는 좌측에서 우측으로 (i) 5분 판독 시간 후 검정 A에 대한 큐브 판독치. (ii) 10분 판독 시간 후 검정 A에 대한 큐브 판독치; (iii) 5분 판독 시간 후 검정 B에 대한 큐브 판독치; 및 (iv) 10분 판독 시간 후 검정 B에 대한 큐브 판독치를 나타낸다.
도 30은 다양한 상이한 시알리다제 농도, 지시약 농도 및 판독 시간을 사용한 검정 A, A', B 및 B'의 비교를 도시한다. 각각의 시알리다제 농도에 대해, 막대는 좌측에서 우측으로 (i) 디스크당 1 μg/ml의 지시약 분자 및 5분 판독 시간을 사용한 검정 B의 큐브 판독치; (ii) 디스크당 3 μg/ml의 지시약 분자 및 5분 판독 시간을 사용한 검정 B의 큐브 판독치; (iii) 디스크당 1 μg/ml의 지시약 분자 및 10분 판독 시간을 사용한 검정 A에 대한 큐브 판독치; 및 (iv) 디스크당 3 μg/ml의 지시약 분자 및 10분 판독 시간을 사용한 검정 A에 대한 큐브 판독치를 나타낸다.
도 31은 CDR 및 프레임 워크 영역을 나타내는 항체 125.1의 서열을 도시한다.
도 1은 본 발명에 따른 검정의 한 형식의 개략도이다. 형식은 다음과 같은 기본 성분에 의존한다: 고체 지지체(1); 포획 분자(2); 포획 부위(3) 및 본 발명의 펩티드를 포함하는 지시약 분자(펩티드는 Gal-Sial 절단 부위(4)를 포함함); 및 절단(6)이 일어난 후에만 지시약 분자에 결합하는 결합 분자(5)를 포함한다. 지시약 분자 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴(본 명세서에서 "MOL600c"라고도 지칭됨)이 예로서 제시된다.
도시된 형식에서, 포획 분자(2)는 스트렙타비딘이다. 여기서, 포획 분자(2)는 지시약 분자 내의 비오틴 포획 부위(3)에 결합한다.
도 1a에 도시된 바와 같이, 본 발명의 지시약 분자가 시험 샘플에 첨가되면, 샘플에 존재하는 시알리다제 효소가 Gal-Sial 절단 부위(4)를 특이적으로 인식하고, 지시약 분자(6)의 시알릴 기로부터 절단한다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 이러한 절단 이벤트(6)는 특이적 항체 결합 분자(5)에 대한 결합 부위를 생성시킨다. 결합 분자(5)는 절단(6)이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없다. 따라서, 항체 결합 분자(5)는 시알릴 기의 절단의 결과로서 생성된 아미노산 서열 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg에 결합한다. 항체 결합 분자(5)는 절단 전에는 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg 서열에 결합하지 않는다(도시되지 않음).
도 2는 본 발명에 따른 효소 검출 장치의 개략도이며, 시알리다제 활성의 부재(도 2a) 또는 존재(도 2b)에서 장치의 작동을 나타낸다. 시험 스트립은 상부에서 장치의 다른 성분이 조립되는 접착제 라이너(1)를 포함한다. 우측에서 좌측으로, 샘플 적용 구역(2)은 흡수 패드의 형태이다. 이것은 표지된 결합 분자(7)가 함침된 접합 패드(3)와 부분적으로 겹치게 놓인다. 대안적인 실시형태에서, 표지된 결합 분자는 샘플 적용 영역에 함침될 수 있고, 이는 별도의 접합체 패드에 대한 필요성을 제거한다. 접합 패드(3)는 니트로셀룰로오스 막(4)과 유체 연결되어 있다. 니트로셀룰로스 막(4)은 포획 구역을 한정하는 고정된 스트렙타비딘 분자(5)를 포함한다. 막(4)은 추가로 표지된 분자(11)에 결합하는 포획 구역의 하류에 고정된 추가 결합 분자(6)를 추가로 함유하며, 이는 샘플과 함께 장치를 통과하여 별도의 제어 구역을 형성한다. 대안적으로, 고정된 추가 결합 분자는 표지된 결합 분자(7)에 결합할 수 있다. 장치는 장치의 단부에 도달하는 임의의 시험 샘플 및 시약을 흡수하기 위한 흡수 패드(8)를 선택적으로 추가로 포함한다.
사용 시, 지시약 분자(9)는 시험 샘플이 장치의 샘플 적용 영역(8)과 접촉하기 전에 시험 샘플에 첨가된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 시험 샘플에서 시알리다제 활성이 없는 경우 시알릴 기는 지시약 분자(9)로부터 절단되지 않는다. 접합 패드(3)로 샘플이 유동하면, 결합 분자(7)는 시알릴 기의 절단이 발생하지 않았기 때문에 지시약 분자(9)에 결합할 수 없다. 지시약 분자는 스트렙타비딘(5)과 지표 분자(9)의 비오틴 포획 부위(10) 간의 상호작용을 통해 포획 영역에서 결합된다. 표지된 결합 분자(7)는 지시약 분자(9)에 결합할 수 없기 때문에 포획 영역에 고정되지 않는다. 따라서, 표지된 결합 분자는 제어 구역 및 이 구역을 지나서 유동한다. 추가로 표지된 분자(11)는 또한 장치를 통해, 고정된 추가 결합 분자(6)에 결합하여 고정되는 제어 구역을 통과한다. 따라서 시알리다제 활성의 부재는 제어 구역에서만 신호로 표시되고, 포획 구역에서는 표시되지 않는다. 표지된 결합 분자(7)를 잠재적으로 함유하는 과량의 샘플이 흡수 패드(8)로 유동한다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 시험 샘플에서 시알리다제 활성이 존재하는 경우 시알릴 기는 지시약 분자(9)로부터 절단된다. 접합 패드(3)로 샘플이 유동하면, 결합 분자(7)는 시알릴 기의 절단이 발생하였기 때문에 지시약 분자(9)에 결합할 수 있다. 지시약 분자는 스트렙타비딘(5)과 지표 분자(9)의 비오틴 포획 부위(10) 간의 상호작용을 통해 포획 영역에서 결합된다. 표지된 결합 분자(7)는 절단 부위에서 탈-시알릴화된 지시자 분자(9)에 결합하기 때문에 포획 영역에서 고정된다. 포획 구역에서 결합 부위에 대한 표지된 결합 분자(7)의 상대적인 과량으로 인해, 일부 표지된 결합 분자(7)는 여전히 제어 구역 임 이 구역을 지나서 유동한다. 추가로 표지된 분자(11)는 또한 장치를 통해, 고정된 추가 결합 분자(6)에 결합하여 고정되는 제어 구역을 통과한다. 따라서 시알리다제 활성의 존재는 포획 영역과 제어 영역 모두에서 신호로 표시된다. 과량의 샘플은 흡수 패드(8)로 유동한다.
제어 영역은 선택적이라는 것을 주목해야 한다. 샘플에서 시알리다제 활성의 유무는 포획 구역에서 해당 신호의 유무에 따라서만 모니터링될 수 있다.
도 3은 시험 샘플에서 시알리다제 활성 수준이 증가함에 따른 검정의 시각적 판독치(도 2에 도시함)를 도시한다. 쉽게 인지될 수 있는 바와 같이, 시알리다제 양이 증가함에 따라 제어 영역(1)의 신호는 일정하다. 대조적으로 시알리다제 양이 증가하면 포획 영역(2)의 신호가 또한 증가한다. 이것은 시알리다제 활성에 의해 절단 부위에서 지시약 분자로부터 시알릴 기가 절단되기 때문이다. 이것은 결합 부위를 나타내며, 포획 영역을 한정하는 포획 분자와 지시약 분자의 포획 부위 사이의 상호작용을 통해 포획 영역(2)에서 검출된 결합 분자의 결합을 가능하게 한다.
도 4는 본 발명에 따른 하나의 특이적 효소 검출 장치의 개략도이다. 하기 표는 도면에 대한 범례를 제공하고, 이 도면은 이러한 특정 실시형태에서 카드 성분의 실제 장축 치수 및 각각의 위치를 명시한다. 물론, 치수 및 위치는 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이 달라질 수 있다.
Figure pct00005
본 발명은 하기 실시예를 참고로 추가로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 검정 화학 원리 및 실험 설계
요약하면, 원리는 시알리다제 반응의 화학 생성물에 대한 항체 인식을 기반으로 작동하며, 여기서 화학 기질은 시알리다제와 반응하도록 특별히 설계된 펩티드이고, 이어서 반응 생성물은 그 합성 생성물에 대해 생성되는 항체에 의해서 인식된다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 시알산을 함유하고 비오틴 태그가 있는 글리코펩티드가 제공된다. 시알리다제 활성을 포함하는 시험 샘플과 접촉할 때 시알릴 기는 시알리다제에 의해 글리코펩티드로부터 절단되어 펩티드 상에 펜던트 갈락토실 기를 노출한다. 이어서 탈-시알릴화된 생성물에 대해 발생된 항체는 절단된 생성물에 특이적으로 결합한다. 항체-금 접합체 및 스트렙타비딘 시험 라인이 있는 측면 유동 스트립을 사용함으로써 탈-시알릴화된 생성물의 존재는 적색 선으로 검출되고, 샘플에서 시알리다제 활성을 직접 측정할 수 있다.
5개의 펩티드를 본래 설계하였고, 생성된 후속 항체를 측면 유동 검정에서 성능에 대해 평가하고, 프로파일링하였다. 최적화된 조건 하에서 항체 중 일부는 기질 펩티드에 대한 교차 반응성 및 검정에서 전체 신호 수준 측면에서 다른 항체를 능가하는 것으로 나타났다. 프로젝트의 타당성 단계에 대해 아래에 설명된 평가에서 펩티드를 재평가하고 최고의 성능을 가진 펩티드/항체 조합을 추가 개발에 적용하였다.
실시예 2: 펩티드 설계
후보 펩티드 서열의 설계에서 다음과 같은 여러 요인을 고려하였다.
크기
일반적으로 분자량(MW)이 5000 달톤 미만인 분자는 숙주 유기체에서 좋은 면역 반응을 자극할 가능성이 낮다. 펩티드는 훨씬 더 효과적인 면역원을 생성하는 KLH(키홀 림펫 헤모시아닌)에 접합시킬 의도로 비교적 짧은 서열로 계획되었다. 성능의 잠재적인 변화를 커버하기 위해 다양한 상이한 길이(9 내지 20개 아미노산)를 제안하였다.
접합 화학
두 가지 상이한 접합 화학을 사용하였다. 2개의 펩티드의 경우, 시스테인 표지를 구조에 통합하여 표준 말레이미드 기반 화학을 사용하여 담체 단백질에 접합할 수 있다. 나머지 3개의 펩티드의 경우, 상대적으로 새로운 히드라진 기반 화학을 사용하였는데, 이것은 커플링 전 펩티드의 산화 위험이 적고 UV 흡광도로 커플링 정도를 쉽게 모니터링할 수 있기 때문에 시스테인 화학보다 더 제어 가능한 공정이다. 이러한 접합 화학의 개요를 도 5에 도시한다.
갈락토스 당의 위치
목표는 갈락토스 당과 펩티드의 주변 영역에 매우 높은 친화성을 갖는 항체를 얻는 것이었다. 이를 염두에 두고, 다른 구별되는 펩티드 특징부가 양호하게 측접하도록 당을 구조의 중앙에 배치하도록 결정하였다. 이 접근법은 당 모이어티와의 상호작용이 부족한 주변 결합 항체를 최소화하기를 원하는 것이었다.
구조적 다양성
다양한 펩티드 서열을 작제하는데 다양한 아미노산을 사용하였다. 서열을 따라서 하전된 기, 친수성 기 및 소수성 기를 순서대로 조합함으로써, 다양한 토폴로지가 촉진될 것이다. β-알라닌과 같은 "힌지 기"를 또한 전체 구조적 접힘에서 추가 자유도를 허용하기 위해 사용하였다. 이 외에 서열 다양성을 추가하고 면역 반응을 촉진시키기 위해 비자연 아미노산을 사용하였다. 프로테아제에 대한 감수성을 줄이기 위해, 일부 D-아미노산도 혼입하였다. 사용된 비-표준 및 비-자연 아미노산 중 일부를 도 6에 도시한다.
이들 인자를 고려한 후, 추정 에피토프로서 하기 펩티드 서열을 선택하였다.
Figure pct00006
스페이서, 접합 기 및 비오틴 표지를 C 또는 N 말단에 첨가하였다.
실시예 3: 펩티드 합성
자동화 마이크로파 합성기에서 고체상 화학 방법을 사용하여 갈락토스 표지된 펩티드를 합성하였다. 모든 펩티드를 역상 HPLC를 사용하여 정제하고, Electrospray LCMS로 특징규명하였다. 갈락토스 모이어티를 시알산으로 표지하기 위해, 시알산 주개로서 티. 크루지(T. cruzi)(TcTS) 및 페투인으로부터의 재조합 트랜스시알리다제를 사용하는 효소 경로를 사용하였다. 도 7 및 도 8은 사용된 합성 접근법을 요약한다.
담체 단백질에 접합하기 위한 관련 펩티드 면역원뿐만 아니라 각각의 서열의 2종의 비오티닐화된 유도체를 또한 합성하였는데, 하나를 시알산으로 표지하였다. 이러한 비오티닐화된 유도체는 측면 유동 검정 형식에 대한 기초를 형성할 것이다. 도 9는 다양한 면역화에 따라 이 작업을 위해 합성된 펩티드를 도시한다. 시알산으로 표지된 펩티드를 'c'로 표시한다; 예를 들어, MOL136c. 시알릴 기가 없는 펩티드는 이러한 지정이 없다(예를 들어, MOL136).
실시예 4A: 항체 생성
면역화
5종의 펩티드 면역원 모두를 적절한 커플링 화학을 사용하여 KLH 및 BSA에 커플링시켰다(도 9 참고). KLH 접합체를 10마리의 양(펩티드당 2 개)에 면역화하기 위해 Micropharm Ltd에 제출하였다. 프로그램은 PBS에서 1mg의 KLH-펩티드 용량으로 시작되었다. 3개월의 기간에 걸쳐 0.5mg의 추가 부스터 3개를 투여하였다. 이 기간 동안 3개의 개별 혈액(샘플 1개 및 생산 혈액 2개)을 채취하여 Mologic에 공급하였다. 다양한 혈액의 스크리닝을 수행하기 위해 BSA 접합체를 유지하였다.
초기 ELISA 스크린
폴리스티렌 고 결합 다중 웰 플레이트를 적절한 BSA 접합체 및 비-접합 BSA를 대조군으로 사용하여 감작시켰다. 혈청 샘플을 BSA 차단 웰에서 다양한 희석액에서 인큐베이션시키고, 알칼리성 포스파타제(AP)에 접합된 2차 항-양 항체와 추가로 결합시켰다. 파라-니트로페닐포스페이트(pNPP) AP 기질과의 인큐베이션은 임의의 결합의 존재를 나타냈다 모든 경우에서 완충액, BSA 및 사전 채혈 대조군은 플레이트에 배경 결합을 바인딩을 생성하지 않았다. 도 10a는 검출 방법의 개략도를 도시한다. 도 10b 내지 도 10d는 모든 양이 면역화에 반응했음을 나타내는, 첫 번째 채혈의 결과를 도시한다. 1/1000의 혈청 희석은 높은 신호를 제공하는 반면 BSA의 대조군은 음성이어서 펩티드 특이적 반응을 확인해주었다. 사전 채혈 대조군도 음성이었다.
추가 채혈이 가능해짐에 따라, 이것을 ELISA로 분석하였는데, 이는 시간에 따라서 반응의 향상을 나타낸다. 도 11은 모든 양에 대한 처음 2회의 채혈 사이의 관계를 도시하며, 도 12는 양 CF1062-1067과 비교한 3회의 채혈 모두를 도시한다. 흥미롭게도 세 번째 채혈은 항원에 대한 전반적인 반응 측면에서 정체되거나 감소된 것처럼 보인다. 그럼에도 불구하고 일부 경우에는 결합 반응이 1/1000000 희석에서 검출되었는데, 이는 펩티드에 매우 민감한 다클론성 반응을 시사한다. 세 번째 채혈에서 약간 낮은 반응에도 불구하고, 이들은 매우 특이적인 항체의 하위 집단을 포함할 가능성이 가장 높기 때문에 친화도 정제에 바람직하였다.
실시예 4B: 항혈청 CF1064 및 CF1065 및 MOL136 및 MOL136c의 검출
면역원: KLH-MOL123A
비오티닐화된 펩티드: MOL136(갈락토실); MOL136c(시알릴)
두 양 모두 CF1064를 사용한 KLH-MOL123A로의 면역화에 잘 반응하여 전체적으로 약간 더 강한 반응을 제공하였다(도 11B 참조). ELISA 형식(개략도는 도 13a에 도시됨)에서, CF1064의 결합을 MOL136 및 MOL136c에 대해 평가하였는데, 이는 시알릴화된 펩티드 MOL136c보다 우선적으로 갈락토실(즉, 탈시알릴화된) 펩티드 MOL136에 대한 상당한 특이성을 나타난다(도 13b). 따라서, 항혈청 CF1064에 의한 두 펩티드의 탁월한 구별이 입증되었다.
유사한 특성이 측면 유동 형식에서 관찰되었다. CF1064를 최적화된 조건(10mM 붕산나트륨 완충액 중의 15 μg/ml 로딩, pH 8.0)에서 금 입자에 접합하고, 1.3 ng/ml(스트립당 38 pg)의 최종 농도에서 MOL136 및 MOL136c에 대해 검정하였다. 따라서, 먼저 1.5 mg/ml 스트렙타비딘을 사용하여 각각의 측면 유동 시험 스트립에 포획 구역을 형성하였다. 그런 다음, 각각의 펩티드(PBST 중의 12.5 ng/ml 펩티드) 3 μl를 금-표지된 CF1064 10μl 및 전개 완충액 15 μl(pH 7.5에서 0.5M Tris + 3% BSA + 0.5% Triton X-100)와 혼합하고, 그 후 각각의 샘플을 별도의 측면 유동 시험 스트립을 따라 전개시켰다. 펩티드가 첨가되지 않은 음성 대조군을 또한 음성 대조군으로 전개시켰다. 이어서 15 μl의 전개 완충액 세척을 각각의 측면 유동 시험 스트립을 따라 수행하였다. 탈-시알릴화된 펩티드 MOL136은 포획 구역에서 명확하게 검출되었으며, 시험 스트립에서 가시적인 선으로 관찰되었다. 반대로, 시알릴화된 펩티드 MOL136c 또는 음성 대조군과 관련하여 신호가 거의/전혀 없었다(도 14 참고).
유사한 결과가 금-표지된 CF1065를 사용하여 관찰되었으며, CF1064에 비해 CF1065에 대해 더 높은 신호 수준이 관찰되었다(도 15 참고).
실시예 5: 건강한 질 면봉 추출물의 존재 하에서 CF1064를 사용한 MOL136 및 MOL136c 검출
건강한 질 면봉 추출물의 존재 하에서 실시예 4B에 기재된 절차를 반복하였다. 신호 수준이 약간 낮았지만, MOL136에 대한 특이성은 면봉 매트릭스의 어떠한 간섭 없이도 유지되었다(도 16 참고).
실시예 6: MOL136c 및 CF1064를 사용한 시알리다제 활성의 검출
25 U/ml 시알리다제의 존재 하에서 실시예 4B에 기재된 절차를 반복하였다. 시알리다제가 없는 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플에 펩티드 및 시알리다제가 포함되지 않은 추가 음성 대조군을 전개시켰다. 양성 대조군으로서, 25 U/ml 시알리다제의 존재 하에 MOL136c 대신에 MOL136을 사용하였다. PBST에서 5분 동안 25 U/ml 시알리다제의 존재 하에서 인큐베이션된 MOL136c에 대해 명확한 양성 신호가 관찰되었다. 신호의 수준은 추정되는 최대 신호를 보여주는 양성 대조군의 강도와 유사하였다. 예상된 바와 같이, 음성 대조군과 관련하여 신호가 거의/전혀 관찰되지 않았다(도 17 참고).
전반적으로, CF1064 및 CF1065 모두 갈락토실(즉, 탈-시알릴화된) 펩티드 MOL136에 대해 우수한 특이성을 보였으며, 둘 다 단클론성 스크리닝을 위한 잠재적 후보이다.
실시예 7: 펩티드 개발
펩티드와 항혈청을 평가한 후, 혈청 CF1064와 펩티드 MOL136 및 MOL136c가 시험에 가장 적합한 조합을 제공하는 것으로 나타났다. 양 CF1064는 MOL136과 동일한 펩티드 서열로 면역화되었지만, 비오틴 대신 시스테인-말레이미드 화학을 사용하는 KLH 접합체로 면역화되었다.
MOL136: 비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva -Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val-OH
MOL136c: 비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val-OH
항혈청을 정제하기 위해, 스트렙타비딘 컬럼을 사용하여 MOL136 및 MOL136c를 포획하는 방법을 고안하였다. 이어서, 항체를 결합시키고, MOL136 컬럼에서 용출시키고, MOL136c 컬럼으로 흡수시켜 두 구조 사이의 공통 에피토프를 픽업하는 주변 결합제를 제거하였다. 측면 유동에서 정제된 항체를 평가함으로써 원래의 갈락토실 펩티드 항원에 대한 전반적인 특이성 및 시알릴화된 펩티드에 대한 교차 반응 정도를 측정하였다(도 18). 이것은 프로토타입의 음성 결과에서 관찰된 비특이적 결합의 양을 나타내며, 사용 시에 광학 판독기 없이 육안으로 인지하지 못하도록 크게 감소될 필요가 있기 때문에 중요하다.
정제 및 흡수된 분획은 비-흡수 물질과 비교할 때 검정에서 가장 양호하게 수행되었다. 상당히 낮은 배경 신호에도 불구하고 펩티드 구조를 절단하여 성능을 향상시키기 위해 추가 방법 개발이 필요하였다.
펩티드 설계를 개선하고 펩티드에서 갈락토스 모이어티에 결합하지 않는 항체의 주변 상호 작용을 제거하기 위해서, 본래 서열 MOL136을 더 짧은 서열 MOL600으로 절단하였다:
MOL600: NH2-Cyc -DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-비오틴
MOL600c: NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴
이어서, MOL600 및 MOL600c를 ELISA 및 측면으로 검정하였는데, 이는 성능이 상당히 향상되었음을 보여주었다(도 19 참고).
실시예 8: MOL600c 제형/안정성 연구 및 규모 확대 생산
MOL600c 펩티드가 어떻게 제형화될 수 있는지를 평가하기 위해서, 연구를 설정하여 건조 조건을 조사하였다. 펩티드를 건조 완충액 중에서 제형화하고, 공기 건조하고, 프로토타입 형식으로 사용하기 전에 실온에서 저장하였다. 데이터를 도 20에 도시하는데, 이것은 상이한 온도 및 상이한 다른 건조 방법으로 폴리프로필렌 튜브에 저장된 펩티드 MOL600c의 안정성을 입증한다. 펩티드는 전체적으로 4주까지 기능을 유지했지만 성능은 8주에 감소하는 것으로 보인다.
제조를 위해, 펩티드 합성은 규모 확대 가능한 것으로 나타났으며, 제조 배치까지 확대할 수 있다. 펩티드는 자동화 시스템에서 고체상 합성에 의해 생성되고, 그 다음 HPLC로 정제된다. 두 가지 추가 화학 단계가 필요하며, 순도 95% 초과의 사양으로 HPLC에 의한 추가 최종 정제가 필요하다. 생성물은 전기분무 질량 분석법으로 확인된다. 시험당 12 ng의 펩티드만 필요하므로 펩티드의 1 내지 2mg 배치는 적절한 크기를 갖는다. 도 21은 완결된 MOL600c 배치의 일반적인 분석 데이터를 나타낸다.
실시예 9: 항체 정제 개발
최적화된 절두된 펩티드 시스템과 함께 항혈청 CF1064와 함께 사용되는 정제 공정이 최초로 개발되어 MOL600이 충전된 스트렙타비딘 컬럼과 MOL600c가 충전된 흡수 컬럼에서 작동하였다. 이 공정은 우수한 교차 반응성 기능을 갖는 효과적인 항체를 생산하지만, 일관성을 개선하고, 자동화를 위한 수동 단계의 수를 줄이기 위해서 추가 개선이 필요하였다.
단일 패스를 사용하는 보다 개선된 방법을 탐색하기 위해서, 다른 컬럼 형식을 시도하였으며, 실행 가능하고 자동화 가능성이 있는 것으로 나타났다(도 22). 2개의 상이한 컬럼 유형을 사용하였으며, 검정에서 비-특이적 결합을 줄이기 위해 원치 않는 상호작용을 정리하는 단일 패스 방법에서 사후-흡수 방법까지 공정이 달라졌다. 제조를 위한 최상의 선택은 단일 패스 공정이며, 이는 담체 BSA에 접합된 펩티드 MOL615를 사용하여 달성하고, 이어서 NHS 세파로스 컬럼 상에서 유도체화될 수 있다.
MOL615: NH2-Cyc -DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-옥심
프로토타입의 항체 성분을 측면 유동 어셈블리 내에서 접합 패드 내에서 건조된 금 접합체로 제형화한다. 금 결합체 안정화를 위한 조건이 설정되어 있으며, 추가로 최적화하였다. 시험당 요구되는 것으로 계산된 항체의 양은 85ng로 추정되며, 이는 CE 마킹을 달성하는 필수 검증 배치를 생성하기에 충분하다. 장기적으로, 추가적인 다클론성 시약을 개발해야 하고, 보다 영구적인 해결책으로서 단클론성 시약을 개발해야 할 것이다. 새로운 면역화가 시작되었고, 강력한 항체 역가가 이미 펩티드 표적에 대해 식별되었다(도 10). 상용 하이브리도마 기술 및 또한 인 하우스 파지 패닝 및 팹 생성(Mologic York 및 Scotia Biologics)을 포함한 여러 선택이 단클론성 생성을 위해서 사용될 것이다.
실시예 10: 샘플 완충액
면봉에서 샘플 추출, 펩티드 용해 및 시알리다제에 대한 최적의 분해 조건은 샘플 완충액의 주요 요구 사항이다. 하기 제형을 사용하였다:
100mM 아세트산나트륨, 2mM 염화칼슘, pH 6.0. 0.1% BSA, 0.125% Tween-20 및 0.375% Triton X-100 함유
이 완충액은 장치를 건식으로 실행하고, 스파이크 회수에서 실제 샘플을 추출하는 데 성공적으로 사용되었다.
실시예 11: 측면 유동 장치
측면 유동 장치는 도 4에 따라 구성되었다.
측면 유동 장치의 배치는 12주 동안 37℃에서 안정성을 평가하였다. 6주 후, 신호는 이전 측정보다 값이 향상되었지만 곡선의 모양과 동적 범위는 비교적 일관된 것으로 나타났다(도 23 참조).
실시예 12: 검정 최적화
실행 가능한 성능을 만족시키기 위해서, 분석 시간 길이, 마커에 대한 반응 감도, 라인 신호 강도 및 표준 곡선의 품질과 같은 사양 요소를 평가하였다.
검정은 5분의 인큐베이션 시간으로 작동하는 것으로 밝혀져 있다. 이것은 면봉 샘플 수집에서부터 결과 판독까지 15분 이내에 검정의 총 시간을 유지한다. 체외 진단 산업에서 일반적으로 15분은 현장 진료 신속한 시험의 상한으로 사용된다.
마커(시알리다제)의 전체 관련 범위는 4 U/ml 내지 250 U/ml로 여겨진다. 이는 형광 시알리다제 참조 검정과 관련하여 샘플 데이터 세트의 확산을 추정함으로써 문헌에 기초한다(문헌[Marconi et. al., European Journal of Obstetrics and Gynaecology and Reproductive Biology, 2013, vol. 167, pages 205-209]). BV 조건에서와 같이 약 20개의 상이한 박테리아 종이 조건과 관련되어 있기 때문에 샘플에 다수의 상이한 표현형(박테리아 시알리다제)이 존재할 것이라는 가정이 이러한 접근법에서 만들어졌다. 이 검정은 완충액에서 이러한 범위의 시알리다제에 걸쳐 시험되었으며, 이 범위를 나타내는 표준 곡선은 측면 유동에서 달성되었다(도 24).
이 검정은 또한 실제 건강한 샘플에서 시험되었으며, 시알리다제를 스파이킹함으로써 신호가 회복되었다. 샘플의 스핀 다운 여부는 차이를 나타내지 않았다. 시험 라인의 외관은 샘플 매트릭스의 존재에 의해 부정적인 영향을 받지 않았다(도 25). 샘플이 충분한 이동성을 갖기 위해서, 샘플이 너무 높은 점도를 유지하기 때문에 0.5ml의 희석 샘플 완충액이 너무 농축된 것으로 밝혀졌다. 현재 1ml가 사용할 적절한 양의 완충액으로 간주된다.
실시예 13 추가 항체 생성
MOL616로 지정된 하기 펩티드를 추가 항체를 생성시키기 위해서 선택하였다:
Dpr(AOA)-dSer-Nva-Cyc-dAla-Ser(Gal)-dAla-Arg-Phe-dSer-Val-NH2.
MOL616의 화학식을 도 26에 도시한다.
펩티드는 KLH에 결합되어 KLH-MOL616으로 지칭된 면역원을 생성하였다. 토끼(Oryctolagus cuniculus)를 KLH-MOL616으로 면역화하고, 비장 세포를 포획하고, 이 펩티드의 절두된 버전(MOL615, BSA에 접합됨)으로 스크리닝하였다. 카운터 스크린은 펩티드 MOL615, MOL615c의 시알릴화된 형태로 수행되었다. 스크리닝 공정은 다클론성 스크린에, 그 다음 서브클론 스크린을 거쳐 디시알릴화된 형태에 특이적인 항체를 산출하였다.
이러한 공정은 항체 125.1로 지칭된 단클론성 항체의 생성으로 이어졌다. 이 항체는 탈시알릴화된 분자Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-옥심에 존재하는 에피토프, 더욱 특히 탈시알릴화된 펩티드 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg에 존재하는 에피토프에 대해 특이적이다.
MOL615를 비오티닐화하여 MOL600(실시예 7에 제공된 서열)을 산출하고 항체 결합 친화성 및 동력학을 생체-침투 측정법을 사용하여 측정하였다. 간략하면, MOL600 또는 MOL600c를 스트렙타비딘/비오틴 상호작용에 의해 바이오 센서에 고정하였다. 항체의 결합을 반사광 간섭의 이동에 의해 검출하였다.
상이한 농도의 항체 125.1(각각 1, 2, 4, 8 또는 16 nM)을 사용하여 항체 125.1에 대해 다음과 같은 결합 친화성 및 동력학을 결정하였다:
KD = 7.9 nM; Kon = 54080M-1s-1; Koff = 0.000427 s-1
결합은 도 27에 나타낸 바와 같이 시알릴화된 형태 인 MOL600c와 비교하여 MOL600에 대해 명확하게 특이적이었다.
항체를 서열분석하였고, 감마 중쇄 및 카파 경쇄를 갖는 것으로 결정되었다. 이 항체의 서열을 도 31에 도시하고, 하기에 열거한다.
항체-중쇄
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYSMDWVRQAPGKGLEWVGGITTTLHTFYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTDDAATYFCARGGSSVIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHEDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPG(서열번호 7)
항체-경쇄
ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYGNNHLNWHQQKRGQPPKQLIGSASRLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYNGAWYVAFGGGTELEIKRDPVAPSVLLFPPSKEELTTGTATIVCVANKFYPSDITVTWKVDGTTQQSGIENSKTPQSPEDNTYSLSSTLSLTSAQYNSHSVYTCEVVQGSASPIVQSFNRGDC(서열번호 8)
중쇄 CDR 서열
CDR1 GFSLSSY(서열번호 1)
CDR2 TTTLH (서열번호 2)
CDR3 GGSSVI(서열번호 3)
경쇄 CDR 서열
CDR1 QSSQSVYGNNHLN(서열번호 4)
CRD2 SASRLAS(서열번호 5)
CDR3 QGSYYNGAWYVA(서열번호 6)
주목할 만한 관찰:
추가적인 O-연결된 글리코실화 부위는 213번 위치와 216번 위치 사이의 중쇄 불변 영역에서 검출되었다. 겔 영상으로부터, 이 부위에서 글리코실화된 형태는 비(非)글리코실화된 형태와 풍부도가 유사하다.
N-연결된 글리코실화는 중쇄 불변 영역 N@285에서 검출되었다.
중쇄의 N- 말단에서 Pyro-Glu(Q) 변형을 관찰하였다.
중쇄에서 규칙적인 불변 영역 서열로부터 C-말단 라이신의 제거를 관찰하였다.
실시예 14 추가 분석 최적화
추가 최적화를 위해 2종의 상이한 시알리다제 활성 검정(A 및 B, 아래 참조)을 비교하였다. 검정 설정은 본질적으로 도 2와 관련하여 설명된 것과 같았다.
시험 항체를 금에 접합시키고, 본 명세서에서 "접합체 패드"라고 지칭되는 담체 상에서 건조시켰다. 검정 A에서 시험 항체는 "1064 정제된 Mol615 항체", 즉, Mol615를 사용하여 혈청 1064로부터 정제된 다클론성 항체였다. 검정 B에서 시험 항체는 "125.1"로 지칭된 단클론성 항체였다(실시예 13 참고).
대조군 항체를 또한 금에 접합시키고, 접합 패드 상에서 건조시켰다. 검정 B의 경우, 이것은 Lampire에서 공급하는 Chicken IgY, 제품 코드 7401403이었다.
포획 분자(폴리스트렙타비딘)는 니트로셀룰로스 막에 고정되어 포획 라인을 형성하였다. 별도의 대조군 포획 라인을 형성하였다. 검정 B의 경우, 이것은 항-치킨 IgY 항체(Lampire에서 공급, 제품 코드 7455207)였다.
접합체 패드를 도 2와 같이 니트로셀룰로오스에 적층하였다.
시험 지시약 분자인 NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴(MOL600c)을 준비하고, 1 μg/ml 또는 3 μg/ml를 불활성 다공성 물질(Porex 디스크) 상에서 동결 건조시켜 36 ng의 지시약 분자 또는 디스크당 108 ng의 지시약 분자를 각각 포함하는 지시약 기질 디스크를 생성하였다.
시알리다제를 50, 12.5 및 1.56 U/ml 농도에서 시험하였다. 펩티드 디스크 및 분석 완충액을 사용하는 음성 표준품도 수행하였다. 큐브 판독치 및 시각적 척도에 대해 응답을 측정하였다.
하기 기본 프로토콜을 사용하였다:
모든 용액이 실온에 있고 잘 혼합되어 있는지 확인한다.
50, 12.5 및 1.56 U/ml 시알리다제 완충액 표준 용액으로 원하는 각각의 조건을 시험한다.
모든 표준품 및 시알리다제 완충액을 3회 시험한다.
1000 μl의 시알리다제 표준품을 지시약 기질 디스크와 함께 추출 튜브에 첨가한다. 뚜껑과 캡을 제자리에 접어 튜브를 밀봉한다. 튜브를 부드럽게 교반하고, 지시약 기질 디스크로 5분 동안 인큐베이션시킨다.
추출 튜브에서 4방울을 장치에 샘플 패드에 첨가한다.
큐브 판독기(독일 D-12489 베를린 슈바르츠실트스트라쎄 1에 소재한 OpTricon GmbH(Chembio Diagnostic systems)로부터의 Optricon 판독기)를 사용하여 5분 또는 10분에 판독하고
시험 및 제어 라인 신호를 기록한다.
시험 검정의 특징을 하기에 제시한다.
Figure pct00007
(i) (i) 판독 시간 비교
바람직한 결과는 10분 시험, 5분 인큐베이션 후 5분 판독 시간을 갖는 것이다. 결과에 대한 판독 시간의 효과를 조사하기 위해 5분 및 10분에 결과를 판독하였다. 결과를 도 28에 도시한다. 인지될 수 있는 바와 같이, 검정 A는 검정 B가 5분의 판독 시간만을 필요로 하는 하단 표준에 대한 올바른 응답을 충족하기 위해 10분의 판독 시간이 필요하다. 검정 B는 10분의 판독 시간으로 크게 이익을 얻지 못하는 것으로 보이며; 5분 판독으로 10분 시험의 바람직한 결과를 충족한다.
(ii) 감도 비교
검정 B의 결과는 5분 후에 판독하였고, 검정 A의 결과를 10분 후에 판독하였다. 결과를 도 29에 도시한다.
검정 B는 50 U/ml, 12.5 U/ml 및 1.56 U/ml 표준품에서 검정 A에 비해 더 높은 큐브 판독치를 나타내고, 0 U/ml 표준품에 대해서 더 낮은 큐브 판독치를 나타낸다. A와 B는 둘 다는 각각의 표준품에 대해 올바른 반응을 제공하며, CV%는 사양 내에 존재한다. 검정 B는 더 짧은 장치 개발 시간 후 표준품에 대한 큐브 판독치를 제공하고, 0 표준품에 대해 더 낮은 큐브 판독치를 제공한다. 따라서, 검정 B는 검정 A보다 우수하다.
(iii) 펩티드 농도의 효과
검정 A와 검정 B를 서로 그리고 상이한 펩티드 농도를 갖는 변이체와 비교하였다. 검정 A'는 검정 A에 상응하였지만, 펩티드 농도는 3 μg/ml(디스크당 108 ng)였고; 검정 B'는 검정 B에 상응하였지만, 펩티드 농도는 1μg/ml(디스크당 108 ng)였다.
검정 B 및 B'의 결과는 5분 후에 판독하였고, 검정 A 및 A의 결과를 10분 후에 판독하였다. 결과를 도 30에 도시한다. 펩티드 농도가 높을수록 더 양호한 결과가 제공되었고, 1 μg/ml(디스크당 108ng 초과)의 펩티드 농도가 바람직하다.
결론:
검정 B는 항체에 일어난 변화 및 펩티드 농도의 증가로 인해 검정 A에 대한 성능을 더 짧은 시간에 향상시켰다.
실시예 15 -추가 검정 최적화
금 광학 밀도
금 접합체 분사 농도를 OD4에서 OD6 또는 OD8로 증가시키는 효과를 조사하였고, OD6 금은 OD4에 비해 시험 라인 신호가 약간 증가한 반면, OD8은 3.125U/mL 시알리다제에서 OD4의 시험 라인 신호를 2배로 증가시키는 것을 발견하였다. 따라서, 대략 또는 적어도 8의 OD에서 금 접합을 사용하는 것이 유리하다.
샘플/접합 패드
도 2에 개략적으로 도시된 유형과 같은 측면 유동 검정 장치에서, 샘플 패드는 샘플이 장치를 따라 유동하도록 하여 샘플이 결합 분자를 함유하는 접합체 패드와 접촉한 후, 그 다음 포획 분자와 접촉하게 해야 한다. 샘플의 점도에 따라, 일부 샘플 패드 재료가 유리할 수 있다.
다양한 샘플 패드를 평가하기 위해, 구아검 및 소 뮤신(0.25% 구아검, 0.125% 뮤신, 5% 블루 라텍스(Polysciences Inc., 15709, 2.6%, 물에 용해됨)을 사용하여 합성 질 유체 대체물을 준비하였다. 합성 질 유체는 모든 샘플 패드를 통과하도록 허용되었다. 샘플이 시험 스트립의 길이를 통과하는 데 걸린 시간을 기록하였다(하기 표 참고).
Figure pct00008
Ahlstrom은 상이한 밀도의 유리 섬유 패드이다(각각 8964, 6613 및 6615).
추가 비교를 위해 2개의 샘플 패드(FR1 및 Ahlstrom 8964)를 사용하여 재료를 제조하였다. 대체 샘플 패드가 특이적 또는 비-특이적 신호에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해 4점 표준 곡선(수성 완충 용액 중의 0, 3.125, 12.5 및 50 U/mL 시알리다제)을 사용하여 장치를 실행하였다. 8964 샘플 패드를 사용하여 실행된 샘플은 비특이적 결합(NSB)없이 FR1에 비해 더 높은 특이적 신호를 제공하였다.
6.25 U/ml 시알리다제가 스파이킹된 일련의 임상 샘플을 사용하여 Ahlstrom 8964 샘플 패드와 같은 유리 섬유 유형 패드가 매우 신뢰할 수 있는 샘플 유동 및 효소 검출을 허용한다는 것을 확인하였다.
실시예 16 - 세균성 질염의 진단
임상 샘플을 얻고, Nugent 점수를 결정하기 위해 단서 세포(clue cell)와 같은 기준에 대해 분석하였고, 그에 기초하여 샘플을 세균성 질염에 대해 양성 또는 음성으로 분류하였다. 샘플을 검정 A 또는 검정 B를 사용하여 분석하였다(실시예 14 참고).
결과를 하기에 제시하고, 여기서 se는 감도를 나타내고, sp는 특이성을 나타내고; ppv는 양의 예측 값을 나타내고; nvp는 음의 예측 값을 나타낸다.
검정 A
Figure pct00009
검정 B
Figure pct00010
따라서, 두 검정 모두 세균성 질염에 대해 양성 또는 음성인 임상 샘플의 구별에서 양호하게 기능하였다. 검정 B가 검정 A보다 우수하였다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 구체적인 실시형태에 의해 범주가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위 내에 포함하도록 의도된다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 본 발명의 모든 양태 및 실시형태는 적절하게 본 발명의 다른 양태(단독 포함)로부터 취해진 것을 포함하여 임의의 그리고 모든 다른 일관된 실시형태와 광범위하게 적용 가능하고 결합 가능한 것으로 간주된다. 다양한 간행물이 본 명세서에 인용되며, 그 개시 내용은 전문이 참고에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mologic Ltd <120> Bacterial Vaginosis Diagnostic <130> P148556WO00 <150> GB1812331.5 <151> 2018-07-27 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 2 Thr Thr Thr Leu His 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 3 Gly Gly Ser Ser Val Ile 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 4 Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn His Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 5 Ser Ala Ser Arg Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 6 Gln Gly Ser Tyr Tyr Asn Gly Ala Trp Tyr Val Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 434 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 7 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ser 20 25 30 Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly 35 40 45 Gly Ile Thr Thr Thr Leu His Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly 50 55 60 Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met 65 70 75 80 Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Ser Ser Val Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 130 135 140 Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn 145 150 155 160 Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys 180 185 190 Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala 195 200 205 Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly 210 215 220 Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 225 230 235 240 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu 245 250 255 Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val 260 265 270 Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile 275 280 285 Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Glu Asp Trp Leu Arg Gly 290 295 300 Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 305 310 315 320 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val 325 330 335 Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser 340 345 350 Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu 355 360 365 Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala 370 375 380 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val 385 390 395 400 Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met 405 410 415 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser 420 425 430 Pro Gly <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 8 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Asn His Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Arg Gly Gln Pro Pro Lys Gln 35 40 45 Leu Ile Gly Ser Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Asn 85 90 95 Gly Ala Trp Tyr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Asp Pro Val Ala Pro Ser Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu 115 120 125 Glu Leu Thr Thr Gly Thr Ala Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Phe 130 135 140 Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Val Thr Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr Gln 145 150 155 160 Gln Ser Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Ser Pro Glu Asp Asn 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ala Gln Tyr Asn 180 185 190 Ser His Ser Val Tyr Thr Cys Glu Val Val Gln Gly Ser Ala Ser Pro 195 200 205 Ile Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys 210 215 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> X may be any amino acid, provided at least one of X1, X2, X4 or X5 is a D amino acid and/or a non-standard or non-natural amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Amino acid has a Gal-Sial group <400> 9 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X is absent or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X is absent or Ala in D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is absent or Norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is absent or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is absent or Ala in D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is absent or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is absent or selected from Glu, Arg, Ser, Norvaline, beta-Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is absent or selected from Ser in D form, Ala in D form, Phosphoserine, 1-aminocyclohexane-carboxylic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is absent or selected from Norvaline, 2'-(aminomethyl)biphenyl-2-carboxylic acid , Ala in D form, beta-Ala, Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is selected from 1-aminocyclohexane-carboxylic acid , Ser, Ile, Ala in D form, Ser in D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X is selected from Ala in D form, Pro, Ornithine, Norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is selected from Ser, Thr, Tyr, hydroxylysine, hydroxyproline, Asn, Arg or Phosphoserine; and has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X is selected from Ala in D form, 2'-(aminomethyl)biphenyl-2-carboxylic acid, beta-Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is selected from Arg, Asp in D form, Norleucine, Ornithine, Norvaline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X is absent or selected from Phe, 2'-(aminomethyl)biphenyl-2-carboxylic acid, Ser, Glu, Ala in D form, Ser in D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X is absent or selected from Ser in D form, Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X is absent or selected from Val, Ser, Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is absent or cyclohexylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> X is absent or Ser in D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> X is absent or Val <400> 10 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> X is 1-aminocyclohexane-carboxylic acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(4) <223> Each alanine is in the D form <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Serine has a Gal-Sial group <400> 11 Xaa Ala Ser Ala Arg 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Serine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is norvaline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is 1-aminocyclohexane-carboxylic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(7) <223> Each alanine is in the D form <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Serine has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Serine is in the D form <400> 12 Glu Ser Xaa Xaa Ala Ser Ala Arg Phe Ser Val 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(7) <223> Each alanine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is 2'-(aminomethyl)biphenyl-2-carboxylic acid <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Serine has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Asp is in the D form <400> 13 Arg Ala Xaa Ser Pro Ser Ala Asp Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Serine is phosphoserine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(7) <223> Each alanine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is Ornithine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Serine has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is norleucine <400> 14 Ser Ser Ala Ile Xaa Ser Ala Xaa Glu 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Alanine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> x is norvaline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Serine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> x is beta-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(11) <223> Each alanine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> x is norleucine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Serine has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is 2'-(aminomethyl)biphenyl-2-carboxylic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is Ornithine <400> 15 Ala Arg Xaa Ser Xaa Ala Xaa Ser Xaa Xaa Ala Glu Ser 1 5 10 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(5) <223> Each Alanine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X is beta-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X is 1-aminocyclohexane-carboxylic acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Serine is in the D form <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Serine has a Gal-Sial group <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X is beta-alanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X is norvaline <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(19) <223> Serine is in the D form <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> X is cyclohexylalanine <400> 16 Thr Ala Xaa Glu Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ser Pro Ser Xaa Xaa Ser Glu 1 5 10 15 Thr Xaa Ser Val 20 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X may be any amino acid provided that at least one of X1, X2, X4 and X5 is a D-amino acid and/or a non-standard amino acid or a non-natural amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X may be any amino acid provided that at least one of X1, X2, X4 and X5 is a D-amino acid and/or a non-standard amino acid or a non-natural amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is an amino acid comprising a Gal-Sial group and is selected from Ser, Thr, Tyr, hydroxylysine, hydroxyproline, Asn, Arg or phosphoserine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X may be any amino acid provided that at least one of X1, X2, X4 and X5 is a D-amino acid and/or a non-standard amino acid or a non-natural amino acid. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X may be any amino acid provided that at least one of X1, X2, X4 and X5 is a D-amino acid and/or a non-standard amino acid or a non-natural amino acid. <400> 17 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5

Claims (26)

  1. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물로서, 장치, 키트 또는 물질의 조성물은,
    (i) 지시약 분자(indicator molecule)로서,
    (a) 하기 서열을 포함하는 펩티드로서:
    X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5(서열번호 17)
    식 중,
    Sial은 시알릴 기이고;
    X3은 글리코실 받개(acceptor) 기를 포함하는 아미노산이고, Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 포스포세린(SEP)으로부터 선택되고, 바람직하게는 X3은 Ser이고;
    X1, X2, X4 및 X5는 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택되되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2개 또는 3개는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산인, 펩티드; 및
    (b) 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단 후에 온전하게 유지되는 포획 부위를 포함하는, 지시약 분자;
    (ii) 시험 샘플을 제공받기 위한 포획 구역으로서, 지시약 분자를 고정시키기 위해서, 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 포획 분자를 포함하는 포획 구역; 및
    (iii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자로서, 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없는 결합 분자를 포함하는, 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물.
  2. 제1항에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 Ala이고/이거나, 바람직하게는 X1 및 X2는 둘 다 Ala이고/이거나 바람직하게는 Ala은 DAla 또는 βAla인, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 하전된 아미노산이고, 선택적으로 각각의 하전된 아미노산은 Arg, DAsp 및 LOrn으로부터 선택되는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나는 극성 아미노산이고, 선택적으로 각각의 극성 아미노산은 LSer, DSer 및 Thr으로부터 선택되는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 하기 서열을 포함하고:
    X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
    (서열번호 10), 식 중,
    Sial은 시알릴 기이고,
    X1은 존재하지 않거나 Thr이고,
    X2는 존재하지 않거나 DAla이고,
    X3은 존재하지 않거나 Nle이고,
    X4는 존재하지 않거나 Glu이고,
    X5는 존재하지 않거나 DAla이고,
    X6은 존재하지 않거나 Arg이고,
    X7은 존재하지 않거나 Glu, Arg, Ser, Nva, βAla로부터 선택되고,
    X8은 존재하지 않거나 DSer, DAla, SEP, Cyc으로부터 선택되고,
    X9는 존재하지 않거나 Nva, BIP, DAla, βAla, Orn으로부터 선택되고,
    X10은 Cyc, Ser, Ile, DAla, DSer으로부터 선택되고,
    X11은 DAla, Pro, Orn, Nle으로부터 선택되고,
    X12는 Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 SEP으로부터 선택되고, 바람직하게는 Ser이고,
    X13은 DAla, BIP, βAla으로부터 선택되고,
    X14는 Arg, DAsp, Nle, Orn, Nva로부터 선택되고,
    X15는 존재하지 않거나 Phe, BIP, Ser, Glu, DAla, DSer으로부터 선택되고,
    X16은 존재하지 않거나 DSer, Glu으로부터 선택되고,
    X17은 존재하지 않거나 Val, Ser, Thr으로부터 선택되고,
    X18은 존재하지 않거나 Cha이고,
    X19는 존재하지 않거나 DSer이고,
    X20은 존재하지 않거나 Val인, 장치, 키트 또는 물질의 조성물
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 하기 서열을 포함하거나, 하기 서열로 본질적으로 이루어지거나, 하기 서열로 이루어진, 장치, 키트 또는 물질의 조성물:
    (i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg(서열번호 11)
    (ii) Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val(서열번호 12)
    (iii) Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser(서열번호 13)
    (iv) Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu(서열번호 14)
    (v) DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(서열번호 15); 또는
    (vi) Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(서열번호 16).
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 1종 이상의 특이적 시알리다제에 의한 절단에 대해서 편향되고, 선택적으로 1종 이상의 특이적 시알리다제는 박테리아 기원이고, 선택적으로 박테리아는 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데스(Bacteroides) 및/또는 모빌룬커스 종(Mobiluncus species) 및/또는 가드넬라 바지날리스(Gardnerella vaginalis)인, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 제6항에 정의된 펩티드의 탈-시알릴화된 형태에 대해서 특이적이고, 바람직하게는 펩티드 모티프 Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg에 존재하고, 상응하는 시알릴화된 펩티드 모티프 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg에 존재하지 않거나 잠적된(cryptic) 에피토프에 대해서 특이적인, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 3개의 CDR을 갖는 중쇄 및 3개의 CDR을 갖는 경쇄를 갖는 항체이며, 중쇄 CDR1은 서열번호 1을 갖고/갖거나; 중쇄 CDR2는 서열번호 2를 갖고/갖거나; 중쇄 CDR3은 서열번호 3을 갖고/갖거나; 경쇄 CDR1은 서열번호 4를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR2는 서열번호 5를 갖고/갖거나; 경쇄 CDR3은 서열번호 6을 갖고, 바람직하게는, 중쇄는 서열번호 7을 갖고/갖거나 경쇄는 서열번호 8을 갖는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 리포터 분자, 바람직하게는 금 입자로 표지된, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지시약 분자의 포획 부위는 비오틴 분자 또는 옥심 모이어티를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어지고/지거나; 펩티드의 N- 또는 C-말단에 존재하는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 지시약 분자의 포획 부위는 링커에 의해서 펩티드에 부착되고, 선택적으로 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티를 포함하고, 선택적으로 펩티드는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 링커를 통해서 N- 또는 C-말단에서 비오틴 기에 연결되는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 지시약 분자는 하기 구조를 포함하거나, 하기 구조로 본질적으로 이루어지거나, 하기 구조로 이루어진, 장치, 키트 또는 물질의 조성물:
    (i) Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-비오틴
    (ii) 비오틴-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]- DAla-Arg-Phe-DSer-Val
    (iii) 비오틴-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser
    (iv) 비오틴-PEG-Asp-Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu
    (v) 비오틴-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser; 또는
    (vi) 비오틴-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 지시약 분자는 (i) 서열 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 펩티드; 및 (ii) 선택적으로 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 링커를 통해 펩티드의 N- 또는 C-말단에 연결된 비오틴 분자 또는 옥심 모이어티를 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 포획 부위를 포함하고; 결합 분자는 제8항 또는 제9항에 정의된 바와 같은 항체이고, 바람직하게는 리포터 분자, 가장 바람직하게는 금 입자로 표지되는, 장치, 키트 또는 물질의 조성물.
  15. 항체로서, (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체; 또는 (ii) 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지시약 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 항체는 시알릴화된 펩티드 또는 지시약 분자보다 탈-시알릴화된 유도체에 우선적으로 결합하는, 항체.
  16. 제15항에 있어서, 항체는 제8항, 제9항 및/또는 제10항에 정의된 바와 같은, 항체.
  17. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하는데 사용하기에 적합한 지시약 분자로서, 지시약 분자는,
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드; 및
    b) 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의한 지시약 분자로부터의 시알릴 기의 절단 이후에 온전하게 남아있는 포획 부위를 포함하고, 지시약 분자는 바람직하게는 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 지시약 분자.
  18. 제17항에 있어서, 지시약 분자는 제13항에 정의된 바와 같은, 지시약 분자.
  19. 하기 서열을 포함하거나, 하기 서열로 본질적으로 이루어지거나, 하기 서열로 이루어진 펩티드로서,
    X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
    식 중,
    Sial은 시알릴 기이고;
    X3은 글리코실 받개 기를 포함하는 아미노산이고, Ser, Thr, Tyr, Hyl, Hyp, Asn, Arg 또는 포스포세린(SEP)으로부터 선택되고, 바람직하게는 X3은 Ser이고;
    X1, X2, X4 및 X5는 임의의 아미노산으로부터 독립적으로 선택되되, 단 X1, X2, X4 및 X5 중 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2 또는 3개는 D-아미노산 및/또는 비-표준 아미노산 또는 비-자연 아미노산이고, 펩티드는 바람직하게는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 펩티드는 제6항에 정의된 바와 같고, 바람직하게는 서열 Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg을 포함하거나, 이것으로 본질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진 펩티드인, 펩티드.
  21. 제15항 또는 제16항에 따른 항체를 생성시키는 데 사용하기 위한 펩티드로서, 펩티드는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 펩티드의 탈-시알릴화된 유도체인, 펩티드.
  22. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
    (i) 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
    (ii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없고, 결합 분자는 바람직하게는 제8항, 제9항 및/또는 제10항에 정의된 바와 같은, 단계;
    (iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
    (iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서,
    (i) 시험 샘플을 포획 분자를 포함하는 포획 구역에 첨가하는 단계로서, 상기 포획 분자는 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 지시약 분자의 포획 부위에 결합되어 있고, 상기 포획 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나는 지의 여부에 관계없이 포획 부위에 결합되어 유지되는, 단계;
    (ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없고, 결합 분자는 바람직하게는 제8항, 제9항 및/또는 제10항에 정의된 바와 같은, 단계;
    (iii) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성을 검출함으로써 시험 샘플에서 세균성 질염(bacterial vaginosis)을 진단하는 방법으로서,
    (i) 제1항 내지 제7항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지시약 분자를 시험 샘플과 접촉시키는 단계;
    (ii) 시험 샘플에 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자를 첨가하는 단계로서, 결합 분자는 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없고, 결합 분자는 바람직하게는 제8항, 제9항 및/또는 제10항에 정의된 바와 같은, 단계;
    (iii) 포획 부위에 대한 포획 구역 내의 포획 분자의 결합을 통해서 포획 구역에서 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체를 포획하는 단계로서, 상기 포획 분자는 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이 포획 부위에 결합할 수 있는, 단계; 및
    (iv) 포획 구역에 포획된 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 대한 결합 분자의 결합을 결정함으로써 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단을 검출하는 단계로서, 대조군에 비해서 증가된 절단 수준이 세균성 질염을 진단하는, 단계를 포함하는, 방법.
  25. 시험 샘플에서 시알리다제 효소의 절단 활성의 존재를 검출하기 위한 효소 검출 키트로서,
    (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 지시약 분자로서, 바람직하게는 담체 상에 동결-건조된 지시약 분자;
    (ii) 지시약 분자가 절단되었는지의 여부에 관계 없이, 지시약 분자의 포획 부위에 결합할 수 있는 포획 분자로서, 바람직하게는 스트렙타비딘인 포획 분자;
    (iii) 포획 분자가 부착될 수 있거나, 부착되어 포획 구역을 형성하여 시험 샘플을 제공받는 고체 지지체로서, 바람직하게는 니트로셀룰로스를 포함하는 고체 지지체; 및
    (ii) 지시약 분자의 탈-시알릴화된 유도체에 결합할 수 있는 결합 분자로서, 샘플에 존재하는 시알리다제 효소에 의해서 지시약 분자로부터 시알릴 기의 절단이 일어나지 않는 한 그리고 절단이 일어날 때까지 지시약 분자에 결합할 수 없고, 바람직하게는 제8항, 제9항 및/또는 제10항에 정의된 바와 같은 결합 분자; 및 선택적으로
    (v) 추출 튜브 및/또는 완충액; 및/또는
    (vi) 대조군 검출 분자 및 대조군 검출 결합제를 포함하는, 효소 검출 키트.
  26. 시험 샘플에서 세균성 질염을 진단하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 효소 검출 장치, 효소 검출 키트 또는 물질의 효소 검출 조성물의 용도, 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 제25항에 따른 효소 검출 키트.
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