JP2021531763A - 細菌性膣炎の診断 - Google Patents
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Abstract
Description
X1−X2−X3[Gal−Sial]−X4−X5
(式I)(配列番号9)
式中、
(i)Sialは、シアリル基であり、
(ii)X3は、グリコシル受容体基を含む天然または非天然アミノ酸であり、
(iii)X1、X2、X4、およびX5は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、D−アミノ酸および/または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12[Gal−Sial]−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20
(式II)(配列番号:10)
式中、
Sialは、シアリル基であり、
X1は、存在しないか、またはThrであり、
X2は、存在しないか、またはDAlaであり、
X3は、存在しないか、またはNleであり、
X4は、存在しないか、またはGluであり、
X5は、存在しないか、またはDAlaであり、
X6は、存在しないか、またはArgであり、
X7は、存在しないか、またはGlu、Arg、Ser、Nva、βAlaから選択され、
X8は、存在しないか、またはDSer、DAla、SEP、Cycから選択され、
X9は、存在しないか、またはNva、BIP、DAla、βAla、Ornから選択され、
X10は、Cyc、Ser、Ile、DAla、DSerから選択され、
X11は、DAla、Pro、Orn、Nleから選択され、
X12は、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはSEPから選択され、
X13は、DAla、BIP、βAlaから選択され、
X14は、Arg、DAsp、Nle、Orn、Nvaから選択され、
X15は、存在しないか、またはPhe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSerから選択され、
X16は、存在しないか、またはDSer、Gluから選択され、
X17は、存在しないか、またはVal、Ser、Thrから選択され、
X18は、存在しないか、またはChaであり、
X19は、存在しないか、またはDSerであり、
X20は、存在しないか、またはValである。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg(配列番号11)
(ii)Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val(配列番号12)
(iii)Arg−DAla−Bip−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser(配列番号13)
(iv)Ser−Ser(PO3)−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu(配列番号14)
(v)DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−Bip−Orn−DAla−Glu−Ser(配列番号15)、または
(vi)Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val(配列番号16)、
それらのなかで、Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Argが特に好ましい。
a)本明細書で説明される本発明のペプチド、および
b)試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位、を含む。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン(配列番号11−PEG−ビオチン)
(ii)ビオチン−PEG−Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val(ビオチン−PEG−Asp−配列番号:12)
(iii)ビオチン−PEG−Asp−Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser(ビオチン−PEG−Asp−配列番号13)
(iv)ビオチン−PEG−Asp−Ser−SEP−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu(ビオチン−PEG−Asp−配列番号14)
(v)ビオチン−PEG−Asp−DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser(ビオチンPEG−Asp−配列番号15)、または
(vi)ビオチン−PEG−Asp−Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val(ビオチン−PEG−Asp−配列番号16)
その中で、Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン(配列番号11−PEG−ビオチン)が特に好ましい。
Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg−PEG−ビオチン(配列番号11−PEG−ビオチンの脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープ:Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg(配列番号11の脱シアル化型)に特異的に結合することができる。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型(Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg、すなわち配列番号11)に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
ビオチン−PEG−Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val(ビオチン−PEG−Asp−配列番号12の脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープ、に特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
ビオチン−PEG−Asp−Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal]−DAla−DAsp−Ser(ビオチン−PEG−Asp−配列番号13の脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
ビオチン−PEG−Asp−Ser−SEP−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal]−DAla−Nle−Glu(ビオチン−PEG−Asp−配列番号14の脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
ビオチン−PEG−Asp−DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser(ビオチン−PEG−Asp−配列番号15の脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
ビオチン−PEG−Asp−Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val(ビオチン−PEG−Asp−配列番号16の脱シアル化型)、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のGalペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない(任意の認識可能または検出可能なレベルで)。
および約0.000427s−1のKoffを有し得る。
(i)結合分子に結合することができる第1のメンバー、および
(ii)対の第1のメンバーおよびレポータ分子に結合することができる第2のメンバー、を含む。本発明の特定の実施形態では、インジケータ分子の検出領域はビオチンを含み、アダプター結合対の第1のメンバーはアビジンまたはストレプトアビジンであり、アダプター結合対の第2のメンバーはビオチンであり、レポータ分子はビオチンに結合することができる部分を含む。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg(配列番号11の脱シアル化型)
(ii)Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val(配列番号12の脱シアル化型)
(iii)Asp−Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal]−DAla−DAsp−Ser(配列番号13の脱シアル化型)
(iv)Asp−Ser−SEP−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal]−DAla−Nle−Glu(配列番号14の脱シアル化型)
(v)Asp−DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser(配列番号15の脱シアル化型)、または
(vi)Asp−Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val(配列番号16の脱シアル化型)である。
(i)本明細書で定義されるインジケータ分子と、
(ii)試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、捕捉ゾーンは、インジケータ分子を固定化するために、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる本明細書で定義される捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
(iii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む。
(i)本明細書で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
(iii)捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、当該捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程、を含む。
(i)本明細書で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
(iii)捕捉ゾーンにおける本明細書で定義される捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、当該捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程、を含む。
(i)捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、本明細書で定義される当該捕捉分子は、本明細書で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、当該捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
(iII)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程、を含む。
(i)本明細書で定義される捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、当該捕捉分子は、本明細書で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
(iii)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程、を含む。
(i)試験試料に添加するための本明細書で定義されるインジケータ分子と、
(ii)インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる、本明細書で定義される捕捉分子と、
(iii)捕捉分子を付着させて、試験試料を受容する捕捉ゾーンを形成することができる、固体支持体と、
(iv)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、インジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む。
1.以下の配列を含むペプチドであって、
X1−X2−X3[Gal−Sial]−X4−X5
式中、
(i)Sialは、シアリル基であり、
(ii)X3は、グリコシル受容体基を含む天然または非天然アミノ酸であり、
(iii)X1、X2、X4、およびX5は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、D−アミノ酸および/または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である、ペプチド。
2.X3は、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはホスホセリン(SEP)から選択される、条項1のペプチド。
3.X3は、Serである、条項2のペプチド。
4.X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも2つ、3つ、または4つすべては、D−アミノ酸および/または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸ある、条項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド。
5.X1、X2、X4、およびX5は、少なくとも2つ、3つ、または4つの異なるアミノ酸を含む、条項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド。
6.X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、疎水性アミノ酸である、条項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド。
7.X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、Alaである、条項1〜6のいずれか一項に記載のペプチド。
8.X1およびX2は、両方ともAlaである、条項1〜7のいずれか一項に記載のペプチド。
9.Alaは、DAlaまたはβAlaである、条項7または8に記載のペプチド。
10.X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、荷電アミノ酸である、条項1〜9のいずれか一項に記載のペプチド。
11.各荷電アミノ酸は、Arg、DAsp、およびLOrnから選択される、請求項10のペプチド。
12.X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、極性アミノ酸である、条項1〜11のいずれか一項に記載のペプチド。
13.各極性アミノ酸は、LSer、DSer、およびThrから選択される、請求項12のペプチド。
14.以下の配列を含むペプチドであって、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12[Gal−Sial]−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20
式中、Sialは、シアリル基であり、X1は、存在しないか、またはThrであり、X2は、存在しないか、またはDAlaであり、X3は、存在しないか、またはNleであり、
X4は、存在しないか、またはGluであり、X5は、存在しないか、またはDAlaであり、X6は、存在しないか、またはArgであり、X7は、存在しないか、またはGlu、Arg、Ser、Nva、βAlaから選択され、X8は、存在しないか、またはDSer、DAla、SEP、Cycから選択され、
X9は、存在しないか、またはNva、BIP、DAla、βAla、Ornから選択され、
X10は、Cyc、Ser、Ile、DAla、DSerから選択され、X11は、DAla、Pro、Orn、Nleから選択され、
X12は、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはSEPから選択され、
X13は、DAla、BIP、βAlaから選択され、X14は、Arg、DAsp、Nle、Orn、Nvaから選択され、
X15は、存在しないか、またはPhe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSerから選択され、
X16は、存在しないか、またはDSer、Gluから選択され、
X17は、存在しないか、またはVal、Ser、Thrから選択され、X18は、存在しないか、またはChaであり、
X19は、存在しないか、またはDSerであり、X20は、存在しないか、またはValである、ペプチド。
15.X12は、Serである、条項14のペプチド。
16.ペプチドは、以下の配列を含む、条項1〜15のいずれか一項に記載のペプチド。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg
(ii)Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val
(iii)Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser
(iv)Ser−SEP−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu
(v)DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser、または
(vi)Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val
17.Nle、Nva、Orn、および/またはChaは、それぞれLNle、LNva、LOrn、およびLChaである、条項15または16のいずれか一項に記載のペプチド。
18.ペプチドは、1つ以上の特定のシアリダーゼによる切断のためにバイアスされる、条項1〜17のいずれか一項に記載のペプチド。
19.1つ以上の特定のシアリダーゼは、細菌起源である、条項18に記載のペプチド。
20.細菌は、プレボテラ、バクテロイデスおよび/もしくはモビルンカス種および/またはガードネレラ・バギナリスである、条項19に記載のペプチド。
21.シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用のためのインジケータ分子であって、インジケータ分子は、
a)条項1〜20のいずれか一項で定義されるペプチド、および
b)試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位、を含む、インジケータ分子。
22.捕捉部位は、ビオチン分子またはオキシム部分を含む、条項21に記載のインジケータ分子。
23.捕捉部位は、ペプチドのN末端またはC末端にある、条項21または22に記載のインジケータ分子。
24.捕捉部位は、リンカーによってペプチドに結合されている、条項21〜23のいずれか一項に記載のインジケータ分子。
25.リンカーは、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含む、条項24に記載のインジケータ分子。
26.ペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコール部分からなる、リンカーを介して、そのN末端またはC末端でビオチン基に結合されている、条項25に記載のインジケータ分子。
27.インジケータ分子が以下の構造を含む、条項21〜26に記載のインジケータ分子。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン
(ii)ビオチン−PEG−Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val
(iii)ビオチン−PEG−Asp−Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser
(iv)ビオチン−PEG−Asp−Ser−Ser(PO3)−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu
(v)ビオチン−PEG−Asp−DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser、または
(vi)ビオチン−PEG−Asp−Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val
28a.条項1〜20のいずれか一項に記載のペプチドの脱シアル化誘導体、または条項21〜27のいずれか一項に記載のインジケータ分子に特異的に結合することができる抗体であって、抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも脱シアル化誘導体に優先的に結合する、抗体。
28b.3つのCDRを有する重鎖および3つのCDRを有する軽鎖を有する抗体であって、重鎖CDR1は、配列番号1を有し、重鎖CDR2は、配列番号2を有し、重鎖CDR3は、配列番号3を有し、軽鎖CDR1は、配列番号4を有し、軽鎖CDR2は、配列番号5を有し、および/または軽鎖CDR3は、配列番号6を有する、抗体。
28c.配列番号7の重鎖および/または配列番号8の軽鎖を有する、抗体。
「条項28」へのいずれの言及も、条項28a、条項28b、および条項28cを含むと理解されるべきである。
29.抗体は、エピトープ:
Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg−PEG−ビオチン、より特定的には、エピトープ
Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Argに特異的に結合することができる、条項28に記載の抗体。
30.抗体は、レポータ分子に結合されている、条項28または29に記載の抗体。
31.レポータ分子は、金粒子である、条項30に記載の抗体。
32.条項28に記載の抗体を生成する際における使用のためのペプチドであって、ペプチドは、条項1〜20のいずれか一項で定義されるペプチドの脱シアル化誘導体である、ペプチド。
33.ペプチドは、免疫原性を改善するために担体タンパク質に結合されている、条項32に記載の使用のためのペプチド。
34.ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンに結合されている、条項33に記載の使用のためのペプチド。
35.シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物であって、デバイスは、
(i)条項21〜27のいずれか一項で定義されるインジケータ分子と、
(ii)試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、捕捉ゾーンは、インジケータ分子を固定化するために、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位と結合することができる捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
(iii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
36.デバイス、キット、または組成物は、捕捉分子が付着して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む、条項35に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
37.固体支持体は、試料が適用される試料適用ゾーンをさらに含む、条項36に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
38.固体支持体は、試料適用ゾーンに関して捕捉ゾーンの下流にコントロールゾーンをさらに含み、デバイス、キット、または組成物を使用するアッセイの正常な完了を示すために結合分子に結合する、さらなる結合分子を含む、条項36〜37のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
39.固体支持体は、クロマトグラフィー媒体を含む、条項36〜38のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
40.インジケータ分子は、捕捉分子に結合される捕捉部位を介して捕捉ゾーンに固定化される、条項35〜39のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
41.シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、方法は、
(i)条項21〜27のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
(iii)捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
42.シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、方法は、
(i)捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、当該捕捉分子は条項21〜27のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、当該捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
(iii)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
43.インジケータ分子は、ステップ(i)の前に、インジケータ分子が捕捉分子を介して捕捉ゾーンに結合されるように、捕捉ゾーンに添加される、条項42に記載の方法。
44.試験試料において細菌性膣炎を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、方法は、
(i)条項21〜27のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
(iii)捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。
45.試験試料において細菌性膣炎を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、方法は、
(i)捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、捕捉分子は条項21〜27のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
(ii)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
(iii)捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。
46.インジケータ分子は、ステップ(i)の前に、インジケータ分子が捕捉分子を介して捕捉ゾーンに結合されるように、捕捉ゾーンに添加される、条項45に記載の方法。
47.シアリダーゼ酵素は、プレボテラ、バクテロイデスおよび/もしくはモビルンカス種および/またはガードネレラ・バギナリスに由来する、条項41〜46のいずれか一項に記載の方法。
48.方法は、条項35〜40のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物を使用して実施される、条項41〜47のいずれか一項に記載の方法。
49.方法は、条項35〜39のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物を使用して実施され、さらに、試験試料およびインジケータ分子は、試験試料をデバイス、キット、または組成物に接触させる前に混合される、条項41、44、または47のいずれか一項に記載の方法。
50.シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出キットであって、キットは、
(i)試験試料に添加するための条項21〜27のいずれか一項で定義される、インジケータ分子と、
(ii)インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる、捕捉分子と、
(iii)捕捉分子を付着させて、試験試料を受容する捕捉ゾーンを形成することができる、固体支持体と、
(iv)インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、酵素検出キット。
51.キットは、結合分子に結合することができるさらなる結合分子(コントロール検出結合物質)をさらに含む、条項50に記載の酵素検出キット。
52.固体支持体は、試料適用ゾーンに関して捕捉ゾーンの下流に、さらなる結合分子(コントロール検出結合物質)を付着させることができるコントロールゾーンをさらに含む、条項51に記載の酵素検出キット。
53.結合分子は、条項28〜31のいずれか一項で定義される抗体を含む、条項35〜40のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、条項41〜49のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項50〜52のいずれか一項に記載の酵素検出キット。
54.捕捉部位は、ビオチン分子を含み、捕捉ゾーンはストレプトアビジン分子を含む、条項35〜40または53のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、条項41〜49または53のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項50〜53のいずれか一項に記載の酵素検出キット。
55.細菌性膣炎を試験試料において診断するための、条項35〜40、53、または54のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、もしくは酵素検出組成物、条項41〜49、53、または54のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項50〜54のいずれか一項に記載の酵素検出キットの、使用。
56.試験試料は、膣試料、任意選択的に膣スワブである、条項21〜27のいずれか一項に記載のインジケータ分子、条項35〜40、53、または54のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、もしくは酵素検出組成物、条項41〜49、53、または54のいずれか一項に記載の方法、条項50〜54のいずれか一項に記載の酵素検出キット、あるいは条項55に記載の使用。
図1は、本発明によるアッセイの1つの形態の概略図である。この形態は、次の基本的な成分として、固体支持体(1)、捕捉分子(2)、捕捉部位(3)および本発明のペプチドであってGal−Sial切断部位(4)を含むペプチドを含むインジケータ分子、ならびに切断(6)が発生した後にのみインジケータ分子に結合する結合分子(5)に依存する。インジケータ分子Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン(本明細書では「MOL600c」とも呼ぶ)は、一例として示される。
要約すると、原理はシアリダーゼ反応の化学生成物の抗体認識に基づいて機能し、化学基質はシアリダーゼと反応するように特別に設計されたペプチドであり、反応の生成物はその合成生成物に対して高められた抗体によって認識される。図1および2に示すように、シアル酸を含み、ビオチンタグを有する糖ペプチドが提供される。シアリダーゼ活性を含む試験試料と接触すると、シアリル基がシアリダーゼによって糖ペプチドから切断され、ペプチドにペンダントガラクトシル基を露出する。次に、脱シアル化生成物に対して高められた抗体が、切断された生成物に特異的に結合する。抗体−金コンジュゲートおよびストレプトアビジンテストラインを備えた側方流動ストリップを使用することによって、脱シアル化生成物の存在は赤色ラインとして、かつ試料中のシアリダーゼ活性の直接測定として検出することができる。
候補ペプチド配列の設計では、いくつかの要因が考慮された。
サイズ
原則として、分子量(MW)が5000ダルトン未満の分子は、宿主生物における良好な免疫応答を刺激する可能性は低い。ペプチドは、著しく効果的な免疫原をもたらすKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)に結合することを意図して、比較的短い配列として計画された。性能におけるあらゆる変化の可能性を網羅するために、異なる長さ(9〜20アミノ酸)が提案された。
2つの異なる結合化学を使用した。ペプチドのうちの2つについては、システイン標識が構造に組み込まれているため、標準的なマレイミドベースの化学を使用して担体タンパク質に結合させることができた。他の3つのペプチドについては、結合前のペプチドの酸化のリスクが少なく、結合の程度をUV吸光度によって容易にモニタリングできるため、システイン化学よりも制御可能な処理である比較的新しいヒドラジンベースの化学を使用した。これらの結合化学の概要を図5に示す。
目的は、ガラクトース糖およびペプチドの周辺領域に対して非常に高い親和性を有する抗体を得ることだった。これを念頭におき、糖を構造の中央に配置し、それにより、他の特有なペプチド特性によって側面が十分配置された。この手法は、糖部分との相互作用を欠いた周辺結合抗体を最小限に抑えることが期待される。
広範なアミノ酸が、様々なペプチド配列を構築する際に使用された。荷電、親水性、および疎水性基を配列に沿って組み合わせることによって、多様なトポロジーが促進される。β−アラニンなどの「ヒンジ基」も採用し、全体的な構造的折り畳みにおけるさらなる自由度を可能にした。これに加えて、非天然アミノ酸を使用して、配列の多様性を増加させ、免疫応答を促進させた。プロテアーゼに対する感受性を低減するために、いくつかのD−アミノ酸も組み込んだ。使用されている非標準および非天然アミノ酸のいくつかを図6に示す。
ガラクトース標識ペプチドは、自動マイクロ波シンセサイザーで固相化学法を使用して合成した。すべてのペプチドは逆相HPLCを使用して精製し、エレクトロスプレーLCMSによって特性付けした。ガラクトース部分をシアル酸で標識するために、T.クルーズ由来の組換えトランシアリダーゼ(TcTS)およびシアル酸供与体としてフェチュインを使用する酵素経路を採用した。図7および図8は、使用した合成手法をまとめて示す。
免疫化
5つのペプチド免疫原はすべて、適切な結合化学を使用して、KLHおよびBSAに結合された(図9を参照)。KLHコンジュゲートは、10頭のヒツジへの免疫化のため(ペプチドあたり2頭)、Micropharm Ltdに寄託された。計画は、PBS中に1mgのKLH−ペプチドの用量で開始された。0.5mgの3回の追加免疫を、3ヶ月の期間にわたって加えた。3回の別々の採血をこの期間に実施し(1回の試料および2回の製造用採血)、Mologicに供給した。BSAコンジュゲートを保持して、多数の採血のスクリーニングを実施した。
ポリスチレン高結合マルチウェルプレートは、適切なBSAコンジュゲートおよびコントロールとしての非コンジュゲート化BSAによって感作した。血清試料は、BSAでブロックしたウェル中で様々な希釈率でインキュベートし、さらにアルカリホスファターゼ(AP)に結合された二次抗ヒツジ抗体と結合させた。パラ−ニトロフェニルホスフェート(pNPP)AP基質とのインキュベーションは、何らかの結合の存在を示した。すべての場合において、緩衝液、BSA、および採血前コントロールは、プレートへのバックグラウンド結合を生じなかった。図10Aは検出方法の概略図を示す。図10B〜10Dは、最初の採血の結果を表し、すべてのヒツジが免疫化に反応したことを示す。1/1000の血清希釈は高いシグナルを示したが、一方、BSAのコントロールは陰性であり、ペプチド特異的応答を確認した。採血前コントロールも陰性だった。
免疫原:KLH−MOL123A
ビオチン化ペプチド:MOL136(ガラクトシル)、MOL136c(シアリル)
両方のヒツジともKLH−MOL123Aによる免疫化によく応答したが、CF1064は全体的にわずかに強い反応を示した(図11Bを参照)。ELISA方式(その概略図を図13Aに示す)では、CF1064の結合をMOL136およびMOL136cに対して評価し、シアル化ペプチドMOL136cよりもガラクトシル(すなわち脱シアル化)ペプチドMOL136に有意な特異性を示した(図13B)。したがって、抗血清CF1064による2つのペプチドの優れた識別が実証される。
実施例4Bに記載される手順を、健康な膣スワブ抽出物の存在下で繰り返した。シグナルレベルはわずかに低かったが、MOL136への特異性はスワブマトリックスのいずれの干渉も伴わずに維持された(図16を参照)。
実施例4Bに記載される手順を、25U/mlのシアリダーゼの存在下で繰り返した。シアリダーゼが存在しない試料を陰性コントロールとして使用した。ペプチドおよびシアリダーゼが試料に含まれていない、さらなる陰性コントロールについて実施した。陽性コントロールとして、25U/mlシアリダーゼの存在下で、MOL136cの代わりにMOL136を使用した。PBST中の25U/mlシアリダーゼの存在下で5分間インキュベートしたMOL136cに関して明確な陽性シグナルが認められた。シグナルのレベルは、推定的最大シグナルを示す陽性コントロールの強度と同様だった。予想されたように、陰性コントロールに関してほとんど/まったくシグナルが認められなかった(図17を参照)。
ペプチドおよび抗血清の評価後、血清CF1064ならびにペプチドMOL136およびMOL136cが試験に最も実行可能な組み合わせをもたらすことが示された。ヒツジCF1064は、MOL136と同じペプチド配列で免疫化されたが、ビオチンの代わりにシステイン−マレイミド化学を使用して、KLHコンジュゲートとして免疫された。
MOL136c:ビオチン−PEG−Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val−OH
抗血清を精製するために、ストレプトアビジンカラムを使用してMOL136およびMOL136cを捕捉する方法が考案された。次に、抗体を結合させてMOL136カラムから溶出し、MOL136cカラムに吸収させて、2つの構造間の共通のエピトープを拾い上げる周辺結合物質をすべて除去した。精製された抗体を側方流動で評価することによって、元のガラクトシルペプチド抗原に対する全体的な特異性およびシアル化ペプチドに対する交差反応性の程度を測定した(図18)。これは、プロトタイプにおいて陰性結果として認められる非特異的結合の量を表し、光学リーダを使用しない場合、肉眼で検出されないように大幅に低減させることが必要であるため、重要である。
MOL600:NH2−Cyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Arg−PEG−ビオチン
MOL600c:NH2−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン
次に、MOL600およびMOL600cをELISAによってアッセイし、側方流動で性能の大幅な改善を示した(図19を参照)。
MOL600cペプチドをどのようにして製剤化することができるか評価するため、乾燥条件を調べる試験を設定した。ペプチドは乾燥緩衝液に配合し、風乾し、プロトタイプ形態での使用の前に室温で保存した。データを図20に示し、ポリプロピレンチューブに異なる温度で、異なる乾燥方法を用いて保存されたペプチドMOL600cの安定性を実証する。ペプチドは全体で4週目までそれらの機能を維持したが、性能は8週で低下するように思われる。
最適化された切断ペプチドシステムと共に抗血清CF1064を用いて使用される精製プロセスは、MOL600を添加したストレプトアビジンカラムおよびMOL600cを添加した吸収カラムで実施するように最初に開発した。このプロセスは優れた交差反応特性を有した有効な抗体を生成するが、一貫性を改善し、自動化のためにマニュアルステップの数を低減するさらなる改善が必要とされた。
プロトタイプにおける抗体成分は、側方流動アセンブリ内のコンジュゲートパッドに乾燥された金コンジュゲートとして製剤化される。金コンジュゲートの安定化のための条件は確立されており、さらに最適化されている。試験あたりに必要とされる計算上の抗体量は85ngと見積もられ、CEマーキングを達成するのに要求されるバリデーションバッチを作成するために十分なものである。長期的には、追加のポリクローナル試薬および−より永続的な解決策として−モノクローナル抗体が開発されなければならない。新しい免疫化が開始されており、強い抗体力価がすでにペプチド標的に対して特定されている(図10)。いくつかの選択肢がモノクローナル生成に利用され、市販のハイブリドーマ技術、ならびにまたインハウスでのファージパンニングおよびfab生成(Mologic YorkおよびScotia Biologics)が含まれる。
スワブからの試料の抽出、ペプチドの溶解、およびシアリダーゼに最適な消化条件は、試料緩衝液の主要な要件である。以下の組成を使用した。
0.1%BSA、0.125%Tween−20、および0.375%TritonX−100を含有する100mM酢酸ナトリウム、2mM塩化カルシウム、pH6.0
緩衝液は、ドライ状態のデバイスに流して添加回収における実試料を抽出するためにも効果的に使用されている。
側方流動デバイスは、図4に従って組み立てた。
実現可能な性能を満足させるために、アッセイ時間の長さ、マーカーに対する応答の感度、ラインシグナル強度、および標準曲線の質などの仕様要因を評価した。
MOL616と名付けられた以下のペプチドは、さらなる抗体を生成するために選択された。
Dpr(AOA)−dSer−Nva−Cyc−dAla−Ser(Gal)−dAla−Arg−Phe−dSer−Val−NH2。
KD=7.9nM、Kon=54080M−1S−1、Koff=0.000427s−1
図27に示すように、結合は、シアル化型であるMOL600cと比較してMOL600に明らかに特異的だった。
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYSMDWVRQAPGKGLEWVGGITTTLHTFYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTDDAATYFCARGGSSVIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHEDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPG(配列番号7)
ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYGNNHLNWHQQKRGQPPKQLIGSASRLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYNGAWYVAFGGGTELEIKRDPVAPSVLLFPPSKEELTTGTATIVCVANKFYPSDITVTWKVDGTTQQSGIENSKTPQSPEDNTYSLSSTLSLTSAQYNSHSVYTCEVVQGSASPIVQSFNRGDC(配列番号8)
CDR1 GFSLSSY(配列番号1)
CDR2 TTTLH(配列番号2)
CDR3 GGSSVI(配列番号3)
CDR1 QSSQSVYGNNHLN(配列番号4)
CRD2 SASRLAS(配列番号5)
CDR3 QGSYYNGAWYVA(配列番号6)
追加のO−結合グリコシル化部位が、213位と216位の間の重鎖定常領域で検出された。ゲル画像から、この部位でグリコシル化されている型は、グリコシル化されていない型と多くが類似している。
N−結合グリコシル化が、重鎖定常領域N@285で検出された。
Pyro−Glu(Q)修飾が、重鎖のN末端で観察された。
通常の定常領域配列からのC末端リジンの排除が、重鎖で観察された。
さらなる最適化のために、2つの異なるシアリダーゼ活性アッセイ(AおよびB、以下を参照)を比較した。アッセイの設定は、基本的に図2に関連して説明したとおりだった。
試験抗体を金に結合させ、本明細書では「コンジュゲートパッド」と称される担体上で乾燥させた。アッセイAにおける試験抗体は「1064精製Mol615抗体」、すなわちMol615を使用して血清1064から精製されたポリクローナル抗体だった。アッセイBにおける試験抗体は、「125.1」と名付けられたモノクローナル抗体だった(実施例13を参照)。
コントロール抗体も金に結合させ、コンジュゲートパッド上で乾燥させた。アッセイBの場合、これは、Lampireから供給されたニワトリIgY、製品コード7401403だった。
捕捉分子(ポリストレプトアビジン)をニトロセルロース膜に固定化して捕捉ラインを形成させた。別のコントロール捕捉ラインを形成させた。アッセイBの場合、これは抗ニワトリIgY抗体(Lampireから供給された、製品コード7455207)だった。
図2に示すように、コンジュゲートパッドをニトロセルロース上に重ねた。
すべての溶液が室温であり、十分に混合されていることを確認する。
50、12.5、および1.56U/mlのシアリダーゼ緩衝液標準溶液を使用して所望の条件の各々を試験する。
すべての標準およびシアリダーゼ緩衝液を三重測定で試験する。
1000μlのシアリダーゼ標準をインジケータ基質ディスクと共に抽出チューブに添加する。蓋とキャップを位置に折り重ねてチューブを密封する。チューブを静かに撹拌し、インジケータ基質ディスクと5分間インキュベートする。
抽出チューブからデバイスに試料パッドまで4滴添加する。
キューブリーダ(ドイツ、ベルリン、Schwarzschildstrasse 1、D−12489のopTricon GmbH(Chembio Diagnostic Systems)のOptriconリーダ)を使用して5分または10分で読み取り、
試験およびコントロールラインシグナルを記録する。
望ましい出力は、10分試験を有することであり、5分のインキュベーション、その後の5分の読み取り時間を有する。結果は5分および10分で読み取り、読み取り時間の結果への影響を調べた。結果を図28に示す。示されるように、アッセイAは最低濃度標準について正確な応答を満たすために10分の読み取り時間を必要とするが、アッセイBは5分の読み取り時間を必要とするだけである。アッセイBは、10分の読み取り時間の利点がほとんどないようであり、これは5分の読み取りによって10分試験の望ましい出力に適合する。
アッセイBの結果は5分後に読み取り、アッセイAの結果は10分後に読み取った。結果を図29に示す。
アッセイAおよびBを互いに、かつ異なるペプチド濃度の変法と比較した。アッセイA’は、ペプチド濃度が3μg/ml(ディスクあたり108ng)である以外はアッセイAに対応し、アッセイB’は、ペプチド濃度が1μg/ml(ディスクあたり108ng)である以外はアッセイBに対応した。
アッセイBは、抗体に行われた変更およびペプチド濃度の増加によって、より短い時間でアッセイAよりも性能を改善している。
金の光学密度
金コンジュゲート噴霧濃度をOD4からOD6またはOD8に増加させる効果を調査し、OD6の金はOD4と比較してテストラインシグナルがわずかに増加したが、OD8は3.125U/mLシアリダーゼでOD4のテストラインシグナルの2倍を示した。したがって、約または少なくとも8のODで金コンジュゲートを使用することが効果的である。
図2に概略的に示されているタイプなどの側方流動アッセイデバイスでは、試料パッドは、試料がデバイスに沿って流れることを可能にし、試料が結合分子を含むコンジュゲートパッドと接触するようになり、続いて捕捉分子と接触するようになることを可能にする。試料の粘度に応じて、いくつかの試料パッド材料が効果的であり得る。
臨床試料を入手し、手がかりとなる細胞などの基準について分析してニュージェントスコアを判定し、それに基づき、試料を細菌性膣炎に対して陽性または陰性として分類した。アッセイAまたはアッセイBを使用して試料を分析した(実施例14を参照)。
Claims (26)
- シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物であって、前記デバイス、キット、または組成物は、
(i)インジケータ分子であって、
(a)以下の配列を含むペプチドであって、
X1−X2−X3[Gal−Sial]−X4−X5(配列番号17)
式中、
Sialは、シアリル基であり、
X3は、グリコシル受容体基を含むアミノ酸であり、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはホスホセリン(SEP)から選択され、好ましくはX3は、Serであり、
X1、X2、X4、およびX5は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つまたは3つはD−アミノ酸および/または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である、ペプチド、ならびに
b)前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断後も無傷のままである、捕捉部位を含む、インジケータ分子と、
(ii)前記試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、前記捕捉ゾーンは、前記インジケータ分子を固定化するために、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記インジケータ分子の前記捕捉部位と結合することができる捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
(iii)前記インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記結合分子が前記インジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、デバイス、キット、または組成物。 - X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、Alaであり、好ましくは、X1およびX2は、共にAlaであり、および/または好ましくはAlaは、DAlaまたはβAlaである、請求項1に記載のデバイス、キット、または組成物。
- X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、荷電アミノ酸であり、任意選択的に、各荷電アミノ酸は、Arg、DAsp、およびLOrnから選択される、請求項1〜2のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つは、極性アミノ酸であり、任意選択的に、各極性アミノ酸は、LSer、DSer、およびThrから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記ペプチドは、以下の配列を含み、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12[Gal−Sial]−X13−X14−X15−X16−X17−X18−X19−X20(配列番号10)
式中、
Sialは、シアリル基であり、
X1は、存在しないか、またはThrであり、
X2は、存在しないか、またはDAlaであり、
X3は、存在しないか、またはNleであり、
X4は、存在しないか、またはGluであり、
X5は、存在しないか、またはDAlaであり、
X6は、存在しないか、またはArgであり、
X7は、存在しないか、またはGlu、Arg、Ser、Nva、βAlaから選択され、
X8は、存在しないか、またはDSer、DAla、SEP、Cycから選択され、
X9は、存在しないか、またはNva、BIP、DAla、βAla、Ornから選択され、
X10は、Cyc、Ser、Ile、DAla、DSerから選択され、
X11は、DAla、Pro、Orn、Nleから選択され、
X12は、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはSEPから選択され、好ましくはSerであり、
X13は、DAla、BIP、βAlaから選択され、
X14は、Arg、DAsp、Nle、Orn、Nvaから選択され、
X15は、存在しないか、またはPhe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSerから選択され、
X16は、存在しないか、またはDSer、Gluから選択され、
X17は、存在しないか、またはVal、Ser、Thrから選択され、
X18は、存在しないか、またはChaであり、
X19は、存在しないか、またはDSerであり、
X20は、存在しないか、またはValである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。 - 前記ペプチドは、以下の配列を含むか、以下の配列から本質的になるか、または以下の配列からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg(配列番号11)
(ii)Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val(配列番号12)
(iii)Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser(配列番号13)
(iv)Ser−SEP−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu(配列番号14)、
(v)DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser(配列番号15)、または
(vi)Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val(配列番号16) - 前記ペプチドは、1つ以上の特異的シアリダーゼによる切断のためにバイアスされ、任意選択的に、前記1つ以上の特異的シアリダーゼは、細菌起源であり、任意選択的に、前記細菌は、プレボテラ、バクテロイデス、および/もしくはモビルンカス種および/またはガードネレラ・バギナリスである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記結合分子は、請求項6で定義される前記ペプチドの前記脱シアル化型に特異的であり、好ましくはペプチドモチーフCyc−DAla−Ser[Gal]−DAla−Argに存在し、かつ対応するシアル化ペプチドモチーフCyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Argに存在しないか、または潜在する、エピトープに特異的である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記結合分子は、3つのCDRを有する重鎖および3つのCDRを有する軽鎖を有する抗体であり、前記重鎖CDR1は、配列番号1を有し、前記重鎖CDR2は、配列番号2を有し、重鎖CDR3は、配列番号3を有し、前記軽鎖CDR1は、配列番号4を有し、前記軽鎖CDR2は、配列番号5を有し、前記軽鎖CDR3は、配列番号6を有し、好ましくは前記重鎖は、配列番号7を有し、および/または前記軽鎖は、配列番号8を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記結合分子は、レポータ分子、好ましくは金粒子で標識されている、請求項1〜9のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記インジケータ分子の前記捕捉部位は、ビオチン分子もしくはオキシム部分を含むか、ビオチン分子もしくはオキシム部分から本質的になるか、またはビオチン分子もしくはオキシム部分からなり、かつ/または前記ペプチドのN末端もしくはC末端にある、請求項1〜10のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- 前記インジケータ分子の前記捕捉部位は、リンカーによって前記ペプチドに結合され、任意選択的に、前記リンカーは、ポリエチレングリコール(PEG)部分を含み、任意選択的に、前記ペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコールからなる、リンカーを介して、そのN末端またはC末端でビオチン基に結合されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載のデバイス、キットまたは組成物。
- 前記インジケータ分子は、以下の構造を含むか、以下の構造から本質的になるか、または以下の構造からなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
(i)Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−PEG−ビオチン
(ii)ビオチン−PEG−Asp−Glu−DSer−Nva−Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Arg−Phe−DSer−Val
(iii)ビオチン−PEG−Asp−Arg−DAla−BIP−Ser−Pro−Ser[Gal−Sial]−DAla−DAsp−Ser
(iv)ビオチン−PEG−Asp−Ser−Ser(PO3)−DAla−Ile−Orn−Ser[Gal−Sial]−DAla−Nle−Glu
(v)ビオチン−PEG−Asp−DAla−Arg−Nva−DSer−βAla−DAla−Nle−Ser[Gal−Sial]−BIP−Orn−DAla−Glu−Ser、または
(vi)ビオチン−PEG−Asp−Thr−DAla−Nle−Glu−DAla−Arg−βAla−Cyc−Orn−DSer−Pro−Ser[Gal−Sial]−βAla−Nva−DSer−Glu−Thr−Cha−DSer−Val - 前記インジケータ分子は、(i)前記配列Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Argを含むか、前記配列から本質的になるか、または前記配列からなる、ペプチドと、(ii)ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコール部分からなる、リンカーを介して、前記ペプチドのN末端またはC末端と任意選択的に結合される、ビオチン分子もしくはオキシム部分を含むか、ビオチン分子もしくはオキシム部分から本質的になるか、またはビオチン分子もしくはオキシム部分からなる、捕捉部位と、を含み、前記結合分子は、請求項8または9で定義される抗体であり、好ましくは、レポータ分子、最も好ましくは金粒子によって標識されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
- (i)請求項1〜7のいずれか一項で定義されるペプチドの前記脱シアル化誘導体に、または(ii)請求項1〜7もしくは11〜14のいずれか一項で定義されるインジケータ分子に、特異的に結合することができる抗体であって、前記抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも前記脱シアル化誘導体に優先的に結合する、抗体。
- 前記抗体は、請求項8、9、および/または10で定義される通りである、請求項15に記載の抗体。
- シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用に適したインジケータ分子であって、前記インジケータ分子が、
a)請求項1〜7のいずれか一項で定義されるペプチドと、
b)前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位と、を含み、前記インジケータ分子が、好ましくは、請求項1〜7または11〜14のいずれか一項で定義される通りである、インジケータ分子。 - 前記インジケータ分子は、請求項13で定義される通りである、請求項17に記載のインジケータ分子。
- 以下の配列を含むか、以下の配列から本質的になるか、または以下の配列からなる、ペプチドであって、
X1−X2−X3[Gal−Sial]−X4−X5
式中、
Sialは、シアリル基であり、
X3は、グリコシル受容体基を含むアミノ酸であり、Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg、またはホスホセリン(SEP)から選択され、好ましくはX3は、Serであり、
X1、X2、X4、およびX5は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、X1、X2、X4、およびX5のうちの少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つまたは3つは、D−アミノ酸および/または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸であり、前記ペプチドは、好ましくは請求項1〜7のいずれか一項で定義される通りである、ペプチド。 - 前記ペプチドは、請求項6で定義される通りであり、好ましくは、前記配列Cyc−DAla−Ser[Gal−Sial]−DAla−Argを含むか、前記配列から本質的になるか、または前記配列からなる、ペプチドである、請求項19に記載のペプチド。
- 請求項15または16に記載の抗体を生成する際における使用のためのペプチドであって、前記ペプチドは、請求項1〜7のいずれか一項で定義される前記ペプチドの脱シアル化誘導体である、ペプチド。
- シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、前記方法は、
(i)請求項1〜7または11〜14のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を前記試験試料と接触させる工程と、
(ii)前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、前記試験試料に添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項8、9、および/または10で定義される通りである工程、および
(iii)捕捉ゾーンにおける捕捉分子の前記捕捉部位への結合によって、前記捕捉ゾーンにおいて、前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、前記捕捉分子は、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。 - シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、前記方法は、
(i)捕捉分子を含む捕捉ゾーンに前記試験試料を添加する工程であって、前記捕捉分子は、請求項1〜7または11〜14のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の前記捕捉部位に結合され、前記捕捉分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合されたままである工程、
(ii)前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項8、9、および/または10で定義される通りである工程、および
(iii)前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。 - 試験試料において細菌性膣炎を、前記試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、前記方法は、
(i)請求項1〜7または11〜14のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を前記試験試料と接触させる工程、
(ii)前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、前記試験試料に添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項8、9、および/または10で定義される通りである工程、
(iii)捕捉ゾーンにおける捕捉分子の前記捕捉部位への結合によって、前記捕捉ゾーンにおいて、前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、前記捕捉分子は、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合することができる工程、および
(iv)前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。 - シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出キットであって、前記キットは、
(i)請求項1〜7のいずれか一項で定義されるインジケータ分子であって、前記インジケータ分子は、好ましくは担体上に凍結乾燥されている、インジケータ分子と、
(ii)前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記インジケータ分子の前記捕捉部位に結合することができる捕捉分子であって、前記捕捉分子が好ましくはストレプトアビジンを含む、捕捉分子と、
(iii)前記捕捉分子を付着させることができるか、または付着させて、前記試験試料を受容するための捕捉ゾーンを形成する固体支持体であって、前記固相支持体が好ましくはニトロセルロースを含む、固相支持体と、
(iv)前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項8、9、および/または10で定義される通りである、結合分子と、任意選択的に、
(v)抽出チューブおよび/もしくは緩衝剤と、ならびに/または
(vi)コントロール検出分子およびコントロール検出結合物質と、を含む、酵素検出キット。 - 試験試料において細菌性膣炎を診断するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法、あるいは請求項25に記載の酵素検出キットの、使用。
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