CN112513288A - 细菌性阴道病诊断 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种唾液酸酶活性检测试剂盒或装置，所述唾液酸酶活性检测试剂盒或装置包括：(i)指示剂分子，所述指示剂分子包括唾液酸化肽和捕获位点；(ii)捕获区，所述捕获区包括捕获分子；以及(iii)结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合。还提供了使用所述试剂盒或装置的方法以及特异性指示剂分子和特异性结合分子。
Description
技术领域
本发明涉及检测唾液酸酶的裂解活性和其在检测细菌性阴道病中的用途。具体地，本发明提供了可用于检测唾液酸酶的裂解活性的经过特别设计的肽和指示剂分子。本发明的各个其它方面包含用于在测试样品中检测或测量能够使本发明的指示剂分子裂解的唾液酸酶的活性的存在的酶检测装置、试剂盒、方法和用途。
背景技术
唾液酸酶(以其它方式被称为神经氨酸酶)是分裂为使外或内(聚)唾液酸裂解的两个主要类别(分别为EC 3.2.1.18和EC 3.2.1.129)的糖苷水解酶。唾液酸是神经氨酸的N或O取代的衍生物(下文中示出)：
唾液酸通常在自然界中发现于糖蛋白和糖脂(特别是神经节苷脂)中。病毒、细菌和哺乳动物唾液酸酶都是自然界已知的。已知升高水平的细菌唾液酸酶活性充当细菌性阴道病的诊断标志物(BV；Briselden等人,《临床微生物学(J.Clin.Microbiol.)》,1992,第30卷,第663-666页)。这背后的理论基于阴道中可能会发生的细菌失衡以及从乳酸杆菌高的典型健康环境到厌氧驱动微生物组的转变(Petrova等人,《生理学前沿(Front.Physiol.)》,2015,6:81)。某些厌氧菌分泌唾液酸酶并破坏阴道中的天然粘液屏障。尽管如此，用于BV的确切机制仍有待完全建立。患有症状性BV的患者可能会经历显著的不适、阴道排液、难闻的气味以及更普遍地感到缺乏对其阴道健康的控制(Bilardi等人,《公共科学图书馆综合(Plos One)》,2013,第8卷,e74378)。治疗途径通常涉及局部或口服抗生素。也可非处方地获得局部益生元治疗(例如，VH
)和pH凝胶(例如，平衡活性BV)。BV可能会是难治的，并且患者在抗生素治疗之后可能会复发(Bilardi等人,《公共科学图书馆综合》,2013,第8卷,e74378)。一些难治的病例被认为与阴道中的生物膜的形成有关(Verstraelen和Swidsinski,《关于感染性疾病的最新观点(Curr.Opin.Infect.Dis.)》,2013,26:86-89)。冒险不应对BV的存在对性传播感染(包含HIV)和相关早产风险的敏感性更高。早产风险被认为与宫颈粘液屏障的过早减弱有关(Lewis等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,2013,第288卷,第12067-12079页)。目前在临床中，BV测试是基于阴道样品涂片，所述阴道样品涂片被发送以在实验室中进行分析。分析方法包含寻找线索细胞、氢氧化钾(KOH)气味测试或应用如Nugent评分等设定标准(Nash,Jungmann和Gubert,《BMJ学习(BMJ Learning)》,2015,1-29)。在定点照护处使用快速测试将会通过递送快速答案、使患者立即进行治疗计划并加快用于递送结果的整个过程来使患者受益。同样，通过避免外包给实验室以及避免所涉及的资源和时间成本并且首先将患者时间减少到单个时段，将会对医疗保健提供者有潜在的益处。
用于诊断BV的两种主要类型的产品当前可在美国和欧洲获得。一组产品基于测量pH的变色拭子。另一组产品也是比色的并且基于唾液酸酶活性测量。基于pH的产品可在定点照护处非处方地获得并且包含
(由常识公司(Common Sense)出售)和
(由凯妮汀公司(Canesten)出售)。基于唾液酸酶检测的目前出售的主要产品是BV Blue(由积水诊断试剂公司(Sekisui Diagnostics)和格里佛斯诊断试剂公司(Gryphus Diagnostics)出售)。BV Blue是基于拭子的测试；将样品拭子放置在指示剂溶液中，这将改变颜色以指示样品中存在唾液酸酶活性。测试大约需要15分钟来运行。
基于pH的测试缺乏准确性，因为各种条件都可能会导致阴道的局部pH发生变化(例如，念珠菌病和滴虫病以及BV)。检测唾液酸酶活性的已知测试如BV Blue缺乏敏感性。
发明内容
本发明来自提高唾液酸酶活性检测的敏感性和/或特异性的尝试。本发明人现在已经特别设计了用于检测唾液酸酶的裂解活性的肽和对应的指示剂分子。如本文进一步所描述的，每个肽通过半乳糖基基团与唾液酸化基团缀合(并且因此充当唾液酸酶的底物)，其中肽架构被特别设计使得一旦唾液酸化基团通过样品中存在的一种或多种唾液酸酶从肽中裂解，肽的去唾液酸化衍生物被特异性结合分子(例如，抗体)识别并结合。在优选的实施例中，肽掺入一种或多种氨基酸，这些氨基酸增强了肽对蛋白酶裂解的抗性。
因此，在一方面中，本发明提供了一种肽，其包括根据下式的序列：
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
(式I)(SEQ ID NO:9)
其中：
(i)Sial是唾液酸化基团；
(ii)X3是包括糖基受体基团的天然或非天然氨基酸；并且
(iii)X1、X2、X4和X5独立地选自任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
肽可以基本上由式I的序列组成或由其组成。
根据本发明的所有方面，“唾液酸化基团”意指唾液酸取代基，其中唾液酸是神经氨酸的N-或O-取代的衍生物(例如，N-乙酰神经氨酸；被称为“Neu5Ac”或“NANA”)。
根据本发明的所有方面，“Gal”意指半乳糖基取代基。在优选实施例中，半乳糖基取代基是具有以下结构的基团：
在特定实施例中，半乳糖基取代基是β-半乳糖的基团。在此类实施例中，半乳糖基取代基被O-连接到唾液酸化基团。本发明涵盖所有可能的区域异构体。技术人员还将理解，可以使用其它糖类代替半乳糖基基团，如例如，葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖的基团。因此，本文中对“半乳糖基取代基”的提及应作相应解释。
如上文所示，-Gal-Sial基团与X3缀合，其中X3是包括糖基受体基团的天然或非天然氨基酸。也就是说，由X3表示的氨基酸的侧链包括与Gal取代基形成键的亲核取代基(即，糖基供体)。例如，亲核取代基可以是羟基或胺取代基。因此，在特定实施例中，X3可以选自丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、羟赖氨酸(Hyl)、羟脯氨酸(Hyp)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)和磷酸丝氨酸(SEP)。在优选实施例中，X3是Ser。
从式I应当理解的是，-Gal-Sial基团仅键合到X3(如式I中的方括号所指示的)。其不会将X3桥接到X4。为避免疑问，下文示出了替代性且等效公式(Ia)：
因此，-Gal-Sial基团从肽骨架分支。因此，-Gal取代基在结构中居中定位，使得其侧翼为氨基酸X1、X2、X4和X5。因此，如本文进一步所描述的，可以产生对每个肽的去唾液酸化衍生物具有非常高的亲和力和特异性的结合分子(例如，抗体)，并且使与Gal取代基缺乏相互作用的外围结合分子(例如，抗体)的产生最小化。
X1、X2、X4和X5独立地选自任何氨基酸(天然的和非天然的)，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或(i)非标准氨基酸或(ii)非天然氨基酸。当产生作为对肽的去唾液酸化衍生物具有高亲和力的抗体的结合分子时，非标准和非天然氨基酸增加了序列多样性，并帮助在宿主生物中促进免疫应答。D-氨基酸帮助降低对蛋白酶的敏感性。在特定实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少两个、三个或所有四个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
技术人员将非常熟悉术语“天然”和“非天然”氨基酸。为避免疑问，“天然”氨基酸是自然界中发现的氨基酸，并且包含标准和非标准氨基酸两者。如本领域已知的，标准氨基酸是直接由通用遗传密码中的三联体密码子编码的氨基酸。相反，非标准氨基酸是在自然界中发现但不直接由通用遗传密码中的三联体密码子编码的氨基酸。“非天然”氨基酸是在自然界中未发现但仅通过人工合成而存在的氨基酸。如本文所使用的，不带前缀“D”或“L”的氨基酸名称用于意指D和L立体异构体。使用“D”或“L”前缀表示所述具体立体异构体。
肽或指示剂分子的“去唾液酸化衍生物”是唾液酸化基团通常通过唾液酸酶从肽或指示剂分子中裂解产生的产物。因此，就不存在唾液酸化基团的情况而言，肽或指示剂分子的“去唾液酸化衍生物”通常仅或基本上仅不同于唾液酸化肽或指示剂分子。因此，本文中对肽或指示剂分子的“去唾液酸化衍生物”的任何提及应理解为意指所述肽或指示剂分子的去唾液酸化形式。
进一步增加肽序列拓扑的多样性是有益的，因为已经显示这进一步促进产生对每种肽的去唾液酸化衍生物具有非常高的亲和力和特异性的结合分子。这对于作为抗体的结合分子尤其相关。因此，在优选实施例中，X1、X2、X4和X5包括至少两种、三种或四种不同的氨基酸。在一些实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少一个是疏水性氨基酸。例如，X1、X2、X4和X5中的至少一个可以选自丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)，D-丙氨酸(DAla)、1-氨基环己烷-羧酸(Cyc)、β-丙氨酸(βAla)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸(Bip)和环己基丙氨酸(Cha)。优选地，采用Nle、Nva和Cha的L-立体异构体。在另外的实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少两个或三个是疏水性氨基酸。X1、X2、X4和X5中的所有四个可以是疏水性氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。在特定实施例中，至少一种疏水性氨基酸是Ala。在另外的实施例中，X1和X2均为Ala。在优选实施例中，Ala是DAla或βAla。在另外的实施例中，每个疏水性氨基酸选自DAla、βAla、Ile、Val、Pro、Nle、Nva、Cyc、Cha和Bip。另外地或可替代地，在一些实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少一个是带电氨基酸。例如，X1、X2、X4和X5中的至少一个可以选自精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、鸟氨酸(Orn)和磷酸丝氨酸(SEP)。优选地，采用Orn的L-立体异构体和Asp的D-立体异构体。在另外的实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少两个或三个是带电氨基酸。X1、X2、X4和X5中的所有四个可以是带电氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。在特定实施例中，每个带电氨基酸选自Arg、Glu、DAsp、LOrn和SEP。另外地或可替代地，在一些实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少一个是极性氨基酸。例如，X1、X2、X4和X5中的至少一个可以选自丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和半胱氨酸(Cys)。优选地，采用Ser的D-立体异构体。在另外的实施例中，X1、X2、X4和X5中的至少两个或三个是极性氨基酸。X1、X2、X4和X5中的所有四个可以是极性氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。在特定实施例中，每个极性氨基酸选自LSer、DSer和Thr。在优选实施例中，为了最大化肽序列拓扑的多样性，X1、X2、X4和X5是疏水性、带电和极性氨基酸的组合。Pro和βAla特别可用于本发明的肽中，因为其充当“铰链基团”，从而允许整体结构折叠具有另外的自由度，从而进一步增加了肽序列拓扑的多样性。
在优选实施例中，肽的分子量小于5000道尔顿。这有助于刺激宿主生物中的免疫应答，以产生与肽的去唾液酸化衍生物结合的抗体。因此，在特定实施例中，肽的长度可以为5-20个氨基酸，更优选地长度为9-20个氨基酸。
因此，在相关的方面中，本发明提供了一种肽，其包括根据下式的序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
(式II)(SEQ ID NO:10)
其中：
Sial是唾液酸化基团；
X1不存在或者是Thr；
X2不存在或者是DAla；
X3不存在或者是Nle；
X4不存在或者是Glu；
X5不存在或者是DAla；
X6不存在或者是Arg；
X7不存在或者选自Glu、Arg、Ser、Nva、βAla；
X8不存在或者选自DSer、DAla、SEP、Cyc；
X9不存在或者选自Nva、BIP、DAla、βAla、Orn；
X10选自Cyc、Ser、Ile、DAla、DSer；
X11选自DAla、Pro、Orn、Nle；
X12选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或SEP；
X13选自DAla、BIP、βAla；
X14选自Arg、DAsp、Nle、Orn、Nva；
X15不存在或者选自Phe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSer；
X16不存在或者选自DSer、Glu；
X17不存在或者选自Val、Ser、Thr；
X18不存在或者是Cha；
X19不存在或者是DSer；
X20不存在或者是Val。
从式II应当理解的是，-Gal-Sial基团仅键合到X12(如式II中的方括号所指示的)。其不会将X12桥接到X13。为避免疑问，下文示出了替代性且等效公式(IIa)：
因此，-Gal-Sial基团从肽骨架分支。因此，定位-Gal取代基使得其侧翼为氨基酸X10-11和X13-14以及氨基酸X1-9和X15-20(如果存在的话)。因此，如本文进一步所描述的，可以产生对每个肽的去唾液酸化衍生物具有非常高的亲和力和特异性的结合分子(例如，抗体)，并且使与Gal取代基缺乏相互作用的外围结合分子(例如，抗体)的产生最小化。
在优选实施例中，X12是Ser。
在特定实施例中，根据本发明的所有方面，肽包括以下序列、基本上由其组成或由其组成：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg(SEQ ID NO:11)；
(ii)Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(SEQ IDNO:12)；
(iii)Arg-DAla-Bip-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser(SEQ ID NO:13)；
(iv)Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu(SEQ ID NO:14)；
(v)DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-Bip-Orn-DAla-Glu-Ser(SEQ ID NO:15)；或
(vi)Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(SEQ ID NO:16)；
其中Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg是特别优选的。
发明人发现这些特异性肽对于检测唾液酸酶活性特别有用，并在实例部分中进一步描述。
优选地，Nle、Nva、Orn和/或Cha(当存在时)分别是LNle、LNva、LOrn和LCha。
在一些实施例中，通过相应地构建肽使肽偏向于通过一种或多种特异性唾液酸酶进行裂解，使得位于-Gal Sial基团侧翼的氨基酸确保了裂解的特异性和敏感性。因此，特异性唾液酸酶可以对肽具有不同的亲和力。这允许利用本发明来在测试样品中检测特异性唾液酸酶活性。如本文所描述的，本发明的肽对于检测细菌性阴道病特别有用。因此，在优选实施例中，一种或多种特异性唾液酸酶是细菌来源的。具体地，一种或多种特异性唾液酸酶可以来自普氏菌(Prevotella species)、拟杆菌(Bacteroides species)和/或动弯杆菌(Mobiluncus species)和/或阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)。
在相关方面中，将本发明的肽掺入到指示剂分子中，以用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在。指示剂分子是本文进一步描述的用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒、酶检测物质组合物以及方法的核心组分。基于发明人先前对用于检测酶的裂解活性的指示剂分子以及与裂解产物特异性结合的结合分子的一般概念的公开，在检测唾液酸酶活性以诊断BV的背景下，由发明人专门开发了本文所描述的指示剂分子(参见PCT/GB2014/053171，其通过引用并入本文)。因此，本发明提供了一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的指示剂分子，所述指示剂分子包括：
a)如本文所描述的本发明的肽；以及
b)捕获位点，所述捕获位点在所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解之后保持完整。
捕获位点是指示剂分子的介导指示剂分子与存在于捕获区内的捕获分子的结合的离散区域(如下文更详细地描述)。因此，捕获位点是指示剂分子中负责将指示剂分子保留或定位在捕获区内的部分。在指示剂分子的裂解之后，捕获位点可以保持完整或基本上完整，使得位点仍被存在于装置的捕获区内的捕获分子识别并结合。在这些情况下，完整的指示剂分子和指示剂分子在裂解之后包括捕获位点的部分两者都将与捕获区内的捕获分子结合。捕获位点可以包括任何合适的分子，例如，生物素分子或肟部分。捕获位点可以位于肽的N端或C端处。指示剂分子有效性的关键是通过在捕获区处的捕获位点与捕获分子之间的相互作用进行固定，并在裂解发生之后通过结合分子同时结合。
因此，完整的指示剂分子可以包括与本发明的肽连接的捕获位点部分，肽包括第一唾液酸化基团。指示剂分子通过唾液酸酶进行的裂解产生包括捕获位点部分和肽的去唾液酸化形式的片段。片段(即，裂解的指示剂分子)在结构上与完整的指示剂分子不同，因为所述片段缺少完整的指示剂分子中存在的第一唾液酸化基团。第一唾液酸化基团的这种缺乏在片段上显露或暴露了完整指示剂分子中不存在、隐藏或难以接近的表位(新颖的结合位点)。因此，可以认为完整的指示剂分子包括隐蔽的表位。如下文所讨论的，本发明的装置、试剂盒、物质组合物和方法的结合分子对此表位是特异性的，并且因此与完整的指示剂相比仅或优先地与指示剂片段结合。
指示剂分子的肽和捕获位点可以通过本领域技术人员已知的任何方式缔合。在优选实施例中，肽和捕获位点可以通过直接共价连接缔合。肽和捕获位点可以紧密相邻或可以被接头或间隔子(例如，聚乙二醇(PEG)部分)分开。在一些实施例中，肽通过包括聚乙二醇部分、基本上由其组成或由其组成的接头在其N端或C端与生物素基团连接。一种或多种另外的氨基酸可以存在于肽的N端或C端处，以将接头基团(如PEG)连接到肽。在一些实施例中，一种或多种另外的氨基酸可以包括Asp。PEG部分可以进一步在PEG部分的一端或两端处包括可以与肽的末端残基和/或捕获位点(例如，生物素分子)反应的官能团(例如，胺基，任选地烷基胺基)以在合成期间将肽和捕获位点彼此连接。因此，在特定实施例中，指示剂分子包括以下结构、基本上由其组成或由其组成：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素(SEQ ID NO:11-PEG-生物素)；
(ii)生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:12)；
(iii)生物素-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:13)；
(iv)生物素-PEG-Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:14)；
(v)生物素-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:15)；或
(vi)生物素-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:16)；
其中Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素(SEQ ID NO:11-PEG-生物素)是特别优选的。
在本发明的上下文中，指示剂分子(通过捕获位点)可以以相对高的亲和力与捕获区中的捕获分子结合(如下文更详细地描述)。在一些实施例中，指示剂分子的解离常数(kd)将相对低，并且优选地介于0M与1×10-7M之间(取决于测定所需的敏感性)。在本发明的某些实施例中，指示剂分子的解离常数将介于1×10-15M和1×10-9M之间。
在本发明的某些实施例中，由于指示剂分子的捕获位点与捕获区中存在的捕获分子的直接结合，可以实现这种结合相互作用。在此上下文中，直接结合意指指示剂分子(通过捕获位点)与捕获分子的结合而没有任何中间体。
在本发明的优选实施例中，指示剂分子的捕获位点和捕获区中存在的捕获分子是结合对的两个半部分。在此上下文中，结合对由能够彼此结合的两个分子或实体组成。在本发明的某些实施例中，结合相互作用是特异性的，使得结合对的每个成员仅能够结合其相应配偶体或有限数量的结合配偶体。此外，如上文所详述的，优选的是结合对表现出相对高的亲和力。结合对可以是自然界中发现的结合对或者可以是人工产生的相互作用分子或实体对。
在本发明的一些实施例中，指示剂分子的捕获位点和捕获分子是结合对的两个半部分，其中结合对选自以下：-抗原和抗体或其抗原结合片段；生物素和亲和素、链霉亲和素、中性亲和素或captavidin；免疫球蛋白(或其适当的结构域)和蛋白A或G；碳水化合物和凝集素；互补核苷酸序列；配体和受体分子；激素和激素结合蛋白；酶辅因子和酶；酶抑制剂和酶；纤维素结合结构域和纤维素纤维；固定的氨基苯基硼酸和携带顺式二醇的分子；以及木葡聚糖和纤维素纤维及其类似物、衍生物和片段。
在本发明的特定实施例中，结合对由生物素和链霉亲和素组成。在本发明的另外的实施例中，指示剂分子的捕获位点包括表位，并且捕获分子包括与第一捕获位点处存在的表位特异性结合的抗体。在本发明的上下文中，术语抗体涵盖来自任何物种的天然免疫球蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab')2片段、Fab片段、Fv片段、sFv片段和高度相关的分子，如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的分子(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆的或多克隆的。因此，在具体实施例中，捕获分子包括抗体。在其它实施例中，捕获位点包括生物素分子，并且捕获区包括链霉亲和素分子。
本文进一步描述的用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒、酶检测物质组合物以及方法的另一种核心组分是结合分子。结合分子被设计成与指示剂分子的在唾液酸化基团通过样品中存在的唾液酸酶活性从指示剂分子中裂解之后形成的去唾液酸化衍生物特异性结合。去唾液酸化衍生物的形成显露了可以与结合分子特异性结合的新颖结合位点。因此，在优选实施例中，结合分子不能与指示剂分子结合(以任何可感知的或可检测的水平)，除非并且直到唾液酸化基团从指示剂分子中裂解已经发生。在替代性实施例中，相对于唾液酸化肽或指示剂分子，结合分子优先与去唾液酸化衍生物结合。因此，与唾液酸化形式相比，结合分子对去唾液酸化衍生物具有更高的亲和力。
可替代地观察到，在优选实施例中，结合分子能够与去唾液酸化指示剂分子(片段)特异性结合，并且不能与完整的(唾液酸化)指示剂分子结合(以任何可感知的或可检测的水平)。
技术人员能够很好地确定相对于唾液酸化形式，特定的结合分子是否优先与去唾液酸化衍生物结合。这可以例如以相对解离常数来表达。例如，在特定实施例中，结合分子与去唾液酸化衍生物之间的结合相互作用的解离常数可以比结合分子与唾液酸化形式之间的结合相互作用的解离常数低2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍(或更多)。
在具体实施例中，结合分子包括抗体。为避免疑义，术语抗体涵盖来自任何物种的天然免疫球蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、F(ab')2片段、Fab片段、Fv片段、sFv片段和高度相关的分子，如基于保留特异性结合亲和力的抗体结构域的分子(例如，单结构域抗体)。抗体可以是单克隆的或多克隆的。本发明人已经产生了仅识别指示剂分子的去唾液酸化衍生物的抗体，并且因此除非并且直到已经发生唾液酸化基团的裂解，否则所述抗体将不(以任何显著的程度)与指示剂分子结合。可以根据本领域已知的技术产生抗体。这可能依赖在对动物(如绵羊、兔子或山羊)进行免疫时使用的指示剂分子的去唾液酸化衍生物。可替代地，可以用去唾液酸化肽对动物进行免疫(即，无需连接捕获位点)。可以从血清中分离多克隆抗体并进行亲和纯化。单克隆抗体可以使用众所周知的和特征性的杂交瘤技术产生。
因此，在相关方面中，本发明还提供了一种能够与如本文所定义的本发明的肽或如本文所定义的本发明的指示剂分子的去唾液酸化衍生物特异性结合的抗体。如本领域技术人员基于本文公开内容将理解的相对于唾液酸化肽或指示剂分子，抗体可以优先与去唾液酸化衍生物结合。因此，与唾液酸化形式相比，抗体对去唾液酸化衍生物具有更高的亲和力。技术人员能够很好地确定相对于唾液酸化形式，特定的抗体是否优先与去唾液酸化衍生物结合。这可以例如以相对解离常数来表达。例如，在特定实施例中，抗体与去唾液酸化衍生物之间的结合相互作用的解离常数可以比抗体与唾液酸化形式之间的结合相互作用的解离常数低2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍(或更多)。在特定实施例中，抗体不能与唾液酸化肽或指示剂分子结合。也就是说，所述抗体只能在唾液酸化基团的裂解发生之后与去唾液酸化衍生物结合。
因此，在优选实施例中，抗体可以与以下表位特异性结合：
Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-生物素(SEQ ID NO:11-PEG-生物素的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位，Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg(SEQ ID NO:11的去唾液酸化形式)。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式(Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg，即，SEQ ID NO:11)结合。
在另一个实施例中，提供了可以与以下表位特异性结合的抗体：
生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:12的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式结合。
在另外的实施例中，提供了可以与以下表位特异性结合的抗体：
生物素-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal]-DAla-DAsp-Ser(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:13的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式结合。
在另外的实施例中，提供了可以与以下表位特异性结合的抗体：
生物素-PEG-Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal]-DAla-Nle-Glu(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:14的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式结合。
在另外的实施例中，提供了可以与以下表位特异性结合的抗体：
生物素-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:15的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式结合。
在另外的实施例中，提供了可以与以下表位特异性结合的抗体：
生物素-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(生物素-PEG-Asp-SEQ ID NO:16的去唾液酸化形式)；具体地此分子中存在的表位，更具体地此分子的Gal肽部分中存在的表位。优选地，抗体不能(以任何可感知的或可检测的水平)与此分子的唾液酸化形式结合。
在另外的实施例中，提供了一种抗体，其具有有3个CDR的重链和有3个CDR的轻链，其中重链CDR1具有SEQ ID NO:1；重链CDR2具有SEQ ID NO:2；重链CDR3具有SEQ ID NO:3；轻链CDR1具有SEQ ID NO:4；轻链CDR2具有SEQ ID NO:5；和/或轻链CDR3具有SEQ ID NO:6。
抗体可以具有带SEQ ID NO:7的重链和/或具有带SEQ ID NO:8的轻链。
优选地，抗体可以与分子Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg中存在的表位特异性结合。优选地，抗体不(以任何可感知的或可检测的水平)与分子Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg结合。
对于(去唾液酸化)分子Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-肟(SEQ ID NO:11-PEG-肟的去唾液酸化形式)，抗体的KD可以小于100nM，优选地小于80、60、50、40、30、20或10nM，例如约7.9nM。对于此分子，其Kon可以为约54080M-1s-1；
并且Koff为约0.000427s-1。
结合分子可以直接或间接与报道分子缀合(即，用其标记)，以允许检测结合分子与指示剂分子的结合。报道分子可以是适合于通过本领域技术人员可用的任何方式进行检测的任何物质或部分。因此，报道分子通常能够生成或产生信号。在本发明的某些实施例中，报道分子选自以下：-金颗粒；发色团；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见的化合物；含有信号产生性物质的脂质体或其它囊泡；电活性物种；或酶及其底物的组合。用作报道部分的合适的酶-底物组合可以是酶碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸。在本发明的特定实施例中，报道分子是金颗粒。
在本发明中还设想了用报道分子间接标记结合分子。因此，报道分子可以与另外的结合分子连接，所述另外的结合分子进而与结合分子结合以提供标记。这种间接结合可以由能够同时与结合分子和报道分子结合的衔接子介导。作为说明性实施例，在结合分子是抗体的情况下，间接标记可以由以特异性方式与抗体结合分子结合的另外的抗体介导。另外的抗体可以直接用报道分子来标记，如金颗粒；发色团；发光化合物；荧光分子；放射性化合物；可见的化合物；含有信号产生性物质的脂质体或其它囊泡；电活性物种；或酶及其底物的组合。用作报道部分的合适的酶-底物组合可以是酶碱性磷酸酶和底物硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸。在本发明的特定实施例中，报道部分是金颗粒。
在报道是金颗粒的实施例中，应该使用的金颗粒结合分子缀合物的光密度为至少4，优选地至少5、6或7，最优选地至少或约8、9或10。
在其中报道分子通过衔接子分子与结合分子结合的本发明的实施例中，在将测试样品添加到指示剂分子之前，可以将衔接子与结合分子预复合，条件是衔接子不阻止结合分子与裂解的指示剂分子的结合。
衔接子可以是能够介导结合分子与报道分子的间接相互作用的任何材料或分子。在一些实施例中，衔接子是链霉亲和素，并且结合分子包括生物素分子。衔接子也可以是“衔接子结合对”，其中所述结合对包括：
(i)能够与结合分子结合的第一成员；以及
(ii)能够与所述一对的第一成员和报道分子结合的第二成员。在本发明的某些实施例中，指示剂分子的检测区包括生物素，衔接子结合对的第一成员是亲和素或链霉亲和素，衔接子结合对的第二成员是生物素，并且报道分子包括能够结合生物素的部分。
鉴于前述内容，在互补方面中，本发明的肽的去唾液酸化衍生物也形成本发明的一部分，并用于产生结合分子，特别是抗体。因此，本发明提供了用于产生如本文所定义的抗体的肽，其中肽是根据本发明的肽的去唾液酸化衍生物，并且抗体能够与本发明的肽的去唾液酸化衍生物特异性结合。因此，在特定实施例中，肽是：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg(SEQ ID NO:11的去唾液酸化形式)；
(ii)Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(SEQ IDNO:12的去唾液酸化形式)；
(iii)Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal]-DAla-DAsp-Ser(SEQ ID NO:13的去唾液酸化形式)；
(iv)Asp-Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal]-DAla-Nle-Glu(SEQ ID NO:14的去唾液酸化形式)；
(v)Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(SEQ ID NO:15的去唾液酸化形式)；或
(vi)Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Va(SEQ ID NO:16的去唾液酸化形式)。
包括序列Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg、基本上由其组成或由其组成的肽是特别优选的。
在特定实施例中，可以将肽与载体蛋白缀合以提高免疫原性，并且因此提高宿主生物中的抗体产生。例如，肽可以与钥孔虫戚血蓝蛋白缀合。载体蛋白可以位于肽的N端或C端处。
鉴于前述内容，本发明进一步提供了用于在掺入了如上文所定义的指示剂分子、捕获分子和结合分子的测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒、酶检测物质组合物以及方法。使用仅与指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合而不与未裂解的指示剂分子结合的如抗体等结合分子，使得能够在测试样品中检测低浓度的唾液酸酶活性。
因此，在另外的方面，本发明提供了一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，所述装置包括：
(i)如本文所定义的指示剂分子；
(ii)捕获区，所述捕获区用于收纳所述测试样品，其中所述捕获区包括无论所述指示剂分子是否已经裂解都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合的如本文所定义的捕获分子，以便固定所述指示剂分子；以及
(iii)如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生。
本发明进一步提供了一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)使如本文所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
发明人已经示出本发明的装置、试剂盒、物质组合物和方法在BV诊断领域中具有具体的应用。因此，本发明进一步提供了一种用于通过检测样品中唾液酸酶的裂解活性来诊断所述测试样品中的细菌性阴道病的方法，所述方法包括：
(i)使如本文所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过捕获区中的如本文所定义的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解，其中与对照物相比增加的裂解水平诊断出细菌性阴道病。
在特定实施例中，指示剂分子可以通过捕获分子(即，在与测试样品接触之前)(预)固定在捕获区中。因此，本发明还提供了一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)将所述测试样品添加到包括捕获分子的捕获区，所述捕获分子与如本文所定义的指示剂分子的所述捕获位点结合，其中无论所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解是否发生，所述捕获分子都保持与所述捕获位点结合；
(ii)添加如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
类似地，本发明还提供了一种用于通过检测样品中唾液酸酶的裂解活性来诊断所述测试样品中的细菌性阴道病的方法，所述方法包括：
(i)将所述测试样品添加到包括如本文所定义的捕获分子的捕获区，所述捕获分子与如本文所定义的指示剂分子的所述捕获位点结合，其中无论所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解是否发生，所述捕获分子都保持与所述捕获位点结合；
(ii)添加如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解，其中与对照物相比增加的裂解水平诊断出细菌性阴道病。
因此，对于那些通过捕获分子(即，在与测试样品接触之前)将指示剂分子(预)固定在捕获区中的实施例，在方法的步骤(i)之前，可以将指示剂分子添加到捕获区，使得指示剂分子通过捕获分子结合在捕获区中。结合分子的添加可以在将测试样品添加到捕获区的同时或之后进行。因此，方法的步骤(i)和(ii)可以依次或同时发生。
在本文提供的方法的上下文中，将结合分子“添加”到测试样品的步骤应理解为涵盖使结合分子与测试样品接触的任何步骤。因此，此步骤可以涵盖将测试样品施加到包括结合分子的装置的步骤。结合分子可以在溶液中，或者可以在载体上。例如，可以将结合分子干燥到或以其它方式浸渍到固相载体中或固相载体上，所述固相载体可以是本文其它地方讨论的“缀合物垫”。在优选实施例中，使测试样品与在其上已经干燥的结合分子的固相载体接触。测试样品中包括的液体和/或添加到载体中的液体使结合分子溶解。
在使结合分子干燥到或以其它方式浸渍到固相载体中或固相载体上的实施例中，固相载体优选地包括玻璃纤维、聚酯纤维或具有类似性质的材料或由其组成。固相载体应优选地具有以下性质中的一种或多种：基本重量约75g/m2；卡尺约0.38-0.43mm；芯吸速率约3-5(s/2cm)；和/或吸水率约63-79mg/cm2。因此，缀合物垫可以具有这些性质。类似地，样品垫可以具有这些性质。
尽管在优选实施例中，结合分子不能与指示剂分子结合，除非并且直到唾液酸化基团通过样品中存在的唾液酸酶从指示剂分子中裂解，在一些实施例中，相对于如本文其它地方所描述的唾液酸化形式，结合分子优先地与指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合。因此，可以发生与唾液酸化指示剂分子的某种程度的结合(在一些情况下，这可以被认为是背景信号)。然而，由于结合分子将优先地与去唾液酸化衍生物结合，因此相比其中唾液酸化指示剂分子未裂解或不存在指示剂分子的样品，包括去唾液酸化衍生物的样品中产生的信号要大得多。
为了考虑唾液酸酶活性的背景水平(如果存在的话)，方法通常涉及将在测试样品中测量的裂解水平与对照物进行比较。通常，对照物表示健康受试者中对应的唾液酸酶活性水平。“健康受试者”意指不患有BV的受试者。对照物可以在取自匹配的健康对照者的对应测试样品中。可替代地，对照物可以是通过确定一系列健康和患病患者中的唾液酸酶活性而设置的唾液酸酶活性的阈值水平。设置阈值的合适方法是本领域技术人员众所周知的。阈值可以从患者数据的训练集中数学地得出。评分阈值因此根据BV的存在或不存在来分离测试样品。可以在开发或训练阶段从一组具有已知结果的患者中得出此量的解释，即，截止阈值。因此，可以在从训练数据通过本领域技术人员已知的方法执行所要求保护的方法之前固定阈值。
例如，如实施例中所展示的，可以使用立方读取器，例如，来自德国柏林的Schwarzschildstrasse 1，D-12489的OpTricon GmbH(化学生物诊断系统(ChembioDiagnostic systems))的Optricon读取器。举例来说，在实例中使用的测定中，小于10的立方读数与不存在视觉信号相关，并且被认为是阴性结果，并且因此指示不存在细菌性阴道病；并且至少30个单位的立方读数与强视觉信号相关，并且被认为是阳性结果，并且因此指示存在细菌性阴道病。
10-20个单位的立方读数与微弱的视觉信号相关，并且被认为是可以指示不存在已确立的细菌性阴道病的结果，但可以指示低的感染水平，例如，早期细菌性阴道病。
在特定实施例中，要检测的唾液酸酶源自普氏菌、拟杆菌和/或动弯杆菌和/或阴道加德纳菌。
本发明的酶检测装置和物质组合物可以以准备立即使用的形式供应。可替代地，基本组分可以作为成套试剂盒提供，任选地与合适的试剂和/或用于酶检测装置组装的说明书一起提供。因此，在另一方面中，本发明提供了一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)如本文所定义的指示剂分子，所述指示剂分子用于添加到所述测试样品；
(ii)如本文所定义的捕获分子，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合；
(iii)固相载体，所述捕获分子可以与所述固相载体连接以形成用于收纳所述测试样品的捕获区；以及
(iv)如本文所定义的结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生。
在相关的方面中，本发明还提供了一种如本文所描述和定义的酶检测装置或物质组合物的用途，其用于在测试样品中诊断BV。类似地，本发明还提供了一种如本文所描述和定义的方法的用途，其用于在测试样品中诊断BV。本发明进一步提供了一种如本文所描述和定义的酶检测试剂盒的用途，其用于在测试样品中诊断BV。
在某些实施例中，本发明可以在侧向流动或垂直流动装置中执行。因此，通常，本发明依赖于某种形式的固相载体。固相载体可以限定样品的液体流动路径。在具体实施例中，固相载体包括色谱介质或毛细管流动装置。在一些实施例中，本发明可以以测试条形式提供。
在本发明的具体实施例中，捕获区形成在固相载体上。涵盖可以与捕获分子连接的任何载体以形成捕获区。固相载体可以采取例如珠粒(例如，琼脂糖或琼脂糖珠粒)或孔(例如，在微板中)的形式。因此，在某些实施例中，装置包括固相载体，捕获分子与所述固相载体连接以形成捕获区。在本发明的试剂盒的情况下，可以提供没有与捕获分子连接的固相载体。在那些实施例中，试剂盒的使用者可以在将装置与测试样品一起使用之前将捕获分子固定在固相载体上以形成捕获区。因此，试剂盒还可以包括用于将捕获分子固定在固相载体上的装置。固定装置可以包括任何合适的试剂以允许要形成捕获区。固相载体可以用合适的固定方式预先形成。例如，固相载体可以包括生物素分子，所述生物素分子被布置成与形成捕获分子(的一部分)的亲和素(例如，链霉亲和素)分子相互作用。当然，如本文所讨论的和本领域技术人员将容易理解的，其它结合对相互作用可以用于将捕获分子固定在固相载体上以形成捕获区。
捕获区可以通过将能够与指示剂分子的捕获位点结合的捕获分子固定在其中或在其上来限定。捕获分子的固定化可以通过任何合适的方式来实现。其中装置是包括色谱介质的流动装置，捕获分子可以通过直接结合到介质而被固定，或通过结合到与介质缔合或结合的载体分子(如蛋白质)而间接地被固定。
在另外的实施例中，固相载体进一步包括施加有样品的样品施加区。样品施加区可以预先装载有指示剂分子，使得当施加测试样品时，样品中的任何酶都作用于样品施加区内的指示剂分子的裂解位点。样品施加区可以含有使样品保持在样品施加区中预定的时间段的屏障。这允许样品与指示剂分子相互作用足够长的持续时间以达到可测量的裂解水平。如本领域技术人员将容易理解的，这可以是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、60分钟或更长时间，这取决于要检测的唾液酸酶。约5-15分钟、5-10分钟或约5分钟是优选的。在此时间段之后，屏障可能会被样品降解或以其它方式去除，从而允许样品继续流过装置。可替代地，可以在将混合物添加到装置如样品施加区之前，将测试样品和指示剂分子进行预混合或预温育。然而，在可以预先混合或预先温育测试样品和指示剂分子的情况下，可以省略样品施加区。此处，可以可能将混合物直接添加到捕获区，以允许指示剂分子通过与捕获分子的相互作用而固定。在一些实施例中，可以将测试样品施加到捕获区上游处的色谱介质，使得例如通过毛细管作用将其抽吸通过捕获区。色谱介质可以由流体能够穿过的任何材料制成，如流体通道或多孔膜。在本发明的某些实施例中，色谱介质包括条或膜，例如，硝化纤维素条或膜。
指示剂分子可以存在于载体上，所述载体应该是惰性材料并且优选地是多孔的。其可以是合适的聚合物，如聚四氟乙烯。例如，载体可以是惰性多孔膜盘。指示剂分子可以例如已经被冷冻干燥到载体上。在优选实施例中，可以在将混合物添加到装置之前，将测试样品和指示剂分子进行预混合或预温育。这可以涉及使样品与包括指示剂分子的载体接触，优选地以冻干形式。这可以例如在如管的容器中完成。优选地，将样品和指示剂分子温育至少3、4或5分钟且不超过30分钟，优选地温育约5-15分钟、5-10分钟或约5分钟，例如，3-7分钟或4-6分钟。
技术人员将能够确定各种组分的合适的量和浓度，但是举例来说，对于单个测定或在单个试剂盒中，指示剂分子优选地以至少30、40、50、60、70、80、90或100ng的量存在，更优选地以至少或约110、120、130、140、150、160、170、180或190ng的量存在。
如果唾液酸化基团通过样品中存在的唾液酸酶从指示剂分子中裂解，则必须以允许与指示剂分子进行相互作用的方式在装置中提供结合分子。因此，结合分子可以在施加到装置之前与指示剂分子预混合。这可以在指示剂分子与测试样品已经混合之前或之后。优选地是在避免结合分子可能对指示剂分子的裂解位点处的酶活性(在测试样品中)具有任何影响之后。结合分子可以优选地在捕获区上游的任何点处提供在装置上或装置中，使得结合分子在指示剂分子被固定(通过指示剂分子的捕获位点与限定捕获区的捕获分子之间的相互作用)之前遇到测试样品和指示剂分子。可替代地，可以在将测试样品和指示剂分子添加到捕获区之后，将结合分子添加到捕获区。这确保了任何指示剂分子将已经被固定在捕获区处，从而(在裂解的(即，去唾液酸化)指示剂分子的情况下)为结合分子提供结合位点以产生信号。
固相载体可以进一步包括对照区，所述对照区相对于样品流和样品施加区(如果存在的话)位于捕获区下游，所述对照区含有另外的结合分子(在本文中被称为“对照检测结合剂”)，所述另外的结合分子与结合分子结合以指示使用装置成功完成了测定。可替代地，另外的结合分子(对照检测结合剂)可以与另外的分子结合(在本文中被称为“对照检测分子”)，将所述另外的分子添加到样品或装置中并且与样品一起流过装置。另外的分子(对照检测分子)可以用本文所定义的报道分子直接或间接标记。为了便于检测，优选地，报道分子和与结合分子连接的报道分子相同，尽管可以不同。
对照区在空间上与捕获区分离，例如，如果将报道结合或固定在每个相应区中，则产生两条分离的测试线。此对照区用于确认包含结合分子在内的测试样品已经穿过整个装置，并确认装置操作正确。不管样品中是否存在唾液酸酶活性，预期在对照区处有阳性信号。基于与指示剂分子的裂解位点结合的结合分子的性质或基于添加到样品中的另外的分子的性质来选择另外的结合分子。结合分子和另外的结合分子或另外的分子和另外的结合分子可以形成如本文所定义的结合对。例如，如果结合分子是物种特异性抗体(例如，绵羊抗体)，则另外的结合分子可以是抗物种抗体(例如，抗绵羊抗体)。例如，对照检测分子可以是鸡IgY抗体，并且对照检测结合剂可以是抗鸡IgY抗体，或者反之亦然。可替代地，如果另外的分子是来自不同物种的抗体，例如，鸡或山羊，另外的结合分子可以是适当的抗物种抗体。这允许通过特异性相互作用将结合分子或另外的分子固定在对照区处。可以通过任何合适的方式，例如，通过共价或非共价相互作用将另外的结合分子固定在对照区中。
根据本发明的所有方面，测试样品可以是阴道样品，任选地是阴道拭子。可以通过任何合适的方式收集测试样品并以适合于本发明使用的任何形式存在。通常，使用无菌拭子收集样品。此外，作为从其原始来源获得测试样品的一部分，在使用本发明进行测试之前，可以对样品进行一个或多个处理或预处理步骤。在一个实施例中，可以处理样品以产生用于测试的溶液或悬浮液。此外，在某些实施例中，可以储存测试样品，例如，在约-20℃下冷冻，作为在使用本发明进行测试之前将样品保存任何给定时间长度的方式。
应当注意的是，本发明通常基于分离的样品在体外进行。在一些实施例中，例如，本发明的方法可以包含获得用于测试的样品的步骤，例如，使用无菌拭子。
鉴于上述内容，本发明可以通过以下编号的条款进一步定义：
1.一种肽，所述肽包括以下序列：
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
其中：
(i)Sial是唾液酸化基团；
(ii)X3是包括糖基受体基团的天然或非天然氨基酸；并且
(iii)X1、X2、X4和X5独立地选自任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
2.根据条款1所述的肽，其中X3选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或磷酸丝氨酸(SEP)。
3.根据条款2所述的肽，其中X3是Ser。
4.根据条款1到3中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5中的至少两个、三个或所有四个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
5.根据条款1到4中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5包括至少两种、三种或四种不同的氨基酸。
6.根据条款1到5中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是疏水性氨基酸。
7.根据条款1到6中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是Ala。
8.根据条款1到7中任一项所述的肽，其中X1和X2均为Ala。
9.根据条款7或8所述的肽，其中Ala是DAla或βAla。
10.根据条款1到9中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是带电氨基酸。
11.根据条款10所述的肽，其中每个带电氨基酸选自Arg、DAsp和LOrn。
12.根据条款1到11中任一项所述的肽，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是极性氨基酸。
13.根据条款12所述的肽，其中每个极性氨基酸选自LSer、DSer和Thr。
14.一种肽，所述肽包括以下序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
其中：Sial是唾液酸化基团；X1不存在或者是Thr；X2不存在或者是DAla；X3不存在或者是Nle；
X4不存在或者是Glu；X5不存在或者是DAla；X6不存在或者是Arg；X7不存在或者选自Glu、Arg、Ser、Nva、βAla；X8不存在或者选自DSer、DAla、SEP、Cyc；
X9不存在或者选自Nva、BIP、DAla、βAla、Orn；
X10选自Cyc、Ser、Ile、DAla、DSer；X11选自DAla、Pro、Orn、Nle；
X12选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或SEP；
X13选自DAla、BIP、βAla；X14选自Arg、DAsp、Nle、Orn、Nva；
X15不存在或者选自Phe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSer；
X16不存在或者选自DSer、Glu；
X17不存在或者选自Val、Ser、Thr；X18不存在或者是Cha；
X19不存在或者是DSer；X20不存在或者是Val。
15.根据条款14所述的肽，其中X12是Ser。
16.根据条款1到15中任一项所述的肽，其中所述肽包括以下序列：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg；
(ii)Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val；
(iii)Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser；
(iv)Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu；
(v)DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser；或
(vi)Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val。
17.根据条款15或16中任一项所述的肽，其中Nle、Nva、Orn和/或Cha分别是LNle、LNva、LOrn和LCha。
18.根据条款1到17中任一项所述的肽，其中所述肽偏向于通过一种或多种特异性唾液酸酶进行裂解。
19.根据条款18所述的肽，其中所述一种或多种特异性唾液酸酶是细菌来源的。
20.根据条款19所述的肽，其中所述细菌是普氏菌、拟杆菌和/或动弯杆菌和/或阴道加德纳菌。
21.一种指示剂分子，其用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在时使用，所述指示剂分子包括：
a)如条款1到20中任一项所定义的肽；以及
b)捕获位点，所述捕获位点在所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解之后保持完整。
22.根据条款21所述的指示剂分子，其中所述捕获位点包括生物素分子或肟部分。
23.根据条款21或22所述的指示剂分子，其中所述捕获位点可以位于所述肽的N端或C端处。
24.根据条款21到23中任一项所述的指示剂分子，其中所述捕获位点通过接头与所述肽连接。
25.根据条款24所述的指示剂分子，其中所述接头包括聚乙二醇(PEG)部分。
26.根据条款25所述的指示剂分子，其中所述肽通过包括聚乙二醇部分、基本上由其组成或由其组成的接头在其N端或C端与生物素基团连接。
27.根据条款21到26中任一项所述的指示剂分子，其中所述指示剂分子包括以下结构：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素；
(ii)生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val；
(iii)生物素-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser；
(iv)生物素-PEG-Asp-Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu；
(v)生物素-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser；或
(vi)生物素-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val。
28a.一种抗体，其能够与以下特异性结合：根据条款1到20中任一项所述的肽的去唾液酸化衍生物，或者根据条款21到27中任一项的指示剂分子，其中相对于唾液酸化肽或指示剂分子，所述抗体优先与去唾液酸化衍生物结合。
28b.一种抗体，其具有带3个CDR的重链和带3个CDR的轻链的抗体，其中重链CDR1具有SEQ ID NO:1；重链CDR2具有SEQ ID NO:2；重链CDR3具有SEQ ID NO:3；轻链CDR1具有SEQ ID NO:4；轻链CDR2具有SEQ ID NO:5；和/或轻链CDR3具有SEQ ID NO:6。
28c.一种抗体，其具有带SEQ ID NO:7的重链和/或具有带SEQ ID NO:8的轻链。
任何对“条款28”的提及应理解为涵盖条款28a、条款28b和条款28c。
29.根据条款28所述的抗体，其中所述抗体可以与以下特异性结合：表位Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-生物素，更具体地表位Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg。
30.根据条款28或29所述的抗体，其中所述抗体与报道分子缀合。
31.根据条款30所述的抗体，其中所述报道分子是金颗粒。
32.一种肽，其用于在产生根据条款28所述的抗体时使用，其中所述肽是如条款1到20中任一项所定义的所述肽的去唾液酸化衍生物。
33.根据条款32所述的供使用的肽，其中所述肽与载体蛋白缀合以提高免疫原性。
34.根据条款33所述的供使用的肽，其中所述肽与钥孔虫戚血蓝蛋白缀合。
35.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，所述装置包括：
(i)如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子；
(ii)捕获区，所述捕获区用于收纳所述测试样品，其中所述捕获区包括无论所述指示剂分子是否已经裂解都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合的捕获分子，以便固定所述指示剂分子；以及
(iii)结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生。
36.根据条款35所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，其中所述装置、试剂盒或物质组合物包括与所述捕获分子连接的固相载体以形成所述捕获区。
37.根据条款36所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，其中所述固相载体进一步包括施加有所述样品的样品施加区。
38.根据条款36到37中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，其中所述固相载体进一步包括对照区，所述对照区相对于所述样品施加区位于所述捕获区下游，所述对照区含有另外的结合分子，所述另外的结合分子与所述结合分子结合以指示使用所述装置、试剂盒或物质组合物成功完成了测定。
39.根据条款36到38中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，其中所述固相载体包括色谱介质。
40.根据条款35到39中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，其中所述指示剂分子通过与所述捕获分子结合的所述捕获位点固定在所述捕获区中。
41.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)使如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
42.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)将所述测试样品添加到包括捕获分子的捕获区，所述捕获分子与如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子的所述捕获位点结合，其中无论所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解是否发生，所述捕获分子都保持与所述捕获位点结合；
(ii)添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
43.根据条款42所述的方法，其中在步骤(i)之前，将所述指示剂分子添加到捕获区，使得所述指示剂分子通过所述捕获分子结合在所述捕获区中。
44.一种用于通过检测样品中唾液酸酶的裂解活性来诊断所述测试样品中的细菌性阴道病的方法，所述方法包括：
(i)使如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解，其中与对照物相比增加的裂解水平诊断出细菌性阴道病。
45.一种用于通过检测样品中唾液酸酶的裂解活性来诊断所述测试样品中的细菌性阴道病的方法，所述方法包括：
(i)将所述测试样品添加到包括捕获分子的捕获区，所述捕获分子与如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子的所述捕获位点结合，其中无论所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解是否发生，所述捕获分子都保持与所述捕获位点结合；
(ii)添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生；
(iii)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解，其中与对照物相比增加的裂解水平诊断出细菌性阴道病。
46.根据条款45所述的方法，其中在步骤(i)之前，将所述指示剂分子添加到捕获区，使得所述指示剂分子通过所述捕获分子结合在所述捕获区中。
47.根据条款41到46中任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶源自普氏菌、拟杆菌和/或动弯杆菌和/或阴道加德纳菌。
48.根据条款41到47中任一项所述的方法，其中所述方法使用根据条款35到40中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物执行。
49.根据条款41、44或47中任一项所述的方法，其中所述方法使用根据条款35到39中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物执行，进一步其中在使所述测试样品与所述装置、试剂盒或物质组合物接触之前，将所述测试样品和指示剂分子混合。
50.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)如条款21到27中任一项所定义的指示剂分子，所述指示剂分子用于添加到所述测试样品；
(ii)捕获分子，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合；
(iii)固相载体，所述捕获分子可以与所述固相载体连接以形成用于收纳所述测试样品的捕获区；以及
(iv)结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生。
51.根据条款50所述的酶检测试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括另外的结合分子(对照检测结合剂)，所述结合分子能够与所述结合分子结合。
52.根据条款51所述的酶检测试剂盒，其中所述固相载体进一步包括对照区，所述对照区相对于所述样品施加区位于所述捕获区下游，所述另外的结合分子(对照检测结合剂)可以与所述对照区连接。
53.一种根据条款35到40中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物、根据条款41到49中任一项所述的方法或根据条款50到52中任一项所述的酶检测试剂盒，其中所述结合分子包括根据条款28到31中任一项所定义的抗体。
54.一种根据条款35到40或53中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物、根据条款41到49或53中任一项所述的方法或根据条款50到53中任一项所述的酶检测试剂盒，其中所述捕获位点包括生物素分子，并且所述捕获区包括链霉亲和素分子。
55.一种根据条款35到40、53或54中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物、根据条款41到49、53或54中任一项所述的方法或根据条款50到54中任一项所述的酶检测试剂盒的用途，其用于在测试样品中诊断细菌性阴道病。
56.根据条款21到27中任一项所述的指示剂分子、根据条款35到40、53或54中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物、根据条款41到49、53或54中任一项所述的方法、根据条款50到54中或条款55中使用的任一项所述的酶检测试剂盒，其中所述测试样品是阴道样品，任选地是阴道拭子。
附图说明
现在将参考附图通过举例的方式描述本发明，在附图中：
图1是根据本发明的测定的一种形式的示意图。形式依赖于以下基本组分：固相载体(1)；捕获分子(2)；指示剂分子，所述指示剂分子包括捕获位点(3)和本发明的肽，肽包括Gal-Sial裂解位点(4)；以及结合分子(5)，所述结合分子仅在裂解(6)发生之后才与指示剂分子结合。指示剂分子Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素(SEQ ID NO:11-PEG-生物素；在本文中也被称为“MOL600c”)通过举例的方式示出。
图2是根据本发明的酶检测装置的示意图，并且示出了在不存在(图2A)或存在(图2B)唾液酸酶活性的情况下装置的操作。
图3示出了随着测试样品中唾液酸酶活性的水平升高，测定(如图2所示)的视觉读数。
图4是根据本发明的酶检测装置的示意图。此图指定了卡组件中的每个卡组件的确切纵向尺寸和位置。
图5是用于将本发明的肽与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)偶联的两种缀合化学的示意图：(A)半胱氨酸/马来酰亚胺偶联；(B)肼/苯甲醛偶联。
图6示出了在设计本发明的肽期间采用的一些非标准和非天然氨基酸。
图7是总结用于生产本发明的肽的合成方法的示意图。
图8示出了使用转唾液酸酶(transialidase)和胎球蛋白(唾液酸供体)经由酶促途径生产本发明的唾液酸化肽。
图9示出了合成的各种肽和肽-蛋白缀合物作为本发明的一部分。(A)合成的肽和肽-蛋白缀合物的表格总结。(B)合成的肽和肽-蛋白缀合物的示意性概述。
图10示出了用本发明的KLH-肽缀合物对绵羊进行免疫之后的初始ELISA结果。(A)检测方法的示意图；(B)-(D)第一出血物的结果，表明所有绵羊均对免疫作出应答。编号1056、1057、1058、1059、1062、1063、1064、1065、1066和1067分别表示来自特异性免疫绵羊的抗血清。
图11A-C示出了图10中描述的绵羊第二出血物的ELISA结果。相对于第一出血物，第二出血物中作出应答的抗血清有所增加。
图12A-B示出了对绵羊CF1062-1067的所有三种出血物进行的比较。
图13示出了当针对MOL136和MOL136c评估抗血清CF1064时的ELISA结果。(A)检测方法的示意图；(B)ELISA结果示出对半乳糖基(即，去唾液酸化)肽MOL136的特异性显著优先于对唾液酸化肽MOL136c的特异性。
图14示出了使用金标记的CF1064通过侧向流动测定检测去唾液酸化肽MOL136，相对于唾液酸化肽MOL136c，观察到很少/没有信号或阴性对照物(样品中不包含肽)。
图15示出了使用金标记的CF1064和CF1065通过侧向流动测定检测去唾液酸化肽MOL136，相对于唾液酸化肽MOL136c，观察到很少/没有信号或阴性对照物(样品中不包含肽)。
图16示出了在存在健康的阴道拭子提取物的情况下对MOL136和MOL136c与金标记的CF1064的结合进行比较的侧向流动测定。
图17示出了在存在25U/ml唾液酸酶的情况下MOL136c的侧向流动测定。
图18示出了示出不同亲和纯化的抗血清级分之间的比较的侧向流动数据。(A)线强度的图形表示；(B)观察到的侧向流动测试条：(1)-金敏感的亲和纯化的多克隆抗体，(2)-金敏感的亲和纯化的多克隆抗体，其中去除了交叉反应抗体，(3)来自亲和纯化的金敏感的交叉反应抗体。
图19示出了(A)通过ELISA对MOL136、MOL136c、MOL600和MOL600c结合进行的比较，以及(B)示出与MOL136/136c相比性能显著改善的侧向流动实验(参见图18)。
图20示出了在不同的储存温度下和用两种不同的热干燥方法，在聚丙烯管中的热干燥的MOL600c的稳定性数据：快速真空和加热块方法。将ELISA中的测量值标准化为去唾液酸化百分比，因为这将导致通过抗体进行识别并增加信号。
图21示出了MOL600c批次的典型数据。(A)HPLC痕量分析；(B)阳离子电喷雾MS确认。
图22是示出使用不同琼脂糖基质进行抗体纯化的柱方法的示意图。关于MOL600和MPL600c示出的橙色标签表示生物素。关于MOL615示出的紫色标签表示肟基。
图23示出了在37℃下12周内储存的侧向流动盒的稳定性数据。
图24示出了与肽MOL600c温育5分钟的唾液酸酶浓度的侧向流动标准曲线。使用立方读取器对测试线进行定量。
图25示出了健康的志愿者阴道样品在群拭子上的侧向流动测试。在1ml样品缓冲液中提取样品并将其以五种方式分裂。(A)但没有肽的样品；(B)具有MOL600c的样品；(C)具有MOL600c和以500U/ml的唾液酸酶处理5分钟的样品；(D)用MOL600c离心的样品；(E)将具有MOL600c的样品和相同的唾液酸酶温育离心。
图26示出了MOL616的化学式。
图27示出了示出相对于唾液酸化形式MOL600c，抗体125.1对MOL600的特异性的实例13的结果。
图28示出了使用一系列不同唾液酸酶浓度的测定A和B的比较。对于每种唾液酸酶浓度，左条表示测定B的立方读数，并且右条表示测定A的立方读数。
图29示出了使用一系列不同唾液酸酶浓度和读取时间的测定A和B的比较。对于每种唾液酸酶浓度，条从左到右表示(i)5分钟读取时间之后，测定A的立方读数；(ii)10分钟读取时间之后，测定A的立方读数；(iii)5分钟读取时间之后，测定B的立方读数；以及(iv)10分钟读取时间之后，测定B的立方读数。
图30示出了使用一系列不同唾液酸酶浓度、指示剂浓度和读取时间的测定A、A'、B和B'的比较。。对于每种唾液酸酶浓度，条从左到右表示(i)针对每盘含1μg/ml指示剂分子，并且读取时间为5分钟的测定B的立方读数；(ii)针对每盘含3μg/ml指示剂分子，并且读取时间为5分钟的测定B的立方读数；(iii)针对每盘含1μg/ml指示剂分子，并且读取时间为10分钟的测定A的立方读数；以及(iv)针对每盘含3μg/ml指示剂分子，并且读取时间为10分钟的测定A的立方读数。
图31示出了指示CDR和框架区的抗体125.1的序列。
具体实施方式
图1是根据本发明的测定的一种形式的示意图。形式依赖于以下基本组分：固相载体(1)；捕获分子(2)；指示剂分子，所述指示剂分子包括捕获位点(3)和本发明的肽，肽包括Gal-Sial裂解位点(4)；以及结合分子(5)，所述结合分子仅在裂解(6)发生之后才与指示剂分子结合。指示剂分子Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素(在本文中也被称为“MOL600c”)通过举例的方式示出。
在所示形式中，捕获分子(2)是链霉亲和素。此处，捕获分子(2)与指示剂分子内的生物素捕获位点(3)结合。
如图1A所示，一旦将本发明的指示剂分子添加到测试样品中，样品中存在的唾液酸酶就会特异性识别Gal-Sial裂解位点(4)并从指示剂分子中裂解唾液酸化基团(6)。
如图1B所示，此裂解事件(6)产生了特异性抗体结合分子(5)的结合位点。结合分子(5)不能与指示剂分子结合，直到裂解(6)已经发生。因此，抗体结合分子(5)与由于唾液酸化基团的裂解而产生的氨基酸序列Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg结合。抗体结合分子(5)在裂解之前不与Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg序列结合(未示出)。
图2是根据本发明的酶检测装置的示意图，并且示出了在不存在(图2A)或存在(图2B)唾液酸酶活性的情况下装置的操作。测试条包含其上组装有装置的其它组件的粘合衬垫(1)。从右到左，样品施加区(2)呈吸收垫的形式。将所述样品施加区部分重叠置于在缀合物垫(3)上，所述缀合物垫用标记的结合分子(7)浸渍。在替代性实施例中，可以将标记的结合分子浸渍在样品施加区中，并且这去除了对单独的缀合物垫的需要。缀合物垫(3)与硝酸纤维素膜(4)流体连接。硝酸纤维素膜(4)含有限定捕获区的固定的链霉亲和素分子(5)。膜(4)进一步含有在捕获区下游的固定的另外的结合分子(6)，所述另外的结合分子与另外的标记的分子(11)结合，所述另外的标记分子与样品一起穿过装置并形成单独的对照区。可替代地，固定的另外的结合分子可以与标记的结合分子(7)结合。装置任选地进一步包括吸收垫(8)，以吸收到达装置末端的任何测试样品和试剂。
在使用中，在使测试样品与装置的样品施加区域(8)接触之前，将指示剂分子(9)添加到测试样品中。如图2A所示，在测试样品中不存在唾液酸酶活性的情况下，唾液酸化基团没有从指示剂分子(9)中裂解。在样品流入缀合物垫(3)时，因为唾液酸化基团的裂解未发生，所以结合分子(7)不能与指示剂分子(9)结合。指示剂分子通过链霉亲和素(5)与指示剂分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用在捕获区处结合。标记的结合分子(7)没有固定在捕获区域处，因为其无法与指示剂分子(9)结合。因此，标记的结合分子流过对照区及其它区域。另外的标记的分子(11)也穿过装置到达对照区，在所述对照区，所述另外的标记的分子通过与固定的另外的结合分子(6)结合而被固定。因此，不存在唾液酸酶活性的情况仅在对照区处显示为信号，而不在捕获区处显示为信号。可能含有标记的结合分子(7)的过量样品流入吸收垫(8)。
如图2B所示，在测试样品中存在唾液酸酶活性的情况下，唾液酸化基团从指示剂分子(9)中裂解。在样品流入缀合物垫(3)时，因为唾液酸化基团的裂解已经发生，所以结合分子(7)可以与指示剂分子(9)结合。指示剂分子通过链霉亲和素(5)与指示剂分子(9)的生物素捕获位点(10)之间的相互作用在捕获区处结合。标记的结合分子(7)由于在裂解位点处与去唾液酸化指示剂分子(9)结合而被固定在捕获区处。由于标记的结合分子(7)相对于捕获区处的结合位点相对过量，一些标记的结合分子(7)仍流经对照区及其它区域。另外的标记的分子(11)也穿过装置到达对照区，在所述对照区，所述另外的标记的分子通过与固定的另外的结合分子(6)结合而被固定。因此，存在唾液酸酶活性的情况在捕获区处和对照区处两者均被显示为信号。过量的样品流入吸收垫(8)。
应当注意的是，对照区是任选的。样品中存在或不存在唾液酸酶活性可以仅基于捕获区域处存在或不存在对应信号来进行监测。
图3示出了随着测试样品中唾液酸酶活性的水平升高，测定(如图2所示)的视觉读数。可以容易地看出，随着唾液酸酶量的增加，对照区(1)处的信号是恒定的。相比之下，随着唾液酸酶量的增加，捕获区(2)处的信号也增加。这是由于唾液酸化基团通过唾液酸酶活性在裂解位点处从指示剂分子中裂解了。这显露了结合位点，使得能够与结合分子结合，所述结合分子通过限定捕获区的捕获分子与指示剂分子的捕获位点之间的相互作用在捕获区(2)处被检测到。
图4是根据本发明的一种特异性酶检测装置的示意图。下表提供了此图的图例，并指定了此特定实施例中卡组件中的每个卡组件的确切纵向尺寸和位置。
当然，如本领域技术人员容易理解的，尺寸和位置可以变化。
| 组分 | 大小 | 基准点的位置 |
| 背衬卡(1) | 60mm | 0mm |
| 硝酸纤维素膜(2) | 25mm | 20mm |
| 缀合物垫(3) | 17mm | 5mm |
| 样品垫(4) | 10mm | 0mm |
| 吸收垫(5) | 22mm | 38mm |
参考以下实验实例，将进一步理解本发明。
实例
实例1：测定化学原则和实验设计
总之，原则基于抗体识别唾液酸酶反应的化学产物起作用，其中化学底物是专门设计用于与唾液酸酶反应的肽，并且然后反应产物由针对所述合成产物产生的抗体识别。如图1和2所示，提供了含有唾液酸并具有生物素标签的糖肽。当与含有唾液酸酶活性的测试样品接触时，唾液酸化基团通过唾液酸酶从糖肽中裂解，以暴露肽上的侧半乳糖基基团。然后针对去唾液酸化产物产生的抗体与裂解的产物特异性结合。通过使用抗体-金缀合物和带有链霉亲和素测试线的侧向流动条，可以将存在去唾液酸化产物的情况检测为红线，以及在样品中直接测量的唾液酸酶活性。
最初设计了五种肽，并且随后评估了产生的抗体，并对其在侧向流动测定中的性能进行了描绘。这示出，在优化条件下，抗体中的一些抗体在与底物肽的交叉反应性和测定中的总体信号水平方面的性能优于其它抗体。在下文针对项目可行性阶段所描述的评估中，对肽进行了重新评估，并将具有最佳性能的肽/抗体组合用于进一步开发。
实例2：肽设计
在候选肽序列的设计中，考虑了许多因素：
大小
通常，分子量(MW)小于5000道尔顿的分子不太可能在宿主生物中刺激良好的免疫应答。肽被计划为相对较短的序列，旨在与KLH(钥孔虫戚血蓝蛋白)缀合，从而产生更多更有效的免疫原。提出了一系列不同的长度(9-20个氨基酸)以覆盖任何潜在的性能变化。
缀合化学
使用了两种不同的缀合化学。对于肽中的两种肽，将半胱氨酸标记物掺入结构中，使得可以使用基于标准马来酰亚胺的化学将其与载体蛋白缀合。对于其它三种肽，使用了一种作为比半胱氨酸化学更可控的过程法人相对较新的基于肼的化学，因为在偶联之前肽氧化的风险较小，并且偶联程度可以通过UV吸收容易地监测。这些缀合化学的概述如图5所示。
半乳糖的位置
目的是获得对半乳糖和肽的周围区具有非常高亲和力的抗体。考虑到这一点，决定将糖在结构中居中放置，使得所述糖侧翼适当地为其它独特的肽特征。此方法有望使与糖部分缺乏相互作用的外围结合抗体减至最少。
结构多样性
一系列氨基酸用于构建各种肽序列。通过沿着序列组合带电基团、亲水性基团和疏水性基团，将促进多种拓扑。还采用“铰链基团”(如β-丙氨酸)以允许在整个结构折叠中增加另外的自由度。除此以外，还采用非天然氨基酸来增加序列多样性并促进免疫应答。为了降低对蛋白酶的敏感性，还掺入了一些D-氨基酸。图6中示出了采用的非标准和非天然氨基酸中的一些。
考虑这些因素后，选择以下肽序列作为推定的表位。
将间隔子、缀合基团和生物素标记物添加到C端或N端。
实例3：肽合成
使用固相化学方法在自动化微波合成器上合成半乳糖标记的肽。使用反相HPLC纯化所有肽，并通过电喷雾LCMS表征。为了用唾液酸标记半乳糖部分，采用了使用了来自克鲁斯氏锥体虫(T.cruzi)的转唾液酸(TcTS)和胎球蛋白作为唾液酸供体的酶促途径。图7和8总结了所使用的合成方法。
以及还合成了与载体蛋白缀合的相关肽免疫原，每个序列的两个生物素化衍生物，其中一个用唾液酸标记。这些生物素化衍生物将形成侧向流动测定形式的基础。图9示出了根据各种免疫合成用于这项工作的肽。标记有唾液酸的肽用“c”指定；例如，MOL136c。缺少唾液酸化基团的肽没有此名称(例如，MOL136)。
实例4A：抗体产生
免疫
使用适当的偶联化学，所有五个肽免疫原均与KLH和BSA偶联(参见图9)。将KLH缀合物提交给微生物制药有限公司(Micropharm Ltd)以用于对十只绵羊进行免疫(每条肽两只)。用含1mg剂量的KLH肽的PBS开始程序。在三个月的持续时间内给予三剂另外的0.5mg的增强剂。在此期间抽取了三种单独的出血物(一种采样出血物和两种生产出血物)并供应给莫洛吉克公司(Mologic)。保留BSA缀合物以进行各种出血物的筛选。
初始ELISA筛选
用适当的BSA缀合物和非缀合BSA使聚苯乙烯高结合多孔板敏化。将血清样品以各种稀释度在BSA封闭的孔中温育，并进一步和与碱性磷酸酶(AP)缀合的次级抗绵羊抗体结合。与对硝基苯基磷酸酯(pNPP)AP底物一起温育表明存在任何结合。在所有情况下，缓冲液、BSA和前出血物对照物均导致与板的无背景结合。图10A示出了检测方法的示意图。图10B-10D示出了第一出血物的结果，表明所有绵羊均对免疫作出应答。血清稀释度为1/1000时产生高信号，而BSA的对照物为阴性，从而证实了肽的特异性应答。前出血物对照物也为阴性。
随着可获得另外的出血物，还通过ELISA分析了这些出血物，示出了随着时间的推移应答增强。图11展示了所有绵羊的前两种出血物之间的关系，而图12示出了与绵羊CF1062-1067相比所有三种出血物的关系。有趣的是，就所述所有绵羊对抗原的总体应答而言，第三出血物似乎处于稳定期或者甚至减少。然而，在一些情况下，在1/1000000稀释度下检测到结合应答，从而表明对肽高度敏感的多克隆应答。尽管在第三出血物中应答稍低，但由于所述第三出血物最有可能含有高度特异性抗体的亚群，因此所述第三出血物对所述亲和纯化是优选的。
实例4B：抗血清CF1064和CF1065以及MOL136和MOL136c的检测免疫原：KLH-MOL123A
生物素化肽：MOL136(半乳糖基)；MOL136c(唾液酸化)
两只绵羊对KLH-MOL123A免疫的应答良好，对CF1064的总体应答略强(参见图11B)。在ELISA形式中(其示意图如图13A中所示)，评估了CF1064针对MOL136和MOL136c的结合，从而示出了对半乳糖基(即，去唾液酸化)肽MOL136的显著的特异性(图13B)优先于唾液酸化肽MOL136c的特异性。因此，证明了抗血清CF1064对两种肽的优异区分。
在侧向流动形式中观察到类似的性质。在最佳条件下(在10mM硼酸钠缓冲液中装载15μg/ml；pH 8.0)将CF1064与金颗粒缀合，并以1.3ng/ml的最终浓度(每条38pg)针对MOL136和MOL136c进行测定。因此，首先使用1.5mg/ml链霉亲和素在每个侧向流动测试条上形成捕获区。然后，将3μl每种肽(含12.5ng/ml肽的PBST)与10μl金标记的CF1064和15μl运行缓冲液(pH 7.5的0.5M Tris+3％BSA+0.5％Triton X-100)混合，然后将每个样品沿着单独的侧向流动测试条运行。没有添加肽的阴性对照物也作为阴性对照物运行。然后沿每个侧向流动测试条运行15μl运行缓冲液洗涤。去唾液酸化肽MOL136在捕获区中明显检测到，在测试条上以可见线观察到。相反，与唾液酸化肽MOL136c或阴性对照物相比，观察到很少/没有信号(参见图14)。
使用金标记的CF1065观察到类似的结果，相对于CF1064，针对CF1065观察到更高的信号水平(参见图15)。
实例5：在存在健康的阴道拭子提取物的情况下使用CF1064进行MOL136和MOL136c的检测
在存在健康的阴道拭子提取物的情况下重复实例4B中所描述的程序。尽管信号水平稍低，但仍保留了对MOL136的特异性，而无拭子基质的任何干扰(参见图16)。
实例6：使用MOL136c和CF1064进行的唾液酸酶活性的检测
在存在25U/ml唾液酸酶的情况下重复实例4B中所描述的程序。将不存在唾液酸酶的样品用作阴性对照物。运行另外的阴性对照物，其中样品中不包含肽和唾液酸酶。作为阳性对照物，在存在25U/ml唾液酸酶的情况下，使用MOL136代替MOL136c。对于在存在25U/ml唾液酸酶的情况下在PBST中温育5分钟的MOL136c，观察到明显的阳性信号。信号水平在强度上与阳性对照物的信号水平类似，后者示出推定的最大信号。如预期的那样，对于阴性对照物，观察到很少/没有信号(参见图17)。
总体而言，CF1064和CF1065两者对半乳糖基(即，去唾液酸化)肽MOL136均显示出良好的特异性，并且均为单克隆筛选的潜在候选者。
实例7：肽开发
在对肽和抗血清进行评估之后，这示出血清CF1064和肽MOL136和MOL136c提供了最可行的测试组合。用与MOL136相同的肽序列对绵羊CF1064进行了免疫，但使用半胱氨酸-马来酰亚胺化学代替生物素作为KLH缀合物。
MOL136：生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val-OH；
MOL136c：生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val-OH。
为了纯化抗血清，设想了一种使用链霉亲和素柱捕获MOL136和MOL136c的方法。然后将抗体结合并从MOL136柱上洗脱，并且然后吸收到MOL136c柱上，以去除任何外围结合剂，从而拾取两个结构之间的共同表位。通过在侧向流中评估经过纯化的抗体，测量了对原始半乳糖基肽抗原的总体特异性以及与唾液酸化肽的交叉反应程度(图18)。这很重要，因为其表示了在原型中并且在不使用光学读取器的情况下以阴性结果观察到的非特异性结合的数量将需要显著减少，使得无法通过肉眼拾取。
与未吸收的材料相比，经过纯化和吸收的级分在测定中性能最佳。尽管背景信号显著降低，但需要进一步的方法开发以通过截短肽结构来改善性能。
为了更精炼肽设计并去除不结合肽中半乳糖部分的抗体的外围相互作用，将原始序列MOL136截短为较短的序列MOL600：
MOL600：NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-生物素；
MOL600c：NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素。
然后，通过ELISA对MOL600和MOL600c进行了测定并且侧向示出性能显著提高(参见图19)。
实例8：MOL600c调配物/稳定性研究和扩大生产
为了评估如何调配MOL600c肽，建立了一项研究以研究干燥条件。在干燥缓冲液中调配肽，风干并在室温下储存，然后以原型形式使用。数据在图20中示出，从而显示出在不同温度和不同干燥方法下聚丙烯管中储存的肽MOL600c的稳定性。肽在整个4周之前都保留了其功能，然而性能似乎在8周时下降。
对于制造来说，肽合成已经显示出是可扩大的，并且可以斜升到制造批次。通过在自动化系统上进行固相合成来生产肽，并且然后通过HPLC纯化。需要两个另外的化学步骤，并通过HPLC进一步最终纯化到>95％纯度的规格。产物通过电喷雾质谱法确认。由于每个测试仅需要12ng肽，因此1-2mg的肽批次具有足够的大小。图21示出了完整的MOL600c批次的典型分析数据。
实例9：抗体纯化开发
最初开发了与抗血清CF1064以及经过优化的截短的肽系统一起使用的纯化过程，以在装有MOL600的链霉亲和素柱和装有MOL600c的吸收柱上工作。尽管此过程产生了具有良好交叉反应性特征的有效抗体，但需要进一步改进以提高一致性并减少手动步骤的数量以用于自动化。
为了探索使用单程的更精炼方法，尝试了其它柱形式，并示出了所述其它柱形式是可行的并且有可能自动化(图22)。已经使用了两种不同的柱类型，并且过程已经从单程方法变到吸收后方法，在所述过程中，不想要的相互作用被消除以减少测定中的非特异性结合。用于制造的最佳选择是单程过程，并且这可以使用与载体BSA缀合并且然后衍生化到NHS琼脂糖柱上的肽MOL615来实现。
MOL615：NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-肟。
将原型中的抗体组分调配成干燥到侧向流动组合件内的缀合物垫中的金缀合物。已经建立了金缀合物稳定化的条件，并对其进一步进行了优化。每次测试所需的计算的抗体量估计为85ng，这足以产生实现CE标记的所需验证批次。从长远来看，将必须开发另外的多克隆试剂，并且作为更永久的解决方案，必须开发单克隆试剂。新的免疫已经开始，并且已经针对肽靶鉴定了强抗体滴度(图10)。若干种选择将用于单克隆产生，包含商业杂交瘤技术以及还有室内噬菌体淘选和fab产生(莫洛吉克约克和斯科舍生物制剂公司(MologicYork and Scotia Biologics))。
实例10：样品缓冲液
从拭子中提取样品、溶解肽以及唾液酸酶的最佳消化条件是样品缓冲液的原则要求。使用以下调配物：
100mM乙酸钠、2mM氯化钙、pH 6.0，含有0.1％BSA、0.125％Tween-20和0.375％Triton X-100。
缓冲液已经成功用于在干燥中运行装置并且还以加入标准的回收率提取实际样品。
实例11：侧向流动装置
根据图4构建了侧向流动装置。
评估了一批侧向流动装置在37℃下在12周内的稳定性。在6周之后，信号的值相比于早期的测量值有所增加，然而曲线的形状和动态范围似乎相对一致(参见图23)。
实例12：测定优化
为了满足可行的性能，评估了如测定时间长度、对标志物的应答敏感性、线信号强度和标准曲线质量等规格因素。
已经示出测定在5分钟的温育时间内起作用。这将会使测定从拭子样品收集到结果读取的总时间保持在15分钟之内。在体外诊断行业中，通常以15分钟为标准，作为定点照护快速测试的上限。
标志物(唾液酸酶)的整个相关范围据信为4U/ml到250U/ml。这基于通过估计与荧光唾液酸酶参考测定有关的样品数据集的传播得到的文献(Marconi等人,《欧洲产科学与妇科学以及生殖生物学杂志(European Journal of Obstetrics and Gynaecology andReproductive Biology)》,2013年,第167卷,第205-209页)。在此方法中进行了一些假设，因为在BV病状中，由于约20种不同的细菌物种与病状相关联，因此样品中将存在多种不同的表型(细菌唾液酸酶)。已经在缓冲液中跨这一范围的唾液酸酶测试了测定，并且已经以侧向流动获得了表示此范围的标准曲线(图24)。
也已经在实际健康样品上测试了测定，并且已经通过掺入唾液酸酶恢复了信号。已经示出样品是否被离心分离没有影响。测试线的外观不受样品基质的存在的不利影响(图25)。为了使样品具有足够的流动性，发现0.5ml的稀释样品缓冲液浓度过高，因为样品保留了太多的粘度。目前1ml被认为是要使用的适当的缓冲液量。
实例13：另外的抗体产生
选择了指定为MOL616的以下肽以产生另外的抗体：
Dpr(AOA)-dSer-Nva-Cyc-dAla-Ser(Gal)-dAla-Arg-Phe-dSer-Val-NH2。
MOL616的化学式示出于图26中。
将肽与KLH偶联，从而产生被称为KLH-MOL616的免疫原。用KLH-MOL616对兔子(穴兔)进行免疫，并且捕获脾细胞并用此肽的截短版本(MOL615，与BSA缀合)对脾细胞进行筛选。用肽MOL615的唾液酸化形式MOL615c执行计数器筛选。筛选过程涉及多克隆筛选、然后是亚克隆筛选，以产生对去唾液酸化形式具有特异性的抗体。
此过程导致产生被称为抗体125.1的单克隆抗体。此抗体对去唾液酸化的分子中存在的表位Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg-PEG-肟具有特异性，更具体地对去唾液酸化的肽中存在的表位Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg具有特异性。
使MOL615生物素化以产生MOL600(实例7中提供的序列)，并使用生物干涉测量法来测量抗体结合亲和力和动力学。简而言之，通过链霉亲和素/生物素相互作用将MOL600或MOL600c固定在生物传感器上。通过反射的光干扰中的偏移来检测抗体的结合。
使用不同浓度的抗体125.1(分别为1、2、4、8或16nM)，针对抗体125.1确定以下结合亲和力和动力学：
KD＝7.9nM；Kon＝54080M-1s-1；Koff＝0.000427s-1。
相比于唾液酸化形式MOL600c，结合明显对MOL600具有特异性，如图27所示。
对抗体进行测序并确定其具有γ重链和κ轻链。此抗体的序列示出于图31中并在下文列出。
抗体重链
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYSMDWVRQAPGKGLEWVGGITTTLHTFYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTDDAATYFCARGGSSVIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHEDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPG(SEQ ID NO:7)
抗体轻链
ALVMTQTPSPVSAAVGGTVTISCQSSQSVYGNNHLNWHQQKRGQPPKQLIGSASRLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYNGAWYVAFGGGTELEIKRDPVAPSVLLFPPSKEELTTGTATIVCVANKFYPSDITVTWKVDGTTQQSGIENSKTPQSPEDNTYSLSSTLSLTSAQYNSHSVYTCEVVQGSASPIVQSFNRGDC
(SEQ ID NO:8)
重链CDR序列
CDR1 GFSLSSY(SEQ ID NO:1)
CDR2 TTTLH(SEQ ID NO:2)
CDR3 GGSSVI(SEQ ID NO:3)
轻链CDR序列
CDR1 QSSQSVYGNNHLN(SEQ ID NO:4)
CRD2 SASRLAS(SEQ ID NO:5)
CDR3 QGSYYNGAWYVA(SEQ ID NO:6)
值得注意的观察：
在位置213与216之间的重链恒定区中检测到另外的O连接的糖基化位点。从凝胶图像来看，在此位点处的经过糖基化的形式在丰度上与未糖基化的形式类似。
在重链恒定区N@285上检测到N连接的糖基化。
在重链N端处观察到Pyro-Glu(Q)修饰。
从在重链上观察到的规则恒定区序列消除C端赖氨酸。
实例14：进一步测定优化
为了进一步优化，对两种不同的唾液酸酶活性测定进行了比较(A和B，参见下文)。测定设置基本上如结合图2所描述的。
将测试抗体与金缀合并干燥到载体上，在本文中被称为“缀合物垫”。测定A中的测试抗体是“经过1064纯化的Mol615抗体”，即，使用Mol615从血清1064纯化的多克隆抗体。测定B中的测试抗体是被称为“125.1”的单克隆抗体(参见实例13)。
对照抗体也与金缀合，并干燥到缀合物垫上。对于测定B，这是由兰普尔(Lampire)供应的鸡IgY，产品代码7401403。
将捕获分子(聚链霉亲和素)固定在硝酸纤维素膜上以形成捕获线。形成了单独的对照捕获线。对于测定法B，这是抗鸡IgY抗体(由兰普尔供应，产品代码7455207)。
如图2所示，将缀合物垫层压到硝酸纤维素上。
制备了测试指示剂分子NH2-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素(MOL600c)，并将1μg/ml或3μg/ml冷冻干燥到惰性多孔材料上(Porex盘)以产生指示剂底物盘，所述指示剂底物盘分别包括每盘36ng指示剂分子或每盘108ng指示剂分子。
以以下浓度测试唾液酸酶：50、12.5和1.56U/ml。还运行了使用肽盘和测定缓冲液的阴性标准品。针对立方读数和视觉刻度对应答进行了测量。
使用了以下基本方案：
确保所有溶液均在室温下并充分混合。
用50、12.5和1.56U/ml唾液酸酶缓冲液标准溶液对期望的条件中的每种期望的条件进行测试。
对所有标准品和唾液酸酶缓冲液一式三份地进行测试。
将1000μl唾液酸酶标准品和指示剂底物盘一起添加到提取管中。通过折叠盖子并盖到适当位置以密封管。轻轻搅动管，并允许与指示剂底物盘一起温育5分钟。
从提取管向装置的样品垫中添加4滴。
使用立方阅读器(德国柏林的Schwarzschildstrasse 1,D-12489的opTriconGmbH(化学生物诊断系统)的Optricon读取器)在5或10分钟处读取并记录测试和对照线信号。
测试测定的特征如下文所示。
(i)进行读取时间的比较
期望的输出是具有10分钟的测试，5分钟的温育以及5分钟的读取时间。在5和10分钟处读取结果，以研究读取时间对结果的影响。结果示于图28中。可以看出，测定A需要10分钟的读取时间才能满足最低标准的正确应答，测定B仅需要5分钟的读取时间。从10分钟的读取时间来看，测定B似乎并没有显著益处；其满足了10分钟测试和5分钟读取的期望输出。
(ii)敏感性的比较
在5分钟之后读取测定B的结果，并且在10分钟之后读取测定A的结果。结果示于图29中。
在50U/ml、12.5U/ml和1.56U/ml的标准品中，相对于测定A，测定B的立方读数更高，并且对于0U/ml的标准品，立方读数更低。A和B两者都针对标准品中的每一个给出了正确的应答，并且％CV在规格内。在装置开发时间缩短之后，测定B给出了标准品的立方读数，并且对于0标准品，则给出了较低的立方读数。因此，测定B优于测定A。
(iii)肽浓度的影响
将测定A和B彼此进行比较，并与具有不同肽浓度的变体进行比较。测定A'对应于测定A，但肽浓度为3μg/ml(每盘108ng)；测定B'对应于测定B，但肽浓度为1μg/ml(每盘108ng)。
在5分钟之后读取测定B和B'的结果，并且在10分钟之后读取测定A和A'的结果。结果示于图30中。较高的肽浓度提供更好的结果，并且>1μg/ml(每盘>108ng的肽浓度是优选的。
结论：
由于抗体的变化和肽浓度的增加，测定B在较短的时间内相比测定A具有改进的性能。
实例15——另外的测定优化
金光密度
研究了将金缀合物喷涂浓度从OD4增加到OD6或OD8的影响，并发现当相比于OD4，OD6金在测试线信号中略有增加时，OD8在3.125U/mL唾液酸酶下的测试线信号是OD4的两倍。因此，使用OD为约或至少8的金缀合是有利的。
样品/缀合物垫
在侧向流动测定装置中，如图2中示意性表示的类型，样品垫应允许样品沿装置流动，以允许样品与含有结合分子的缀合物垫接触并且随后与捕获分子接触。取决于样品的粘度，一些样品垫材料可以是有利的。
为了评估不同的样品垫，使用瓜尔豆胶和牛粘蛋白(0.25％瓜尔胶、0.125％粘蛋白、5％蓝乳胶(多科学公司(Polysciences Inc.)，15709，2.6％，溶于水中))制备了合成的阴道液替代品。允许合成阴道液流过所有样品垫。记录样品运行测试条的长度所花费的时间(参见下表)。
| 样品垫 | 窗口启动时间 | 窗口运行时间的长度 |
| 1.FR1 10mm血液分离器 | 01:20 | 02:20 |
| 2.GF-142 | 01:16 | 02:06 |
| 3.8964，奥斯龙 | 01:17 | 02:07 |
| 4.6613，奥斯龙 | 01:45 | 01:20 |
| 5.6615，奥斯龙 | 02:20 | 01:30 |
奥斯龙是密度不同的玻璃纤维垫(分别为8964、6613和6615)。
为了进行进一步比较，使用两个样品垫(FR1和奥斯龙8964)制备了材料。使用4点标准曲线(含0、3.125、12.5和50U/mL唾液酸酶的水性缓冲液)运行装置，以确定替代样品垫是否对特异性或非特异性信号有任何影响。相对于FR1，使用8964样品垫运行的样品具有更高的特异性信号，没有非特异性结合(NSB)。
使用一组掺入有6.25U/ml唾液酸酶的临床样品，可以确定玻璃纤维型垫(如奥斯龙8964样品垫)允许非常可靠的样品流动和酶检测。
实例16-细菌性阴道病的诊断
获得临床样品并分析如线索细胞等标准以确定Nugent评分，在此基础上将样品分类为细菌性阴道病阳性或阴性。使用测定A或测定B分析样品(参见实例14)。
结果如下文所示，其中se代表敏感性；sp代表特异性；ppv代表阳性预测值；并且nvp代表阴性预测值。
测定A
| Nugent | Nugent | |||
| 阳性 | 阴性 | 总计 | ||
| 测定A | 阳性 | 25 | 0 | 25 |
| 测定A | 阴性 | 2 | 25 | 27 |
| 总计 | 27 | 25 | 52 |
| se | sp | ppv | npv | |
| 估计 | 0.93 | 1 | 1 | 0.93 |
| 95％CI： | [0.76；0.99] | [0.86；1] | [0.86；1] | [0.76；0.99] |
| p值 | 5.65E-06 | 5.96E-08 | 5.96E-08 | 5.65E-06 |
测定B
| se | sp | ppv | npv | |
| 估计 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 95％CI： | [0.87；1] | [0.86；1] | [0.87；1] | [0.86；1] |
| p值 | 1.49E-08 | 5.96E-08 | 1.49E-08 | 5.96E-08 |
因此，两种测定在区分细菌性阴道病阳性或阴性的临床样品之间性能良好。测定B优于测定A。
本发明不限于本文所描述的具体实施例的范围。事实上，除了本文所描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。此外，本文所描述的本发明的所有方面和实施例被认为是广泛适用的并且可以与任何和所有其它一致的实施例组合，包含适当地选自本发明的其它方面的实施例(包括单独地)。本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用以其全文并入本文。
序列表
<110> 莫洛迪克有限公司（Mologic Ltd）
<120> 细菌性阴道病诊断
<130> P148556WO00
<150> GB1812331.5
<151> 2018-07-27
<160> 17
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 穴兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 2
Thr Thr Thr Leu His
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 3
Gly Gly Ser Ser Val Ile
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 4
Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn His Leu Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 5
Ser Ala Ser Arg Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 6
Gln Gly Ser Tyr Tyr Asn Gly Ala Trp Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 434
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 7
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ser
20 25 30
Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly
35 40 45
Gly Ile Thr Thr Thr Leu His Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met
65 70 75 80
Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly
85 90 95
Gly Ser Ser Val Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly
115 120 125
Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
130 135 140
Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn
145 150 155 160
Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys
180 185 190
Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala
195 200 205
Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
245 250 255
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val
260 265 270
Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile
275 280 285
Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Glu Asp Trp Leu Arg Gly
290 295 300
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val
325 330 335
Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu
355 360 365
Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val
385 390 395 400
Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser
420 425 430
Pro Gly
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 8
Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn
20 25 30
Asn His Leu Asn Trp His Gln Gln Lys Arg Gly Gln Pro Pro Lys Gln
35 40 45
Leu Ile Gly Ser Ala Ser Arg Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Ser Tyr Tyr Asn
85 90 95
Gly Ala Trp Tyr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Asp Pro Val Ala Pro Ser Val Leu Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu
115 120 125
Glu Leu Thr Thr Gly Thr Ala Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Phe
130 135 140
Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Val Thr Trp Lys Val Asp Gly Thr Thr Gln
145 150 155 160
Gln Ser Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Ser Pro Glu Asp Asn
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Ser Ala Gln Tyr Asn
180 185 190
Ser His Ser Val Tyr Thr Cys Glu Val Val Gln Gly Ser Ala Ser Pro
195 200 205
Ile Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210 215
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> X可以是氨基酸，条件是X1、X2、X4或X5中的至少一个是D氨基酸
和/或非标准或非天然氨基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 氨基酸具有Gal-Sial基团
<400> 9
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工（ARTIFICIAL）
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X不存在或者是Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X不存在或者是D形式的Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X不存在或者是正亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X不存在或者是Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X不存在或者是D形式的Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X不存在或者是Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X不存在或者选自Glu、Arg、Ser、戊氨酸、β-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X不存在或者选自D形式的Ser、D形式的Ala、磷酸丝氨酸、
1-氨基环己烷-羧酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X不存在或者选自戊氨酸、2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸、
D形式的Ala、β-Ala、鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X选自1-氨基环己烷-羧酸、Ser、Ile、D形式的Ala、D形式
的Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X选自D形式的Ala、Pro、鸟氨酸、正亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X选自Ser、Thr、Tyr、羟赖氨酸、羟脯氨酸、Asn、Arg或
磷酸丝氨酸；并且具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X选自D形式的Ala、2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸、β-Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X选自Arg、D形式的Asp、正亮氨酸、鸟氨酸、戊氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X不存在或者选自Phe、2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸、Ser、
Glu、D形式的Ala、D形式的Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> X不存在或者选自D形式的Ser、Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (17)..(17)
<223> X不存在或者选自Val、Ser、Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X不存在或者是环己基丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (19)..(19)
<223> X不存在或者是D形式的Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> X不存在或者是Val
<400> 10
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa
20
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> X是1-氨基环己烷-羧酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(4)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<400> 11
Xaa Ala Ser Ala Arg
1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是戊氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X是1-氨基环己烷-羧酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(7)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 丝氨酸呈D形式
<400> 12
Glu Ser Xaa Xaa Ala Ser Ala Arg Phe Ser Val
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(7)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Asp呈D形式
<400> 13
Arg Ala Xaa Ser Pro Ser Ala Asp Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 丝氨酸是磷酸丝氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(7)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X是鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是正亮氨酸
<400> 14
Ser Ser Ala Ile Xaa Ser Ala Xaa Glu
1 5
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> x是戊氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 丝氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> x是β-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(11)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> x是正亮氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X是2'-(氨基甲基)联苯-2-羧酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X是鸟氨酸
<400> 15
Ala Arg Xaa Ser Xaa Ala Xaa Ser Xaa Xaa Ala Glu Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(5)
<223> 每个丙氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是正亮氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X是β-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X是1-氨基环己烷-羧酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X是鸟氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 丝氨酸呈D形式
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 丝氨酸具有Gal-Sial基团
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X是β-丙氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X是戊氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(19)
<223> 丝氨酸呈D形式
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(18)
<223> X是环己基丙氨酸
<400> 16
Thr Ala Xaa Glu Ala Arg Xaa Xaa Xaa Ser Pro Ser Xaa Xaa Ser Glu
1 5 10 15
Thr Xaa Ser Val
20
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X可以是任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是
D氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X可以是任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是
D氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X是包括Gal-Sial基团的氨基酸并且选自Ser、Thr、Tyr、
羟赖氨酸、羟脯氨酸、Asn、Arg或磷酸丝氨酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X可以是任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是
D氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X可以是任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个是
D氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸。
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
Claims (26)
1.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物，所述装置、试剂盒或物质组合物包括：
(i)指示剂分子，所述指示剂分子包括：
(a)肽，所述肽包括以下序列：
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5(SEQ ID NO:17)
其中：
Sial是唾液酸化基团；
X3是包括糖基受体基团的氨基酸并且选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或磷酸丝氨酸(SEP)，优选地其中X3是Ser；并且
X1、X2、X4和X5独立地选自任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个，优选地至少两个或三个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸；以及
b)捕获位点，所述捕获位点在所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解之后保持完整；
(ii)捕获区，所述捕获区用于收纳所述测试样品，其中所述捕获区包括无论所述指示剂分子是否已经裂解都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合的捕获分子，以便固定所述指示剂分子；以及
(iii)结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生。
2.根据权利要求1所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是Ala，优选地其中X1和X2均为Ala，和/或优选地其中Ala是DAla或βAla。
3.根据权利要求1到2中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是带电氨基酸，任选地其中每个带电氨基酸选自Arg、DAsp和LOrn。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中X1、X2、X4和X5中的至少一个是极性氨基酸，任选地其中每个极性氨基酸选自LSer、DSer和Thr。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述肽包括以下序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12[Gal-Sial]-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20
(SEQ ID NO:10)，其中：
Sial是唾液酸化基团；
X1不存在或者是Thr；
X2不存在或者是DAla；
X3不存在或者是Nle；
X4不存在或者是Glu；
X5不存在或者是DAla；
X6不存在或者是Arg；
X7不存在或者选自Glu、Arg、Ser、Nva、βAla；
X8不存在或者选自DSer、DAla、SEP、Cyc；
X9不存在或者选自Nva、BIP、DAla、βAla、Orn；
X10选自Cyc、Ser、Ile、DAla、DSer；
X11选自DAla、Pro、Orn、Nle；
X12选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或SEP，优选地是Ser；
X13选自DAla、BIP、βAla；
X14选自Arg、DAsp、Nle、Orn、Nva；
X15不存在或者选自Phe、BIP、Ser、Glu、DAla、DSer；
X16不存在或者选自DSer、Glu；
X17不存在或者选自Val、Ser、Thr；
X18不存在或者是Cha；
X19不存在或者是DSer；
X20不存在或者是Val。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述肽包括以下序列、基本上由其组成或由其组成：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg(SEQ ID NO:11)；
(ii)Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val(SEQ ID NO:12)；
(iii)Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser(SEQ ID NO:13)；
(iv)Ser-SEP-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu(SEQ ID NO:14)；
(v)DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser(SEQID NO:15)；或
(vi)Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val(SEQ ID NO:16)。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述肽偏向于通过一种或多种特异性唾液酸酶进行裂解，任选地其中所述一种或多种特异性唾液酸酶是细菌来源的，任选地其中所述细菌是普氏菌(Prevotella species)、拟杆菌(Bacteroidesspecies)和/或动弯杆菌(Mobiluncus species)和/或阴道加德纳菌(Gardnerellavaginalis)。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述结合分子对权利要求6所定义的所述肽的去唾液酸化形式具有特异性，优选地对在肽基序Cyc-DAla-Ser[Gal]-DAla-Arg中存在并且在对应的唾液酸化肽基序Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg中不存在或者是隐蔽的表位具有特异性。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述结合分子是具有带3个CDR的重链和带3个CDR的轻链的抗体，其中重链CDR1具有SEQ ID NO:1；重链CDR2具有SEQ ID NO:2；重链CDR3具有SEQ ID NO:3；轻链CDR1具有SEQ ID NO:4；轻链CDR2具有SEQ ID NO:5；并且轻链CDR3具有SEQ ID NO:6，优选地其中所述重链具有SEQ ID NO:7和/或所述轻链具有SEQ ID NO:8。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述结合分子用报道分子，优选地金颗粒标记。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述指示剂分子的所述捕获位点包括生物素分子或肟部分、基本上由其组成或由其组成；和/或在所述肽的N端或C端处。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述指示剂分子的所述捕获位点通过接头与所述肽连接，任选地其中所述接头包括聚乙二醇(PEG)部分，任选地其中所述肽通过接头在其N端或C端处与生物素基团连接，所述接头包括聚乙二醇部分、基本上由其组成或由其组成。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述指示剂分子包括以下结构、基本上由其组成或由其组成：
(i)Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-PEG-生物素；
(ii)生物素-PEG-Asp-Glu-DSer-Nva-Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg-Phe-DSer-Val；
(iii)生物素-PEG-Asp-Arg-DAla-BIP-Ser-Pro-Ser[Gal-Sial]-DAla-DAsp-Ser；
(iv)生物素-PEG-Asp-Ser-Ser(PO3)-DAla-Ile-Orn-Ser[Gal-Sial]-DAla-Nle-Glu；
(v)生物素-PEG-Asp-DAla-Arg-Nva-DSer-βAla-DAla-Nle-Ser[Gal-Sial]-BIP-Orn-DAla-Glu-Ser；或
(vi)生物素-PEG-Asp-Thr-DAla-Nle-Glu-DAla-Arg-βAla-Cyc-Orn-DSer-Pro-Ser[Gal-Sial]-βAla-Nva-DSer-Glu-Thr-Cha-DSer-Val。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的装置、试剂盒或物质组合物，其中所述指示剂分子包括(i)肽，所述肽包括序列Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg、基本上由其组成或由其组成；以及(ii)捕获位点，所述捕获位点包括生物素分子或肟部分、基本上由其组成或由其组成，所述捕获位点任选地通过接头与所述肽的N端或C端连接，所述接头包括聚乙二醇部分、基本上由其组成或由其组成；并且其中所述结合分子是如权利要求8或9所定义的抗体并且优选地用报道分子，最优选地金颗粒标记。
15.一种抗体，其能够与以下特异性结合：(i)如权利要求1到7中任一项所定义的肽的去唾液酸化衍生物；或(ii)如权利要求1到7或11到14中任一项所定义的指示剂分子，其中相对于唾液酸化肽或指示剂分子，所述抗体优先与去唾液酸化衍生物结合。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中所述抗体如权利要求8、9和/或10所定义。
17.一种指示剂分子，其适于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在时使用，所述指示剂分子包括：
a)如权利要求1到7中任一项所定义的肽；以及
b)捕获位点，所述捕获位点在所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解之后保持完整，其中所述指示剂分子优选地如权利要求1到7或11到14中任一项所定义。
18.根据权利要求17所述的指示剂分子，其中所述指示剂分子如权利要求13所定义。
19.一种肽，其包括以下序列、基本上由其组成或由其组成：
X1-X2-X3[Gal-Sial]-X4-X5
其中：
Sial是唾液酸化基团；
X3是包括糖基受体基团的氨基酸并且选自Ser、Thr、Tyr、Hyl、Hyp、Asn、Arg或磷酸丝氨酸(SEP)，优选地其中X3是Ser；并且
X1、X2、X4和X5独立地选自任何氨基酸，条件是X1、X2、X4和X5中的至少一个，优选地至少2个或3个是D-氨基酸和/或非标准氨基酸或非天然氨基酸，其中所述肽优选地如权利要求1到7中任一项所定义。
20.根据权利要求19所述的肽，其中所述肽如权利要求6所定义并且优选地是包括序列Cyc-DAla-Ser[Gal-Sial]-DAla-Arg、基本上由其组成或由其组成的肽。
21.一种肽，其用于在产生根据权利要求15或16所述的抗体时使用，其中所述肽是如权利要求1到7中任一项所定义的所述肽的去唾液酸化衍生物。
22.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)使如权利要求1到7或11到14中任一项所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生，并且其中所述结合分子优选地如权利要求8、9和/或10所定义；
(iii)通过捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
23.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在或不存在的方法，所述方法包括：
(i)将所述测试样品添加到包括捕获分子的捕获区，所述捕获分子与如权利要求1到7或11到14中任一项所定义的指示剂分子的所述捕获位点结合，其中无论所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解是否发生，所述捕获分子都保持与所述捕获位点结合；
(ii)添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生，并且其中所述结合分子优选地如权利要求8、9和/或10所定义；
(iii)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解。
24.一种用于通过检测样品中唾液酸酶的裂解活性来诊断所述测试样品中的细菌性阴道病的方法，所述方法包括：
(i)使如权利要求1到7或11到14中任一项所定义的指示剂分子与所述测试样品接触；
(ii)向所述测试样品添加结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生，并且其中所述结合分子优选地如权利要求8、9和/或10所定义；
(iii)通过捕获区中的捕获分子与所述捕获位点的结合在所述捕获区处捕获所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述捕获位点结合；以及
(iv)通过确定所述结合分子与在所述捕获区中捕获的所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物的结合来检测所述唾液酸化基团从所述指示剂分子中的裂解，其中与对照物相比增加的裂解水平诊断出细菌性阴道病。
25.一种用于在测试样品中检测唾液酸酶的裂解活性的存在的酶检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)如权利要求1到7中任一项所定义的指示剂分子，其中所述指示剂分子优选地冷冻干燥到载体上；
(ii)捕获分子，无论所述指示剂分子是否已经裂解，所述捕获分子都能够与所述指示剂分子的所述捕获位点结合，其中所述捕获分子优选地包括链霉亲和素；
(iii)固相载体，所述捕获分子能够与所述固相载体连接或与所述固相载体连接以形成用于收纳所述测试样品的捕获区，其中所述固相载体优选地包括硝酸纤维素；以及
(iv)结合分子，所述结合分子能够与所述指示剂分子的去唾液酸化衍生物结合，其中所述结合分子不能与所述指示剂分子结合，除非并且直到所述唾液酸化基团通过所述样品中存在的唾液酸酶从所述指示剂分子中裂解已经发生，并且其中所述结合分子优选地如权利要求8、9和/或10所定义；以及任选地
(v)提取管和/或缓冲液；和/或
(vi)对照检测分子和对照检测结合剂。
26.一种根据权利要求1到14中任一项所述的酶检测装置、酶检测试剂盒或酶检测物质组合物、根据权利要求22到24中任一项所述的方法或根据权利要求25所述的酶检测试剂盒的用途，其用于在测试样品中诊断细菌性阴道病。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023185172A1 (zh) * | 2022-04-01 | 2023-10-05 | 广东菲鹏生物有限公司 | 层析试纸条、检测试剂盒及方法 |
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