CN108872571B - 一种基于硫磺素t的免疫分析方法 - Google Patents
一种基于硫磺素t的免疫分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于硫磺素T的免疫分析方法及其应用，该方法在传统碱性磷酸酶反应体系ELISA的基础上，加入酶响应的多肽作为反应底物，多肽在酶催化下形成的β‑折叠结构，随后引入荧光染料硫磺素T，利用硫磺素T与β‑折叠多肽结合产生的信号进行检测，提供了五种读出模式用于检测肺炎支原体抗体，显示了更多的选择性，提供了一种检测肺炎支原体IgM抗体的优越方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫测定领域，具体涉及一种基于硫黄素T的多读出模式的免疫分析方法及其应用。
背景技术
多重读出模式比单种读出模式对于疾病诊断显示更加明显的优势。多种模式的读出不仅可以在各种资源有限的条件下更加灵活的报告疾病，还能通过验证不同的读数结果的一致性提高检测的可靠性。定性和定量双重分析显示更多的优势。定性分析协助对疾病的快速判断。定量分析提供准确和详细的数据报告疾病的进展情况。因此，开发一个多种读出的免疫测定分析是一个疾病诊断领域有吸引力的研究方向。多肽自组装结合荧光染料为我们开发多信号免疫测定分析提供了可能性。近年来多肽作为各种生理信号生物传感器，受到越来越多的关注，由于其水溶性好、成本低、合成方便、无污染，显示良好的应用前景。
肺炎支原体是引起肺炎较常见的病原体，引起严重的呼吸道感染和神经系统损害，儿童和青少年多发。从患者标本中分离出肺炎支原体是诊断感染的可靠标准，但常规培养需要10～14天，甚至更长时间，对早期诊断价值不大。特异性的血清学检查方法主要有被动凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，在恢复期或急性期抗体浓度成倍增高或见底可协助诊断肺炎支原体感染。
由于肺炎支原体感染临床症状不典型，缺乏特异性，不易与其他细菌、病毒等感染鉴别，易误诊。传统培养法检测肺炎支原体需2周以上，耗时长且检出率较低，不能及时指导临床用药。肺炎支原体感染后，可刺激机体产生IgM和IgG抗体，通过检测血清中的特异性抗体可以辅助诊断支原体感染，IgM型抗体在感染早期即可出现，短时间内其浓度成倍升高对支原体感染的诊断有重要意义。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有多读出模式的免疫分析方法，从定性和定量两方面进行检测，比传统方法显示更多的优势。
在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“IgM”是指：免疫球蛋白M。
术语“IgG”是指：免疫球蛋白G。
术语“MP”是指：肺炎支原体。
术语“Tris”是指：三羟甲基氨基甲烷。
术语“ELISA”是指：酶联免疫吸附测定。
术语“ALP”是指：碱式磷酸酶。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基于硫磺素T的免疫分析方法，所述方法包括：使用碱性磷酸酶作为标记酶，使用多肽作为反应底物，将多肽前体与硫磺素T结合，通过检测所述硫磺素T的荧光来检测样本中肺炎支原体抗体MP-IgM的存在或浓度，所述多肽为如下(a)或(b)所述的多肽：(a)具有甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸的氨基酸序列，(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加且可与所述硫磺素T结合的由(a)衍生的多肽。
优选地，根据本发明第一方面所述的基于硫磺素T的免疫分析方法，所述方法进一步包括：
(1)包被抗原：以相应的稀释浓度包被肺炎支原体菌体抗原于酶标板孔中，并封膜封板，静置；
(2)洗板：加入Tris-HCl洗涤液洗板，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分；
(3)封闭：加封闭液，室温封闭；
(4)洗板，重复步骤2；
(5)加入标准品和待测血清，室温孵育；
(6)洗板，重复步骤2；
(7)用稀释液将检测抗体稀释至工作浓度，封板，室温孵育；
(8)洗板，重复步骤2；
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，室温避光孵育；和
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
更优选地，根据前述的基于硫磺素T的免疫分析方法，步骤(1)中所述的包被液为血清白蛋白溶液，肺炎支原体菌体抗原浓度为0.1～20mg/ml，优选为0.1～10mg/ml，最优选为1mg/mL，注入量为100μl/孔，静置条件为4℃过夜或37℃静置2小时。
再优选地，根据前述的基于硫磺素T的免疫分析方法，步骤(2)中所述的Tris-HCl洗涤液浓度为0.05μmol/L；每孔注入量为100μl，洗板次数为3次，每次间隔1～3分钟。
还优选地，根据前述的基于硫磺素T的免疫分析方法，步骤(3)中所述的封闭液为血清白蛋白溶液，封闭液的加入量为200μl/孔，封闭时间为0～5小时，优选为0～2小时，最优选为1小时。
优选地，根据前述的基于硫磺素T的免疫分析方法，步骤(5)中所述的标准品为肺炎支原体菌体抗原标准品，优选为碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM；标准品的加入量为0.1mg，待测血清的加入量为1ul，孵育时间为0～5小时，优选为0～2小时，最优选为1小时。
更优选地，根据前述的基于硫磺素T的免疫分析方法，步骤(7)中所述的稀释液为磷酸缓冲溶液，pH为7.0～7.5，每孔注入量为100μl，孵育时间为0～5小时，优选为0～2小时，最优选为1小时。
再优选地，步骤(9)中的所述的多肽前体的终浓度为0～10mg/ml，优选为5～10mg/ml，最优选为6mg/mL；所述的硫磺素T的终浓度为0～100μg/mL，优选为0～50μg/mL，最优选为20μg/mL；多肽前体和硫磺素T的混合比例为1:10，优选为1：5，最优选为1：1；每孔注入混合溶液的量为100μl，孵育时间为5～60分钟，优选为5～30分钟，最优选为20分钟。
本发明的第二方面提供了用于实施本发明第一方面提供的基于硫磺素T的免疫分析方法的组合产品，所述组合产品包括：
已包被抗原、洗涤液、封闭液、标准品、多肽前体和硫磺素T；
优选地，所述组合产品为试剂盒形式，其中各包含成分为各自独立存在的试剂状态；
更优选地，所述组合产品还包括紫外灯。
本发明还提供了所述的组合产品在制备用于检测和/或诊断肺炎支原体感染疾病的产品中的应用，优选地，所述肺炎支原体感染疾病为肺炎。
本发明的免疫分析方法可以具有但不限于以下有益效果：
1、多重读出模式的免疫分析法有利于协助诊断肺炎支原体感染。肉眼读出模式诊断这种疾病适合于医疗设施落后的地区。肺炎支原体感染，表现为普通感冒相似的临床症状，快速的定性检测有助于临床医生排除非支原体感染性肺炎，而精确的定量分析则可以更好地指导临床用药。
2、本发明提供了一种五种读出模式的免疫测定方法，用于检测肺炎支原体抗体，该方法在传统碱性磷酸酶反应体系ELISA的基础上，加入酶响应的多肽作为反应底物，多肽在酶催化下形成的β-折叠结构，随后引入荧光染料硫磺素T，利用硫磺素T与β-折叠多肽结合产生的信号进行检测。通过肉眼、紫外线灯和共聚焦显微镜可以进行定性读出，这种三种模式的读出方法比临床上广泛使用的被动凝集法更可靠；通过紫外吸收和荧光光谱的测定可以进行定量检测肺炎支原体IgM抗体，这种方法检测的线性范围更广泛，精密度、可重复性与ELISA方法相类似。将五种读出模式集成到一种免疫测定方法，显示了更多的选择性，提供了一种检测肺炎支原体IgM抗体的优越方法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明提供的免疫分析方法示意图。
图2示出了本发明提供的免疫分析方法与被动凝集法对比图。
图3示出了本发明提供的免疫分析方法荧光和紫外检测定量数据与酶联免疫吸附测定ELISA方法对比图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
多肽前体甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸，购自上海吉尔生化有限公司；
硫磺素T购自Sigma-Aldrich；
Tris-HCl购自Sigma-Aldrich；
MP抗原、碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM，购自北京沫之东生物公司；
商品化ELISA试剂盒，购自Abnova公司；
被动凝集试剂盒购自FUJIREBIO公司；
血清样本来自解放军总医院检验科；
血清白蛋白溶液，购自Hyclone；
磷酸缓冲液，购自Sigma-Aldrich。
仪器：
紫外-可见光谱仪，型号UV2450，购自日本Shimadzu公司；
多功能全波长酶标仪EnSpire Series Multilabel Plate Readers，购自美国PerkinElmer公司；
单光子共聚焦显微镜，型号FV1000，购自奥林巴斯公司；
紫外仪，型号WD-9403A，购自北京六一仪器厂；
荧光显微镜，购自Leica型号DM2000。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的基于硫磺素T的免疫分析方法的实施步骤。
具体操作如下：
(1)包被：以相应的稀释浓度的血清白蛋白溶液包被肺炎支原体菌体抗原(100μl/孔，1mg/mL)于96孔酶标板，并封膜封板，4℃过夜。
(2)洗板：加入每孔100μl Tris-HCl(0.05μmol/L)洗涤液，洗板3次，每次间隔1min，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分。
(3)封闭：加封闭液，每孔200μl，室温封闭1小时。
(4)洗板，重复步骤2。
(5)加入碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM标准品0.1mg和待测血清1ul，室温孵育1小时。
(6)洗板，重复步骤2。
(7)用稀释液磷酸缓冲溶液将检测抗体稀释至工作浓度pH＝7.2，100μl/孔，封板，室温孵育1小时。
(8)洗板，重复步骤2。
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，多肽前体和硫磺素T的终浓度分别为6mg/mL、20μg/mL，多肽前体和硫磺素T的混合比例为1:1；注入量为100μl/孔，室温避光孵育20min。
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的基于硫磺素T的免疫分析方法的实施步骤。
具体操作如下：
(1)包被：以相应的稀释浓度的血清白蛋白溶液包被肺炎支原体菌体抗原(100μl/孔，0.1mg/mL)于96孔酶标板，并封膜封板，37℃放置2小时。
(2)洗板：加入每孔100μl Tris-HCl(0.05μmol/L)洗涤液，洗板3次，每次间隔3min，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分。
(3)封闭：加血清白蛋白溶液，每孔200μl，室温封闭2小时。
(4)洗板，重复步骤2。
(5)加入碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM0.1mg和待测血清1ul，100μl/孔，室温孵育2小时。
(6)洗板，重复步骤2。
(7)用稀释液磷酸缓冲溶液将检测抗体稀释至工作浓度pH＝7.5，100μl/孔，封板，室温孵育2小时。
(8)洗板，重复步骤2。
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，多肽前体和硫磺素T的终浓度分别为10mg/mL、100μg/mL，多肽前体和硫磺素T的混合比例为1:5；注入量为100μl/孔，室温避光孵育30min。
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
实施例3
本实施例用于说明本发明提供的基于硫磺素T的免疫分析方法的实施步骤。
具体操作如下：
(1)包被：以相应的稀释浓度的血清白蛋白溶液包被肺炎支原体菌体抗原(100μl/孔，10mg/mL)于96孔酶标板，并封膜封板，4℃过夜。
(2)洗板：加入每孔100μl Tris-HCl(0.05μmol/L)洗涤液，洗板3次，每次间隔2min，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分。
(3)封闭：加血清白蛋白溶液，每孔200μl，室温封闭5小时。
(4)洗板，重复步骤2。
(5)加入碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM0.1mg和待测血清1ul，100μl/孔，室温孵育5小时。
(6)洗板，重复步骤2。
(7)用稀释液磷酸缓冲溶液将检测抗体稀释至工作浓度pH＝7.0，100μl/孔，封板，室温孵育5小时。
(8)洗板，重复步骤2。
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，多肽前体和硫磺素T的终浓度分别为5mg/mL、50μg/mL，多肽前体和硫磺素T的混合比例为1:10；注入量为100μl/孔，室温避光孵育5min。
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
实施例4
本实施例用于说明本发明提供的基于硫磺素T的免疫分析方法的实施步骤。
具体操作如下：
(1)包被：以相应的稀释浓度的血清白蛋白溶液包被肺炎支原体菌体抗原(100μl/孔，20mg/mL)于96孔酶标板，并封膜封板，37℃放置2小时。
(2)洗板：加入每孔100μl Tris-HCl(0.05μmol/L)洗涤液，洗板3次，每次间隔1min，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分。
(3)封闭：加血清白蛋白溶液，每孔200μl，室温封闭5小时。
(4)洗板，重复步骤2。
(5)加入碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人MP-IgM0.1mg和待测血清1ul，100μl/孔，室温孵育0.5小时。
(6)洗板，重复步骤2。
(7)用稀释液磷酸缓冲溶液将检测抗体稀释至工作浓度pH＝7.4，100μl/孔，封板，室温孵育0.5小时。
(8)洗板，重复步骤2。
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，多肽前体和硫磺素T的终浓度分别为6mg/mL、20μg/mL，多肽前体和硫磺素T的混合比例为1:1；注入量为100μl/孔，室温避光孵育60min。
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
试验例1
在96孔板中包被MP抗原，加入待测血清，血清中的MP-IgM与MP抗原结合，加入碱式磷酸酶ALP标记的鼠抗人IgM二抗，加入硫磺素T与多肽前体，碱式磷酸酶ALP催化多肽前体组装形成β折叠，硫磺素T分子与β折叠多肽结合产生荧光信号。同时采用被动凝集试剂盒进行对照试验。
如图2所示，本方法应用三种定性模式，碱式磷酸酶ALP催化多肽前体形成水凝胶，由流动自由的液体状态变成流动受限的凝胶状态，将反应板垂直旋转90°可以观察到反应系统物理状态的变化，阴性孔由于未结合ALP，没有凝胶形成，因此呈现有一定角度的斜面，阳性孔的液体在碱式磷酸酶ALP诱导下形成凝胶呈现为垂直的液面。另外，也可以通过紫外线灯和荧光显微镜观察荧光信号进行定性检测。硫磺素T与β折叠结合后其荧光信号会显著增强，在紫外线灯下，可以清楚地观察到阳性孔显示强烈的荧光，而阴性孔没有荧光。荧光显微镜下，我们可以观察到阳性样本呈现荧光，并且可见凝胶的形成。而阴性样本没有检测到荧光，没有凝胶的形成。这种三种模式的定性检测比被动凝集法更灵活，结果判断更可靠。
试验例2
采用实施例1的方法对血清MP-IgM进行定量检测，硫磺素T与β折叠多肽结合后发生增强，通过检测荧光光谱和紫外光谱发现，荧光强度、紫外吸光度的大小与血清MP-IgM的浓度呈线性正相关，并且与商品化的ELISA试剂盒相关性良好。如图3所示，本发明提供的方法荧光定量的线性范围是1.2～60ng/ml，“硫磺素T与β折叠”紫外定量的线性范围是1.7～60ng/ml，比ELISA的线性范围更广泛(1.5～20ng/ml)。这些结果表明，本发明提供的方法可以更好的协助诊断肺炎支原体感染。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (23)
1.一种用于实施基于硫磺素T的免疫分析方法的组合产品，其特征在于，所述组合产品包括：包被于酶标板的肺炎支原体菌体抗原、洗涤液、封闭液、标准品、碱性磷酸酶标记的抗肺炎支原体抗体的抗体、多肽前体和硫磺素T；所述多肽前体的氨基酸序列为甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸。
2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述组合产品为试剂盒形式，其中各包含成分为各自独立存在的试剂状态。
3.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述组合产品还包括紫外灯。
4.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述方法包括：使用碱性磷酸酶作为标记酶，使用多肽前体作为反应底物，将多肽前体与硫磺素T混合，通过检测所述硫磺素T的荧光来检测样本中肺炎支原体抗体MP-IgM的存在或浓度。
5.根据权利要求4所述的组合产品，其特征在于，所述方法进一步包括：
(1)包被抗原：以相应的稀释浓度包被肺炎支原体菌体抗原于酶标板孔中，并封膜封板，静置；
(2)洗板：加入Tris-HCl洗涤液洗板，并翻转酶标板置于吸水纸上并滤去水分；
(3)封闭：加封闭液，室温封闭；
(4)洗板，重复步骤2；
(5)加入标准品和待测血清，室温孵育；
(6)洗板，重复步骤2；
(7)用稀释液将碱性磷酸酶标记的抗肺炎支原体抗体的抗体稀释至工作浓度，封板，室温孵育；
(8)洗板，重复步骤2；
(9)加入多肽前体和硫磺素T混合溶液，室温避光孵育；和
(10)检测：测定每孔硫磺素T紫外和荧光光谱的变化。
6.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(1)中包被液为血清白蛋白溶液，肺炎支原体菌体抗原浓度为0.1～20mg/mL，注入量为100μl/孔，静置条件为4℃过夜或37℃静置2小时。
7.根据权利要求6所述的组合产品，其特征在于，步骤(1)中所述肺炎支原体菌体抗原浓度为0.1～10mg/mL。
8.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(1)中所述肺炎支原体菌体抗原浓度为1mg/mL。
9.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(2)中所述的Tris-HCl洗涤液浓度为0.05μmol/L；每孔注入量为100μl，洗板次数为3次，每次间隔1～3分钟。
10.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(3)中所述的封闭液为血清白蛋白溶液，封闭液的注入量为200μl/孔，封闭时间为0～5小时。
11.根据权利要求10所述的组合产品，其特征在于，步骤(3)中封闭时间为0～2小时。
12.根据权利要求11所述的组合产品，其特征在于，步骤(3)中封闭时间为1小时。
13.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(5)中所述的标准品为肺炎支原体菌体抗原标准品；标准品的注入量为0.1mg，待测血清的注入量为1ul，孵育时间为0～5小时。
14.根据权利要求13所述的组合产品，其特征在于，步骤(5)中所述的标准品为碱式磷酸酶标记的鼠抗人MP-IgM；孵育时间为0～2小时。
15.根据权利要求14所述的组合产品，其特征在于，步骤(5)中孵育时间为1小时。
16.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(7)中所述的稀释液为磷酸缓冲溶液，pH为7.0～7.5，每孔注入量为100μl，孵育时间为0～5小时。
17.根据权利要求16所述的组合产品，其特征在于，步骤(7)中孵育时间为0～2小时。
18.根据权利要求17所述的组合产品，其特征在于，步骤(7)中孵育时间为1小时。
19.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，步骤(9)中的所述的多肽前体的终浓度为0～10mg/ml；所述的硫磺素T的终浓度为0～100μg/mL；每孔注入所述混合溶液的量为100μl，孵育时间为5～60分钟。
20.根据权利要求19所述的组合产品，其特征在于，步骤(9)中的所述的多肽前体的终浓度为5～10mg/ml；所述的硫磺素T的终浓度为0～50μg/mL；多肽前体和硫磺素T的混合比例为1：5；孵育时间为5～30分钟。
21.根据权利要求19所述的组合产品，其特征在于，步骤(9)中的所述的多肽前体的终浓度为6mg/mL；所述的硫磺素T的终浓度为20μg/mL；多肽前体和硫磺素T的混合比例为1：1；孵育时间为20分钟。
22.权利要求1至21中任一项所述的组合产品在制备用于检测和/或诊断肺炎支原体感染疾病的产品中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，所述肺炎支原体感染疾病为肺炎。
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