发明内容
为克服现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供猪肺炎支原抗体检测试剂盒,本发明利用非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体多肽抗原作为包被液包被固相载体,可有效提高多肽与目标抗体的结合效率,从而显著提高可检测灵敏度,同时显著降低非特异背景读值,特异性高,操作简单,诊断速度快,在进行大规模检测中经济方便等优点。
本发明的另一目的在于提供猪肺炎支原抗体检测试剂盒的制备方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案如下:
一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒,包括被偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的固相载体;阳性血清和阴性血清各1管,其中阳性血清为Mhp标准阳性血清稀释液,阴性血清为Mhp标准阴性血清稀释液;用辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液的酶标二抗1瓶;抗体稀释液1瓶;底物显色液1瓶;终止液1瓶。
所述偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液是偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液按照5μg/ml-10μg/ml的浓度稀释;其中偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原是通过以下方法制备得到的:
1)选取猪肺炎支原体特异反应原性多肽溶解,得到猪肺炎支原体特异多肽溶液;
2)取非蛋白多聚体溶解,得到非蛋白多聚体溶液;
3)在猪肺炎支原体特异多肽溶液或非蛋白多聚体溶液中加入偶联剂,混合均匀;
4)将猪肺炎支原体特异多肽溶液与非蛋白多聚体溶液混合均匀,搅拌反应,使猪肺炎支原体特异多肽偶联到非蛋白多聚体上;
5)用透析袋去除未参与结合的偶联剂,纯化,冻干,得到偶联猪肺炎支原体特异多肽;
其中猪肺炎支原体特异反应原性多肽为SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:5系列多肽中的一种。
所述偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的固相载体是将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液稀释,然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板,每孔100μL,4℃过夜包被,用PBST洗涤液250μl/孔洗涤2-4次后拍干,用封闭液150μl/孔,37℃封闭1h,洗涤液PBST 250μl/孔洗涤2-4次后拍干,放入真空袋中,加入干燥剂,抽真空,4℃保存;所述包被液为1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中,调节pH值至9.6,并定容至1000mL。
所述辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG的稀释液是用HRP保护液按照辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG与HRP保护液体积比为1﹕2000-10000的比例稀释,酶标二抗每瓶量为12ml;所述HRP保护液为0.1%BSA 1.0g,0.25%EDTA2.5g,加PBS至1000ml。
所述Mhp标准阳性血清稀释液是用抗体稀释液按照体积比为1:2-128的比例将Mhp标准阳性血清稀释,每管量为1ml;Mhp标准阴性血清稀释液用抗体稀释液按照体积比为1:2-128的比例将Mhp标准阴性血清稀释,每管量为1ml。作为优选的Mhp标准阳/阴性血清用抗体稀释液按照1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128稀释。
所述抗体稀释液为0.1%BSA1.0g加入PBS至1000ml;每瓶量为12ml。
所述底物显色液为50mg TMB,10mL DMSO,9.8g柠檬酸和1.2ml 30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml;每管量为12ml。
所述终止液包括双蒸水178.3mL和98%的浓硫酸21.7mL,每管量为6ml。
本发明所述的猪肺炎支原抗体检测试剂盒还包括1瓶洗涤液,所述洗涤液为0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12H2O,8.0g NaCl,0.2g KCl,0.5mL Tween-20(0.05%V/V),加双蒸水定容至100ml,pH值为7.4。
一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
1)非蛋白多聚体定向偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的固相载体的包被;
2)抗体稀释液(AD)配制;
3)底物液显色液配制;
4)终止液配制;
5)阴阳性血清稀释;
6)酶标二抗配制;
7)试剂盒的组装:将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被至少8孔的酶标板1块、阴阳性血清各1管、抗体稀释液1瓶、酶标二抗1瓶、底物显色液1瓶、终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。
相比现有技术,本发明的有益效果在于:本发明采用偶联的猪肺炎支原体特异多肽抗原作为包被液,能够有效提高猪肺炎支原体特异多肽与目标抗体的结合率,从而显著提高检测灵敏度,同时显著降低非特异背景读值,特异性高,具有操作简单,诊断速度快,在进行大规模检测中经济方便等优点,是一种便于普及的好方法,具有广泛的应用前景。本发明的检测方法,包被抗原用量可减至10ng/ml,降低了成本,有利于推广使用。
下面结合具体的实施方式对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
本发明中所采用的偶联猪肺炎支原体特异多肽的制备方法如下:
1)猪肺炎支原体特异Mhp多肽的筛选
有效多肽段的选择和确定,是根据参考文献(Hopp & Woods,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.78,p.3824-3828,Chou & Fassman,1978,Advances inEnzymology,vol.47,p.45-148)提供的方法,对猪肺炎支原体膜蛋白的抗原表位进行预测,确定天然抗原的氨基酸序列,然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇(epitopes)。使用ELISA检测不同多肽与猪肺炎支原体抗血清的反应,最后选出具有良好反应原性的猪肺炎支原体特异多肽。
本实施例根据猪肺炎支原体膜蛋白序列,筛选出5条具有良好反应原性的猪肺炎支原体特异多肽,序列如下所示:
P1:Glu Thr Asp Ser Asp Tyr Lys Ile Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser Asn AsnAsn Ile Arg Asn
P2:Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys Gln Ser Asn Leu Leu Val Ala GluPhe Asn Phe Ser Leu Lys Lys
P3:Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr Thr LysPro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala
P4:Gln Ala Lys Leu Asp Tyr Gly Asn Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Thr Gln LeuAla Lys Val Glu Val Glu Ala Leu Phe Lys Lys Gly Asn Lys
P5:Gln Ile Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Ser Gln Ser Ala Arg Glu IleLeu Ala Ser Pro。
2)偶联猪肺炎支原体特异多肽的制备
称取10mg的上述任一种猪肺炎支原体特异反应原性多肽,加50μL DMSO溶解,然后加入10ml双蒸水,称取1mg的多糖葡糖胺,加1ml PBS溶解,在多糖溶液内加10mg偶联剂EDC混匀,然后与多肽溶液混合,室温搅拌反应3小时。使用透析袋(孔径MWCO 10000-12000)去除未参与结合的偶联剂(EDC),纯化、冻干,得到偶联猪肺炎支原体特异多肽。
实施例1
一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒,通过以下方法制备:
1)选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液按照(包被液为1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中,调节pH值至9.6,并定容至1000mL)5μg/ml的比例稀释,然后将稀释的偶联多肽抗原包被8孔板,每孔100μL,4℃过夜包被,次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干,用封闭液150μl/孔,37℃封闭1h,洗涤液PBST 250μl/孔洗涤3次后拍干,放入真空袋中,加入干燥剂,抽真空,4℃保存;
2)抗体稀释液(AD)配制:称取1.0g BSA(0.1%),加PBS至1000ml,4℃保存;
3)底物液显色液配制:4ml TMB(50mg TMB溶于10mL DMSO中),9.8g柠檬酸,1.2ml 30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml,4℃避光保存;
4)终止液配制(2mol/L H2SO4):双蒸水178.3mL,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7mL;
5)阴阳性血清稀释:用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:2稀释,1ml/管分装,4℃保存;
6)酶标二抗配制:用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:2000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG,4℃保存;
7)试剂盒的组装:将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的8孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。
实施例2
一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒,通过以下方法制备:
1)选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液(包被液为1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中,调节pH值至9.6,并定容至1000mL)按照10μg/ml的比例稀释,然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被48孔板,每孔100μL,4℃过夜包被,次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干,用封闭液150μl/孔,37℃封闭1h,洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干,放入真空袋中,加入干燥剂,抽真空,4℃保存;
2)抗体稀释液(AD)配制:称取1.0g BSA(0.1%),加PBS至1000ml,4℃保存;
3)底物液显色液配制:4ml TMB(50mg TMB溶于10mL DMSO中),9.8g柠檬酸,1.2ml 30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml,4℃避光保存;
4)终止液配制:双蒸水178.3mL,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7mL;
5)阴阳性血清稀释:用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:64稀释,1ml/管分装,4℃保存;
6)酶标二抗配制:用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:4000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG,4℃保存;
7)试剂盒的组装:将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的48孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。
实施例3
一种猪肺炎支原抗体检测试剂盒,通过以下方法制备:
1)选择上述任一种偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原用包被液(包被液为1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中,调节pH值至9.6,并定容至1000mL)按照2.5μg/ml的比例稀释,然后将稀释的偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被96孔板,每孔100μL,4℃过夜包被,包被浓度为8μg/ml,次日用PBST洗涤液250μl/孔洗涤3次后拍干,用封闭液150μl/孔,37℃封闭1h,洗涤液PBST 250μl/孔洗涤4次后拍干,放入真空袋中,加入干燥剂,抽真空,4℃保存;
2)抗体稀释液(AD)配制:称取1.0g BSA(0.1%),加PBS至1000ml,4℃保存;
3)底物液显色液配制:4ml TMB(50mg TMB溶于10mL DMSO中),9.8g柠檬酸,1.2ml 30%H2O2加蒸馏水定容至1000ml,4℃避光保存;
4)终止液配制:双蒸水178.3mL,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7mL;
5)阴阳性血清稀释:用抗体稀释液按阳性血清/阴性血清与抗体稀释剂按体积比为1:128稀释,1ml/管分装,4℃保存;
6)酶标二抗配制:用HRP保护液按HRP保护液与辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG体积比为1:8000的比例稀释辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG,4℃保存;
7)试剂盒的组装:将偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被的96孔酶标板1块、1ml/管的阴阳性血清各1管、12ml/瓶的抗体稀释液1瓶、12ml/瓶的酶标二抗1瓶、12ml/瓶的底物显色液1瓶、6ml/瓶的终止液1瓶、操作说明书一份组装成ELISA试剂盒。
利用本发明的猪肺炎支原抗体检测试剂盒检测抗体的使用方法如下:
1)偶联猪肺炎支原体特异多肽抗原包被液包被的酶标板中每孔内加入100μL已经稀释好的各样本,每个样品必须使用一个独立的枪头,每块板中阴阳性对照血清各设两孔室温下孵育30分钟,再将各孔的液体弃入废液缸内;
2)用微量移液器取洗涤液,洗涤酶标板,约250μL/孔,洗涤6次,最后一次加入洗涤液后浸泡洗涤5min,再将板中残留的洗涤液弃入废液缸内,然后用力扣拍到吸水材料上,注意应避免包被板孔干燥;
3)然后在每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体,室温下孵育30分钟,并重复该步骤;
4)每孔加入100μL TMB底物液,避光显色10分钟,每孔加入50μL终止液,使反应终止,轻震酶标板,使板内液体混匀;
5)使用酶标仪测定并记录样本和对照样本的A450吸收值,10min完成测定;
本实验结果应符合下列条件:
Mhp阳性对照的平均值(P)减去阴性对照的平均值(N)必须大于0.15。阴性对照平均值(N)必须小于或等于0.15。如果试验无效应重做。Mhp抗体的阳性/阴性通过计算样品与阳性对照(S/P)的比值进行判定。具体计算方法如下:
①如果S/P值小于0.20,样品应判定为Mhp抗体阴性(-)。
②如果S/P值在0.20-0.25之间判定为样品Mhp可疑(+/-),如果S/P值大于0.25,则判定为样品Mhp抗体阳性(+)。
应用实施例1:猪肺炎支原体特异Mhp P97抗原表位特异性间接ELISA试验
1)材料
待测血清:猪伪狂犬病毒阳性血清1份、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清1份、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)阳性血清1份、猪圆环病毒(PCV)阳性血清1份、猪链球菌的阳性血清1份、Mhp阳性血清2份、Mhp阴性血清2份,空白对照2份。
其他:包被好的酶标板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪(OD450nm);HRP标记羊抗猪抗体;TMB;终止液:2M H2SO4;洗涤液:PBST。
2)方法
①将包被好的酶标板加入1:40阴阳性血清或被检样品100μL,室温30min;
②洗涤PBST,250μL/孔,洗涤6次,每次5min;
③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体(1:3000),室温30min;
④重复②洗涤步骤;
⑤底物:每孔加入100μLTMB,避光显色10min;
⑥终止液:2M H2SO4,50μL/孔;
⑦酶标仪测定OD450nm读取结果。
表2为特异性检测结果,表2的结果表明:伪狂犬病毒、猪瘟病毒、PCV检测为阴性,PRRSV和猪链球菌为弱阳性。
表1
应用实施例2:猪肺炎支原体特异Mhp P97多肽抗原表位包被浓度间接
ELISA试验
材料与方法:
1)材料
待测血清Mhp阴阳性血清经IDEXX和IDVET检测过的阴性血清2份,阳性血清7份;包被好的ELISA板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪(OD450nm);HRP标记羊抗猪抗体;TMB;终止液:2M H2SO4;洗涤液:PBST。
2)方法
①将包被好的酶标板中加入1:40阴阳性血清或被检样品(经IDEXX和IHA检测过的阴性血清2份,阳性血清7份,100μL,室温30min;
②洗涤PBST,250μL/孔,洗涤6次,每次5min;
③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体(1:3000),室温30min。
④重复②洗涤步骤;
⑤底物:每孔加入100μL TMB,避光显色10min;
⑥终止液:2M H2SO4,50μL/孔;
⑦酶标仪测定OD450nm
3)实验结果
表2是上述9份血清的OD450nm结果,每份样品分别测试两次。
表2
应用实施案例3:猪肺炎支原体特异Mhp P97多肽抗原表位间接ELISA猪
血清样本检测试验
材料与方法:
1)材料
待测血清:Mhp阴阳性血清18份,两份空白对照组;包被好的酶标板、多道移液器、灭菌吸头、酶标仪(OD450nm);HRP标记羊抗猪抗体;TMB;终止液:2M H2SO4;洗涤液:PBST。
2)方法
①将包被好的板子加入1:40阴阳性血清或被检样品,100μL,室温30min。
②洗涤PBST,250μL/孔,洗涤6次,每次5min。
③每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体(1:3000),室温30min
④重复②洗涤步骤
⑤底物:每孔加入100μL TMB,避光显色10min。
⑥终止液:2M H2SO4,50μL/孔;
⑦酶标仪测定OD450nm
3)实验结果
表3是上述18份血清及两份空白对照试剂的OD450nm的结果,每份样品测试分别测试两次。
表3
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式,不能以此来限定本发明保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。