CN101799471A - 基于猪瘟病毒ns3建立的间接elisa方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus CSFV)NS3建立的间接ELISA方法，通过基因克隆表达技术，获取猪瘟病毒重组蛋白NS3。以重组蛋白NS3为包被抗原建立起间接ELISA方法，包括抗原重组蛋白NS3的制备、间接ELISA建立、判定标准的建立及临床血清学检测的应用。可用于猪群中CSFV NS3特异性抗体检测，以此判断猪群中CSFV NS3抗体水平、猪群中CSFV自然感染的情况，以及为CSFV E2基因工程标记疫苗提供鉴别ELISA检测方法。目前该方法是国际上首次利用CSFV NS3建立检测猪群中CSFV抗体的ELISA，其敏感性和特异性明显高于基于Ems建立的ELISA。
Description
技术领域：
本发明属于兽医生物技术领域，是基于猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus CSFV)重组蛋白NS3为包被抗原，建立检测CSFV抗体的间接ELISA方法。
背景技术：
猪瘟(Classical Swine Fever CSF)是由CSFV引起的一种急性热性传染病，各种年龄阶段的猪都可感染发病，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为A类传染病，我国将其列为一类传染病。虽然该病在北美洲、大洋洲及部分欧洲国家已经消灭，但在其他养猪国家仍广泛存在，并对养猪业造成严重危害。我国长期对猪群免疫接种猪瘟病毒兔化弱毒(Hog Cholera Lapizined Virus HCLV)疫苗，基本控制了猪瘟的大流行，但猪瘟在我国各地猪群中广泛存在，并呈现地区性散发性特点，在猪群中存在一定隐性感染和持续性感染现象。
当前CSF实验室诊断方法主要存在的问题之一是如何有效地区分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染，虽然有报道特异性RT-PCR能够区分病毒野毒和疫苗毒感染，但其对技术性要求过高，不适合大规模的流行病学调查。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有操作简单、敏感性高、快速、易标准化等优点，适合于大规模血清学检测。但当前研制开发的绝大部分CSFV抗体检测试剂盒，包括广泛用于CSFV-Ab血清学检测的IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒，同样不能区分CSFV野毒株和疫苗毒株的感染产生的抗体。随着基因工程疫苗技术的发展，现已研究开发出以CSFV E2作为抗原的基因工程标记疫苗，和基于CSFV Erns的鉴别诊断ELISA。虽然CSFV E2基因工程疫苗能够对易感猪群提供保护，但在实际临床中以Erns为抗原建立的鉴别诊断ELISA在血清学检测方面存在敏感性低的缺陷(75～80％)，导致CSFV基因工程标记疫苗在实际临床应用中受到限制。上述问题存在导致开展CSFV净化工作受到严重阻碍，使得我国猪群中CSFV长期存在并对养猪业造成巨大危害。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，可用于猪群中CSFV NS3蛋白抗体检测，以此判断猪群中CSFV NS3抗体水平、猪群中CSF自然感染的情况，以及为CSFV E2基因工程标记疫苗提供鉴别诊断ELISA。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，该方法包括如下步骤：
(1)、包被抗原的制备：
根据GenBank中猪瘟病毒全基因序列(登录号：AF351433)，设计两条引物，上游引物fP：5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP：5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′，通过PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)cDNA中扩增到长度为2049bp NS3基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)(购自Novagen公司，产品编号：69015-3)中，构建重组原核表达载体pETNS3；将重组原核表达载体pETNS3转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞，经0.1mM IPTG诱导高效表达了重组蛋白NS3，该蛋白主要以包含体形式表达，部分为可溶性表达，采用Ni+亲和层析方法(参照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin试剂盒说明书)纯化得到重组蛋白NS3，制得抗原。对照孔包被的抗原硫氧还蛋白由pET-32a(+)空质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞诱导表达，采用Ni+亲和层析方法进行纯化。
(2)、以纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立间接ELISA：
①包被：用pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板(美国Costa公司)，检测孔NS3蛋白包被量为200ng/孔，对照孔包被硫氧还蛋白40ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐温-20，下同)洗涤2遍；
②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，300μl/孔，37℃条件下封闭2h后甩干，用PBST洗涤3次；
③血清作用条件：血清样品稀释液为PBST稀释5％脱脂奶粉，添加5％大肠杆菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀释为2μl/孔；37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
④酶标兔抗猪抗体作用条件：酶标兔抗猪抗体(购自美国Sigma公司，产品目录号：A5670)用PBST做104倍稀释，100μl/孔，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
⑤底物显色：TMB底物(购自Sigma公司，产品目录号：T8768)100μl/孔，37℃条件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，终止反应；
⑥读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据，计算结果。
本发明中提及的PBST皆为0.05M PH7.4PBS+0.05％吐温-20。(3)、间接NS3-ELISA结果判定标准：
参考血清的确定：经IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒和IFA检测为阳性的血清，在该NS3-ELISA条件下重复性检测OD值为1.0±0.1确定为参考阳性血清；经IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒和IFA检测为阴性的血清，在该NS3-ELISA条件下重复性检测OD值为0.1±0.05确定为参考阴性血清。
S/P值判定结果计算公式如下：
样品OD值＝检测孔OD值-对照孔OD值
临界OD值＝阴性血清平均OD值(n＞30)+3×标准差
样品S/P值＝样品OD值/参考阳性血清OD值
临界S/P值＝临界OD值/参考阳性血清OD值
判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明试验成立；临界S/P值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P＜0.3判定为阴性。
黄病毒科各成员NS3在功能方面相似，在人医方面已有报道用丙型肝炎(HCV)重组蛋白NS3建立ELISA应用于感染人群血清学检测。牛病毒性腹泻病毒(Bovine Virus Diarrhea Virus BVDV)与CSFV同属于瘟病毒属，运用BVDV NS3建立ELISA检测牛群中BVDV的抗体水平在国外已经报道。利用分子生物学技术克隆表达CSFV NS3基因获取重组蛋白NS3，运用WesternBlotting分析证明能与血清中的CSFV NS3特异性抗体结合，以重组蛋白NS3为抗原建立间接ELISA，依据ELISA原理以S/P值作为该方法的结果判定标准，使该方法在检测血清抗体过程中标准化，减少在实验操作过程中造成的系统误差，可以作为一种可靠的CSFV抗体血清学检测方法，成为CSFV E2基因工程标记疫苗一种候选鉴别ELISA检测方法。NS3-ELISA的建立理论上能为我国利用CSFV E2基因工程标记疫苗代替传统HCLV提供鉴别诊断自然感染的方法，使得运用基因工程标记疫苗结合配套鉴别诊断ELISA净化我国猪群中的CSFV感染有可靠的技术保障。
本发明方法首次利用分子生物学基因克隆表达技术，获取CSFV重组蛋白NS3，以重组蛋白NS3为抗原建立起间接ELISA。该NS3-ELISA可用于猪群中CSFV NS3特异性抗体检测，以此判断猪群中CSFV NS3抗体水平、猪群中CSF自然感染的情况，以及为CSFV E2基因工程标记疫苗提供鉴别ELISA检测方法。
附图说明：
图1是重组蛋白NS3在大肠杆菌Rosetta中诱导表达及蛋白纯化SDS-PAGE分析图。
其中：第1泳道：蛋白质标准，从上至下分别是97.2KDa、66.4KDa、44.3KDa、29KDa；第2泳道：纯化后的重组蛋白NS3；第3泳道：诱导菌裂解后上清；第4泳道：诱导菌裂解后沉淀；第5泳道：诱导后全菌；第6泳道：未诱导全菌；第7泳道：Western Blotting分析诱导菌裂解液；第8泳道：WesternBlotting分析未诱导菌裂解液。
图2是IFA检测血清样品结果图。
其中：A：参考阳性血清；B：参考阴性血清；C：阴性血清；D：阳性血清。
具体实施方式：
1、包被抗原的制备：
1.1特异性引物设计与合成：利用Primer 5.0引物分析软件，根据GenBank收录CSFV全基因序列(GenBank登陆号为：AF351433)中NS3编码区基因序列设计一对引物fP和rP，引物两端分别设有Sac I和Xho I酶切位点，预计可扩增出CSFV基因组中5,142-7,191bp(长度为2,049bp)的基因片段。
上游引物fP：5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′；下游引物rP：5′-TCTCCTCGAGTTATAGACCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′。上、下游引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。
1.2pETNS3原核表达载体的构建：采用NS3特异性上下游引物从质粒pPOHCLV(包含HCLV全长cDNA)中扩增NS3基因片段，用限制性内切酶SacI和Xho I(购自大连宝生物公司)分别对NS3PCR产物和pET-32a(+)载体进行酶切，用T4DNA连接酶连接两者酶切产物(购自大连宝生物公司)。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，采用PCR方法和酶切鉴定阳性克隆，阳性克隆送至上海英俊生物技术公司进行测序。
挑取单个阳性克隆菌落PCR鉴定结果表明能扩增到2,000bp多目的条带，与预计NS3基因片段大小一致。挑取单个阳性克隆菌落增菌培养后提取质粒，用限制性内切酶Sac I和Xho I进行酶切鉴定，酶切后得到5,300bp和2,000bp大小的片段。阳性克隆测序结果显示NS3基因插入位置、插入方向和阅读框正确，结果表明重组原核表达载体pETNS3构建成功。
1.3重组蛋白NS3诱导表达与鉴定：将构建好的重组原核表达载体pETNS3质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，挑单个菌落进行增菌培养，LB液体培养基中添加50μg/ml浓度Amp和1％浓度葡萄糖，30℃条件下140rpm培养4h左右至对数生长期(620nm吸光度为0.6)，加入IPTG终浓度为1mM，继续培养5-6h后收菌。分别取诱导和非诱导菌液2ml，离心后收集细菌沉淀，用50μl PBS(0.05M PH7.4)悬浮细菌。样品加2×SDS凝胶加样缓冲液50μl混匀，煮沸处理5min后振荡裂解细菌，稍离心后取上清进行SDS-PAGE，鉴定蛋白是否表达。取诱导培养菌液离心后弃上清收集细菌沉淀，用PBS悬浮细菌后超声波裂解至清亮，4℃条件下10,000×g/min离心5min，分别取上清和沉淀悬浮液加2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，煮沸处理5min后SDS-PAGE鉴定蛋白表达方式。
1.4蛋白纯化：取100ml LB液体培养基，按照1.3中蛋白诱导表达条件进行大量诱导培养。取包含体参照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin试剂盒说明书进行蛋白纯化，取回收蛋白质样品加2×SDS凝胶加样缓冲液煮沸处理5min后，进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。回收蛋白样品采用分光光度计测定蛋白质浓度，加入50％甘油置-20℃保存备用。
SDS-PAGE分析显示，重组蛋白NS3在大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞中成功表达，主要以包含体的形式表达，部分以可溶性方式表达，蛋白分子量大小为95kDa，与预测的重组蛋白NS3大小基本一致(参见图1)。回收后蛋白质样品进行SDS-PAGE鉴定纯度，结果表明蛋白纯化效果较好，纯度在90％以上，测定蛋白质浓度为1.0mg/ml(见图1)。
1.5Western Blotting分析：按照1.3中方法诱导表达蛋白，分别取诱导和非诱导全菌SDS-PAGE，参照常规Western Blotting方法进行操作，最后采用增强型HRP-DAB底物显色试剂(购自北京天根生化科技公司)进行显色。结果显示：与SDS-PAGE对比，pETNS3转化Rosetta(DE3)诱导后在Western Blotting对应位置出现特异性的条带，而对照未诱导菌则无(见图1)。结果表明重组蛋白NS3能与阳性血清中抗体发生特异性抗原抗体反应。
2、以重组蛋白NS3建立间接ELISA：
取纯化后重组蛋白NS3做包被抗原建立间接ELISA方法，采用方阵法摸索ELISA最佳蛋白包被浓度和血清稀释浓度，以及ELISA最佳反应条件。最终确定条件如下：
①包被：检测孔重组蛋白NS3包被量为200ng/孔，对照孔硫氧还蛋白包被量为40ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST(0.05M PH7.4PBS+0.05％吐温-20)洗涤2遍；
②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，300μl/孔，37℃条件下封闭2h后甩干，用PBST洗涤3次；
③血清作用条件：血清稀释液为PBST稀释5％脱脂奶粉，添加5％的大肠杆菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀释为2μl/孔；37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
④酶标兔抗猪抗体作用条件：酶标兔抗猪抗体用PBST做104倍稀释后，100μl/孔，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
⑤底物显色：TMB底物100μl/孔，37℃条件下作用10min后加2M H2SO4终止反应；
⑥读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据。
3、结果判定：
检测结果计算公式：
样品OD值＝检测孔OD值-对照孔OD值
样品S/P值＝样品OD值/参考阳性血清OD值
判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明试验成立。血清样品临界S/P值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P＜0.3判定为阴性。
ELISA重复性试验：按照确定好的ELISA条件，用参考阳性血清和参考阴性血清进行批次间重复性试验，检验所建立ELISA的稳定性，结果见下表1。结果显示：参考阳性血清10次重复性试验后，NS3检测孔OD值变异系数为3.8％，对照孔OD值变异系数为10.9％，检测OD值变异系数为4.2％；参考阴性血清NS3检测孔OD值变异系数为21％，对照孔OD值变异系数为10.5％，检测OD值变异系数为40.6％。结果表明参考阳性血清重复性检测变异性小，NS3检测孔OD值和测定OD值变异系数均低于10％，检测结果具有很好的重复性，所以该NS3-ELISA以S/P值作为判定标准；而参考阴性血清重复性变异性大，各个指标变异系数均大于10％，所以以P/N值判定结果变异性大，不适合作为本方法的判定标准。
表1 批次间重复性试验结果
无交叉反应：应用CSFV重组蛋白NS3建立起的间接NS3-ELISA检测猪群中常见传染性病毒性疾病，如猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)参考阳性血清、伪狂犬病毒(PRV)参考阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)参考阳性血清和猪圆环病毒2型(PCV-2)参考阳性血清，结果均为阴性。表明运用NS3融合蛋白建立的相关ELISA方法与猪群中常见病原抗体之间无交叉反应。
本发明的间接NS3-ELISA与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒比较：检测不同年龄和种群猪的血清样品325份，比较间接NS3-ELISA与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果之间一致性，结果显示阳性血清符合率为88.42％，阴性血清符合率为85.19％，总符合率为87.08％，表明两者之间检测结果有较高的一致性，见下表2。
表2 间接NS3-ELISA与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果对比表
| 阳性 | 阴性 | 总数 | |
| IDEXX-Kit | 190 | 135 | 325 |
| NS3-ELISA | 182 | 143 | 325 |
| 符合数 | 168 | 115 | 283 |
| 符合率(％) | 88.42 | 85.19 | 87.08 |
IFA检测42份NS3-ELISA与IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果存在差异的血清样：NS3-ELISA和IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒检测结果比较有42份样品存在差异性，进一步采用IFA进行检测，结果显示：与IFA结果比较NS3-ELISA的总符合率为66.67％，而IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒为33.33％。表明这42份血清样品中NS3-ELISA检测结果与IFA检测结果有较好的一致性，同时从总的血清检测结果来看NS3-ELISA在敏感性和特异性方面稍高于IDEXX公司CSFV-Ab检测试剂盒。
Claims (1)
1.一种基于猪瘟病毒NS3建立的间接ELISA方法，其特征在于：该方法根据间接ELISA的原理建立，包括如下步骤：
(1)、包被抗原的制备：
根据GenBank中猪瘟病毒全基因序列(登录号：AF351433)，设计两条引物，上游引物fP：5′-GATGAGCTCGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG-3′，下游引物rP：5′-TCTCCTCGAGTTATAGA CCAACTACCTGTTTTAGTGC-3′；通过PCR方法从猪瘟病毒兔化弱毒cDNA中扩增到长度为2049bp NS3基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组原核表达载体pETNS3；将重组原核表达载体pETNS3转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)细胞，经1mM IPTG诱导高效表达了重组蛋白NS3，该蛋白主要以包含体形式表达，部分为可溶性表达，采用Ni+亲和层析方法纯化得到重组蛋白NS3；
(2)、以纯化后的猪瘟病毒重组蛋白NS3做包被抗原建立间接ELISA：
①包被：用pH为9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板，检测孔NS3蛋白包被量为200ng/孔，4℃条件下包被24小时后甩干，采用PBST洗涤2遍；
②封闭：封闭采用PBST稀释5％脱脂奶粉，300μl/孔，37℃条件下封闭2h后甩干，用PBST洗涤3次；
③血清作用条件：血清样品稀释液为PBST稀释5％脱脂奶粉，添加5％大肠杆菌裂解液，得100μl/孔，血清做50倍稀释为2μl/孔；37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
④酶标兔抗猪抗体作用条件：酶标兔抗猪抗体用PBST做104倍稀释后，100μl/孔，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤4次；
⑤底物显色：TMB底物100μl/孔，37℃条件下作用10min后加2M H2SO4100μl/孔，终止反应；
⑥读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；
(3)、结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明试验成立，样品临界S/P值为0.3，S/P≥0.3判定为阳性，S/P＜0.3判定为阴性。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20100811 |