CN104862285A - 猪流行性腹泻病毒抗体捕获elisa检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物免疫学技术领域。具体涉及猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA检测方法及应用。本发明以抗猪流行性腹泻病(PEDV)N蛋白的单克隆抗体包被酶标板，捕获原核表达的PEDV N蛋白作为抗原建立检测猪血清中猪流行性腹泻病毒抗体的捕获ELISA方法。本发明具有快速简便、特异灵敏等特点，适用于在体外检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体。其中分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株N2D1保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014174。本发明还公开了在体外猪流行性腹泻病毒抗体检测中的应用。

Description

猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA检测方法及应用

技术领域

本发明属于动物免疫学技术领域。具体涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA检测方法及应用，本方法适用于临床猪群中猪流行性腹泻病毒血清抗体的快速检测。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,简称PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，简称PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为主要特征，不同日龄和品种的猪均易感，其中对10日龄以内仔猪的危害最为严重，发病率和病死率均可达100％。该病于1791年首次发生于英国并在欧洲普遍流行，被称作“流行性病毒腹泻(epidemic viral diarrhea,EVD)”。1976年英国猪群中再次出现了病毒性腹泻，所有日龄的猪均可感染发病，为了与1971年所发生的EVD相区别，将这次发生的腹泻称为EVD 2型。1978年比利时学者从一份标记为CV777的粪便样品中分离到病毒，证实该病毒能引起哺乳仔猪和育肥猪发病，于是将这一疾病命名为猪流行性腹泻(PED)，并沿用至今。我国1973年在猪群中发生传染性腹泻，1984年证实PEDV在我国存在，2006年在国内出现PED流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2010年以来PED在包括我国在内的多个亚洲国家爆发流行，严重制约了亚洲国家养猪业的健康发展。即使在之前从未出现过PED流行的美国也在2013年出现了PED的流行，给美国养猪业造成了严重的经济损失。

血清抗体水平检测在PEDV流行病学调查、疫苗免疫效果评价等方面具有广泛的应用，目前检测PEDV血清抗体的方法主要有中和试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)，3种检测方法均具有特异敏感的特点，其中中和试验是最经典最可靠的方法，但中和试验和间接免疫荧光试验均存在实验周期长、技术要求高和检测成本高的问题，且两种方法不适合大规模样品的检测和基层使用，而酶联免疫吸附试验(ELISA)的操作简单快速、成本低廉、可以同时检测大量样品，对技术条件要求较低，因此发展PEDV抗体的ELISA检测方法将为我国猪流行性腹泻的快速准确诊断提供有力的工具，从而为养猪业的健康发展保驾护航。

目前已经公布的PEDV抗体检测方法的专利文献有两个，分别是黄伟坚等的“检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接ELISA试剂盒”(专利申请号：201310701145X)和李彬等的“检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒”(专利申请号：2014102242274)。黄伟坚等采用的是间接ELISA方法，所用的抗原蛋白是PEDV N蛋白内部的主要亲水区序列135-319位氨基酸；李彬等也是采用的间接ELISA方法，而所用抗原是原核表达的PEDV完整N蛋白。但是上述文献还存在如表1所述的缺陷，这正是本发明需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是克服现有间接ELISA存在的非特异性反应问题，用制备的针对PEDV N蛋白的单克隆 抗体包被ELISA板，捕获原核表达的PEDV完整N蛋白，建立一种检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的捕获ELISA方法，用于猪流行性腹泻病毒抗体的检测、流行病学调查及疫苗免疫效果的评价等。

本发明采用抗PEDV N蛋白的单克隆抗体包被ELISA板，再捕获原核表达的PEDV完整N蛋白作为抗原，在检测方法的建立、抗原选择、抗原吸附方式等方面与黄伟坚、李彬等的报道的方法均有本质的不同。本发明通过单克隆抗体主动吸附N蛋白可以最大程度上减少杂质蛋白和无活性蛋白的结合，从而减少非特异性反应，提高检测方法的特异性和灵敏性。

本发明应用分子生物学技术和免疫学技术，获得表达纯化的PEDV N蛋白并制备了针对PEDV N蛋白的单克隆抗体，在此基础上建立了猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体捕获酶联免疫吸附(ELISA)检测方法，并对其性能进行了测定。所建立的方法特异性好、灵敏度高、检测结果可靠，适用于猪群中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的检测。

本发明的技术方案如下所述：

1.本发明构建了PEDV完整N蛋白的重组表达菌株，表达纯化了PEDV N蛋白：

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)AJ1102株病毒基因组为模版进行RT-PCR扩增获得PEDV N基因，扩增用上下游引物中分别引入了BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，将扩增的N基因经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后连接到pET-30a载体的相应酶切位点，构建了pET-30a-N重组质粒，并经双酶切鉴定，将鉴定正确的pET-30a-N质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性菌落。将阳性菌于37℃培养，待菌液OD值达到0.4-0.6时加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG进行诱导，7h后收集菌体，低温高压破碎，分别对沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳鉴定。根据鉴定结果，对上清中的N蛋白通过Ni柱亲和纯化，获得纯化的PEDV N蛋白。

2.本发明制备了一株针对PEDV N蛋白的单克隆抗体：

以纯化的PEDV N蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠，经两次免疫后检测小鼠血清效价，取达到免疫效价要求的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用原核表的的PEDV N蛋白包被ELISA板，建立ELISA方法对获得的杂交瘤细胞进行筛选，经过三轮筛选，获得一株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株N2D1，申请人将该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株N2D1，于2014年9月23日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为：CCTCC NO：C2014174。

3.本抗体捕获ELISA检测方法的相关试剂材料：

(1)ELISA板：以杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体包被ELISA板，用2％牛血清白蛋白(BSA)封闭1h后加入原核表达并经纯化的N蛋白进行吸附结合，在超净工作台中风干后密闭封装，4℃保存。

(2)洗涤液：含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)

(3)血清稀释液：含5％(m/v)脱脂奶的PBST

(4)封闭液：含2％(m/v)BSA的PBST

(5)辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗猪酶标二抗(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)

(6)底物显色液A：Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加蒸馏水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装

(7)底物显色液B：四甲基联苯二胺20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水溶解并定容至1000ml；0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装

(8)终止液：2.5ml氢氟酸加到900ml蒸馏水中，定容至1000ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装

(9)标准阳性血清 

(10)标准阴性血清 

4.本发明检测方法在检测猪流行性腹泻病毒抗体时的操作步骤：

(1)待检血清用血清稀释液做160倍稀释，每孔加入100μL，同时设立标准阴阳性血清对照，37℃作用1h，弃去血清样品，每孔加入200μL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，每次5min。

(2)每孔加入100μL HRP标记的鼠抗猪酶标二抗，37℃作用1h后弃去，每孔加入200μL洗涤液进行洗涤，共洗涤3次，每次5min。

(3)每孔依次加入50μL显色液A和50μL显色液B，避光反应10min后每孔加入50μL终止液。

(4)在酶标仪中读取OD_630nm值，计算S/P值，S/P＝(检测样品OD_630nm—阴性对照OD_630nm)/(阳性对照OD_630nm—阴性对照OD_630nm)。

(5)结果判定：当S/P值＜0.026时判为阴性；当S/P值≥0.043时判为阳性；当0.026≤S/P值＜0.043时判定为可疑，需要重新检测，再次检测S/P值≥0.026时判为阳性，S/P值＜0.026时判为阴性。

本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1可以在制备猪流行性腹泻病毒抗体的单克隆抗体中的应用。

同时本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体可以在制备猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA试剂盒中的应用。

在本发明中，申请人已经公开了本试剂盒中的核心试剂，如杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体，重组PEDV N蛋白，以及酶标板和其他试剂如：洗涤液、血清稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液、标准阳性血清和标准阴性血清，按本领域的公知常识组装试剂盒。

本发明优点与创新点：

(1)本发明建立的检测方法灵敏性高，所需要的样品量少，样品处理简单快速，整个检测过程操作简便快速，成本低廉。

(2)本发明采用单克隆抗体吸附抗原蛋白的方式建立的，与传统的间接ELISA检测方法相比能够减少杂质蛋白和无活性蛋白的吸附，降低非特异性反应。检测方法特异性好，与常见的几种猪病毒性病原如猪圆环病毒(porcine circovirus,简称PCV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，简称PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis of swine，简称TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,简称PoRV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,简称PRV)、口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,简称FMDV)、猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,简称JEV)、猪细小病毒(porcine parvovirus,简称PPV)等的阳性血清均无交叉反应。

(3)本发明与PEDV血清中和试验的符合率高，检测结果可靠，适合生产实践中样品的大规模检测。

本发明与相关的两个专利文献(专利申请号201310701145X和专利申请号2014102242274)报道检测方法的差异分析比较如表1所示：

表1 本发明与相关专利文献的主要特征和效果的比较

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是猪流行性腹泻病毒(PEDV)AJ1102株N基因核苷酸和对应的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：2是PEDV AJ1102株N基因编码的蛋白质序列。

图1：是本发明的总体技术路线图。

图2：本发明扩增到的PEDV AJ1102株N基因琼脂糖凝胶电泳检测图。附图标记说明：M：DNA Marker；1：N基因(完整N基因1326bp+酶切位点序列18bp)。

图3：本发明制备的重组PEDV N蛋白的SDS-PAGE电泳检测图。附图标记说明：M：Protein Marker；1：pET-30a/BL21菌液；2-8：pET-30a-N/BL21重组菌株诱导后1-7h；9：重组表达菌破碎后离心沉淀；10：重组表达菌破碎后离心上清；11-13：镍柱纯化后的重组N蛋白。

图4：是包被抗体稀释倍数的确定。

图5：是商购质粒pET-30a的图谱。

图6：是本发明构建的重组质粒pET-30a-N的模式图。

具体实施方式

实施例1

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不是限制本发明，总体实施步骤按照图1中技术路线进行。

一、PEDV N基因的克隆和N蛋白重组表达质粒的构建

本发明涉及的PEDV N基因是申请人自己克隆得到的，该基因的序列已在GenBank数据库中登录，登录 号为JX188454.1。PEDV N基因的克隆与测序具体方法是：将发明人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室分离到的猪流行性腹泻病毒AJ1102株(参见文献：Bi J,Zeng S,XiaoS,Chen H,Fang L.Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain AJ1102Isolated from a Suckling Piglet with Acute Diarrhea in China.J.Virol.86(19),10910-10911，2012年10月)接种已长至单层的VERO细胞，24h后，待细胞发生病变时收集细胞悬液，冻融3次后提取RNA。根据PEDV AJ1102株的序列设计引物(上游引物P1：TTTGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCAG；下游引物P2：GGGAAGCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTC)，在引物P1和P2中分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ位点。通过RT-PCR扩增N基因，RT-PCR体系与反应条件如下：

RT反转体系： 

RT反转条件： 

反转得到的cDNA作为模版PCR扩增N基因；

PCR反应体系： 

PCR反应条件： 

通过RT-PCR扩增得到的目的基因序列长度为1344bp(完整N基因1326bp+酶切位点序列18bp)(电泳结果见图2)。回收目的基因用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入pET-30a载体(购自Life Technologies公司，见图5)的相应位点，转化E.coli DH5α大肠杆菌进行质粒扩增，提取质粒进行酶切鉴定和测序，并与GenBank中登录的序列进行同源性比较和分析，结果与原序列的同源性为100％，将构建正确的重组质粒命名为pET-30a-N(该重组质粒构建模式图见图6)。

二、免疫原和抗原蛋白的制备

用重组质粒pET-30a-N转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落扩大培养，当活化培养的菌液OD_600nm值在0.4～0.6时加入终浓度为0.8mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。在诱导表达7h后，取1mL诱导表达菌液于12000r/min离心1min，弃上清，用100μL PBS将沉淀重悬。加入25μL5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后，100℃沸水中煮沸10min后，置于冰上，作为SDS-PAGE检测的样品。同样取诱导表达7h的菌液离心后用PBS重悬，将重悬的菌液经超声波破碎仪(仪器厂家：JNBIO HIGH PRESSURE HOMOGENIZER-JN300PLUS,main energy:1000～1500)破碎，10000r/min离心30min后，用常用的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，分别取上清和沉淀加入适量的SDS-PAGE Loading Buffer制备样品，进行SDS-PAGE检测。经检测发现重组N蛋白在诱导后7h获得高效表达，并且是以可溶性蛋白的形式存在(见图3)。诱导200mL重组菌，取破碎后的上清利用AKTA FPLC(购自Amersham Biosciences公司，UPC-900)纯化系统，通过融合表达的his标签亲和纯化获得N蛋白，经SDS-PAGE电泳检测可见纯化效果良好(图3)，使用微量紫外分光光度计进行蛋白浓度测定，分装后于-80℃保存。

将纯化的PEDV N蛋白作为本发明单克隆抗体制备的免疫原和抗体吸附的检测抗原。

三、抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备

利用上步中制备得到的免疫原免疫4周龄雌性BALB/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)。取100μg N蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化，背部皮下注射小鼠进行首免。14d后用相同剂量的N蛋白与等体积不完全佐剂(购自sigma公司)乳化后进行第二次免疫，在二免14d后用间接ELISA方法测定小鼠血清抗体效价。在融合前的3～5天，腹腔注射不加佐剂的N蛋白加强免疫。融合时，取经过加强免疫的BALB/c小鼠一只，无菌操作分离脾细胞，与新鲜制备的无菌的SP2/0骨髓瘤细胞按照1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(数量个数比为1:10～1:15)的比例用PEG(购自sigma公司)0.8mL在37℃的条件下进行细胞融合。将融合的细胞用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮，分种于96孔细胞培养板中，并补充正常小鼠脾细胞作为饲养细胞辅助杂交瘤细胞生长。培养四天后更换为HT培养基(购自Sigma公司)。当培养基略变黄时，进行抗体检测。对筛选到的阳性孔用有限稀释法(Che,X.Y.,L.W.Qiu,Y.X.Pan,K.Wen,W.Hao,L.Y.Zhang,Y.D.Wang,Z.Y.Liao,X.Hua,V.C.Cheng,and K.Y.Yuen.2004.Sensitive and specific monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay for detection of nucleocapsid antigen in sera from patients with severe acute respiratory syndrome.J.Clin.Microbiol.42:2629–2635.)进行克隆、筛选。经过3次克隆，获得1株能稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，申请人将其命名为杂交瘤细胞株N2D1。

选取6周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射500μL弗氏不完全佐剂预刺激，1周后将杂交瘤细胞N2D1通过腹腔注射小鼠(5x10⁵～10⁶个细胞/只)，当小鼠腹部膨大时(大约10天)收集腹水，将收集到的腹水采用常规 的辛酸-硫酸铵法进行纯化，最终获得纯化的单克隆抗体，使用微量紫外分光光度计测定抗体浓度，分装后-80℃保存。

四、抗体捕获ELISA检测方法的建立

(1)包被抗体最佳稀释倍数的确定

将纯化的N2D1株抗体用包被液先作100倍稀释后再作倍比稀释(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800)包被酶标板，100μL/每孔，4℃过夜，次日拍干孔内的液体，加入含5％脱脂牛奶的PBST封闭，200μL/每孔，37℃封闭1h，加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗(购自sigma公司)孵育1h后显色并读取吸光值，根据OD_630nm值变化情况可以看出，当抗体稀释倍数小于1600倍时，OD_630nm值无明显差异(见图4)，说明ELISA板孔内抗体已达到饱和，因此确定抗体的最佳稀释倍数为1:1600，此时抗体浓度为3.1μg/mL。

(2)蛋白最佳结合浓度及血清最佳稀释倍数的确定

将纯化的PEDV N蛋白和PEDV阴阳性血清(以下简称“血清”)分别进行倍比稀释，通过十字交叉法确定最佳捕获蛋白浓度和血清的最佳稀释度，检测发现当蛋白浓度为2μg/mL、血清稀释倍数为1:160时，有最大P/N值(见表2)，因此确定捕获蛋白的最佳浓度为2μg/mL、血清最佳稀释倍数为1:160。

表2 蛋白结合浓度及血清稀释倍数的确定

(3)最佳封闭液的确定

为尽量降低非特异性反应，对4种常用的ELISA封闭液(含0.2％牛血清白蛋白，即BSA的PBST、含0.5％BSA的PBST、含2％海藻糖的PBST、含5％脱脂奶的PBST)进行了对比，每组分别设置3个重复并计算OD_630nm平均值。从表3中可知，当以含5％脱脂奶粉的PBST作为封闭剂时，阳性血清的OD_630nm值较高，阴性血清OD_630nm值最低，且有最大的P/N值，由此确定含0.2％BSA的PBST为最适宜本检测方法的封闭液。

表3 封闭液的选择

(4)血清稀释液的确定

采用几种不同的血清稀释液(PBST、含0.1％BSA的PBST、含0.5％BSA的PBST、含5％脱脂奶的PBST)对标准阴阳性血清进行检测，每组设置3个重复并计算OD_630nm平均值，结果显示使用含5％脱脂奶的PBST作为血清稀释液时P/N值最大，为9.01(表4)，因此确定以含5％脱脂奶的PBST作为本发明的血清稀释液。

表4 血清稀释液的确定

(5)血清最佳反应时间的确定

以将血清反应时间设置为15min、30min、45min、60min、90min五个时间点，每个时间点设立3个重复并计算OD_630nm平均值值，结果当血清反应时间为60min时，阳性血清的OD_630nm值较高，阴性血清的OD_630nm值也相对较低，且P/N值最大(表5)，因此确定血清的最佳反应时间为60min。

表5 血清最佳反应时间的确定

(6)酶标二抗最佳作用时间的确定

于加入鼠抗猪酶标二抗后反应不同时间进行检测，不同时间点设立3个重复并计算OD_630nm平均值，结果当反应时间为60min时，P/N值最大(表6)，因此确定二抗的最佳反应时间为37℃作用60min。

表6 酶标二抗最佳反应时间的确定

(7)底物最佳反应时间的确定

于加入底物后不同时间进行检测，不同时间点设立3个重复并计算OD_630nm平均值，结果当底物的作用时间为15min时，本底水平较低且酶促反应充分，有最大的P/N值(表7)，因此确定底物的最佳反应时间为10min。

表7 底物最佳反应时间的确定

(8)阴阳性临界值的确定

本检测方法采用S/P值进行结果判定，每次检测时设立阴性标准血清和阳性标准血清的对照，S/P＝(检测样品OD_630nm—阴性对照OD_630nm)/(阳性对照OD_630nm—阴性对照OD_630nm)。根据统计学原理检测一定量的阴性血清后，计算阴性样品S/P值的均值X和标准差SD，在99％的可信度下，以X+3×SD作为阳性下限值，在95.3％的可信度下，以X+2×SD作为阳性下限值，在X+3×SD与X+2×SD之间的判为可疑，对可疑样品需再次检测，并以X+2×SD为阳性下限判定。用建立的抗体捕获ELISA方法检测了148份PEDV阴性血清样品，在样品值符合正态分布情况下，经计算S/P值的平均值X＝-0.008，SD＝0.017，确定该检测方法的的判定标准为：当S/P值＜0.026时判为阴性，当S/P值≥0.043时判为阳性，当0.026≤S/P值＜0.043时判定为可疑，需要重新检测，再次检测S/P值≥0.026时判为阳性，S/P值＜0.026时判为阴性。

(9)抗体捕获ELISA检测方法操作程序

将纯化的杂交瘤细胞株N2D1的单克隆抗体以3.1μg/mL于4℃包被ELISA板过夜，次日甩弃包被液，加入含0.2％BSA的PBST，200μL/每孔，37℃封闭1h，甩弃封闭液，每孔加入200μL PBST洗板3次，每次5min；将纯化的PEDV N蛋白用PBST稀释至2μg/mL，每孔加入100μL，37℃吸附1h，甩弃未吸附的蛋白，每孔加入200μL PBST洗板3次，每次5min，在超净工作台中吹干ELISA板，密封保存备用。

取制备好的ELISA板，将待检的血清用血清稀释液进行1:160倍稀释，并设立阴阳性对照，每孔加入100μL，37℃孵育1h；甩弃血清，每孔加入200μL PBST洗板3次，每次5min；每孔加入100μL HRP标记的鼠抗猪酶标二抗，37℃孵育1h；甩弃酶标二抗，每孔加入200μL PBST洗板3次，每次5min，依次加入50μL底物显色液A和50μL底物显色液B，避光显色10min，加入50μL显色终止液，在酶标仪中读取OD_630nm值，按 照确定的计算方法将OD_630nm值换算为S/P值并判定检测结果。

(10)抗体捕获ELISA检测方法与中和试验的比较

用本发明建立的抗体捕获ELISA检测方法与常规中和试验同时检测了96份临床血清样品，血清中和效价用Reed－Muench两氏法计算，当中和效价小于1:4判为阴性，大于或等于1:4判为阳性，结果显示本发明的ELISA方法和中和试验检测的阳性符合率为87.18％，阴性符合率为84.21％，总符合率为85.42％(表8)。

表8 ELISA检测结果与血清中和试验符合率

与经典的PEDV血清抗体中和试验具有较高的符合率，可用于临床PEDV血清样品的检测。

综上所述，本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1可以在制备猪流行性腹泻病毒抗体的单克隆抗体中的应用。

同时本发明制备的杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体可以在制备猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA试剂盒中的应用。

在本发明中，申请人已经公开了本试剂盒中的核心试剂，如杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体，重组PEDV N蛋白，以及酶标板，其他试剂如：洗涤液、血清稀释液、封闭液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗猪酶标二抗、底物显色液A、底物显色液B、终止液、标准阳性血清和标准阴性血清等，将上述核心成分和试剂直接组装成检测猪流行性腹泻病毒抗体的试剂盒。

Claims (4)

1.一株分泌抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株N2D1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014174。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株N2D1在制备猪流行性腹泻病毒抗体的单克隆抗体中的应用。

3.权利要求1中所述的杂交瘤细胞株N2D1分泌的单克隆抗体在制备猪流行性腹泻病毒抗体捕获ELISA试剂盒中的应用。

4.一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含有由保藏号为CCTCC NO：C2014174的杂交瘤细胞株N2D1分泌的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体。