CN103044544A - 一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的elisa试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物免疫分析技术领域。具体涉及一种用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测的酶联免疫(ELISA)试剂盒及应用。本发明的方法主要包括免疫原、抗体的制备、包被原及酶标抗体的制备和ELISA检测方法的建立。本发明的试剂盒主要由抗PRRSVN蛋白特异性酶标记物、PRRSV标准阳性对照、包被有抗PRRSVN蛋白特异性单克隆抗体的酶标板组成。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等特点，适用于对临床猪群中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。

Description

一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及应用

技术领域

本发明属于动物免疫化学分析技术领域。具体涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的酶联免疫(ELISA)检测试剂盒与应用，本发明的试剂盒适用于临床猪群的猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，简称PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，简称PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的烈性传染病。以妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍及各年龄阶段猪的呼吸道症状为特征。1987年首次在美国发现，当时由于病原不清楚，故称为“猪神秘病”，又因为部分发病猪耳部发绀变紫，故又称之为“蓝耳病”。不久PRRS迅速在北美和欧洲暴发流行。1995年国内某些猪场发生了以流产、死胎等为主要症状的疫病，怀疑是由PRRSV引起的繁殖障碍性疾病。1996年中国农科院哈尔滨兽医研究所在国内分离到第一株PRRSV病毒(CH-la株)，证实该病在国内存在。2006年6月开始，我国南方部分省市发生了以体温高热不退、皮肤发红、呼吸困难为主要临床症状的疫情，该病给养猪业造成了巨大经济损失。经流行病学调查、病毒分离、基因分析、动物试验等，最终确定是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株造成的，并定名为高致病性猪蓝耳病。

目前检测PRRSV抗原的主要方法有RT-PCR、免疫过氧化物酶单层试验(Immunoperoxidase monolayerassay，IPMA)和病毒分离等。检测PRRSV抗体的方主要是血清学实验，包括IPMA、间接免疫荧光(indirectimmunofluorescence assay，IFA)、血清中和试验(serum neutralization test，SN)和酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)。IPMA需要首先分离出病毒，而分离病毒所需时间长，且灵敏性差。国内外有部分学者采用RT-PCR技术检测PRRS病原的存在，并获得了较好的实验室检测效果，然而RT-PCR首先需要反转录，其技术要求高、样本处理难、价格昂贵，因此不适用于大规模检测。我国现阶段缺乏快速、准确、成本低廉的PRRS检测试剂。近年来，ELISA法以其灵敏、快速、特异、简便等优点，在动物疾病的检测诊断领域已被广泛应用。目前国内外检测PRRSV抗原的ELISA方法较多，但已申请专利的检测PRRSV抗原的ELISA方法只有两种，分别是杨汉舂等的“猪繁殖与呼吸综合征病毒双抗体夹心ELISA试剂盒”(专利申请号：200910093631.1)和吴艳涛等的“检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒及检测方法”(专利申请号：201010252436.1)。与上述两个专利相比：本发明是采用针对高致病性PRRSVN蛋白不同抗原表位的两株单克隆抗体建立的双抗体夹心ELISA方法，而吴艳涛等采用的是一株针对PRRSV N蛋白的单克隆抗体和一种针对整个PRRSV的多克隆抗体，在方法的建立方面有本质的不同；杨汉春等采用的是针对PRRSV经典株-BJ-4株的单克隆抗体。但是，目前在我国流行的主要是高致病性PRRSV，本专利中请在对高致病性PRRSV进行检测时具有更高的特异性。

本发明应用免疫学技术筛选出针对PRRSVN蛋白单克隆抗体，研制针对高致病性PRRSV的快速检测试剂盒，并对其性能进行测定。试剂盒检测方位宽，假阳性低，检测灵敏、准确、可靠，适用于临床猪群中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，制备专门针对抗PRRSV WUH3株N蛋白单克隆抗体。利用2株针对N蛋白不同抗原表位的单克隆抗体研制一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒，作为在临床猪群中的猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA检测方法中的应用。

本发明的技术方案是：

申请人通过分子生物学方法，获得一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，该抗体是由保藏号为CCTCC NO：C201195和保藏号为CCTCC NO：C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的。

所述的杂交瘤细胞N4D2和N3H12于2011年9月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号分别为CCTCC NO：C201195和CCTCC NO：C201194。

申请人研制了一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其包含所述的保藏号为CCTCCNO：C201195和保藏号为CCTCC NO：C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的的单克隆抗体。

申请人提供了一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的的ELISA试剂盒，该试剂盒由下列部分构成：保藏号为CCTCC NO：C201195的单克隆抗体包被的酶标板和保藏号为CCTCC NO：C201194的单克隆抗体制备的酶标记物，阳性对照，阴性对照，包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液，其中所述的包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液的组分及配比如下：

包被液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液：1.59gNa₂CO₃，2.93gNaHCO₃，加三蒸水定容至1000mL；

20倍浓缩洗涤液：称取NaCI 160g、KCl 4g、Na₂HPO₄·12H2O 58g、KH₂PO₄4g，用800ml三蒸水溶解，调节pH值至7.4，再加入Tween-2010ml，最后加三蒸水定容至1000ml；

封闭液：在100ml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成；

底物显色液A：Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装；10ml/瓶；

底物显色液B：四甲基联苯二胺20mg，无水乙醇10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml；过滤除菌，无菌分装，10ml/瓶；

终止液：2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml，过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶。

本发明是通过如下步骤获得的：

一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA检测方法，其包括制备免疫原、抗体、包被原、酶标板、酶标记物和样品前处理，其具体制备步骤如下所述：

(1)将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)WUH3株ORF7基因扩增后，连接到pET-30a载体上，构建原核表达质粒pET-30a-ORF7，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后，将其表达产物(重组的N蛋白)经Ni-NTA柱纯化后得到免疫原；

(2)将步骤(1)得到的重组N蛋白免疫原经动物免疫、细胞融合和筛选后得到特异性抗N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞N4D2和N3H12(其保藏号分别为CCTCC NO：C201195和CCTCC NO：C201194)；

(3)将步骤(2)得到的抗N蛋白单克隆抗体N4D2，经抗体纯化后得到包被原；

(4)将步骤(2)得到的抗N蛋白单克隆抗体N3H12，经抗体纯化、酶标后得到酶标记物；

(5)将步骤(3)得到的纯化的抗N蛋白单克隆抗体N4D2包被的酶标板；

(6)分别制备阳性对照，阴性对照，包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液，

所述的包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液的组分及配比如下：

包被液为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液：取1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加三蒸水定容至1000mL；

20倍浓缩洗涤液：取NaCl 160g、KCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 58g、KH₂PO₄4g，用800ml三蒸水溶解，调节pH至7.4，再加入Tween-2010ml，最后加三蒸水定容至1000ml；

封闭液：在100ml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成；

底物显色液A：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶；

底物显色液B：取四甲基联苯二胺20mg，无水乙醇10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml；过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶；

终止液：取2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml；过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶。

其中所述的阳性对照和阴性对照是通过如下步骤制备得到的：

阳性对照的制备

将实施例1中制备的如序列表SEQ ID NO：1所述核苷酸序列的纯化重组N蛋白，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至50ng/ml后，即为制备本试剂盒的阳性对照。

阴性对照的制备

将原核表达载体pET-30a转化E.coli BL21(DE3)，涂布到含卡那霉素(Kna)抗性(50μg/mL)的LB平皿上，挑取单菌落扩大培养，经质粒提取和酶切鉴定正确后的重组菌用于后续的诱导表达。将重组菌按照1∶1000(体积比)的比例加入含有卡那霉素(Kan)抗性(50μg/mL)的液体LB培养基中，过夜培养后，第二天，按照1∶100(体积比)的比例在37℃进行大量诱导。在OD_600nm值在0.3时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mM/L进行诱导表达。在诱导表达4h后，将菌液于12000r/min离心1min，弃掉上清，加入1/10(体积比)的PBS重悬沉淀。经超声波破碎仪(仪器厂家：JNBIO HIGH PRESSUREHOMOGENlZER-JN300PLUS，main energy：1000～1500)破碎，10000r/min离心10min后，取上清用PBS稀释100倍(体积比)后，即为本试剂盒的阴性对照。

(7)将待检的猪血液经4000r/min，离心5min，获得猪血清(样品)；或者将待检猪的组织样品经研磨，离心后取上清即可得到待检样品；

(8)用笨发明制备的试剂盒对步骤(7)的待测样品进行ELISA测定及结果判定。

本发明试剂盒有以下优点：

(1)样品前处理简单、方便、快捷，缩短了整个检测过程所需要的时间。

(2)本发明采用两株抗N蛋白的单克隆抗体所建立的检测方法具有很好的特异性，与口蹄疫病毒(footand mouth disease virus，FMDV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)、猪瘟病毒(Hogcholera virus，HCV)、猪乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)和猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)无交叉反应。

(3)本发明对猪繁殖与呼吸综合征病毒的高致病性变异毒株和经典毒株和均可进行检测，具有很好的敏感性。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是PRRSV WUH3株ORF7基因序列。

序列表SEQ ID NO：2是PRRSV WUH3株重组N蛋白的氨基酸序列。

图1：本发明检测方法建立的技术路线。

图2：本发明扩增到的PRRSVWUH3株ORF7基因琼脂糖凝胶电泳检测图(图中：M：DNALadder；1：ORF7基因(372bp)；2：阴性对照)。

图3：本发明所制备的重组N蛋白的SDS-PAGE电泳检测图(途中：M：蛋白Marker：1：pET-30a诱导后5h；2：pET-30a-ORF7未诱导；3：pET-30a-ORF7诱导后5h；4：重组表达菌破碎后离心上清；5：重组表达菌破碎后离心沉淀；6：纯化后的重组N蛋白)。

图4：本发明所构建的原核表达质粒pET-30a-ORF7示意图。

图5：本发明中所使用的单克隆抗体的抗体亚类鉴定结果(N4D2：IgG1，κ；N3H12：IgG1，κ)。

图6：本发明的特异性实验结果。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不是限制本发明。

实施例1  免疫原的制备

本实施例中的免疫原(纯化的重组N蛋白)的制备按照图1所示的技术路线。具体方法为：

1、ORF7基因的克隆和测序

本发明涉及的ORF7基因是申请人自己克隆得到的，该基因的序列已在GenBank数据库中登录，登录号为HM853673.1。该序列与已知序列有100％的同源性。ORF7基因的克隆与测序具体方法是：将发明人所在的华中农业大学农业稳微生物国家重点实验室病毒室分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒WUH3株(Li B，Xiao SB，Wang YW，Xu SS，Jiang YB，Chen HC，Fang LR.Immunogenicity of the highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus GP5 protein encoded by a synthetic ORF5 gene.Vaccine.2009，27(13)：1957-1963.)【GenBank登录号为HM853673.1】接种已长至单层的Marc-145细胞(购自卫生部武汉生物制品所)，48h后，待细胞发生皱缩、聚集和脱落等病变时收集病毒，在-80℃条件下冻融3次，1000r/min离心10min去除细胞碎片，分装后存于-80℃保存备用。根据PRRSV WUH3株的序列设计引物，扩增ORF7基因。设计上游引物P1：GCGGGATCCATGCCAAATAACAACGGC；下游引物P2：GGGAAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGC。在引物P1和P2分别插入BamH I和Hind III位点。两引物之间包含有ORF7基因完整的阅读框。取适量的PRRS病毒悬液提取总RNA，按照宝生物工程(大连)有限公司的RNA PCR Kit(AMV)试剂盒说明书中的操作说明进行提取，并扩增出目的基因ORF7(序列长度为372bp，见图2)，将目的基因通过琼脂糖回收试剂盒(购自TIANGEN公司)回收后，连接到pGEM-T载体(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)上，转化E.coli DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)。挑选单菌落，并在含有100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中培养后，采用质粒小量提取试剂盒(购自TransGen Biotech公司)提取目的质粒，并经BamH I和Hind III双酶切鉴定后，挑选正确的克隆，将重组菌液送金斯瑞公司进行序列测定，并将测序结果与GenBank中的有关数据进行同源性比较和分析，结果与原序列的同源性为100％。

2、原核表达质粒pET-30a-ORF7的构建和重组N蛋白的表达和纯化

将pGEM-T-ORF7经BamH I和Hind III双酶切后，插入原核表达载体pET-30a(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)的相同位点，并转化E.coli DH5α。挑取单菌落扩大培养后，提取质粒并经双酶切鉴定后，证实pET-30a-ORF7原核表达质粒(图4)构建成功。将重组质粒pET-30a-ORF7转化E.coli BL21(DE3)，涂布到含卡那霉素(Kna)抗性(50μg/mL)的LB平皿上，挑取单菌落扩大培养，经质粒提取和酶切鉴定后正确的重组菌用于后续的诱导表达。将重组菌按照1∶1000(体积比)的比例加入含有卡那霉素(Kan)抗性(50μg/mL)的液体LB培养基中，过夜培养后，第二天，按照1∶100(体积比)的比例在37℃进行大量诱导。在OD_600nm值在0.3时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mM/L进行诱导表达。在诱导表达4h后，取1mL诱导表达菌，将菌液于12000r/min离心1min，弃掉上清，用100μL磷酸盐缓冲液(即PBS：取KCL 0.2g，NaCL 8g，KH₂PO₄0.27g，NaHPO₄1.42g于900ml ddH₂O中，搅拌至完全溶解，定容至1L)将沉淀重悬。加入25μL5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后，在100℃沸水中煮沸10min后，置于冰上，作为SDS-PAGE检测的样品。另外，将用PBS重悬后的菌液经超声波破碎仪(仪器厂家：JNBIO HIGHPRESSURE HOMOGENIZER-JN300PLUS，main energy：1000～1500)破碎，10000r/min离心10min后，再次将沉淀重悬，分别取上清和沉淀加入适量的SDS-PAGE Loading Buffer制备样品，进行SDS-PAGE检测。经检测发现重组的N蛋白在诱导后4h获得高效表达，并是以可溶性蛋白的形式存在。再次诱导200ml重组菌，将菌液离心后按照GE公司(GE Healthcare公司)的可溶性蛋白纯化方法(按照产品使用说明书进行操作)，使用Ni-NTA柱对其进行纯化。最终获得纯度很好的重组N蛋白(图3)，即作为本发明的免疫原，另外，可建立间接ELISA方法用于阳性杂交瘤细胞株的筛选。

实施例2抗N蛋白单克隆抗体的制备

利用实施例1中制备的免疫原免疫6周龄雌性BALB/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)。免疫程序是：取重组N蛋白100μg的蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化，皮下注射小鼠。间隔14天后进行第二次免疫，换用不完全佐剂(购自sigma公司)乳化，并在二次免疫后的14天用间接ELISA方法测定小鼠血清抗体效价。最后在融合前的3～5天，腹腔加强免疫，不加佐剂。融合时，取经最后加强免疫的BALB/C小鼠一只。眼眶放血致死(收集血清，即为阳性血清)，无菌分离脾细胞，与新鲜制备的无菌的SP2/0骨髓瘤细胞(购自卫生部武汉生物制品所)按照1～2×10⁷个SP2/0与10⁸个免疫细胞(数量比：1∶10～1∶15)的比例用PEG(购自sigma公司)0.8mL在37℃的条件下进行细胞融合。具体方法是：第一分钟逐滴滴入1mL。第二分钟加1mL，第3～4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL RPMI-1640液(购自GIBCO公司)，也需慢慢加入。在1000r/min离心5min，去上清，于37℃放置5～8min。用HAT培养基(购自Sigma公司)悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250μl/孔。一次融合可接种4～8块96孔板。放在细胞培养箱进行培养，并观察其生长情况，于第四天更换100μl HT培养基(购自Sigma公司)。当培养基略变黄时，进行抗体检测。对筛选出来的阳性孔用有限稀释法(Che，X.Y.，L.W.Qiu，Y.X.Pan，K.Wen，W.Hao，L.Y.Zhang，Y.D.Wang，Z.Y.Liao，X.Hua，V.C.Cheng，and K.Y.Yuen.2004.Sensitive and specifi c monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassay for detection of nucleocapsidantigen in sera from patients with severe acute respiratory syndrome.J.Clin.Microbiol.42：2629-2635.)进行克隆、筛选。经过3～4次的克隆，最终筛选到两株分泌抗N蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，并于2011年9月20日送中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，申请人将其命名为杂交瘤细胞N4D2(保藏编号为CCTCC NO：C201195)和杂交瘤细胞N3H12(保藏编号为CCTCC NO：C201194)。对该细胞系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体的平均数为70，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在90～100之间，均高于两亲本细胞的染色体数目。将这两株细胞系注射BALB/C小鼠腹腔，可大量制备单克隆抗体。采用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒(购自Thermo公司)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定，结果两株抗体的抗体亚类均为小鼠IgG1亚类(图5)，轻链亚类为κ。并通过相加ELISA的方法(Qiu，L.W.，B.di，K.Wen，X.S.Wang，W.H.Liang，Y.D.Wang，Y.X.Pan，M.Wang，Y.Q.Ding，and X.Y.Che.2009.Development of an antigen capture immunoassay based on monoclonal antibodies specifi c fordengue virus serotype 2 nonstructural protein 1 for early and rapid identifi cation of dengue virus serotype 2infections.Clin.Vaccine Immunol.16：88-95.)确定了制备的两株抗体与N蛋白的结合位点不同，可用于后续检测方法的构建。

实施例3单克隆抗体的纯化

对实施例2制备的抗体腹水采用辛酸一硫酸铵法进行纯化。具体操作过程为：取制备的腹水5mL12000r/min，离心5min，取上清，约为5mL；在上清中加入20mL醋酸缓冲液(pH：4.5，该醋酸缓冲液的配方：称取NaAc·3H₂O 4.085g溶于450ml ddH₂O中，用HCl调pH至4.5，用ddH₂O定容至500ml)，混匀后，缓慢加入825μl辛酸，边加边搅动；搅拌30min，于4℃12000r/min离心30min；将上清用滤纸过滤，并调节pH至7.0～7.4之间，按总体积≤45％的比例加入饱和硫酸铵(pH：7.2)，边加边搅拌，搅拌30min，置于4℃冰箱，沉淀4～5h；于4℃12000r/min离心30min；用适量10mM Tris-HCL(pH：9.0)将沉淀重悬，装入透析袋，用10mM Tris-HCL(pH：9.0)在4℃透析过夜，于12000r/min离心5min，取上清定容至5mL。并在紫外分光光度仪上测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为95％。分装后保存于-80℃备用。该纯化的抗体N4D2和N3H12可用于制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂盒的相关试剂。

实施例4酶标板和酶标记物的制备

1、酶标板的制备

将实施例3中制备的纯化的单克隆抗体(N4D2)用包被液稀释至2μg/ml，100μl/孔，加入96孔板，4℃过夜。第二天，拍干孔内的液体，加入含5％脱脂乳的PBST封闭，200μl/孔，37℃1h。用洗涤液洗3遍，每遍2min。风干孔内的残存液体，即可获得用于制备试剂盒的酶标板。

2、酶标记物的制备

将实施例3制备的纯化的单克隆抗体(N3H12)进行酶标，制备酶标记物。具体操作过程为：取5mg辣根过氧化物酶(HRP，购自sigma公司)溶于0～5mL ddH₂O中，加入0.5mL NaIO₄(0.06M)，于4℃30min后，加入乙二醇(0.16M)0.5mL，室温避光30min以终止氧化反应；加入5mg/mL的IgG 1mL，置于4℃冰箱，用碳酸盐缓冲液(0.05M，碳酸盐缓冲液成分：取1.59gNa₂CO₃，2.93gNaHCO₃，溶于800mL三蒸水中，完全溶解后加三蒸水定容至1000mL，pH：9.5)透析过夜；次日，吸出透析袋内的液体，加入0.2mLNaBH₄(5mg/mL)置于4℃冰箱2h后，加入等体积的饱和硫酸铵(pH：7.2)置于4℃冰箱30min，于10000r/min离心10min弃上清，沉淀用适量磷酸盐缓冲液(20mM，磷酸盐缓冲液成分：取7.16g Na₂HPO₄，3.12g NaH₂PO₄，溶于800mL三蒸水中，完全溶解后加三蒸水定容至1000mL，pH：7.4)重悬后，用PB在4℃透析过夜；次日，10000r/min离心5min，上清定容至5mL，分装保存于-80℃。即可获得用于制备试剂盒的酶标记物。

实施例5包被浓度和酶标记物工作浓度的确定。

将实施例3中制备的纯化抗体N4D2作为包被原和实施例4中制备的酶标记物N3H12，采用方阵滴定的方法按照双抗体夹心ELISA的操作程序，确定包被原的最佳包被浓度和酶标记物的最佳工作浓度。具体操作过程为：将包被原用包被液按照8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml进行稀释，将稀释好的抗体100μl/孔，横向加入酶标板中，4℃过夜。第二天，拍干孔内的液体，用含5％脱脂乳的PBST封闭，37℃1h。用洗涤液洗3遍，每遍2min。将扩增的PRRSV和Marc-145细胞按照体积比为1∶40用PBST稀释，100μl/孔，分别加入阳性和阴性测定孔，37℃1h。再次洗涤。将酶标记物按照1∶400、1∶800、1∶1200、1∶1600、1∶2000、1∶2400(体积比)进行稀释，100μl/孔，纵向加入酶标板中，37℃1h。洗涤后，加入底物显色液A和底物显色液B各50μl/孔，显色15min，最后以终止液终止反应。在630mn波长下，用酶标仪读取其吸光值(OD值630nm)。结果见表1。结果显示：包被原N4D2的最佳包被浓度为2μg/ml，酶标记物N3H12的最佳工作浓度为1∶1000。

实施例6阳性对照和阴性对照的制备

1、阳性对照的制备

将实施例1中制备的将实施例1中制备的如序列表SEQ ID NO：1所述核苷酸序列的纯化重组N蛋白，用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至50ng/ml后，即为制备本试剂盒的阳性对照。

2、阴性对照的制备

将原核表达载体pET-30a转化E.coli BL21(DE3)，涂布到含卡那霉素(Kna)抗性(50μg/mL)的LB平皿上，挑取单菌落扩大培养，经质粒提取和酶切鉴定正确后的重组菌用于后续的诱导表达。将重组菌按照1：1000(体积比)的比例加入含有卡那霉素(Kan)抗性(50μg/mL)的液体LB培养基中，过夜培养后，第二天，按照1∶100(体积比)的比例在37℃进行大量诱导。在OD_600nm值在0.3时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.8mM/L进行诱导表达。在诱导表达4h后，将菌液于12000r/min离心1min，弃掉上清，加入1/10(体积比)的PBS重悬沉淀。经超声波破碎仪(仪器厂家：JNBIO HIGH PRESSUREHOMOGENIZER-JN300PLUS，main energy：1000～1500)破碎，10000r/min离心10min后，取上清用PBS稀释100倍(体积比)后，即为本试剂盒的阴性对照。

表1包被原最佳包被浓度和酶标记物最佳工作浓度的确定

实施例7检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒的制备及其检测方法

1、检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒的制备

按实施例1～6的方法制备检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒。

2、检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒的检测方法

2.1、判定标准(cutoff)值的确定。

选取了70份经RT-PCR鉴定为PRRSV阴性的猪血清(长白猪，湖北省成宁市神童牧业有限责任公司)，用于本发明试剂盒的判定标准(cutoff)值的确定。采用本发明所建立的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA检测方法，对选取的70份猪血清进行检测，测定其OD(630nm)值。检测结果为：70份血清的平均值为0.074，标准差为0.026，规定以70血清的平均OD(630nm)值加5倍标准差作为阴阳性的临界值(0.074+0.026×5≈0.20)，当样品的OD(630nm)值大于或等于0.20判为阳性，小于0.20判为阴性。

2.2、敏感性试验

利用本发明的检测方法检测纯化的PRRSV ORF7基因的原核表达产物重组N蛋白和经Marc-145细胞扩增的PRRSV WUH3株，来确定其敏感性。

经紫外分光光度仪测定纯化的N蛋白的浓度为0.7mg/mL，用PBST先稀释100倍后做倍比稀释(100×20～100×211)，检测结果如表2。结果显示，本发明试剂盒对纯化的N蛋白的最低检测量为6.84ng/mL。

表2利用ELISA方法检测纯化的N蛋白

同时将稀释后的PRRSVWUH3株使用本发明的试剂盒进行ELISA检测，结果如表3。结果显示，PRRSVWUH3株稀释到640倍后检测仍为阳性，即本发明的试剂盒可对病毒可检测到100个TCID₅₀。

表3利用ELISA方法检测PRRSV试验

根据表2-3的试验结果，表明本发明的试剂盒具有很高的敏感性。

2.3、特异性试验

利用本发明的试剂盒分别对猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(HCV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪流感病毒(SIV)检测，并以本试剂盒的阳性对照和阴性对照作为参考。结果(见图6)显示，本发明的试剂盒具有很好的特异性(PPRSV检测为阳性、而对猪群的其它主要的病毒性疾病的检测结果均为阴性)。说明本发明的试剂盒具有很好的特异性。

2.4、重复性实验

2.4.1、批次内重复实验

将8份已知且经RT-PCR检测的阳性血清和8份已知且经RT-PCR检测的阴性血清使用同一批次的6个不同检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒进行检测，结果如表4、表5。其检测结果的变异系数＜10％，表明该试剂盒能进行较好的批次内重复实验。

2.4.2、批次间重复实验

将8份已知且经RT-PCR检测的阳性血清和8份已知且经RT-PCR检测的阴性血清使用3个不同批次的检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒进行检测，结果如表6、表7。其检测结果的变异系数＜15％，表明该试剂盒能进行较好的批次间重复。

表4同批次试剂盒检测8份已知的阳性血清

表5同批次试剂盒检测8份已知的阴性血清

表6不同批次试剂盒检测8份已知的阳性血清

表7不同批次试剂盒检测8份已知的阴性血清

实施例8样品处理方法

样品处理方法：将待检的猪血液，经4000r/min离心10min，取上面的血清，即可进行检测，每次检测血清样品所需的样品量为100μl。对待检的动物组织样品，取100mg动物组织，加1mL PBS，在组织破碎仪上破碎后，10000r/min离心5min后，取20μl上清，加入180μl PBS，混匀后，取100μl即可进行检测。

实施例9ELISA试剂盒制备

9.1、ELISA试剂盒组成

(1)96孔酶标板2块(具体成分和制备过程请参照实施例3和4)；

(2)酶标记物1瓶(20mL)(具体成分和制备过程请参照实施例3和4)；

(3)阳性对照1瓶(1mL)(具体成分和制备过程请参照实施例6)；

(4)阴性对照1瓶(1mL)(具体成分和制备过程请参照实施例6)；

(5)洗涤液(20×浓缩)1瓶(30mL)；

(6)底物显色液A  1瓶(10mL)；

(7)底物显色液B  1瓶(10mL)；

(8)终止液1瓶(10mL)。

9.2、所用试剂配制

包被液为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液：取1.59gNa₂CO₃，2.93gNaHCO₃，加三蒸水定容至1000mL。

20倍浓缩洗涤液：称取NaCl 160g、KCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 58g、KH₂PO₄4g，用800ml三蒸水溶解，调节pH值至7.4，再加入Tween-2010ml，最后加三蒸水定容至1000ml。

封闭液：在100ml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成。

底物显色液A：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH值至5.0～5.4，0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装，10ml/瓶。

底物显色液B：取四甲基联苯二胺(TMB)20mg，无水乙醇10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml，过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶。

终止液：取2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml注射用水中，用注射用水定容至1000ml；过滤除菌；无菌分装；10ml/瓶。

9.3酶标板制备

将纯化的N4D2单克隆抗体用包被液稀释为2μg/mL，每孔加100uL，4℃过夜，倾去孔内包被液，拍干，然后用封闭液封闭，37℃孵育2小时，倾去孔内封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干，用铝膜真空封闭保存、备用。

实施例10本试剂盒的应用

10.1、工作液的配制

洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用蒸馏水20倍稀释后使用。

10.2、ELISA操作步骤

撕开密封膜，按照检测的需要量取出酶标板。每孔加200μl洗涤液洗1次，2min，拍干。加入已经处理好的样品(血清或者动物组织破碎离心后的上清液)100μl，不同的样品应更换枪头，并做阳性和阴性对照。轻微晃动后，置于37℃培养箱中孵育1h。倾去孔内液体，拍干，用洗涤液洗3次，2min/次。加酶标记物，100μl/孔，置于37℃培养箱中孵育1h。倾去孔内液体，拍干，再次洗涤洗3次，2min/次。加入底物显色液A一滴(50μl)和底物显色液B一滴(50μl)，轻微晃动，使孔内液体均匀，避光显色15min。加终止液一滴(50μl)。在630nm处测量光密度(OD)值。

10.3、结果判定

使用本试剂盒进行检测试验成立的条件是：阳性对照孔的OD_630nm值≥0.5，且≤2.0；阴性对照孔的OD_630nm值＜0.15。样品OD_630nm值≥0.20时判为阳性；样品OD_630nm值＜0.20时判为阴性。

Claims (6)

1.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO：C201195和保藏号为CCTCC NO：C201194的杂交瘤细胞N4D2和N3H12所分泌的。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号分别为CCTCC N0：C201195和CCTCC NO：C201194。

3.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其包含权利要求1所述的单克隆抗体。

4.一种检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的的ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒由下列部分构成：保藏号为CCTCC NO：C201195的单克隆抗体包被的酶标板和保藏号为CCTCC NO：C201194的单克隆抗体制备的酶标记物，阳性对照，阴性对照，包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液，其中所述的包被液，洗涤液，样品稀释液，底物显色液A、底物显色液B和终止液的组分及配比如下：

包被液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，加三蒸水定容至1000mL；

20倍浓缩洗涤液：称取NaCl 160g、KCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 58g、KH₂PO₄4g，用800ml三蒸水溶解，调节pH至7.4，再加入Tween-2010ml，最后加三蒸水定容至1000ml；

封闭液：在100ml洗涤液中加入5g脱脂乳溶解制成；

底物显色液A：Na₂HPO₄·12H₂O 14.6g，柠檬酸9.33g，过氧化氢脲0.52g，加注射用水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，用0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装，10ml/瓶；

底物显色液B：四甲基联苯二胺20mg，无水乙醇10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml，过滤除菌，无菌分装，10ml/瓶；

终止液：2.5ml氢氟酸加到900ml注射用水中，定容至1000ml，过滤除菌，无菌分装，10ml/瓶；

其中所述的阳性对照和阴性对照通过如下步骤获得：

阳性对照制备：

用磷酸盐缓冲液(PBS)将序列表SEQ ID NO：1所述核苷酸序列的纯化的重组N蛋白稀释至50ng/ml后，即为阳性对照；

阴性对照制备

将原核表达载体pET-30a转化E.coli BL21(DE3)，涂布到含卡那霉素抗性(50μg/mL)的LB平皿上，挑取单菌落扩大培养，经质粒提取和酶切鉴定正确后的重组菌用于后续诱导表达，将重组菌按体积比为1∶1000的加入含有卡那霉素的液体LB培养基(50μg/mL)中，过夜培养后，于第二天将重组菌按体积比为1∶100加入含有卡那霉素的液体LB培养基(50μg/mL)，在37℃下进行大量诱导；在OD_600nm值在0.3时加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，使其终浓度为0.8mM/L进行诱导表达；在诱导表达4h后，将菌液于12000r/min离心1min，弃上清，加入1/10体积比的PBS重悬沉淀；再用超声波破碎仪破碎，于10000r/min离心10min，取上清用PBS稀释100倍(体积比)，即为阴性对照。

5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的ELISA试剂盒中的应用。

6.权利要求3或4所述的试剂盒在体外检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

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