CN102242083A - 抗新i型鸭肝炎病毒3d蛋白单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体,属于分子生物学技术领域,涉及基因工程和免疫学技术。将新I型鸭肝炎病毒3D蛋白抗原纯化。用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,经融合、间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞和有限稀释法克隆化后,获得分泌抗鸭肝炎IC型病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,保藏号为CGMCC-4580;其ELISA效价为1×10-6以上,能特异识别新I型鸭肝炎病毒感染细胞的病毒3D蛋白,其Ig亚型重链为IgG1,轻链为κ。本发明为新I型鸭肝炎病毒的检测、新I型鸭肝炎病毒3D蛋白结构和功能研究以及病毒的致病机理研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及抗体工程技术,具体为涉及抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体。
背景技术
I型鸭病毒性肝炎是由I型鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitisvirus serotype I,DHV-I)引起雏鸭的一种急性高度致死性传染病。I型鸭肝炎病毒(DHV-1C)属小RNA病毒科(Picornaviridae),其病毒核衣壳为对称的二十面体,无囊膜,无血凝性,直径大小为20-40nm。1994年Kim等在韩国发现一种新I型鸭肝炎病毒,命名为DHV-1C,并报道了此新I型鸭肝炎病毒基因序列,分析结果表明DHV-1与DHV-1C属于同一个病毒属的不同血清型,同源性为68.5%-73.2%。由5′非编码区(5′UTR)、一个大的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)、3′非编码区(3′UTR)和Poly(A)尾巴组成,ORF编码2249个氨基酸多聚蛋白。该蛋白在病毒包装过程中,裂解为结构蛋白VP0、VP1、VP3和非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。全长为7792bp,3D基因位于基因组的6050bp-7408bp,全长1358bp,编码453个氨基酸(Kim M C,Kwon Y K,Joll S J.Recent Korean isolates of duck hepatitis virus reveal the presence of anew gene-and serotype when compared to duck hepatitis virus type 1 typestratus.Arch Virol,2007,152(11):2059-2072.)。3D蛋白是病毒RNA依赖的RNA聚合酶,又称病毒相关抗原,是非结构蛋白,催化病毒RNA的合成。
本研究以纯化的新I型鸭肝炎病毒3D蛋白为抗原进行抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单抗的制备,期望筛选到能与新I型鸭肝炎病毒反应的单抗。以新I型鸭肝炎病毒3D重组蛋白制备特异性单克隆抗体可为新I型鸭肝炎病毒的研究提供必要的试剂和技术手段,对探讨3D蛋白在新I型鸭肝炎病毒形成及其致病方面具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体。
本发明的单抗隆抗体是用纯化的DHV-1C 3D重组蛋白为抗原,通过杂交瘤细胞方法获得的,能够特异识别DHV-1C感染细胞病毒3D蛋白的单克隆抗体。DHV-1C 3D重组蛋白是将DHV-1C 3D基因克隆与原核表达载体pET-30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化的3D重组蛋白。
该单克隆抗体的具体制备方法如下:
1、根据DHV-1C 3D基因cDNA序列设计一对引物,通过PCR扩增得到全长3D基因,将DHV-1C N株3D基因克隆于原核表达载体pET-30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达3D蛋白;进行SDS-PAGE检测及Westernblot分析鉴定后,裂解表达菌体,分离包涵体,用pH 8.0的尿素裂解沉淀,离心后取上清经镍亲和层析过柱纯化(购自Qiagen公司,Valencia,CA公司),将纯化后蛋白用6mol/L尿素进行梯度透析复性获得3D重组蛋白。
2、用DHV-1C 3D重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,以HAT培养基(购自Invitrogen公司)选择性培养后,经3D重组蛋白和His蛋白进行双重ELISA筛选和有限稀释法克隆化,获得分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9;将杂交瘤细胞注BALB/c小鼠诱生腹水,对获得抗3D蛋白单克隆抗体特性进行鉴定。
3、以ELISA测定抗3D蛋白单克隆抗体的腹水效价,间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性,用单克隆抗体亚型测定试剂盒(Zymed Laboratories,Inc.)鉴定抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚类。
本发明的优点是:(1)本发明提供的DHV-1C 3D重组蛋白制备方法简单,纯度高;(2)本发明提供抗DHV-1C 3D蛋白的单克隆抗体特异性强,制备方法简单;(3)抗DHV-1C 3D蛋白单克隆抗体可用于3D蛋白结构和功能研究。
具体地,在一个方面,本发明提供分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.4580。
另一方面,本发明提供针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.4580的杂交瘤细胞系分泌。
再一方面,本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物,其包含上述定义的单克隆抗体。
在另一个发明,本发明提供用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒,其包含上述定义的单克隆抗体。
在另一个方面,本发明提供上述定义的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。
在又一个方面,本发明涉及所述单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。
杂交瘤细胞株2D9,于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101),保藏号为CGMCC No.4580。
附图说明
图1为DHV-1C 3D基因PCR产物(A)和pET 30a-3D酶切鉴定图(B),其中A中的泳道1:3D基因的PCR产物;泳道M:DNA分子质量标准;B中的泳道1:pET30a-3D的BamH1和Hind III双酶切产物;泳道M:2kb DNA分子质量标准。
图2为DHV-1C 3D表达蛋白的SDS-PAGE(A)和Western blotting(B)鉴定图,其中泳道M是蛋白质Marker,泳道2-5分别是BL21(DE3)/pET30a-3D在1、2、3和4小时诱导表达的菌体,泳道1是BL21(DE3)/pET-30a载体诱导表达菌体;图(B)泳道2和1分别是BL21(DE3)/pET30a-3D和BL21(DE3)/pET-30a诱导表达菌体在鸭抗DHV-1CN株阳性血清下的Western blotting结果。
图3为3D蛋白单克隆抗体2D9的Western blotting鉴定图,图中泳道1是3D蛋白,泳道2是大肠杆菌菌体蛋白,泳道M是蛋白质Marker。
图4为抗3D蛋白单克隆抗体2D9的IFA鉴定图,图中A和B分别是单克隆抗体2D9与N株感染的鸭胚成纤维细胞及正常鸭胚成纤维细胞的反应结果,其中A图表示单克隆抗体2D9可以检测出N株病毒感染的鸭胚成纤维细胞的3D蛋白,显示绿色荧光;B图表示未感染病毒的鸭胚成纤维细胞没有荧光。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.DHV-1C 3D重组蛋白的制备
根据DHV-1C序列设计引物,PCR扩增DHV-1C 3D基因,将其克隆于原核表达载体PET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达DHV-1C3D蛋白;收集表达菌体,冻融3次后,离心分离包涵体,用pH 8.0的尿素裂解沉淀,经镍亲和层析纯化,获得DHV-1C 3D重组蛋白,最后该蛋白经6M尿素进行梯度透析复性。
1).3D重组表达质粒的构建
根据DHV-1C 3D核苷酸序列(SEQ ID NO:1)设计合成特异性引物,上游引物3DF:5’TCGGGATCCGCTATTGTTGAGAAAAAGTATTCAG3’(SEQ ID NO:2下划线为BamH1位点),下游引物3DR:5’CAGAAGCTTTTATATAATCATGCAGGCAGTATATG 3’(SEQ ID NO:3,下划线为Hind III位点)。以PCR从DHV-1CN株(哈尔滨兽医研究所)按常规方法反转录的cDNA中扩增3D基因(PCR反应条件为:94℃5min;94℃30s,56℃30s,72℃3min,32个循环;72℃延伸10min,4℃保存)。扩增片段大小为1359bp(见图1A)。pET30a(购自Novagen公司)经BamH1/Hind III双酶切消化后,将扩增的3D基因连接到原核表达载体pET-30a的BamH1/Hind III位点间,转化大肠杆菌Top10,提取转化细菌的质粒,以上述PCR反应和BamH1/Hind III酶切鉴定重组表达质粒(PCR反应结果参见图1A,酶切结果参见图1B),经序列测定验证,获得3D重组表达质粒pET30a-3D。阳性重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen公司),SDS-PAGE和Western blotting表明(图2),表达的65.8kDa重组3D蛋白(泳道2)可被DHV-1C病毒阳性血清所识别,空载体pET30a诱导蛋白(泳道1)不能被DHV-1C病毒阳性血清所识别。其中DHV-1C病毒阳性血清是利用由哈尔滨兽医研究所的DHV-1C病毒N株免疫番鸭制备,即将纯化的100μgDHV-1C N株与弗氏佐剂等比例混合,充分乳化,制备免疫抗原,免疫4周龄鸭。免疫3次,每次100μg/每只(0.2mL);第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原,肌肉注射;间隔14天,用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫;间隔14天,用不加佐剂的免疫抗原进行三免,肌肉注射;免疫10天后,采血,分离DHV-1C病毒阳性血清。
2).DHV-1C 3D重组蛋白的表达与纯化
以氯化钙法将重组表达质粒pET30a-3D转化大肠杆菌BL21(DE3),取阳性克隆用LB液体培养基(含50μg/mL Kan),37℃250r/min振荡培养过夜,次日按1∶100的比例接种于含10mL新鲜LB培养基100mL锥形瓶中,37℃300r/min振荡培养,当OD600=0.6时,加入终浓度为1mM IPTG诱导表达2h,4℃12000r/min离心30sec,收集菌体,冻融三次,4℃12000r/min离心10min,SDS-PAGE分析裂解菌体的上清和沉淀,分析3D蛋白的表达情况。加入5倍体积8M尿素溶解沉淀,振荡至溶液澄清,4℃12000r/min离心10min,弃沉淀,上清转移至镍离子亲和层析柱中(购自Qiagen公司,Valencia,CA),振荡1h,由pET-30a表达的带有His标签的VP3表达蛋白与镍离子螯合,先后用2倍体积柱床体积pH=8.0的8M尿素溶液,3倍柱床体积pH=6.3的8M尿素,3倍柱床体积pH=5.9的8M尿素和5倍柱床体积pH=4.5的8M尿素洗脱柱床,收集洗脱液1ml/管;用SDS-PAGE分析洗脱液,经6mol/L尿素进行梯度透析复性,获得高纯度的3D重组蛋白。
实施例2.抗3D蛋白单克隆抗体的制备
用等量弗氏佐剂(Sigma公司)乳化纯化的100ug 3D重组蛋白,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,15天后用不完全弗氏佐剂(Sigma公司)乳化等体积蛋白进行二次免疫,二次免疫后十天断尾采血用ELISA方法检测小鼠血清效价,此时小鼠血清效价已经明显上升,经第三次免疫后检测小鼠血清效价,阳性值达1.0以上,P/N大于10时取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(Invitrogen公司)作用下进行细胞融合,用HAT培养基(购自Invitrogen公司)进行选择性培养;以纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL)为检测抗原,用双重ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行筛选,阳性杂交瘤经连续5次有限稀释法克隆化,获得稳定分泌抗3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,将其于2011年2月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101),保藏号为CGMCC No4580;将杂交瘤细胞注入致敏小鼠腹腔诱生腹水,获得抗N株3D蛋白单克隆抗体2D9。具体如下。
1).小鼠免疫
分别将纯化的DHV-1C 3D重组蛋白与弗氏佐剂等比例混合,充分乳化,制备3D免疫抗原,免疫6周龄BALB/c小鼠8只(购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心)。免疫3次,每次100μg/每只(0.2mL);第一次以弗氏完全佐剂免疫抗原,背部皮下多点注射;间隔20天,用弗氏不完全佐剂免疫抗原进行第二次免疫,腹腔注射;间隔20天,用不加佐剂的3D免疫抗原进行三免,肌肉注射;免疫15天后,尾静脉采血,以3D重组蛋白为检测抗原,用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清的抗体水平,免疫小鼠抗体滴度达到1∶4000以上,表明小鼠获得良好免疫效果。
2).杂交瘤细胞株的建立
i)细胞融合
细胞融合前3天,以不加佐剂的3D重组蛋白尾静脉注射小鼠,每只100μg(0.1mL),无菌取脾脏,分离脾细胞,计数后按5∶1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞(2×107)混合,在PEG4000作用下进行细胞融合(《实用免疫学》,杨廷彬主编,长春出版社,1994年12月出版);用HAT选择培养基(购自Invitrogen公司)重悬,置5%CO2 37℃进行选择性培养,5天后半量换液,10天后改为HAT培养基(购自Invitrogen公司)。待细胞克隆长至1/4-1/2培养孔时,取细胞培养上清检测分泌抗体。
ii).杂交瘤细胞筛选
分别用纯化的3D重组蛋白和His蛋白(购自KPL公司)作为检测抗原,对杂交瘤细胞培养上清中的分泌抗体进行双重ELISA检测,筛选阳性杂交瘤细胞。用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的VP3重组蛋白或His蛋白,按100μL 0.045μg/孔加入酶标板中,37℃包被1h后转入4℃过夜;用含0.05%吐温20的PBS缓冲液(PBST)洗涤3次,加5%脱脂奶粉37℃封闭1h,每孔加入杂交瘤细胞培养上清100μL,37℃孵育2h;PBST洗3次,加入1∶5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),37℃孵育1h,PBST洗4次,加入显色底物OPD-H2O2(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),避光反应10min后,用2M H2SO4终止反应,用酶标仪读取OD490值,以与阴性OD490值的比值大于2.1判为阳性。3D重组蛋白阳性而His蛋白阴性检测的杂交瘤细胞孔为阳性克隆。
iii).有限稀释法克隆化获得杂交瘤细胞系和保藏
用HT培养基将杂交瘤细胞稀释至20个/ml,每孔0.1ml接入96孔培养板,细胞含量分别为2个/孔和1个/孔,置5%CO2 37℃培养,5-7天观察细胞克隆生长情况,选取单克隆生长孔细胞上清,以ELISA检测分泌抗体;对阳性克隆进行连续5次克隆,获得稳定分泌抗VP3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D9,使其抗体分泌阳性率达95%以上。杂交瘤细胞株2D9扩大培养,500转/分钟离心5分钟,收集细胞培养上清,将细胞沉淀用37℃提前预热的DMEM冻存液(含7份DMEM+2份血清+1份二甲亚砜)重悬,每管2ml分装,-70℃冻存细胞。该杂交瘤细胞株于2011年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国,北京),保藏号为CGMCC-4580。
3).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的制备。
成年雌性BALB/c小鼠经0.2ml/只降植烷腹腔注射,致敏1周后,腹腔注射杂交瘤细胞2D9悬液5×106-1×107,7-10天后采集腹水,12000g离心5min,收集上清。上清加入等量PH7.2巴比妥缓冲盐水(VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/L NaCl,0.8mmol/L Mg2+,0.3mmol/L Ca2+)稀释;每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅(Sigma公司),混匀,悬液在室温孵育30分钟,摇动;2000g离心20分钟,即得到澄清的单克隆抗体2D9腹水,-70℃冻存。
4).抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价的测定。
首先抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水用PBS缓冲液1000倍稀释,然后倍比稀释,3D重组蛋白(2μg/ml)100μL/孔包被的酶标板(购自Corning公司),37℃孵育2h;加入倍比稀释(1∶2000)的抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水100μl,37℃孵育1h,PBST洗涤3次后加入1∶5000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育1h,PSBT洗涤后,加入显色底物OPD-H2O2(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),避光反应10min,用2M H2SO4终止反应,用酶标仪读取OD490值,以与阴性OD490值比值大于2.1判为阳性,以阳性孔的最大稀释度为抗3D蛋白单克隆抗体2D9腹水效价。结果测得单克隆抗体2D9腹水的ELISA效价分别为:6.4×10-6。
实施例3.抗3D蛋白单克隆抗体2D9的特性鉴定
以纯化3D重组蛋白为检测抗原用间接ELISA方法测定抗3D蛋白单克隆抗体2D9的腹水效价;以间接免疫荧光鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性;用Zymed Laboratories,Inc公司亚型测定试剂盒鉴定抗3D蛋白单克隆抗体2D9重链和轻链的Ig亚型。
i).抗3D蛋白单克隆抗体2D9与DHV-1C的反应性和特异性鉴定
以间接免疫荧光测定抗3D蛋白单克隆抗体与DHV-1C病毒蛋白的反应性和特异性。鸡胚成纤维细胞DF1经DHV-1C病毒(哈尔滨兽医研究所)感染24h,PBS洗两次;100μl/孔加入甲醇固定,1h后弃固定液,分别加入单克隆抗体2D9的细胞培养上清,100μl/孔,37℃孵育1h;PSB洗涤3次,加入1∶100稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),37℃孵育30min;PBS洗涤后,加入PBS 100μl,荧光显微镜观察并照相。结果单克隆抗体2D9株均特异识别DHV-1CC病毒3D蛋白(图4A),而阴性对照则没有荧光(图4B)。
ii).抗3D蛋白单克隆抗体的Ig亚型测定。
利用Zymed Laboratories,Inc.公司亚型测定试剂盒测定抗3D蛋白单克隆抗体Ig亚型。结果显示,单克隆抗体2D9的重链为IgG1,轻链均为κ。
Claims (6)
1.分泌抗新I型鸭肝炎病毒3D蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.4580。
2.针对新I型鸭肝炎病毒3D蛋白的单克隆抗体,其由保藏号为CGMCCNo.4580的杂交瘤细胞系分泌。
3.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物组合物,其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
4.用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的试剂盒,其包含权利要求2所述的单克隆抗体。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于治疗新I型鸭肝炎病毒病的药物中的应用。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测新I型鸭肝炎病毒的药物中的应用。
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