CN104297493A

CN104297493A - 可溶性i型鸭肝炎病毒3d蛋白在制备elisa试剂中的应用及其elisa试剂盒

Info

Publication number: CN104297493A
Application number: CN201410606977.8A
Authority: CN
Inventors: 汪铭书; 程安春; 曹乾大; 陈孝跃
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: CN104297493B

Abstract

本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用及其ELISA试剂盒，ELISA试剂盒含有可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液和终止液，将该试剂盒用于检测I型鸭病毒性肝炎抗体具有特异性强、重现性好、敏感度高，与用全病毒作包被抗原的ELISA试剂盒检测的符合率高，可用于临床样品的检测。

Description

可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用及其ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用和检测I型鸭病毒性肝炎血清抗体的ELISA试剂盒。

背景技术

我国是世界上养鸭数量最多的国家，鸭的饲养量约占世界的70％，养鸭业在我国农业经济中占有重要地位。鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)可引起雏鸭的鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)。DVH是一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。

鸭肝炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)，本病毒有三个血清型，分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，无免疫交叉反应。在我国，主要流行1型鸭病毒性肝炎，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。因此对DHAV等鸭源病毒进行研究具有重要的社会和经济意义。

对鸭肝炎及鸭肝炎病毒进行研究，离不开鸭肝炎病毒及其抗体的检测试剂及检测方法。可用于DHV及其抗体检测的试剂及方法虽很多，如血凝实验、协同凝集实验、中和实验、琼脂扩散、ELISA、荧光抗体、免疫组化、胶体金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和试验，但因其操作复杂、费时、成本高，不能用于快速检测因而不适于基层推广应用。ELISA法具有操作简便快速、特异性强、敏感性高、重复性好等优点。早在1991年，Zhao等运用中和实验、琼脂扩散试验、ELISA法对DHV抗体进行检测，阳性检出率分别为18.8％、68.8％和68.8％；杨萍萍等以氯仿去脂、0.22μm孔径滤膜过滤、凝胶柱浓缩层析方法纯化得到的病毒作为包被抗原，也建立了检测DHV血清抗体的间接ELISA方法。但该方法在具体使用中受到限制，一致未能推广，其主要原因之一是检测DHV血清抗体的间接ELISA方法对抗原纯度要求很高，但由于病毒必须依靠宿主细胞才能增殖，因此进行全病毒抗原纯化时难于与宿主蛋白分离。

随着对DHAV-1分子生物学研究的不断深入，将重组表达蛋白(特别是大肠杆菌原核表达蛋白)抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测中成为可能。大肠杆菌表达的重组蛋白抗原易于制备和纯化，且表达重组蛋白抗原的宿主细胞大肠杆菌比制备DHV抗原的宿主细胞(如鸭胚及鸭源细胞、鸡胚等)与DHV的宿主(鸭)亲缘关系更远，检测时由于抗原纯度而产生非特异性的可能性也减少。但重组表达的蛋白抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测还有一个困难，就是大肠杆菌表达易形成不溶性的包涵体，包涵体由于杂蛋白含量较低、可避免蛋白酶降解、难溶于水等特点而使其易于分离纯化。包涵体中的目标蛋白虽然其肽链是完整的，但却是非天然形式、无生物学活性的表达蛋白，包涵体的溶解非常困难，需要用强变性剂高浓度尿素、SDS等来打断分子内和分子间的非共价键、离子键等，为获得有活性的蛋白，继而需要进行蛋白复性，而包涵体蛋白溶解后的复性不仅费时、费力，且复性率低。

DHAV具有微RNA病毒科成员相似的特点，为单股正链RNA，完整基因组长度约为7.7kb，由5’非翻译区、一个大的开放阅读框(ORF)、3’非翻译区组成，ORF含有6750nt，编码2249AA的多聚蛋白，随后被病毒编码的蛋白酶切割，首先分解成P1、P2和P3产物，然后P1、P2和P3(P1编码结构蛋白、P2和P3编码非结构蛋白)又进一步分别分解为VP0/VP1/VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C和3A/3B/3C/3D蛋白，产生12个成熟的病毒蛋白。3D是DHAV的一种非结构蛋白，虽然不是病毒粒子的组成成分，但在病毒生命循环中扮演着重要角色，在合成负链RNA、合成复制酶过程中占有主导的作用，加之其本身的酶催化活性，使得3D蛋白在病毒的生存过程中必不可少，因此，在病毒感染机体内可能产生3D抗体，但目前未见3D蛋白是否可以作为抗原检测DHAV抗体的ELISA方法报道；同时，获得高纯度有活性的抗原并应用于制备ELISA检测试剂盒，对于鸭病毒性肝炎抗体的检测的有重要的意义和推动作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂中的应用；本发明的目的之二在于提供检测I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂中的应用，所述可溶性蛋白的制备步骤如下：将SEQ ID NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸连接于pET-32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为0.2～1.0mmol/L、温度为20～39℃条件下诱导表达4～12小时，收集菌液，离心后收集菌体，将收集的菌体用20mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴下超声，破碎后进行离心，上清用Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，超滤得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。

优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)PLYS。

优选的，所述诱导表达为加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，在温度为25℃条件下诱导表达6小时。

优选的，所述活化的具体步骤为：将表达菌株接种于Amp抗性的LB培养基中，在37℃、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp抗性的LB培养基按体积比为1：100扩大培养至OD₆₀₀为0.6即可。

更优选的，所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次间隔30sec。

2、检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒含有可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板。

优选的，所述反应板的制备方法为将1μg/mL的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白按每孔100μL加入反应板中，4℃过夜包被，次日PBST洗板5次，拍干即可。

优选的，所述试剂盒还含有酶标抗体、显色液和终止液。

更优选的，所述酶标抗体为HRP标记羊抗鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG，所述显色液为TMB，所述终止液为浓度为2mol/L的H₂SO₄。

本发明的有益效果在于：本发明公开了可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂中的应用，且将其构建为检测试剂盒，获得的试剂盒具有特异性强、重现性好、敏感度高，与用全病毒作包被抗原的ELISA试剂盒检测的符合率高，对I型鸭病毒性肝炎的诊断具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因PCR扩增产物电泳结果(M：DL 2000Marker，1：3D基因PCR扩增产物)。

图2为I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因载体构建过程中PCR鉴定和酶切鉴定结果(A：pJET-1.2+/DHAV-H-3D质粒PCR鉴定，M：DL2000Marker，1：PCR产物；B：pJET-1.2+/DHAV-H-3D质粒酶切鉴定，M：DL15000Marker，1：Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切条带，2：Xho Ⅰ单酶切条带；C：pET-32(a)+/DHAV-H-3D质粒的PCR鉴定，M：DL2000Marker，1：PCR产物；D：pET32a+/DHAV-H-3D质粒的酶切鉴定，1：Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切结果，2：Xho Ⅰ单酶切条带)。

图3为可溶性3D蛋白表达条件的优化(M为低分子量蛋白质标准品；A：表达菌的筛选，1为pET-32(a)+空载体表达产物，2-4分别为pET-32(a)+/DHAV-H-3D重组质粒转化Rosetta、BL21和BL21(DE3)PLYS三种不同表达宿主菌的表达产物；B：诱导表达时间的优化，1-5依次为诱导12h、10h、8h、6h和4h的BL21(DE3)PLYS宿主菌表达产物；C：诱导表达温度的优化，1-6分别为39℃、37℃、35℃、30℃、25℃和20℃的BL21(DE3)PLYS宿主菌表达产物；D：IPTG浓度优化，1-5分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L和1.0mmol/L的IPTG诱导的表达产物。

图4为3D蛋白Western-blot检测及纯化蛋白电泳(A为3D蛋白的免疫印迹检测结果，M为蛋白质Marker，1为3D蛋白印迹。B为SDS-PAGE检测纯化的3D蛋白，M为低分子量蛋白质Marker，1为纯化的3D蛋白)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、克隆I型鸭肝炎病毒株DHAV-H的3D基因

I型鸭肝炎病毒株H(DHAV-H)(GenBank：JQ301467)、E.coli DH5α菌种和pET-32(a)+载体均由四川农业大学禽病防治研究中心保存并提供。各种分子生物学试剂购于生物试剂公司。

根据DHAV-H的基因组序列(GenBank：JQ301467)设计扩增3D基因的引物，具体引物如下：

P1：5’-ggggtaccgatcaagggaaagtagtgagcaag-3’(SEQ ID NO.1)，下划线表示Kpn Ⅰ酶切位点；

P2：5’-acgcctcgagtcagatcatcatgcaagctgt-3’(SEQ ID NO.2)，下划线表示Xho Ⅰ酶切位点；然后将设计的引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

取保存的DHAV-H病毒液以灭菌PBS作5倍稀释，添加1/100体积的双抗(青霉素、链霉素的终浓度分别为100IU/mL和100μg/mL)后于37℃温育1h，然后接种9日龄发育良好、无母源抗体的鸭胚，弃去24h内死亡胚，收集24～72h死亡胚的尿囊液及胚体，按照Trizol试剂盒说明书提取病毒RNA。

将提取的病毒RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，反转录和PCR扩增体系如表1所示。

表1反转录和PCR反应体系

反录转程序为：30℃10min，42℃15min，95℃5min，4℃5min，循环一次；PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性40sec，56℃退火40sec，72℃后延伸30sec，30个循环，最后72℃后延伸10min。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。结果显示，扩增获得长度约1386bp的片段(不包括内切酶位点和保护性碱基则为1368bp)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，与预期片段大小相同，因此按照天根生化科技(北京)有限公司的胶回收试剂盒说明书回收目的条带，回收获得的片段命名为DHAV-H-3D。

实施例2、构建表达I型鸭肝炎病毒株H 3D蛋白的表达载体

将回收的DHAV-H-3D与pJET1.2载体连接，连接反应参照pJET1.2克隆试剂盒说明书进行，反应体系如表2所示。

表2、连接DHAV-H-3D与pJET1.2载体

按表2体系混合后进行瞬时离心，然后在20℃条件下连接15min。连接产物转化DH5α感受态细胞，并用Amp抗性的LB固体及液体培养基筛选，并将筛选菌落用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2中A所示。结果显示，筛选获得了阳性克隆。

为了进一步检测阳性克隆，将阳性克隆的菌株提取质粒，然后经Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切及Xho Ⅰ单酶切鉴定，酶切体系如表3所示。

表3、Kpn Ⅰ及Xho Ⅰ酶切鉴定反应体系

按表3体系混合后瞬时离心，然后于37℃条件水浴3h，反应结束将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2中B。结果显示，DHAV-H-3D片段正确连入pJET1.2载体中，并命名为pJET-1.2+/DHAV-H-3D。将pJET-1.2+/DHAV-H-3D送Invitrogen公司测序，筛选未突变的序列用于构建表达载体。

取测序正确的pJET-1.2+/DHAV-H-3D和pET-32(a)+载体分别用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，回收3D基因及载体骨架，然后按表4所示体系进行连接。

表4、3D基因及载体骨架连接体系

按表4体系混合后瞬时离心，然后于16℃条件下过夜连接，得pET-32(a)+/DHAV-H-3D质粒。连接产物转化DH5α宿主菌，以Amp抗性LB固体及液体培养基筛选，然后进行PCR鉴定，结果如图2中C所示。然后将PCR鉴定为阳性的菌株用于提取质粒，并将质粒用Xho Ⅰ进行单酶切及用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2中D所示。由图2中C和D可知，3D基因及载体骨架正确连接。

实施例3、I型鸭肝炎病毒株H可溶性3D蛋白的表达

表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta、大肠杆菌BL21和大肠杆菌BL21(DE3)PLYS菌种均由四川农业大学禽病防治研究中心保存；含I型鸭肝炎病毒株H 3D蛋白的表达载体pET-32(a)+/DHAV-H-3D由实施例2中构建；各种分子生物学试剂购于生物试剂公司。

将实施例2获得的pET-32(a)+/DHAV-H-3D质粒分别转化BL21、Rosetta和BL21(DE3)PLYS表达菌，转化菌于Amp抗性的LB液体培养基中37℃、120r/min条件下过夜培养，次日将过夜培养物与新鲜Amp抗性的LB液体培养基按体积比为1：100扩大培养约3小时，菌液OD₆₀₀达0.6时加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，并在37℃下诱导12h，然后收集菌液，将菌液在12000r/min条件下、离心10min，菌体用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)按1:10(V/V)悬浮。同时以pET-32(a)+载体转化相应表达菌作为阴性对照。

为了筛选表达出可溶性3D蛋白的表达菌，然后将上述制得的悬浮菌液在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次之间间隔30sec，然后将破碎后的菌液在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃沉淀(为不溶性包涵体表达蛋白)，收集上清(为可溶性表达蛋白)。吸取80μL上清，加入20μL含β-巯基乙醇的5×SDS上样buffer，煮沸10min后在12000r/min条件下常温离心5min，然后进行SDS-PAGE电泳检查，结果如图3中A所示。结果显示，通过将重组质粒pET-32(a)+/DHAV-H-3D转化到三种表达菌后，在约68kD处出现了目的条带，而阴性对照不含有此条带，并且转化BL21(DE3)PLYS菌株的蛋白表达量最大、BL21的表达量次之，所以根据表达量筛选出最佳表达菌为BL21(DE3)PLYS。

I型鸭肝炎病毒株H可溶性3D蛋白表达条件的优化：

(1)IPTG浓度的优化：将含有pET-32(a)+/DHAV-H-3D重组质粒的BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按体积比为1:100接种于5支含Amp抗性的LB液体培养基试管中，并于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG至终浓度分别为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L和1.0mmol/L，然后在37℃条件下诱导培养12h，然后用SDS-PAGE检测可溶性3D蛋白的表达量，结果如图3中B所示。结果显示，IPTG终浓度为0.8mmol/L条件下可溶性3D蛋白的表达量最高，即IPTG终浓度为0.8mmol/L为最适浓度。

(2)诱导表达温度优化：将含有pET-32(a)+/DHAV-H-3D重组质粒的BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按体积比为1:100接种于6支含Amp抗性的LB液体培养基试管中，并于37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，然后分别于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、37℃和39℃条件下诱导12h，然后用SDS-PAGE检测可溶性3D蛋白的表达量，结果如图3中C所示。结果显示，温度在25℃条件下可溶性3D蛋白的表达量最高，即诱导温度为25℃为最适表达温度。

(3)诱导表达时间优化：将含有pET-32(a)+/DHAV-H-3D重组质粒的BL21(DE3)PLYS菌株的菌液按体积比为1:100接种于5支含Amp抗性的LB液体培养基试管中，并于37℃振荡培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，然后于温度为25℃条件下诱导4h、6h、8h、10h和12h，然后用SDS-PAGE检测可溶性3D蛋白的表达量，结果如图3中D所示。结果显示，温度在诱导表达6h后可溶性3D蛋白的表达量以达到最高，即诱导表达时间为6h。

经过上述优化，可以看出含有pET-32(a)+/DHAV-H-3D重组质粒的BL21(DE3)PLYS菌最优表达条件为0.8mmol/L IPTG、25℃诱导6h。后续按照此条件对3D蛋白进行大量表达。

I型鸭肝炎病毒株H可溶性3D蛋白Western-blot检测，具体步骤如下：按最优表达条件表达可溶性3D蛋白，然后进行SDS-PAGE，随后将电泳后的凝胶转印至PVDF膜上，80V转印90min，转印完毕后将PVDF膜取出，以1％BSA于37℃摇动孵育1h，然后以1:100稀释的抗DHAV的IgG在37℃摇动孵育1h后取出，以TBS洗涤3次，每次2min，随后以1:3000稀释的HRP标记的羊抗鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG于37℃摇动孵育1h，以TBS洗涤后按照DAB显色试剂盒说明书显色，待目的条带清晰可见时以蒸馏水冲洗终止显色，结果如图4中A所示，最后将PVDF膜干燥避光保存。

I型鸭肝炎病毒株H可溶性3D蛋白的纯化：将含重组质粒pET-32(a)+/DHAV-H-3D的BL21(DE3)PLYS在最适条件下表达，然后收集菌体，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)悬浮后在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次之间间隔30sec，然后将破碎后的菌液在4℃、12000r/min条件下离心10min，收集上清(为可溶性表达蛋白)；然后将收集的上清在Bio-rad公司提供的Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱纯化(纯化液及纯化方法按试剂盒说明书进行)，将收集的纯化蛋白液进行透析后用0.45μm的滤膜超滤，最后置于4℃、-20℃、-70℃或冻干保存。将纯化后的可溶性3D蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图4中B所示。结果显示表达的3D蛋白经Ni²⁺-NTA亲和纯化后，得到了纯度、浓度均较高的蛋白，经核酸蛋白分析仪测定蛋白浓度为1.5mg/mL。

实施例4、利用可溶性3D蛋白以ELISA方法检测I型鸭病毒性肝炎抗体

ELISA方法检测I型鸭病毒性肝炎抗体的具体步骤如下：

(1)抗原包被反应板：加入实施例3纯化获得的可溶性3D蛋白，100μL/孔，包被，次日PBST洗板5次，每次3min，拍干；

(2)封闭液封闭，同上洗板；

(3)加入待检鸭血清，在37℃孵育1.5h，同上洗板；

(4)加入工作浓度的酶标抗体(HRP标记羊抗鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG)，在37℃条件下孵育0.5h，同上洗板；

(5)加入TMB显色液，避光反应；

(6)加入终止液(2mol/L H₂SO₄)，50μL/孔；

(7)酶标仪以双波长形式读取OD₄₅₀-OD₆₃₀值；

(8)选择P/N值最大者为最佳反应条件。

为了获得最佳的检测效果，按表5所示条件优化：

表5、间接ELISA条件优化

ELISA方法的反应条件优化

(1)最佳酶标抗体浓度

将酶标抗体(KPL公司的HRP标记羊抗鸭IgG，浓度为100μg/mL)分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600浓度稀释，每个浓度设置两个重复，均于37℃孵育，同时设置阴阳性血清，然后检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值，并取平均值，结果如表6所示。选择P/N值最大者为最佳二抗稀释度。

表6、酶标抗体工作浓度优化

由表6可知，酶标抗体作1:800稀释时效果最佳。

(2)最佳抗原包被浓度及血清稀释度

将实施例3纯化获得的可溶性3D蛋白分别作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600稀释，鸭病毒性肝炎阳/阴性血清分别作1:100、1:200、1:400、1:800稀释，每个浓度设置2个重复，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表7所示。选择P/N值最大者为最佳条件。

表7、抗原包被浓度和血清稀释度选择

由表7可知，将可溶性3D蛋白作1：1:1600，血清作1：400稀释效果最佳。

(3)最佳显色时间

将显色时间分别设置为5min、10min、15min、20min、25min和30min，每个显色时间阳性、阴性血清均设置4个重复，均于37℃避光显色，然后检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值，读取平均值，结果如表8所示。选择P/N值最大者为最佳显色时间。

表8、最佳显色时间选择

结果显示，显色时间为15min时效果最佳。

(4)最佳包被条件

分别在37℃处理1h后在4℃过夜，37℃处理4h后在4℃过夜和直接在4℃过夜三种条件下包被，同时设置阳性和阴性血清，各7个重复，读取OD₄₅₀-OD₆₃₀平均值，结果如表9所示。选择P/N值最大者为最佳包被条件。

表9、包被条件优化

由表9可知，在4℃条件下包被过夜为最佳包被条件。

(5)最佳封闭液、封闭时间

分别以1％BSA、5％BSA、1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、1％小牛血清、5％小牛血清、1％明胶和5％明胶为封闭液，每一种封闭液设置3个重复，并于37℃条件下封闭，读取OD₄₅₀-OD₆₃₀平均值，结果如表10所示。然后设置封闭时间为30min、60min、90min、120min，读取OD₄₅₀-OD₆₃₀平均值，结果如表11所示。选择P/N值最大者作为最佳封闭液、封闭时间。

表10、最佳封闭液选择

表11、封闭时间选择

由表10和表11可知，最佳封闭液为1％BSA，最佳封闭时间为0.5h。

根据上述优化条件构建检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，具体为：可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板、酶标抗体、显色液和终止液，其中反应板以浓度1μg/mL的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白按每孔100μL加入反应板中，4℃过夜包被，次日PBST洗板5次，拍干，其效果最佳；酶标抗体为HRP标记羊抗鸭IgG，所述显色液为TMB，所述终止液为浓度为2mol/L的H₂SO₄。

ELISA检测方法为：以1μg/mL的可溶性3D蛋白液4℃过夜包被，以1％BSA作为封闭液37℃封闭0.5h，血清稀释度1:400于37℃孵育1.5h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1:800稀释于37℃孵育0.5h，显色15min。

利用根据上述ELISA的优化条件，检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒的特异性：

(1)特异性交叉实验

用建立的ELISA试剂盒检测鸭沙门氏菌(Sal)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭肿头败血症病毒(DSHDV)、禽流感病毒H5(AIV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭里默氏杆菌(RA)阳性血清，设置鸭肝炎阳性、阴性血清对照，每个血清设置3个重复，读取OD₄₅₀-OD₆₃₀平均值，结果如表12所示。

表12、ELISA试剂盒特异性检测

结果显示，六种待检阳性血清与阴性血清的比值均小于2.1，表明建立的ELISA试剂盒特异性很好。

(2)特异性阻断实验

用可溶性3D蛋白与I型鸭肝炎病毒感染的阳性血清按体积比为10：1混合，于37℃中和1h后稀释至最佳血清稀释度，用建立的ELISA试剂盒检测，计算阻断率，结果如表13所示。

表13、ELISA试剂盒阻断实验结果

结果显示，阳性血清阻断率为72.8％，阴性血清阻断率为16.4％。表明可溶性3D蛋白能与鸭肝炎阳性血清特异性识别并进行中和。

(3)变异系数

同一批纯化的3D蛋白按不同批次包被酶标条，然后检测6份血清的OD₄₅₀-OD₆₃₀值，每份血清设置6个重复，检测其变异系数作板内、板间变异系数，变异系数CV＝标准差/平均值(SD/X×100％)，结果如表14和表15所示。

表14、板内变异系数测定

表15、板间变异系数测定

结果表明，板内变异系数在1.9％-6.6％，均小于10％，板间变异系数在1.4％-6.7％，均小于10％。表明建立的ELISA试剂盒法重现性好。

(4)阳性阈值确定

以可溶性3D蛋白最佳稀释度包被酶标条，以最佳反应条件进行反应，检测60份阴性血清OD₄₅₀-OD₆₃₀值，计算cut-off值＝均值+3×方差(V_cut-off＝X+3×SD)，结果如表16所示。

表16、60份阴性血清OD₄₅₀-OD₆₃₀值

取均值+3×SD作为阳性阈值，结果显示，阳性阈值为0.155+3×0.028＝0.238。

(5)敏感性检测

取8份I型鸭病毒性肝炎阳性血清，分别从1:100开始，以2倍倍比稀释，用建立的ELISA试剂盒检测，以能检测出阳性的最大稀释度为灵敏度，结果如表17所示。

表17、ELISA试剂盒灵敏度检测

结果显示，ELISA试剂盒检测I型鸭病毒性肝炎血清的灵敏度为1:3200。

综上可见，利用本发明制得的包被可溶性3D蛋白的ELISA试剂盒检测I型鸭病毒性肝炎抗体具有特异性强、重现性好、敏感度高的优点，可用于临床样品的检测。

实施例5、可溶性3D蛋白与全病毒ELISA检测的比较

全病毒ELISA检测抗原的制备：

将DHAV-1弱毒的尿囊液原毒(为血清I型鸭肝炎病毒CH60株，该病毒株为本实验室分离致弱的病毒株，公开于公开号为103103163A的中国专利，保藏编号为CCTCC NO.V201248)以灭菌PBS作5倍稀释，添加相当于稀释液1/100体积的双抗(青霉素、链霉素的终浓度分别为100IU/mL和100μg/mL)于37℃温育1h后接种鸡胚，每天照蛋两次，24h内死亡胚舍弃，收集24-72h内死亡鸡胚尿囊液和胚体，胚体经-20℃冻融两次并研磨后以适量PBS悬浮，10000r/min离心30min取上清与尿囊液混匀置-20℃保存备用。

将DHAV-1弱毒病毒液经10000r/min离心30min，取上清液0.22μm滤膜过滤后45000r/min离心2h，将沉淀以离心前病毒液体积的1/40比例加入灭菌PBS悬浮，分装于-20℃保存备用，并以核酸蛋白仪检测其蛋白浓度。

全病毒ELISA方法，具体步骤如下：

a.抗原包被反应板，100μL/孔，37℃处理1h后转入4℃过夜包被，次日PBST洗板5次，每次3min，拍干；

b.以含质量分数为1％BSA的PBST封闭，37℃封闭1h，同上洗板；

c.加入待检血清，于37℃反应1h，同上洗板；

d.加入工作浓度的酶标抗体(HRP标记羊抗鸭IgG)，于37℃孵育1h，同上洗板；

e.加入TMB显色液，避光反应15min；

f.加入终止液(浓度为2mol/L的H₂SO₄)，50μL/孔；

g.酶标仪以双波长形式读取OD₄₅₀-OD₆₃₀值。

h.选择P/N值最大者为最佳反应条件。

然后并按照表18的条件进行优化ELISA的条件：

表18、间接ELISA条件优化

(1)最佳酶标抗体浓度

将酶标抗体(KPL公司的HRP标记羊抗鸭IgG，浓度为100μg/mL)分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200浓度稀释，每个浓度设置两个重复，均于37℃孵育，同时设置阴阳性血清，然后检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值，并取平均值，结果如表19所示。选择P/N值最大者为最佳二抗稀释度。

表19、酶标抗体浓度优化

由表19可以看出，酶标抗体的最佳浓度为按体积比为1:200稀释。

(2)最佳抗原包被浓度及血清稀释度

将DHAV-1全病毒分别作1:50、1:100、1:200、1:400、1:800和1:1600稀释，鸭病毒性肝炎阳/阴性血清分别作1:100、1:200、1:400和1:800稀释，每个浓度设置2个重复，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表20所示。选择P/N值最大者为最佳条件。

表20、抗原包被浓度和血清稀释度选择

结果显示，最佳抗原包被浓度1.125μg/ml，最佳血清稀释度为1:100。

(3)最佳显色时间

设置显色时间分别为5min、10min、15min、20min、25min和30min，每个显色时间设置4个重复，并设置阳性、阴性血清，均于37℃避光显色，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值。结果如表21所示。

表21、显色时间选择

结果显示，显色时间为10min时P/N值最大且阴性值较低，即最佳显色时间为10min。

(4)最佳包被条件

设置37℃反应1h后4℃包被过夜，37℃反应4h后4℃包被过夜和4℃包被过夜三个条件包被，每个包被条件设置7个重复，检测检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表22所示。

表22、包被条件优化

由表22可以看出，在4℃包被过夜时P/N值最大，即最佳包被条件为4℃包被过夜。

(5)最佳封闭液及封闭时间

分别以质量分数为1％的BSA、质量分数为5％的BSA、质量分数为1％的脱脂奶粉、质量分数为5％的脱脂奶粉、质量分数为1％的小牛血清、质量分数为5％的小牛血清、质量分数为1％的明胶和质量分数为5％的明胶为封闭液，并设置封闭时间为30min、60min、90min和120min四个梯度，每一种封闭液均设置阳性、阴性血清，各设置3个重复，均于37℃封闭，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表23和24所示。

表23、最佳封闭液选择

表24、封闭时间选择

结果显示，封闭液为质量分数为5％的明胶和封闭时间为30min时P/N值最大，即最佳封闭液为质量分数为5％的明胶，最佳封闭时间为30min。

(6)最佳血清、酶标抗体孵育时间

血清孵育时间分别设置为30min、60min、90min和120min四个梯度，每个时间点设置7个重复，均在37℃孵育，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表25所示。

表25、血清孵育时间优化

酶标抗体孵育时间分别设置为30min、60min、90min和120min四个梯度，每个时间点设置7个重复，均在37℃孵育，检测OD₄₅₀-OD₆₃₀值后取平均值，结果如表26所示。

表26、酶标抗体孵育时间优化

由表25和表26可知，血清孵育时间为60min和酶标抗体孵育时间为60min时P/N值最大，即最佳血清孵育时间为60min，最佳酶标抗体孵育时间为60min。

全病毒ELISA的特异性检测

(1)特异性交叉实验

利用上述优化的ELISA检测方法检测鸭沙门氏菌(Sal)、鸭大肠杆菌(E.coli)、鸭肿头败血症病毒(DSHDV)、禽流感病毒H5(AIV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭疫里默氏杆菌(RA)阳性血清，设置鸭肝炎阳性、阴性血清对照，每个血清设置3个重复取平均值，结果如表27所示。

表27、基于DHAV的ELISA方法特异性检测

结果显示，所有待检血清与鸭肝炎阴性血清的比值均小于2.1，表明建立的ELISA方法特异性很好。

(2)特异性阻断实验

用全病毒与I型鸭肝炎病毒感染的阳性血清或阴性血清按体积比为10：1混合，于37℃中和1h后稀释至最佳血清稀释度，然后优化的ELISA方法进行检测，计算阻断率，结果如表28所示。

表28、全病毒阻断实验

结果显示，阳性血清阻断率为91.2％，阴性血清阻断率为5.6％，表明DHAV病毒能与鸭肝炎阳性血清很好的特异性结合。

(3)全病毒ELISA方法变异系数

以两个不同批次纯化的病毒液分别包被酶标板，检测6份血清的OD_450-OD₆₃₀值，每份血清设置6个重复，检测其变异系数作板内、板间变异系数，变异系数CV＝标准差/平均值(SD/X×100％)，结果如表29所示。

表29、板内和板间变异系数测定

结果显示，板内变异系数和板间变异系数均小于10％，表明基于全病毒建立的ELISA方法具有较好的重复性。

(4)全病毒阳性阈值确定

以全病毒最佳稀释度包被酶标条，以最佳反应条件进行反应，检测60份阴性血清OD₄₅₀-OD₆₃₀值，计算cut-off值＝均值+3×方差(V_cut-off＝X+3×SD)，3×SD作为阳性阈值，结果如表30所示。

表30、60份阴性血清OD₄₅₀-OD₆₃₀值

结果显示，全病毒阳性阈值0.067+3×0.025＝0.143。

(5)全病毒ELISA方法敏感性检测

取6份已知的鸭甲肝病毒阳性血清，分别从1:100开始，以2倍倍比稀释，用优化的ELISA方法检测，以能检测出阳性的最大稀释度为灵敏度，结果如表31所示。

表31、基于DHAV的ELISA方法灵敏度检测

结果显示，全病毒ELISA检测的灵敏度为1:6400。

(6)可溶性3D蛋白的ELISA检测和全病毒ELISA检测的符合率比较

分别以实施例4中建立的可溶性3D蛋白的ELISA方法和本实施例中全病毒ELISA方法检测60份相同的血清样品，测OD₄₅₀-OD₆₃₀值，结果见表32所示，然后统计符合率，结果如表33所示。

表32、可溶性3D蛋白和全病毒的ELISA方法检测平行检测60份血清OD₄₅₀-OD₆₃₀值

a为阳性符合，b为阴性符合，c为不符合

表33、可溶性3D蛋白和全病毒的间接ELISA方法的符合率

结果显示两种方法检出的阳性符合率为83.3％，阴性检出符合率为85.7％，总符合率为84.5％，说明基于可溶性3D蛋白的ELISA与基于DHAV-1全病毒的ELISA方法具有较好的符合率。

综上可见，利用本发明制得的包被可溶性3D蛋白的ELISA试剂盒检测I型鸭病毒性肝炎抗体具有特异性强、重现性好、敏感度高，与用全病毒作抗原包被的ELISA试剂盒检测的符合率高，可用于临床样品的检测。

实施例6、可溶性3D蛋白和全病毒ELISA试剂盒的应用

将40只鸭子按照表36分为3D蛋白组(P组)、3D蛋白+疫苗组(P+V组)、疫苗组(V组)及对照组(C组)，并按照表34中的免疫剂量和途径进行免疫和注射。

表34、动物分组及免疫

免疫后3d采血分离血清样品，按照建立的可溶性3D蛋白、DHAV全病毒ELISA方法，分别检测血清中的3D蛋白抗体、鸭甲肝病毒抗体水平，结果如表35所示。

表35、3D蛋白和全病毒抗体水平检测

结果显示3D蛋白抗体和全病毒抗体效价在免疫后3天即可检出，对照组均为阴性，表明利用本发明的方法制备的3D蛋白能够用于检测I型鸭病毒性肝炎的3D蛋白抗体。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂中的应用，其特征在于，所述可溶性蛋白的制备步骤如下：将SEQ ID NO.3所示序列的第9～1376位核苷酸连接于pET-32(a)+载体的多克隆酶切位点处，然后以大肠杆菌Rosetta、BL21或BL21(DE3)PLYS为宿主菌，在Amp抗性的LB培养基中活化后，在IPTG终浓度为0.2～1.0mmol/L、温度为20～39℃条件下诱导表达4～12小时，收集菌液，离心后收集菌体，将收集的菌体用20mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl悬浮，然后在冰浴下超声，破碎后进行离心，上清用Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，超滤得可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)PLYS。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诱导表达为加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，在温度为25℃条件下诱导表达6小时。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活化的具体步骤为：将表达菌株接种于Amp抗性的LB培养基中，在37℃、120r/min条件下过夜培养，然后将培养液与Amp抗性的LB培养基按体积比为1：100扩大培养至OD₆₀₀为0.6即可。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述冰浴下超声为在冰浴条件下超声破碎6次，30sec/次，每次间隔30sec。

6.检测I型鸭病毒性肝炎抗体的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白包被的反应板。

7.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述反应板的制备方法为将1μg/mL的可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白按每孔100μL加入反应板中，4℃过夜包被，次日PBST洗板5次，拍干即可。

8.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有酶标抗体、显色液和终止液。

9.根据权利要求6所述的ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标抗体为HRP标记羊抗鸭IgG或HRP标记兔抗鸭IgG，所述显色液为TMB，所述终止液为浓度为2mol/L的H₂SO₄。