CN105330727B - 一种1型鸭甲肝病毒vp4重组蛋白、elisa试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种1型鸭甲肝病毒vp4重组蛋白、elisa试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法，1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：获取VP4目的片段；构建重组表达质粒pET‑32c‑VP4；制备VP4重组蛋白。本发明成功构建了重组原核表达质粒，成功获得VP4重组蛋白可溶性表达，并且与兔抗DHAV‑1血清具有良好的反应原性，说明DHAV‑1的VP4蛋白成功获得了原核表达，建立了检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，为DHAV‑1抗体的检测及进一步开展DHAV‑1的相关研究提供试验数据和基础材料。

Description

一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法。
背景技术
鸭甲肝病毒(Duck Hepatitis A Virus，DHAV)能引起雏鸭爆发鸭病毒性肝炎，其具有发病急、病程短、传播迅速、病死率高等特点，临床上主要表现为食欲减退、神经症状、突然死亡和肝脏肿大出血，又称歪脖病。目前几乎遍布世界各个养鸭国家和地区，给养鸭业带来了较大的经济损失。DHAV可分为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3三个基因型。DHAV-1为1型鸭甲肝病毒，是引起鸭病毒性肝炎最主要的一种病原，分布最为广泛且致病性强、感染率高，对雏鸭致死率可高达90％以上。目前几乎遍布世界各个养鸭国家和地区，给养鸭业带来了较大的经济损失。
根据疾病的流行病学特点、特征性临床症状和有诊断意义的剖解病变，一般可做出初步诊断，但是确诊尚需借助实验室检测。检测DHAV的实验室方法众多，各有优缺点，中和试验是最经典的方法，虽然结果准确，但是操作费时，不适合临床检测。RT-PCR技术、环介导的恒温扩增技术(LAMP)等一系列分子生物学新技术为该病毒的检测提供了快捷、高效的方法。而用于该病抗体检测的ELISA方法操作简单，容易掌握，不需要高端精密的仪器设备，易于推广。目前针对鸭甲肝病毒抗体检测的ELISA方法为间接ELISA，但现有的间接ELISA方法依然存在耗时长、花费大、纯化蛋白量小，不能规模化生产。
小RNA病毒是RNA病毒中最小的一类，分布极为广泛，可归为肠道病毒属(enterovirus)、口疮病毒属(Aphthovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、嗜肝病毒属(Hepatovirus)、副肠孤病毒属(Parechovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、嵴病毒属(Kobuvirus)、捷申病毒属(Teschovirus)、禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)等。小RNA病毒呈圆形，病毒粒子直径为20～40nm，无囊膜，病毒的结构蛋白(衣壳蛋白)一般包括VP1、VP2、VP3和VP4。其中VP4埋在粒子内部，处于蛋白外壳的内部与基因组RNA相连接。VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，组成一个亚单位。小RNA病毒VP4蛋白在生理温度下的向外暴露与病毒颗粒吸附细胞膜时发生的构象改变有直接的联系，VP4蛋白在病毒毒粒吸附细胞膜之后可能参与了病毒进入细胞过程有关的相关事件。小RNA病毒的蛋白外壳具有很强的自身动态变化，而不是像晶体结构图所反映的那样处于一个静止状态。抗体与病毒结构构象关系的研究对理想疫苗的设计及更好地预防小RNA病毒的传播具有重要意义。但对DHAV衣壳蛋白的研究相对很少。生物信息学分析和推测表明，DHAV的衣壳蛋白可能为VP1、VP3和VP0而不是像其他小RNA病毒那样为VP1、VP2、VP3和VP4，因此DHAV到底是VP0还是VP2和VP4，他们是否位于暴露在病毒表面及抗原性如何目前未见报道。
由此可见，能否对VP4蛋白进行深入研究，基于鸭甲肝病毒的VP4蛋白建立一种重组蛋白的方法，使得纯化获得的蛋白纯度高，并且建立间接ELISA方法，使其敏感性、重复性及特异性好，操作简便，可规模化生产成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题，提供一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法。
本发明技术方案包括以下内容：
一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白，所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：获取VP4目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP4截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GAATTCTACCAGTAGACTTTCATGCAATGG-3'，序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物为5'-CTCGAGTTGAGCTCCTACTTCATAAGAACA-3’，序列如SEQ ID NO:3所示，增殖DHAV-1病毒株，提取DHAV-1病毒株的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到VP4目的片段；
步骤二：构建重组表达质粒pET-32c-VP4：将所述VP4目的片段克隆至pMD19-TSimple载体中，加入连接酶，得到连接产物I，将所述连接产物I转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆体，经鉴定后得到重组质粒pMD19-T Simple-VP4，将所述重组质粒pMD19-TSimple-VP4和表达质粒pET-32c的菌株扩大培养后提取质粒DNA，分别用EcoR I和Xho I双酶切、纯化回收，将回收得到的VP4目的片段和载体片段pET-32c连接，得到连接产物II，将所述连接产物II转化至感受态细胞中培养、筛选出阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET-32c-VP4；
步骤三：制备VP4重组蛋白：重组表达质粒pET-32c-VP4转化至大肠杆菌BL21中，进行重组蛋白诱导表达，结束后纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
所述步骤二中，VP4目的片段与所述pMD19-T Simple载体的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物I加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
所述步骤二中，所述回收得到的VP4目的片段与载体片段pET-32c的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物II加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
所述步骤二中，所述重组质粒pMD19-T Simple-VP4和重组表达质粒pET-32c-VP4的鉴定方法均包括菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，选取所述菌液PCR鉴定正确的阳性菌液提取质粒DNA，对提取的所述质粒DNA用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，选取经菌液PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行所述测序鉴定。
优选地，所述重组蛋白诱导表达步骤包括：IPTG浓度为0.6～1.2mM/L诱导4～12h、温度为37℃。
优选地，IPTG浓度为0.6mM/L诱导4h。
优选地，所述步骤三中纯化方法为Ni亲和层析挂柱纯化。
上述制备方法中，所述步骤一中的1型鸭甲肝病毒株为1型鸭甲肝病毒H株，小RNA病毒科(Picornaviridae)，禽肝病毒属(Avihepatovirus)，学名为1型鸭甲肝病毒(DuckHepatitis A Virus type 1，DHAV-1)，所述1型鸭甲肝病毒H株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201539。
一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
所述的封闭液为含1％脱脂奶粉的PBS缓冲液；所述的酶标二抗为HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液。
一种制备上述ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤：
步骤一：包被：1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白包被ELISA板，所述VP4重组蛋白的最佳包被浓度为3.375μg/ml，100μL/孔，37℃孵育3h后转入4℃过夜，次日PBST缓冲液洗板3～5次，每次3min，拍干；
步骤二：封闭：加入含1％脱脂奶粉150μL/孔于37℃封闭1h，按照步骤一的方法洗板，拍干；
步骤三：待检血清孵育：加入1:160稀释待检血清，于37℃孵育1h，按照步骤一洗板，拍干；
步骤四：酶标二抗孵育：加入工作浓度的HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液，酶标二抗稀释度为1:1600，37℃孵育0.5h，按照步骤一洗板，拍干。
步骤五：显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光显色30min；
步骤六：终止：加入终止液2mol/L H2SO4，50μL/孔；
步骤七：读数：用酶标仪以双波长形式读取OD450nm-OD630nm值。
本发明的有益效果包括：本发明提供一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法，成功构建了pET32c(+)-VP4重组原核表达质粒，成功获得VP4重组蛋白可溶性表达，并且与兔抗DHAV血清具有良好的反应原性，说明病毒DHAV-1VP4蛋白成功获得了原核表达。对DHAV-1的VP4进行原核表达获得重组蛋白，并以表达的重组蛋白建立了检测DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法，建立了检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度，与I型鸭甲肝病毒为包被抗原的ELISA检测方法的符合率较高，可用于DHAV-1血清抗体的检测。为DHAV-1抗体的检测及进一步开展DHAV-1的相关研究提供试验数据和基础材料。
附图说明
图1所示为本发明VP4基因RT-PCR扩增鉴定图。
图2所示为本发明含有重组质粒pMD19-T simple-VP4菌体的阳性克隆菌液PCR鉴定图。
图3所示为图2所述阳性克隆用EcoR I和Xho I双酶切鉴定结果图。
图4所示为本发明含有重组表达质粒pET-32c-VP4菌体的可疑阳性克隆菌液PCR鉴定图。
图5所示为图4所述阳性克隆用EcoR I和Xho I双酶切鉴定结果图。
图6所示为本发明VP4重组蛋白Western blot鉴定图。
图7所示为本发明VP4重组蛋白纯化鉴定图。
图8所示为本发明VP4重组蛋白在宿主菌中的表达形式图。
图9所示为实施例2不同IPTG浓度诱导VP4重组蛋白表达的优化鉴定图。
图10所示为实施例2不同时间诱导VP4重组蛋白表达的优化鉴定图。
图11所示为实施例2中不同温度诱导VP4重组蛋白表达的优化鉴定图。
生物材料保藏
本发明中1型鸭甲肝病毒H株保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO.V201539，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年8月31日，分类命名为1型鸭甲肝病毒H株。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
本发明所述1型鸭甲肝病毒H株，序列已经公开于GenBank数据库中，登记号为JQ301467。
实施例1
一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白，所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：获取VP4目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP4截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GAATTCTACCAGTAGACTTTCATGCAATGG-3'(SEQ ID NO.2)，下游引物为5'-CTCGAGTTGAGCTCCTACTTCATAAGAACA-3’(SEQ ID NO.3)，将实验室保存的DHAV-1病毒株原液用灭菌PBS 5倍稀释，添加1/100体积的双抗后37℃孵育1h后，8000r/min离心5min，取上清接种9～11日龄健康、无DHAV-1母源抗体的鸭胚，弃去24h内死亡胚，收集24～72h死亡胚的尿囊液及胚体，按照Trizol试剂盒说明书提取病毒RNA。按照TaKaRa的PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒进行病毒RNA模板及引物处理，随即进行RT-PCR扩增，得到VP4目的片段；扩增体系见表1，RT-PCR程序第一步(RT)：(30℃10min，42℃15min，95℃5min，4℃5min)×1cycle；第二步(PCR)：94℃5min，(95℃30sec，56℃30sec，72℃40sec)×30cycle，72℃10min。
表1 VP4基因RT-PCR扩增体系
步骤二：构建重组表达质粒pET32c(+)-VP4：
1、制备重组质粒pMD19-T Simple-VP4：
将胶回收的目的片段和1μL pMD19-T simple载体、5μL连接酶solution I混匀，使VP4目的片段物质的量：pMD19-T simple载体物质的量＝6:1，加超纯水补足至10μL，16℃连接过夜。得到连接产物I，连接产物I进行如下操作：取5μL连接产物加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
对筛选出的阳性克隆体鉴定，包括以下步骤：
(1)、菌液PCR鉴定：将上述Amp抗性LB固体和液体培养基筛选的阳性克隆，进行菌液PCR鉴定，PCR体系及程序参照表1所示及相对应的程序；
(2)、双酶切鉴定：选取上述PCR鉴定阳性菌液按照Axygen小量提取质粒DNA的说明书抽提质粒，对提取的质粒DNA用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，反应体系见表2。
表2 EcoR I和Xho I双酶切反应体系
试剂 EcoR I和Xho I双酶切
10xH buffer 2μL
pMD19Tsimple-VP4 12μL
EcoR I(15U/μL) 1μL
Xho I(12U/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O 4μL
总体积 20μL
酶切条件：37℃水浴2h后加入10×Loading buffer终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像呈像观察；
(3)、测序鉴定：选取经菌液PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行所述测序鉴定。将测序正确的质粒pMD19-T simple-VP4菌液按1:50接种含Amp的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养过夜后于4℃冰箱预冷2～2.5h。在无菌操作下进行，4000r/min离心5min，弃上清液，每管菌体按与离心前菌液体积1:20的比例加入等体积30％的甘油生理盐水和LB/Amp液体培养基，用灭菌的枪头吹打均匀，分装于菌种管中，每管分装菌液量不超过菌种管的1/2，封口胶封口并标记，-70℃保存备用。
鉴定结果：如图1所示，1：VP4基因RT-PCR扩增片段、M:2000DNA marker，以提取的DHAV-H病毒核酸为模板，RT-PCR扩增出与预期VP4(278bp)基因大小相符的片段，将RT-PCR扩增的VP4基因连接到pMD19-T simple载体后，筛选的阳性克隆进行菌液PCR鉴定如图2所示，图2中，1～4:VP4基因菌液PCR鉴定、M:2000DNA marker；阳性克隆用EcoRI和Xho I双酶切鉴定结果如图3所示，图3中，1～2:pMD19-T simple-VP4的EcoRI和XhoI双酶切、M:2000DNA marker。由图1～3及测序结果与已知序列一致，表明成功构建了pMD19-Tsimple-VP4克隆载体。
制备DH5α感受态细胞参考有关文献进行如下操作：
(1)取DH5α菌种接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜后挑取一个单菌落接种到5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
(2)按1:100的比例接种至预热至37℃的LB液体培养基中，剧烈振荡培养2～3h，至OD600nm约为0.4～0.5。
(3)取出菌液4℃冰箱预冷2～2.5h。
(4)将细菌培养液分装到预冷的50mL离心管中，4℃以4000r/min离心10min。
(5)弃上清，将离心管残留液体甩尽，按离心前菌液体积的1/10比例向离心管中加入预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮沉淀，冰浴30min，4000r/min离心10min。
(6)弃上清，将离心管倒置1min使残留液体流尽，按离心前菌液体积的1/10比例向离心管中加入预冷的含15％甘油的0.1mol/L CaCl2充分吹打悬浮沉淀。
(7)将悬浮液分装到EP管中，-70℃保存备用。
2、制备重组表达质粒pET-32c-VP4：
(1)目的基因及表达载体的回收：含重组质粒pMD19-T simple-VP4和表达质粒pET-32c的菌株在含Amp的LB固体培养基中分别划线接种后经液体培养基37℃摇床过夜扩大培养，所得菌液均用Axygen试剂盒提取质粒DNA，然后分别用EcoR I和Xho I双酶切；双酶切体系和条件参照表2及相应酶切条件，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，按目的基因及表达载体的大小，对凝胶上的片段进行切割，根据Axygen DNA纯化试剂盒步骤进行纯化回收操作。
(2)目的基因与表达载体的连接：将回收得到的目的基因片段VP4和载体片段pET-32c通过琼脂糖凝胶电泳估计浓度，置于连接体系中：VP4目的片段物质的量与载体pET-32c物质的量之比为6:1，加入连接体系，进行连接，反应体系如表3所示，得到连接产物II。
表3连接反应体系
试剂 剂量
目的基因VP4 6
载体pET-32c(+) 1
Solution I 7.5μL
总体积 15μL
置于PCR反应管中，移液器轻轻吹打混匀，低速瞬时离心，于16℃恒温连接过夜。
将所述连接产物II转化至感受态细胞中，无菌条件下，将连接产物II进行如下操作：取7.5μL连接产物II加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
(3)重组表达质粒的筛选及鉴定：
随机挑取转化平板上生长的单菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养16h后，菌液PCR和双酶切筛选鉴定，挑选两种方法均鉴定正确的菌株进行测序，将测序正确的质粒命名为pET-32c-VP4，具体鉴定方法与上述重组质粒pMD19-T simple-VP4鉴定方法相同。
鉴定结果：将EcoRI和XhoI双酶切后的pMD19-T simple-VP4、pET-32c两种酶切产物分别进行电泳，胶回收后进行连接，转化至DH5α得到含有重组表达质粒的菌体，阳性克隆进行菌液PCR鉴定，如图4所示，图中M:2000DNA marker、1～6:不同可疑菌落pET-32c-VP4菌液PCR，结果5号为阴性，1～4和6号为阳性；阳性克隆EcoRI和XhoI双酶切结果如图5所示，图中M:15000DNA marker、1～2：pET-32c-VP4的EcoRI和XhoI双酶切鉴定。经测序，目的基因VP4序列正确。因此，重组原核表达质粒pET-32c-VP4构建成功。
步骤三：制备VP4重组蛋白：
1、重组质粒pET-32c-VP4转化至表达菌BL21中
将提取的重组质粒pET-32c-VP4转化至感受态宿主菌BL21中，对转化到BL21中的pET-32c-VP4进行菌液PCR鉴定。
2、重组蛋白VP4在宿主菌中的诱导表达
重组表达质粒pET-32c-VP4转化至表达菌BL21中并鉴定正确后，进行重组蛋白诱导表达，VP4重组蛋白诱导表达的条件为：IPTG浓度为0.6～1.2mM/L诱导4～12h、温度为37℃。
3、重组蛋白VP4的Western blot鉴定：
用Western blot方法鉴定重组蛋白，一抗为兔抗DHAV-1血清，二抗为用HRP标记的羊抗兔IgG，具体操作步骤如下：将诱导表达后含重组蛋白VP4的样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12％，电泳后取下胶，转膜缓冲液中。常规方法转印。取出印迹好的PVDF膜，将其浸润在100％甲醇中10sec，用水洗膜三次，将膜放在滤纸上干燥，膜从透明变为半透明。一抗孵育：用含0.05％Tween-20的封闭液按1:100比例稀释的兔抗DHAV-1血清，37℃孵育1h，弃一抗，用PBS洗膜三次，约10min/次。二抗孵育：用含0.05％Tween-20的封闭液1:3000稀释HRP标记的羊抗兔IgG，于37℃孵育箱孵育30min，弃二抗，用PBS洗膜三次，约10min/次。DAB显色：加入DAB显色液避光反应约5min，不宜显色太久，否则背景色变黑。
4、重组蛋白VP4大量表达菌样品的处理：
将过夜培养的pET-32c-VP4/BL2菌液按1：50加入到含1L LB/Amp液体培养基的锥形瓶中，37℃水浴锅振荡培养约2h～2.5h，至细菌生长达到对数生长期，即OD600nm值0.6左右。按照诱导表达条件的优化中得到的最佳IPTG浓度、最佳时间和最佳温度继续培养后于4℃离心机中8000r/min离心10min，收集菌体。菌体用20mM Tris-Cl(pH8.0)与原菌液体积按1:5比例加入，悬浮菌体，超声破碎仪中间歇破碎菌体，每次隔30秒超声一次，直至菌体变清亮，后将破碎菌液4℃、12000r/min离心10min，pET-32c-VP4/BL2中重组蛋白VP4由于是可溶性表达，因此将裂解菌液离心后弃沉淀，上清用于Ni2+-NTA琼脂糖凝胶纯化重组蛋白VP4。5、重组蛋白VP4的亲和纯化：
采用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶进行纯化，配制相关液体纯化表达的VP4重组蛋白，将收集的纯化重组蛋白液进行透析及超滤浓缩置4℃，取样进行SDS-PAGE电泳鉴定收集纯化蛋白的纯度，可置于-20℃备用，也可进行冻干或于-70℃保存。
鉴定结果：Western blot鉴定VP4重组蛋白的结果如6所示，图6中，M：预染蛋白Marker、1：经IPTG诱导的重组蛋白VP4上清样，VP4重组蛋白能被DHAV-1血清识别，表明VP4重组蛋白具有良好的反应原性。如图7所示，亲和纯化方式得到纯度和浓度都较高的目的重组蛋白VP4，图7中，M:蛋白Marker、1：经IPTG诱导的未纯化重组蛋白VP4上清样、2：纯化的VP4重组蛋白、3:1mg/ml的1％BSA。
实施例2 VP4重组蛋白的表达形式分析及诱导表达条件优化
1、表达形式的分析：
(1)取鉴定正确的表达菌划线接种于含Amp的LB固体培养基，挑单菌落经LB液体培养基37℃复壮过夜，取2mL菌液接种100ml LB/Amp，37℃水浴锅振荡2.5～3h，至OD600nm约0.6。
(2)加入IPTG至终浓度均为0.4mmol/L，37℃水浴诱导表达4h。
(3)菌液4℃、8000r/min离心10min，弃上清。
(4)加入10mL pH8.0的20mM Tris-HCl悬浮菌体，冰浴条件下，超声破碎30sec/次，每次间隔30sec，数次，直至菌液清亮为止，经4℃、12000r/min离心10min，分别收集上清和沉淀；沉淀再用2mL 8M尿素反复吹打溶解，4℃，8000r/min离心10min收集上清得沉淀溶解物。
(5)取上清和沉淀溶解物各80μL，加入20μL含β-巯基乙醇的5×SDS上样buffer，水浴煮沸10min，8000r/min离心5min，SDS-PAGE电泳观察。
(6)若在上清中可见目的条带，则为可溶性蛋白，若在沉淀溶解物中，则以包涵体形式存在。
将重组质粒pET-32c-VP4及对应空载质粒分别转化到BL21中扩大培养，加IPTG诱导，冰浴超声破碎后得到的上清和包涵体样品处理后，SDS-PAGE电泳结果如图8所示，图8中，M为蛋白Marker、泳道1～3依次为:空pET32c载体转BL21制样；pET-32c-VP4转BL21超声破碎后的上清；pET-32c-VP4转BL21超声破碎后的包涵体。诱导的含pET-32c-VP4的BL21表达菌上清中存在VP4表达蛋白条带，大小约为30Kda，沉淀中未出现明显目的VP4表达蛋白条带，即表达载体pET-32c-VP4在宿主菌BL21中以可溶性形式表达VP4重组蛋白。
2、表达条件的优化
(1)IPTG浓度的优化
将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL21新鲜菌液1mL接种于50mL LB/Amp液体培养基中，37℃摇床振荡培养大约2.5h至OD600nm值为0.6左右，加入IPTG使其终浓度为：0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L和1.2mmol/L诱导表达4h，对样品进行处理后，SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染、脱色观察。
(2)诱导时间的优化
将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL21 1mL接种于50mL LB/Amp液体培养基中，37℃摇床振荡培养至OD600nm约0.6左右，加入IPTG至上述试验得出的最佳浓度，在分别诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h后，对样品进行处理，SDS-PAGE电泳。
(3)诱导温度的优化
将含重组质粒pET-32c-VP4的表达宿主菌BL21 1mL接种于50mL LB/Amp液体培养基中，37℃摇床振荡培养至OD600nm约0.6左右，加入IPTG至终浓度为上述试验得出的最佳IPTG浓度和最佳诱导时间，然后在25℃、30℃、37℃条件下诱导培养，对样品进行处理后，SDS-PAGE电泳。
如图9、10和11所示，经不同IPTG浓度、不同诱导表达时间和不同温度优化后，得出含重组表达质粒pET-32c-VP4以BL21为宿主菌表达VP4重组蛋白的最佳表达条件是：IPTG浓度0.6mM/L诱导4h，温度为37℃(其中IPTG浓度在0.6～1.2mM/L及诱导时间在4～12h时，目的蛋白表达量变化不大)，图9中：M为蛋白Marker、1～6为IPTG诱导浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mmol/L；图10中：M为蛋白Marker、泳道1～8依次为：诱导时间2、4、6、8、10、12、14和16h；图11中：M为蛋白Marker、泳道1～3依次为：诱导温度25℃、37℃和30℃的上清，4～6依次为诱导温度25℃、37℃和30℃的包涵体。
实施例3
一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
所述的封闭液为含1％脱脂奶粉的PBS缓冲液；所述的酶标二抗为HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液。
一种制备ELISA试剂盒的方法，包括以下步骤：
步骤一：包被：1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白原包被酶标ELISA板，所述VP4重组蛋白的最佳包被浓度为3.375μg/ml，100μL/孔，37℃孵育3h后转入4℃过夜，次日PBST缓冲液洗板3～5次，每次3min，拍干；
步骤二：封闭：加入含1％脱脂奶粉150μL/孔于37℃封闭1h，按照步骤一的方法洗板，拍干；
步骤三：待检血清孵育：加入1:160稀释待检血清，于37℃孵育1h，按照步骤一洗板，拍干；
步骤四：酶标二抗孵育：加入工作浓度的HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液，酶标二抗稀释度为1:1600，37℃孵育0.5h，按照步骤一洗板，拍干。
步骤五：显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光显色30min；
步骤六：终止：加入终止液2mol/L H2SO4，50μL/孔；
步骤七：读数：用酶标仪以双波长形式读取OD450nm-OD630nm值。
实施例4基于VP4重组蛋白的ELISA方法的建立和应用
1、抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定：
采用方正滴定，将纯化的VP4重组蛋白用包被液(pH9.6)稀释并加入酶标板中，按每个稀释度两个重复，将DHAV-1阴阳性血清分别稀释后加入到重组VP4包被的酶标板中，将酶标二抗HRP-兔抗鸭IgG先以1:2000倍稀释，参照实施例3进行间接ELISA检测，最终以P/N值最大的稀释度确定最佳包被抗原稀释度和最佳血清稀释度。
用核酸蛋白仪测得纯化的VP4重组蛋白初始浓度为1.351mg/ml，每个抗原稀释度设置2个重复，取平均值。结果如表4所示，选择P/N值最大者为最佳条件，即VP4重组蛋白的最佳包被浓度为1:400稀释(3.375μg/ml)、血清1:160稀释。
2、酶标二抗最佳工作浓度的确定
将纯化的重组VP4重组蛋白用最佳的抗原稀释度来包被酶标板，将DHAV-1阴阳性血清按最佳稀释度稀释，将酶标二抗HRP-兔抗鸭IgG稀释为不同浓度，参照实施例3进行间接ELISA检测，以P/N值最大的稀释倍数为酶标二抗最佳的工作浓度。
如表5所示，每个浓度三个重复，取平均值，选择P/N值最大者为最佳二抗稀释度，即基于VP4重组蛋白的ELISA最佳酶标二抗稀释度为1:1600，
表4VP4重组蛋白抗原包被浓度和血清稀释度选择
表5包被重组蛋白VP4酶标二抗工作浓度优化
3、最佳包被条件：
按上述VP4重组蛋白最佳抗原稀释度包被酶标板，37℃1h 4℃过夜、37℃3h 4℃过、4℃过夜这三种包被条件设置阴、阳性血清对照，各6个重复，酶标二抗最佳的稀释倍数稀释二抗，参照实施例3操作进行间接ELISA检测序，以P/N值最大时，确定最佳包被条件。
如表6所示，每种包被条件6个重复，取平均值，选择P/N值最大者作为最佳包被条件，即基于VP4重组蛋白的ELISA最佳包被条件为37℃孵育3h后4℃过夜。
表6VP4重组蛋白包被条件优化
包被条件 37℃1h 4℃过夜 37℃3h 4℃过夜 4℃过夜
阳性均值 0.954 0.995 0.889
阴性均值 0.087 0.076 0.077
P/N值 10.936 13.138 11.544
4、最佳封闭液选择：
用以上摸索的最佳抗原稀释倍数、最佳包被条件，将VP4重组蛋白分别包被酶标板，用以下八种封闭液来封闭：5％胎牛血清、10％胎牛血清、1％明胶、5％明胶、1％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉、1％BSA和％BSA，每个孔做3个重复，以最佳的抗体稀释倍数稀释血清及酶标二抗，最后在酶标仪上测定OD450nm-OD630nm值。以P/N值最大的封闭液为最佳封闭液。
如表7所示，八种封闭液各3个重复，取平均值，选择P/N值最大者作为最佳封闭液，即基于VP4重组蛋白的ELISA最佳封闭液为1％脱脂奶粉。
表7包被重组蛋白VP4最佳封闭液选择
封闭液 5％胎牛血清 10％胎牛血清 1％脱脂奶粉 5％脱脂奶粉
阳性均值 1.273 1.173 0.976 0.892
阴性均值 0.069 0.047 0.024 0.024
P/N值 18.555 25.038 41.370 37.479
1％BSA 5％BSA 1％明胶 5％明胶
阳性均值 0.651 0.590 0.420 0.004
阴性均值 0.082 0.031 0.034 0.047
P/N值 7.940 18.949 12.267 0.080
5、封闭时间确定：
按照选出的最佳封闭液条件，设置30min、60min、90min和120min四个封闭时间梯度，每个梯度设3个重复，进行最佳封闭时间摸索。
如表8所示，每一个封闭时间3个重复，取平均值，选择P/N值最大者作为最佳封闭时间，即基于VP4重组蛋白的ELISA的最佳封闭时间均为37℃1h。
表8包被重组蛋白VP4封闭时间选择
封闭时间 0.5h 1h 1.5h 2h
阳性值 1.289 1.121 0.916 0.937
阴性值 0.095 0.069 0.121 0.178
P/N值 13.569 16.211 7.589 5.280
6、血清及酶标二抗孵育时间确定：
按以上摸索好的包被条件、封闭条件、酶标二抗最佳稀释度进行操作，设置30min、60min、90min和120min四个孵育时间梯度，每个梯度设3个重复，进行最佳阴、阳性血清及酶标二抗孵育时间摸索。
如表9和表10所示，每个时间点3个重复，取平均值，选择P/N值最大者，即基于VP4重组蛋白的ELISA的最佳血清孵育时间为1h，最佳二抗孵育时间为0.5h。
表9包被重组蛋白VP4血清孵育时间优化
血清孵育时间 0.5h 1h 1.5h 2h
阳性值 0.995 0.999 1.069 1.061
阴性值 0.197 0.092 0.108 0.101
P/N值 5.054 10.855 9.914 10.500
表10包被重组蛋白VP4酶标二抗孵育时间优化
7、显色时间确定：
设5min、10min、15min、20min、25min和30min六个时间梯度，均于37℃避光加入底物显色液，每个显色时间阴、阳性血清各设置6个重复，取平均值，最后测定OD450nm-OD630nm值，以阳性值≥1.0且P/N值最大的底物作用时间为最佳显色时间。
如表11所示，每个时间点3个重复，取平均值，选择P/N值最大者，即基于VP4重组蛋白的ELISA的最佳显色时间为30min。
表11包被重组蛋白VP4最佳显色时间选择
8、阴阳性临界值的确定：
分别以上述优化的VP4重组蛋白的最佳条件检测60份阴性血清OD450nm-OD630nm值，计算cut-off值＝均值+3×方差，即为阳性阈值。
如表12所示，测定60份阴性血清OD450nm-OD630nm值，阳性阈值＝平均值+3×SD作为阳性阈值，得到VP4阳性阈值为0.078+3×0.041＝0.203。
表12包被重组蛋白VP4 60份阴性血清OD450nm-OD630nm值
0.064 0.115 0.058 0.045 0.051 0.056 0.055 0.059 0.070 0.075
0.093 0.058 0.042 0.012 0.012 0.015 0.012 0.134 0.155 0.049
0.065 0.048 0.068 0.034 0.040 0.092 0.140 0.107 0.082 0.059
0.049 0.072 0.167 0.049 0.045 0.051 0.063 0.044 0.058 0.078
0.100 0.092 0.135 0.087 0.127 0.151 0.159 0.083 0.030 0.057
0.055 0.063 0.074 0.166 0.139 0.097 0.070 0.095 0.180 0.087
9、重复性试验：
分别用相同批次和不同批次的VP4纯化重组蛋白包被的酶标板检测6份血清的OD450nm-OD630nm值，每份血清设置6个重复，检测其板内、板间变异系数，分析建立的ELISA方法的重复性。
(1)板内重复性试验
VP4重组蛋白变异系数在1.58％～4.76％之间，小于10％，如表13所示，说明建立的ELISA方法具有较好的板内重复性。
表13包被重组蛋白VP4板内变异系数测定
阳性血清 均值 SD 板内变异系数
1 0.883 0.029 3.26％
2 1.651 0.045 2.71％
3 1.584 0.025 1.58％
4 0.885 0.032 3.59％
5 0.949 0.042 4.76％
6 1.011 0.037 3.68％
(2)板间重复性试验
VP4变异系数0.10％～9.25％之间，小于10％，见表14所示，说明建立的ELISA方法具有较好板间的重复性。
表14包被重组蛋白VP4板间变异系数测定
阳性血清 均值 SD 板间变异系数
1 0.949 0.092 9.25％
2 1.604 0.067 6.65％
3 1.540 0.063 6.31％
4 0.935 0.070 6.98％
5 0.949 0.001 0.10％
6 1.036 0.034 3.43％
10、特异性试验：
(1)特异性交叉试验
用建立的ELISA方法检测鸭沙门氏菌、鸭大肠杆菌、鸭肿头败血症病毒、禽流感病毒(H5)、鸭瘟病毒和鸭里默氏杆菌的阳性血清，设置DHAV-1阳性血清、阴性血清对照，如表15所示，每个血清设置3个重复取平均值，六种其他病原阳性血清OD450nm-OD630nm值均小于阳性阈值0.203且阳性血清与阴性血清的比值均小于2.1，表明建立的ELISA方法特异性很好。
表15VP4重组蛋白ELISA方法特异性检测
(2)特异性阻断试验
按抗原10:1阴或阳性血清的体积比于37℃中和1h后，分别用建立的ELISA方法检测中和前后的血清，每种血清6个重复，计算阻断率。如表16所示，将DHAV-1阳性、阴性血清与VP4重组蛋白反应，将阻断前后的血清进行检测，分别设置6个重复，取平均值。得到VP4阳性血清阻断率为85.2％，阴性血清阻断率为6.4％。表明VP4重组蛋白能与DHAV-1阳性血清特异性中和。
表16VP4重组蛋白阻断试验
VP4 阻断前 阻断后 阻断率
阳性值 0.5768 0.086 85.2％
阴性值 0.058 0.054 6.4％
P/N值 9.945 1.593 /
11、ELISA方法敏感性检测：
取8份已知的DHAV-1阳性血清，以2倍倍比稀释，用于建立的ELISA方法检测，能检测出阳性的最大血清稀释度为灵敏度。
如表17所示，取8份鸭甲肝病毒阳性血清，从1:100开始进行2倍比稀释，以能检测出阳性最大的稀释倍数作为灵敏度。以表17的数据得出建立的VP4重组蛋白ELISA方法灵敏度为1:1600。
表17VP4重组蛋白ELISA方法灵敏度检测
12、基于VP4重组蛋白ELISA检测方法的应用及与基于DHAV-1的ELISA方法符合率比较：
基于DHAV-1的ELISA方法：以8μg/mL的DHAV-1于37℃3h后4℃过夜包被，接入1:160稀释的被检血清孵育1h，以5％明胶37℃封闭0.5h，加入1:2000稀释的HRP标记的兔抗鸭IgG孵育40min，阴阳临界值为0.210。
以实施例3所示的建立的基于VP4重组蛋白的ELISA检测方法检测48份待检血清，检测结果与基于DHAV-1的ELISA方法的检测结果进行比较，计算符合率。
以VP4重组蛋白、DHAV-1为抗原建立的ELISA方法共同检测48份待检血清，比较两种方法的符合率如表18和19所示，结果显示，本发明的ELISA方法与DHAV-1为抗原的ELISA方法检出的阳性符合率为75.8％，阴性检出符合率为65.2％，总符合率为70.5％。说明基于VP4重组蛋白建立的ELISA检测方法可替代全病毒法对血清样品进行检测。
表18 VP4重组蛋白和DHAV-1的ELISA方法检测48份血清OD450nm-OD630nm值
表19基于VP4重组蛋白和DHAV-1的间接ELISA方法的符合率
VP4法 全病毒法
阳性数 25 33
阴性数 23 15
样品总数 48 48
检出率 52.1％ 68.8％
阳性符合率 75.8％ /
阴性符合率 65.2％ /
与全病毒法总符合率 70.5％ /
本发明预测分析的VP4截断基因序列大小225bp，编码75个氨基酸，含有1个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶II磷酸化位点，也含有抗原位点。经RT-PCR扩增、T克隆和亚克隆，成功构建了原核表达重组质粒pET-32c-VP4，在37℃、0.6mmol/L IPTG诱导4h，VP4重组蛋白(257个氨基酸)可在宿主菌中以可溶性形式表达，经Ni2+NTA柱纯化得到纯度较高的VP4重组蛋白。该重组蛋白能被兔抗DHAV-1血清识别，具有很好的反应原性。以纯化的VP4重组蛋白为包被抗原并对包被条件、封闭条件、血清孵育条件、酶标抗体孵育条件及显色时间等的优化，建立了基于VP4重组蛋白的ELISA检测方法。结果显示，以VP4重组蛋白为包被抗原的ELISA最优检测条件为：以3.375μg/ml的VP4重组蛋白37℃3h后4℃过夜包被，以1％脱脂奶粉作为封闭液37℃封闭1h，血清1:160稀释于37℃孵育1h，HRP标记的羊抗鸭IgG以1:1600稀释于37℃孵育0.5h，TMB显色30min为最佳检测条件，确定的阳性阈值为0.203。建立的该ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度，与I型鸭甲肝病毒为包被抗原的ELISA检测方法的符合率较高，可达到70.5％，可用于DHAV-1血清抗体的检测。
本发明提供一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白、ELISA试剂盒及其制备方法，成功构建了pET32c(+)-VP4重组原核表达质粒，成功获得VP4重组蛋白可溶性表达，并且与兔抗DHAV血清具有良好的反应原性，说明病毒DHAV-1VP4蛋白成功获得了原核表达。对DHAV-1的VP4进行原核表达获得重组蛋白，并以表达的重组蛋白建立了检测DHAV-1抗体的间接ELISA检测方法，建立了检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，建立的ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度，与I型鸭甲肝病毒为包被抗原的ELISA检测方法的符合率较高，可用于DHAV-1血清抗体的检测。为DHAV-1抗体的检测及进一步开展DHAV-1的相关研究提供试验数据和基础材料。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白，其特征在于，所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：获取VP4目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP4截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GAATTCTACCAGTAGACTTTCATGCAATGG-3'，下游引物为5'-CTCGAGTTGAGCTCCTACTTCATAAGAACA-3’，增殖1型鸭甲肝病毒株，提取1型鸭甲肝病毒株的RNA，利用特异性引物进行RT-PCR扩增，得到VP4目的片段；
步骤二：构建重组表达质粒pET32c(+)-VP4：将所述VP4目的片段克隆至pMD19-TSimple载体中，加入连接酶，得到连接产物I，将所述连接产物I转化至感受态细胞中培养，筛选出阳性克隆体，经鉴定后得到重组质粒pMD19-T Simple-VP4，将所述重组质粒pMD19-TSimple-VP4和表达质粒pET-32c的菌株扩大培养后提取质粒DNA，分别用EcoR I和Xho I双酶切、纯化回收，将回收得到的VP4目的片段和载体片段pET-32c连接，得到连接产物II，将所述连接产物II转化至感受态细胞中培养、筛选出阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET-32c-VP4；
步骤三：制备VP4重组蛋白：重组表达质粒pET-32c-VP4转化至大肠杆菌BL21中，进行重组蛋白诱导表达，结束后纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，VP4目的片段与所述pMD19-T Simple载体的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物I加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
4.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述回收得到的VP4目的片段与载体片段pET-32c的物质的量之比为6:1，取5μL所述连接产物II加入50μL感受态细胞E.coli DH5α，吹打混匀，冰浴30min后42℃热击60～90s，冰浴1min，加入LB液体培养基450μL，37℃摇床1.5h后，经Amp抗性LB固体和液体培养基筛选阳性克隆。
5.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，所述重组质粒pMD19-T Simple-VP4和重组表达质粒pET-32c-VP4的鉴定方法均包括菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，选取所述菌液PCR鉴定正确的阳性菌液提取质粒DNA，对提取的所述质粒DNA用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，选取经菌液PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行所述测序鉴定。
6.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白诱导表达条件为：IPTG浓度为0.6～1.2mM/L诱导4～12h、温度为37℃。
7.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中纯化方法为Ni亲和层析挂柱纯化。
8.一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，包括ELISA板、PBST缓冲液、封闭液、酶标二抗、显色液以及终止液，所述ELISA试剂盒还包括权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测1型鸭甲肝病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为含1％脱脂奶粉的PBS缓冲液；所述的酶标二抗为HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液。
10.一种制备权利要求8～9任一项所述的ELISA试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：包被：1型鸭甲肝病毒VP4重组蛋白包被ELISA板，所述VP4重组蛋白的最佳包被浓度为3.375μg/ml，100μL/孔，37℃孵育3h后转入4℃过夜，次日PBST缓冲液洗板3～5次，每次3min，拍干；
步骤二：封闭：加入含1％脱脂奶粉150μL/孔于37℃封闭1h，按照步骤一的方法洗板，拍干；
步骤三：待检血清孵育：加入1:160稀释待检血清，于37℃孵育1h，按照步骤一洗板，拍干；
步骤四：酶标二抗孵育：加入工作浓度的HRP标记的兔或羊抗鸭IgG稀释液，酶标二抗稀释度为1:1600，37℃孵育0.5h，按照步骤一洗板，拍干。
步骤五：显色：加入TMB显色液100μL/孔，避光显色30min；
步骤六：终止：加入终止液2mol/L H2SO4，50μL/孔；
步骤七：读数：用酶标仪以双波长形式读取OD450nm-OD630nm值。
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