CN104360058A - 一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人畜共患病免疫诊断领域，公开了一种布鲁氏菌病抗体检测试纸条及其制备方法。该布鲁氏菌病抗体检测试纸条，首先制备粒径为30nm的胶体金，用其标记重组大消化链球菌蛋白L(protein L)作为指示标记，溶解于金标工作液中，喷涂在玻璃纤维上制成金标垫。从布鲁氏菌基因组中克隆出VirB5基因，并将其连接在pET-28α上，构建成表达载体，并转化到大肠杆菌中，表达出VirB5蛋白，经过分离纯化后包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，将与蛋白L结合的IgG包被硝酸纤维素膜上作为质控线，制备成免疫层析检测装置。本发明布鲁氏菌病免疫层析装置具有特异性强，灵敏度高，稳定性好，简单，经济，快速等特点，对该病的监测和控制流行具有非常重要实际应用价值。

Description

一种新型检测人布鲁氏菌病抗体的免疫层析试纸及制备方法

技术领域

本发明属于免疫学诊断检测技术领域，具体涉及一种检测对人感染布鲁氏菌后体内产生抗体检测试纸及其制备方法。本发明还涉及到作为布鲁氏菌IV型蛋白分泌系统家族之一的VirB5作为诊断抗原的基因工程制备过程，及其在这种蛋白在布鲁氏菌抗体检测方面的应用。 

技术背景

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是一种严重危害人和家畜健康的“再现性”(reemerging)人畜共患传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》中规定管理的乙类传染病。全球约有170个国家和地区流行此病。近年来，布鲁氏菌病的人畜疫情在世界范围内均出现了回升势头，并呈持续增长态势，愈演愈烈。我国除澳门和台湾疫情未知外，所有的省级单位均已报告或发现布病病例，并且一经发现，病例就会很快增加。近20年来，我国的布病病例持续增加，1998年以后，人布鲁氏菌病疫情强势升高，发病人数逐年上升，2013年报告新发病例，发病率3.14/10万，较上一年同期上升18.91％。布病的主要流行区集中于我国的“三北”地区，即东北、华北和西北，以内蒙古、新疆、黑龙江、吉林等地疫情尤为严重。根据布鲁氏菌的细菌学特征和感染宿主的亲嗜性，传统上将布鲁氏菌属分为6个种，即牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌和沙林鼠种布鲁氏菌。 

布鲁氏菌病是一种全身性的疾病，感染后不及时的诊断和治疗多呈现疗程长，预后差、劳动力损失大，卫生消费需求高等特点，给个人、家庭和社会造成极大的经济损失，甚至由此造成的因病致贫，因病返贫现象非常突出，已成为威胁经济发展和社会稳定的重要因素之一。由于布病患者临床表现无特异性，临床误诊很容易错过布病患者急性期最佳治疗期，从而转变为很难治愈的慢性期，造成布病患者生活质量严重下降。目前，布病的诊断主要依赖于实验室诊断，主要包括以下几种方法：①细菌培养法；②血清学诊断方法：虎红平板凝集实验，缓冲平板凝集实验，补体结合实验，酶联免疫吸附实验，荧光偏振实验，乳汁环状实验，布鲁氏菌素皮肤实验等。病原分离法虽精确，但耗时长，阳性检出率低，对分离环境要求高。虎红平板凝集试验和试管凝集试验因操作简便、无需特殊设备，成为我国目前检测人布病和家畜布病常用的方法，但是存在判定结果主观性强、易出现假阳性或漏检的等不足。 

在我国边远地区的基层诊疗机构和畜牧兽医站缺少专业的检测仪器设备和技术人员，因此，开发一种具有简单经济、方便快速的检测方式对该病控制治疗显得尤为重要。胶体金免疫层析技术因简单快速、灵敏度高、特异性好、稳定性高、不需要专业的操作人员、无需特殊的仪器设备且结果判断直接的优点而被广泛的应用于各类疾病检测中。因为简单(试纸条的形式呈现)、快捷(一个测试仅仅需要5min)、经济并且易于使用，免疫层析检测技术已经广泛应用于环境检测；动植物检疫；食品安全；临床诊断等方面。因此，免疫层析技术是非常适宜于我国布鲁氏菌病高发地区的检测技术。 

近年来，应用于布鲁氏菌病的抗体检测中的诊断抗原有，最常见的就是布鲁氏菌的LPS、外膜蛋白 BP26、L7/L12蛋白等。但是在我们长期的应用实践中，我们发现布鲁氏菌定位于细菌表面蛋白外侧VirB5蛋白是近年来对该病的研究热点；该蛋白是布鲁氏菌的IV型蛋白分泌系统家族之一，VirB5对细菌在细胞内生存和繁殖具有重要意义。更重要的是我们发现VirB5蛋白具有较高的免疫原性，作为该病的诊断抗原具有明显的优势：检测布鲁氏菌抗体假阳性低、灵敏度高等特点，而且VirB5蛋白作为胶体金标记的免疫层析试纸条的包被抗原，检测结果稳定，蛋白不易失活等优点。 

发明内容

本发明的目的在于满足我国边远地区对布鲁氏菌病防疫的要求，提供一种敏感、特异性强，能够快速诊断布鲁氏菌病抗体检测试纸条。本发明首次利用布鲁氏菌IV型蛋白分泌系统家族之一的VirB5蛋白作为诊断抗原包被在试纸条的硝酸纤维素膜上作为检测线(T线)。同时，将重组大消化链球菌蛋白L(protein L)作为标记抗原标记在制备的胶体金上，然后溶解在特制的缓冲液中喷涂在玻璃纤维上干燥制成金标垫。蛋白L源于细菌Peptostreptococcus，是一种能和广泛的免疫球蛋白相结合的蛋白质，该蛋白只与抗体的k链结合而不会影响抗体的抗原结合位点，这一特性使其与蛋白A或蛋白G相比，蛋白L不和牛、绵羊的IgG类抗体结合，但是和人的五大类免疫球蛋白均有高亲和性。在反应膜上的质控线包被的是与重组大消化链球菌蛋白L(protein L)结合的人IgG类抗体，将上样垫、金标垫、包被有检测抗原的检测线和质控线的反应膜组装制成一种检测人血清中布鲁氏菌抗体的检测试纸条。 

本发明的提供了以上的试纸条的制备方法的同时，为了实现人血清中布鲁氏菌抗体的快速床边诊断的目的，本发明首先利用基因工程技术，克隆并高效表达布鲁氏菌布鲁氏菌的IV型蛋白分泌系统家族之一的VirB5，并通过免疫学技术对其免疫原性及特异性进行鉴定。实验表明，通过基因工程蛋白抗原的制备具有良好的特异性和灵敏度。进而，本发明提供一种布鲁氏菌病抗体检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述的反应膜上包被有VirB5蛋白作为检测线，将与重组大消化链球菌蛋白L(protein L)结合的IgG类抗体作为指控线。其具体的操作步骤如下： 

通过基因工程手段制备布鲁氏菌VirB5蛋白。从布鲁氏菌基因组中扩增VirB5基因，分别克隆到pMD-18T载体，将重组质粒双酶切，再亚克隆入表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VirB5，转化于大肠杆菌BL21(DE3)菌中，IPTG诱导表达，用亲和层析对重组蛋白进行纯化，并用Western-blot检测其抗原性。 

将步骤(1)制备的布鲁氏菌VirB5蛋白作为检测线，将与重组大消化链球菌蛋白L(irotein L)结合的IgG类抗体作为指控线包被在反应膜上。 

用柠檬酸三钠还原氯金酸制备30nm胶体金：用去离子水溶解1％的氯金酸使其终浓度为0.01％，待溶液沸腾后快速加入0.5ml-1ml浓度为1.05％的柠檬酸三钠水溶液，氯金酸水溶液在约4min左右变为稳定的紫红色然后继续沸腾搅拌10min，反应停止后室温下冷却，用去离子水恢复至溶液原体积，用0.45μm的滤器过滤。将烧制好的胶体金溶液应在电镜下和紫外/可见光谱仪进行对粒径、分散性、形貌的表征。 

标记重组大消化链球菌蛋白L(protein L)及其钝化：在上述制备的30nm胶体金溶液中调节pH值为6-10，室温下快速搅拌5min，快速一次性加入300ul重组大消化链球菌蛋白L(1mg/mL)，搅拌5-60min，静止5-60min之后，磁力搅拌下加入1％-10％BSA(含有5％的小牛血清)和1％-30％聚乙二醇(分子量20000)各1-5mL，搅拌30min。将制备的免疫金4℃、3000rpm低速离心10min，弃去凝聚的胶体颗粒形成的沉淀。然后在12000rpm离心30min，轻轻弃上清，沉淀用胶体金复液，重悬成免疫胶体金，置于4℃备用。 

上样垫的制备及其金标释放垫的制备：将玻璃纤维膜裁剪成1.7cm×30cm，用上样垫处理液浸泡20min，37℃烘干备用。将质地较密的玻璃纤维膜裁剪成0.8cm×30cm，将上述免疫胶体金与胶体金缓冲液按1∶9混合，用喷金划线仪按1ul/cm的速度喷涂在裁剪好的玻璃纤维膜上制备结合物释放垫，37℃晾干备用。将上述制备好的反应膜、结合物释放垫、上样垫和吸水垫组装在支撑板上(如图1)，裁剪成一定规格的试纸条。 

本发明人畜布鲁氏菌抗体快速检测试纸条(胶体金法)具有以下优点： 

体现了快、边、便、易四个特点：快速，5-10分钟就能准确检测出结果；床边诊断；方便简单适用于家庭自检；结果易于读取。 

特异性强：该检测试纸条仅对布鲁氏菌各种人或动物血清中标本呈阳性反应，而对其他病原体感染的血清标本呈现阴性结果。 

对血清样本中抗体具有敏感性强和灵敏度高，保质期长等优点。 

本发明的试纸条利用胶体金标记的免疫层析技术，在基层医疗机构和畜牧兽医站等缺乏大型检测设备和专业技术人员等恶劣条件下实现对该病的定性和半定量测定，可快速筛查受感染患者和动物，对布鲁氏菌的控制流行起到非常重要的作用。同时，该检测方法具有方便、快速、简捷，不需要特殊的仪器设备和不需要对检测人员专业培训，结果清晰易于判读，操作简单方便推广，适合于现场检测和流行病学的调查。 

附图说明

图1是1.2％琼脂糖检测VirB5基因及重组阳性质粒酶切鉴定 

图2是VirB5-32a双酶切鉴定的琼脂凝胶电泳检测(1-4泳道为VirB5-2酶切产物；5泳道为质粒对照；6泳道标准分子10000) 

图3是VirB5蛋白SDS-PAGE分析(Lane M：蛋白Marker；Lane 1：未经IPTG诱导的DE3空菌Lane 2：经IPTG诱导的DE3空菌；Lane 3：未经IPTG诱导的pET28a空质粒Lane 4：经IPTG诱导的pET28a空质粒；Lane 5：未经IPTG诱导的pET28a-VriB5质粒；Lane 6-10：经IPTG诱导2h，3h，4h，5h，6h在大肠杆菌中表达的VirB5蛋白Lane 11、12：纯化后的VirB5蛋白) 

图4是纯化的VirB5蛋白及western bloting分析(Lane M：蛋白Marker；Lane 1：纯化的VirB5蛋白；Lane 2：western bloting结果) 

图5是胶体金紫外-可见光谱图(UV-Vis) 

图6是布鲁氏菌病抗体检测试纸条组装结构图 

图7是试纸条的结果判定(1布鲁氏菌病阴性血清；2、3人布鲁氏菌病阳性血清) 

具体实施方式：

实施例1：布鲁氏菌外膜蛋白BP26的原核表达及纯化 

1.1引物的设计与合成 

参照GenBank是上已经公布的羊种布鲁氏菌参考株16M的VirB5基因序列(登录号：BMEII0029)，根据pGM-T克隆载体及pET-28a原核表达载体的特点，设计两端含有限制性内切酶Xho I/EcoR I酶切位点的引物。引物序列见表1-1。 

表1-1 引物序列 

Table 1-1 Primer sequences 

1.2目的片段的PCR扩增 

以布鲁氏菌16M基因组为模板进行PCR扩增，PCR反应体系见表1-2。采用反应条件为：94℃预变性5 min；95℃50s，58℃45s，72℃1min，循环30次；72℃延伸7min；4℃。反应结束后取PCR产物于1.2％琼脂糖凝胶上电泳分析如图1，将目的片段用DNA回收试剂盒说明书进行回收。 

表1-2 PCR反应体系 

Table 1-2 PCR reaction systerm 

1.3 VirB5基因DNA回收产物的连接转化 

将PCR回收产物与克隆载体pGM-T连接，16℃，连接18h；。连接反应体系见表1-3。 

表1-3T载体连接体系 

Table 1-3 Systerm of T vector ligeration 

将上述连接产物在含有氨苄抗性的平板上培养，培养皿上涂有8μl的IPTG和40μl的X-gal，避光倒置于37℃温箱50～60min。 

将5ul的连接产物加入100μl的感受态细胞中混匀，冰浴30min。42℃热激90s，再冰浴5min。将上述转化的感受态细胞加入800μl无抗性的LB液体培养基，37℃，120rpm振荡培养50min。然后再800rmp离心5min。取沉淀的菌液涂于含IPTG/X-gal的氨苄板上，37℃温箱倒置培养过夜。 

1.4 pGM-T-VirB5重组质粒的鉴定 

菌落PCR鉴定：在过夜培养的LB/IPTG/X-gal氨苄板上挑取单个的、形态大且圆的白色菌落摇于含800μl氨苄抗性的液体LB中，4～6h后取2μl作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。 

酶切鉴定：菌落PCR鉴定为阳性的提取质粒，。然后将pGM-T-VirB5重组质粒进行EcoR I/Xho I双酶切，37℃酶切3h，酶切体系见表1-4。反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察，结果如图2。 

表1-4 pGM-T-VirB5重组质粒酶切体系 

Table 1-4 Enzyme ligest systerm of pGM-T-bp26 

1.5重组质粒与表达载体的双酶切 

将测序后正确的重组质粒以及实验室保存的表达载体pET-28a质粒进行EcoR I/Xho I双酶切，酶切体 系同上，37℃酶切3h。取20μl反应产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪下观察。将从pGM-T-VirB5重组质粒上切下的VirB5基因片段与pET-28a质粒切下的大片段进行回收。 

1.6 pET-28a-VirB5重组质粒的连接、转化 

将双酶切后的目的片段采用T4 DNA连接酶进行连接，恒温水浴槽16℃，连接18h；或者4℃连接24h～26h。连接反应体系见表1-5。 

表1-5 pET-28a-VirB5重组质粒连接体系 

Table 1-5 ligase systerm of pET-28a-VirB5 

将5.0μl连接产物加入到冰浴的DE3感受态中，混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴5min。加入无抗性的灭菌LB培养液800μL，37℃振荡(180rpm)50min，取60μl均匀涂布于含50μg/mL的卡那霉素LB平板上，用涂布棒均匀涂布菌液，至平板表面的菌液被全部吸收。37℃培养箱过夜培养。 

1.7 pET-28a-VirB5蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析 

在过夜培养的卡那板上挑取白色菌落摇于含10mL卡那抗性的液体LB中，6h后取2μL菌液作为模板进行PCR扩增，反应体系与条件同前。将检测为阳性的pET-28a-VirB5重组菌按1∶200进行活化，37℃振荡培养，同时测定菌液的OD值，当OD600在0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1mmol/L进行诱导表达。诱导6h取样，各取1.5mL瞬时离心，取沉淀的菌体。在菌液中加入蛋白上样液，混匀，煮沸10min。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)进行纯度的鉴定，结果如图3 

1.8重组蛋白的Ni柱亲和纯化 

4mL的Lysis Buffer裂解菌体反复冻融三次之后超声破碎，重复2～3次，直至菌体清亮为止；将菌体5000rpm离心15min，；将上清12000rpm离心30min取上清液；将上清液吸入清洗过的Ni柱里，在摇床上冰浴结合1h；取出，800rpm离心2min；再加4mL的Wash Buffer将柱子清洗三遍，800rpm离心2min。加1mL的Elution Buffer洗四遍，收集上清。将上清放入透析袋中，利用蔗糖进行浓缩。将浓缩的蛋白冷冻抽干，于-80℃保存备用。 

1.9 Western-blot免疫鉴定 

按照实验1.7的方法，当SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳结束后，切下含有目的蛋白的凝胶，并在胶的一角做好标记。准备大小和凝胶相同的6张滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，浸泡在装有膜转移缓冲液 的平皿中15min。将胶放于另一个装有膜转移缓冲液的平皿清洗一遍，浸泡10min。从下至上依次放置3层滤纸、凝胶、NC膜，3层滤纸于半干电转移仪中，200mA电泳1h。电转移后将NC膜放在杂交瓶中，用10mL膜转移液洗1遍，10min，再用TBST洗两遍，每次10min。加入15mL膜封闭液，37℃封闭1h。倒去封闭液，用TBST再清洗3次，每次10min。加入100μl小鼠血清和4900mL的TBST作为一抗，37℃杂交1h。用10mL TBST洗涤3次，每次10min。以1∶1000倍用TBST稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG至5mL，37℃于杂交1h。杂交完成后，用10mLTBST洗涤3次，每次10mia，最后加入1150μlHRP显色试剂，避光显色约1～3min。显色至目的条带清晰后，倒掉显色液，加入TBST清洗，终止反应，结果如图4。 

实施例3：制备血清中布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析试纸条 

1.1胶体金的制备 

将烧制胶体金的三角瓶清洗干净后再放在的酸缸中浸泡过夜；取出洗净后先用清水冲洗20遍，之后用蒸馏水清洗3～5遍，再用超纯水冲洗3遍，晾干后用硅烷化试剂进行处理，干燥后用超纯水水冲洗干净，把三角瓶烘干用来制备胶体金。 

将浓度为0.01％氯金酸50ml加入到上述处理好三角瓶中，在磁力搅拌器上加热搅拌，待溶液沸腾后用移液器快速加入1ml浓度为1％的柠檬酸三钠水溶液，溶液颜色在约短时间内变为稳定的酒红色，冷却后用去离子水恢复至50ml，用0.45μm的滤器过滤，放置在室温下备用。烧制好的胶体金溶液应在电镜下和紫外/可见光谱仪观察其等离子共振吸收峰，峰型狭窄，吸收峰值在520nm左右，结果如图5。 

1.2胶体金标记重组大消化链球菌蛋白L(protein L) 

用0.2mol/L碳酸钾把胶体金溶液的PH调至6.0附近，在磁力搅拌的条件下将300ul浓度为1mg/mL重组大消化链球菌蛋白L(protein L)溶液用移液器逐滴加入到上述制备的胶体金中，匀速搅拌10min，静置15min后加入2mL封闭剂(5％牛血清白蛋白)，继续搅拌30min，4℃过夜。 

免疫金的纯化采用离心法，具体操作为将上述混合物转入两个50ml离心管中等重平衡后，3000rpm低速离心10min，弃去沉淀；将上清液用4℃12000rpm条件下离心30min，弃去上清液，沉淀用免疫层析工作液重悬后4℃保存备用。 

1.3金标释放垫的制备 

将玻璃纤维膜裁剪成30×0.8cm大小，浸泡在已经配置好的金标垫处理液(含有0.1％曲拉通-100和0.1％TWEEN-20的水溶液)中10min，然后置于烘箱中烘干备用。 

将制备并纯化后好的免疫金，用上海金标单维平面划膜喷金仪以每厘米30μl的量喷涂在上述处理好的玻璃纤维素膜上室温下晾干备用。 

1.4上样垫的制备 

将玻璃纤维膜(型号为SB08)裁剪成30×1.7cm大小，浸泡在上样垫处理液中10min，然后置于37℃烘箱中4h烘干备用。在此步骤中上样垫处理液配制方法为：称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP)3g；Triton X-1005g；量取10×PB 10ml然后混合后用超纯水定容至100ml。 

1.5试纸条的组装 

将用原核表达制备的布鲁氏菌VirB5蛋白作为检测线，和与重组大消化链球菌蛋白L(porotein L)结合的人IgG作为质控线用喷金划膜仪包被在硝酸纤维素膜上，室温下晾干备用。 

将吸水纸裁剪成30×1.7cm，然后将处理好的样品垫、金标结合垫、上述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，按图6所示组装在尺寸在30×6.0cm的PVC支撑板上最后用裁条机裁剪成宽度为4mm的试纸条，加干燥剂密封在铝箔袋中置于4℃保存备用。 

1.6对检测样本的检测方法 

将试剂条放入待测样本中，10min内读取结果。试剂条除质控线显色外，另外两条检测线都显色或任何一条检测线显色均为布鲁氏菌阳性血清，检测其他细菌的血清只有质控线显色；如果质控线上没有红色线出现，无论检测线是否出现，则该试纸条无效。阳性检测结果和阴性结果如图7。 

Claims (7)

1.一种新型检测人布鲁氏菌病抗体试纸条，其包括：被检测抗体与特异性检测抗原的反应膜和胶体金标记结合物释放垫、样品垫和吸水垫，其中所述的反应膜上包被有布鲁氏菌特异性检测抗原作为检测线，以及可与标记抗原重组大消化链球菌蛋白L(protein L)发生结合的抗体作为质控线。

2.由权利要求1所述的检测人布鲁氏菌抗体试纸条其特征在于，其中所述的特异性检测抗原为布鲁氏菌VirB5蛋白，这种VirB5蛋白是通过基因工程方法重组表达获得。

3.由权利要求1所述的试纸条其特征在于，标记材料为10nm-70nm的胶体金，制备方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方式获得。

4.由权利要求1所述的试纸条其特征在于，其中所述的胶体金标记结合物释放垫为：制备的胶体金标记重组大消化链球菌蛋白L(protein L)，溶解在免疫金工作液中，喷涂在玻璃纤维膜、聚酯纤维膜等材质干燥后制备得到。

5.如权利要求1所述的布鲁氏菌抗体检测试纸条，特征在于：所述反应膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜、聚酯膜，或硝酸纤维素与醋酸纤维素的混合膜之一；所述结合物释放垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维，上样垫的材质为玻璃纤维或聚酯纤维裁剪成型；然后用上垫处理液浸泡，然后15℃到60℃烘干或冷冻干燥。

6.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述的反应膜的检测线为布鲁氏菌的VirB5蛋白，该定位于细菌表面蛋白外侧且具有较高的免疫原性，能够准确指示出体液中的布鲁氏菌抗体的存在；反应膜上的质控线为能与重组大消化链球菌蛋白L(protein L)结合的IgG类抗体。

7.将制备好的反应膜以及结合物释放垫、上样垫、吸水垫和反应膜组装在支撑板上然后裁剪成不同规格的试纸条，检测试纸条结合一定模具可制备成布鲁氏菌抗体检测卡和检测试纸笔。