CN101441215A - 一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条，用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金制成本发明的胶体金抗体检测试纸条的金胶垫。L7/L12蛋白是布鲁氏菌高特异性、免疫原性蛋白。从牛布鲁氏菌基因组中克隆出L7/L12基因，把它连接到pET－28a上，构建成原核表达重组质粒，把这个质粒转化到大肠杆菌中，表达出L7/L12蛋白，蛋白纯化后，以它为抗原包被硝酸纤维膜，作为检测线(T线)，同金胶垫一起装备成本发明的免疫胶体金试纸条。本发明试纸条可用于检测动物血清中的布鲁氏菌抗体，具有特异性强，灵敏度高、稳定性好、方便、快捷的特点，对布鲁氏菌的监测、诊断、净化和控制具有重要意义和实际应用价值。

Description

一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明提供一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条，用于动物布鲁氏菌抗体的检测，本发明还公开了上述试纸条的制备方法，属于血清学检测技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由小球杆状布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，在世界各地都有广泛流行。每年因此病造成的经济损失高达数十亿美元，而且此病还会对人类健康造成严重威胁。从上个世纪90年代起，人与动物发病率又有上升的趋势。

布控、疫原净化与早期诊断是防治该病的最有效途径，这就必然要求对该病进行快速、有效的检测，但是对该病的检测有两困难困扰着这一问题。其一，在我国对动物该病的检测标准方法是GB/T18646-2002，即虎红平板凝集、试管凝集与补体相结合的检测方法。用该标准诊断抗原对动物布鲁氏菌抗体检测时，会与Y.enterocolitica 0∶9、Salmonella 0:30，E.coli 0:157等细菌抗体发生血清学交叉反应，因此该标准的检测结果的特异性只有70％左右，布鲁氏菌病检测特异性低，灵敏度低。在我国对检测出该病的动物采取捕杀政策，每年因错检、漏检对我国造成的济经损失达数十亿元之巨。第二个困难是，该病多发于农村与牧区，基层单位特别是牧区设备简单、技术人员缺少，很难对该病开展广泛检测与流行病学调查。因此发明一种，高特异性、方便快捷的布鲁氏病检测方法与试纸，具有重要的现实与实践意义。

布鲁氏菌L7/12蛋白是其高免疫原性蛋白。L7/L12基因是该菌高度保守基因，各型布鲁氏菌对该基因都高度表达，该基因且与Y.enterocolitica 0∶9、Salmonella0:30，E.coli 0:157等细菌没有同源序列。更值得注意的是，在我们的研究中，该基因表达的蛋白，在人、狗、牛、羊都有较高的免疫原性，并且与Y.enterocolitica 0∶9、Salmonella 0:30，E.coli 0:157抗体没有血清学交叉反应。

免疫胶体金技术自问世以来，得到了迅速发展。已广泛应用于免疫组织(或细胞)化学检测和免疫学检测领域，特别是胶体金免疫层析技术具有操作简单、检测快速灵敏、结果清楚，易于判断和保存，且无需任何仪器设备等优点，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。

经检索未见有布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条公开的文献报道。

发明内容

本发明的目的是公开一种检测布鲁氏菌抗体免疫胶体金试纸条，解决了当前布鲁氏菌病检测特异性低，灵敏度低的缺点。

本发明还提供了上述试纸条的制备方法，适用于工业化生产。

本发明的检测布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条，是以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金制作金标垫，以布鲁氏菌L7/L12蛋白包被硝酸纤维膜作为检测抗原线(T)，用兔抗牛IgG或兔抗羊IgG作为质控线(C)。

本发明检测试纸条的制备方法如下：

用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金技术制作金标垫。再克隆出布鲁氏菌L7/L12基因，把它连接到原核表达载体pET-28a上，而后把重组质粒转化大肠杆菌中，表达并纯化出L7/L12蛋白，用纯化的L7/L12蛋白包被硝酸纤维膜作为检测线抗原线(T)；检测牛时用兔抗牛IgG作为质控线(C)，检测羊时兔抗羊IgG作为质控线(C)，即得检测试纸条。

主要包括以下步骤：

(1)用SPA标记胶体金，制备成胶体金探针，把它喷在玻璃纤维膜上制成胶体金垫；

(2)设计一对引物，以牛布鲁氏菌基因组为模板，用PCR扩增、并纯化出L7/L12基因；

(3)把步骤(2)中所得基因连接到质粒pET-28a的Nde I和Sal I位置上，构建成原核表达重组质粒，转化到大肠杆菌中，表达出L7/L12蛋白；用His-Trp纯出L7/L12蛋白；

(4)用(3)中的纯化的L7/L12蛋白为诊断抗原包被硝酸纤维膜作为本发明胶体金试纸条的检测线(T线)，用兔抗牛IgG(检测牛时)或兔抗羊IgG(检测羊时)、作为质控线(C线)；

(5)将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水滤纸按从上到下依次固定于PVC板上，制备成检测试纸条。

本发明用纯化的L7/12蛋白为检测抗原，就能特异性的检测出动物血清中是否含有布鲁氏菌抗体。用纯化的L7/12蛋白进一步的制备出胶体金试纸条，保留了其特异性强的特点，并增强了其灵敏度高、稳定性。

本发明布鲁氏菌抗体检测胶体金试纸条的积极效果在于：检测特异性高、灵敏度高、稳定性好、方便、快捷。具有操作简单、检测快速、结果清楚，易于判断和保存，且无需任何仪器设备等优点，适合于临床的快速诊断和基层、农村等流行病学调查大规模应用。

附图说明

图1为本发明检测试纸结构示意图；

图2为25mn胶体金镜鉴定结果图；

图3为纯化的融合L7/L12蛋白SDS-PAGE检测图；

图4为胶体金试纸条的检测结果图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例1

胶体金探针的制备

1、材料及方法

(1)兔抗牛IgG购自北京鼎国生物技术有限公司；兔抗牛IgG、兔抗羊IgG购自北京意宏安生物科技有限公司；蛋白定量试剂盒购自联星生物科技公司；建立胶体金免疫层析方法的耗材由上海捷宁生物科技公司提供；

(2)胶体金的制备

采用柠檬酸钠还原法，取硅化过的三角瓶，加入100mL去离子及1mL1％氯金酸，微波炉加热沸腾；迅速加入不同剂量的1％柠檬酸三钠，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约3min，继续煮沸15min，冷却后用去离子水补足体积至100mL。电镜下观察胶体金颗粒的平均直径、分散程度及均匀度。

(3)胶体金标记SPA探针的制备

取100mL三角瓶，加入50mL胶体金；三角瓶中加入磁性转子后放置在磁力搅拌器上，开启搅拌器边搅拌边加入0.1mol/L K₂CO₃，调pH至6.2左右；根据胶体金总量计算出所要标记的SPA总量。加入金标抗体封闭液，加入10％稳定剂BSA至终浓度为1％，继续搅拌35min；然后4℃，3000rpm离心30min，弃沉淀；上清液4℃，13000rpm离心，40min，弃上清加入金标抗体洗涤液重悬沉淀；4℃，13000rpm离心，40min，弃上清，重复洗涤2～3次，最后的沉淀物用金标保存液做适量稀释。

(4)金标垫的制备：选用优质的玻璃纤维膜浸入0.01mol/LPBS(pH6.2)+1％BSA+0.2％Tween-20+0.05mol/L NaCl配置的溶液中，37℃浸泡30min，取出置常温条件下通风干燥，干燥条件下保存备用。

将处理好的玻璃纤维素膜切割成0.55cm左右宽的长条，长度依需要而定。称取蔗糖少量，将其加到上述制备的胶体金标记SPA探针溶液中，使之充分溶解混匀，然后均匀地加到玻璃纤维膜上，4℃放置4h，在低温条件下风干，即为金标垫。

(5)为了更好完成上述试验，应补充以下实验。

SPA与胶体金结合的最佳pH的确定：用0.1mol/L K2CO3结合精密pH试纸调节胶体金溶液pH依次为4.0-9.0，每隔0.5个pH值为一个检测梯度。每管加入1mg/mL的SPA 50μL，在振荡器上混匀，室温下放置20分钟。然后每孔分别加入100μL 10％ Nacl溶液，混匀，室温放置4h，观察胶体金颜色变化，记录保持和空白对照颜色一致的最低pH，即为最佳的标记pH。

SPA与胶体金结合的最佳标记量确定：取1.5mL离心管若干，分别加入已调整为最佳标记pH(6.2)的胶体金1mL，各管依次加入0、5、10、15、...、50μL浓度为1.0mg/mL的SPA，振荡器上混匀，室温放置20min。然后每孔加入100μL的10％ Nacl溶液，室温下放置1h，观察颜色变化，颜色仍保持红色的最小蛋白量即为最佳蛋白标记量。

(6)胶体金标记SPA探针的鉴定

用有Formvar膜的镍网沾取金标蛋白溶液，空气中干燥后磷钨酸复染，透射电镜下观察。

2、结果

胶体金偶联SPA后在电镜下观察，可见金颗粒外周有明显的低电子密度晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白质。见附图一。

实施例2

布鲁氏菌L7/L12蛋白基因的克隆、表达及L7/L12蛋白的纯化

1、材料与方法

(1)菌株及质粒

布鲁氏菌S19、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌BL21(DE3)和pET28 a+载体由军事医学科学院第11所5室保存，pMD18-T simple vector购自TakaRa公司。

(2)相关分子生物学操作

细菌总DNA的提取、PCR扩增、质粒重组、大肠杆菌感受态制备、转化、质粒提取等操作按文献[6]；T4连接酶、DNA的回收纯化按照试剂盒说明书进行(购自TakaRa公司)；DNA测序委托上海生工生物工程公司完成。

(3)L7/L12基因的扩增及克隆

设计5＇端带有限制性内切酶Nde I位点的上游引物：5’-catatggctgatctcgcaaagatcgtt-3’和Sal I酶切位点的下游引物5’-gtcgacttacttgagttcaaccaaggc-3’，以布鲁氏菌S19基因组DNA中为模板扩增L7/L12基因。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物与pMD18-T simple vector连接构建重组质粒pMDL7/L12。

(4)重组质粒pETL7/L12的构建

用限制性内切酶Nde I与Sal I同时消化pMDL7/L12与pET28 a+，分别凝胶回收纯化L7/L12与线性化的pET28 a+基因片段。用T4连接酶使之连接，而成重组质粒pETL7/L12。

(5)蛋白的SDS-PAGE分析及纯化

将重组表达质粒pETL7/L12转化大肠杆菌LB21(DE3)中，挑取阳性克隆菌在LB培养基中，37℃ 180rpm振荡培养过夜，而后1∶100的比例接种至5mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.38，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导表达4h后收菌。将1.5mL菌液离心取沉淀加入50μL灭菌水和50μL 2×SDS蛋白上样缓冲液，震荡混匀后沸水煮15min后稍离心，取上请20μL进行12％的SDS-PAGE分析。经组氨酸结合树脂柱纯化回收可溶性蛋白，得到高纯度的蛋白，蛋白电泳可见单一蛋白条带。

2、结果

1.L7/L12蛋白纯化后SDS-PAGE检测

将层析纯化的L7/L12蛋白经SDS-PAGE检测可见一清晰条带，经凝胶扫描纯度96％。见附图3。

实施例3

鲁氏菌病高特异性免疫胶体金抗体检测试纸条组装及测试

1、材料方法

(1)材料2992、903、8964型样品垫(sample pad)、Ahlstrom 8964型玻璃纤维膜(conjugate release membrane)、Sartorius CN140、AE99和PRIMA60型硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)、470和2727型吸水垫(absorbent pad)、6cm×30cm、8cm×30cm型PVC底板均为上海金标生物科技有限公司产品。

(2)样品垫的处理

取优质的样品垫浸入0.01mol/L PBS(pH为7.4)加入0.05％的Tween-20配成的溶液中，37℃浸泡30min，取出置常温条件下通风干燥，干燥条件下保存备用。

(3)硝酸纤维膜的处理

将硝酸纤维膜浸入有甲醇溶液内浸泡10min，取0.01mol/LPBS(pH7.4)、BSA、Tween-20、NaCl、蔗糖配置硝酸纤维膜的处理液，调节溶液的最终pH值为6.5左右；将膜37℃浸泡30min，PBS洗涤数次，置于低温条件下风干，彻底干燥。

(4)T线及C线的点膜方法

将纯化好的L7/L12蛋白和羊抗鼠IgG用最佳缓冲液分别稀释至最佳浓度。将稀释好的L7/L12蛋白溶液装入BIODOT划膜机喷头2，固定在距硝酸纤维膜下边缘1.1cm的位置上，稀释好的用兔抗牛IgG(检测牛时)或兔抗羊IgG(检测羊时)装入BIODOT划膜机喷头1，固定在距硝酸纤维膜下边缘1.6cm的位置上。T线与C线间的距离为5.0mm，参数均为1.0μL/cm喷在硝酸纤维膜上。将已喷好的硝酸纤维膜4℃放置待风干后备用。

(5)T线及C线条件的优化

设置几组不同的抗体浓度对硝酸纤维膜的T线(检测线)和C线(质控线)进行优化，选出最优的一组作为金标浓度(T线)和包被浓度(C线)。并对T线与C线喷膜量、喷膜速度等因素进行优化。

(6)试纸条的组装

按照底板上划定的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水纸的尺寸，裁定符合要求的材料和制备相关的金标垫。戴上手套，将包被好的硝酸纤维膜粘到PVC底板上，小心抹平膜面。将金标垫紧靠硝酸纤维膜下边缘粘到PVC底板上。将样品垫一部分重叠在金标垫上一起粘到PVC底板上，并对齐抹平。将吸水纸紧一部分重叠在硝酸纤维膜下边缘粘到PVC底板上，并对齐抹平。用切条机切成3.5mm宽的试纸，在装配区将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内。

2、结果

取一滴待检血清样本滴加在制备好的试纸条的加样区，样品开始在硝酸纤维素膜上扩散，待金标垫释放完全后，硝酸纤维素膜上出现了清晰的T线和C线。见图4。

实施例4

胶体金抗体检测试纸条性能的测定及实践

1、胶体金抗体检测试纸条特异性的测定。

应用制备的胶体金试纸条检测与布氏菌种系较近的几种细菌血清，结果均为阴性，表明与它们之间没有交叉反应，试纸条特异性良好。

2、胶体金抗体检测试纸条敏感性

免疫25只小鼠制备的牛布氏菌S19阳性血清，用ELISA检测其平均效价约为1:6400；虎红平板凝集抗原在血清稀释度低于50倍时检测呈阳性；胶体金试纸条能检测到阳性结果的血清效价为1:4000，血清稀释度超过4000倍时，试纸条检测显色不清晰；胶体金试纸条的灵敏度显著高于虎红平板凝集抗原试验但低于ELISA。

3、胶体金抗体检测试纸条重复性

进行3次重复试验，检测结果相一致，说明该方法具有可重复性。

4、胶体金抗体检测试纸条稳定性

4℃放置的布病胶体金检测试纸条定期以标准阳性样本检测，结果显示60天以前的均呈稳定的阳性反应；100天后，金释放速度开始减慢，并开始出现金释放不完全，层析速度也有所减缓。在室温放置90天，检测线显色不清晰。

5、样本检测

对接种小鼠血清检测 用ELISA试验和制备的胶体金试纸条进行鉴别试验结果，结果显示两种检测方法的符合率为100％，表明建立的胶体金试纸条

对病料检测 从牛场采集的89份牛血清，用虎红平板凝集试验检测有13份为阳性，4份为疑似布病感染；用制备的胶体金试纸条进行布氏菌抗体检测有15份为阳性，结果显示两种检测方法的符合率为86.4％；其中虎红平板凝集试验检测为阳性的血清用试纸条检测全部为阳性，两者的符合率为100％。

Claims (2)

1、一种布鲁氏菌抗体免疫胶体金检测试纸条，特征在于：以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)标记胶体金制作金标垫，以布鲁氏菌L7/L12蛋白包被硝酸纤维膜作为检测抗原线(T)，用兔抗牛IgG或兔抗羊IgG作为质控线(C)。

2、权利要求1所限定的胶体金试纸条制备方法，主要包括以下步骤：

(1)用SPA标记胶体金，制备成胶体金探针，把它喷在玻璃纤维膜上制成胶体金垫；

(2)设计一对引物，以牛布鲁氏菌基因组为模板，用PCR扩增、并纯化出L7/L12基因；

(3)把步骤(2)中所得基因连接到质粒pET-28a的Nde I和Sal I位置上，构建成原核表达重组质粒，转化到大肠杆菌中，表达出L7/L12蛋白；用His-Trp纯出L7/L12蛋白；

(4)用(3)中的纯化的L7/L12蛋白为诊断抗原包被硝酸纤维膜作为本发明胶体金试纸条的检测线(T线)，用兔抗牛IgG(检测牛时)或兔抗羊IgG(检测羊时)、作为质控线(C线)；

(5)将样品垫、结合垫、硝酸纤维膜、吸水滤纸按从上到下依次固定于PVC板上，制备成检测试纸条。

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