CN104407130A

CN104407130A - 检测羊痘病毒胶体金试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN104407130A
Application number: CN201310594930.XA
Authority: CN
Inventors: 王海艳; 赵治国; 敖威华; 郭铁筝; 潘国卿; 高利; 李刚; 赵林立; 吴绍强; 周艳君
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2013-11-21
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-11-21
Also published as: CN104407130B

Abstract

本发明公开了一种检测羊痘病毒胶体金试纸条及其制备方法，包括：样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和被衬；其中，样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘附于不吸水的支撑薄片上；所述金标结合垫是结合有金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜；在所述硝酸纤维素膜上各有一条由兔抗P32蛋白IgG以及由羊抗鼠多克隆抗体喷制成的检测线和质控线。本发明进一步对制备金标结合垫所用到的封闭液以及制备检测检测线和质控线时所用到的包被缓冲液的组成进行了优化。特异性和灵敏度试验结果表明，本发明检测羊痘病毒胶体试纸条特异性强、灵敏度高。

Description

检测羊痘病毒胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种胶体金试纸条，尤其涉及一种检测羊痘病毒胶体金试纸条及其制备方法，属于羊痘病毒的检测领域。

背景技术

羊痘是由羊痘病毒属的绵羊痘病毒或山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)引起的绵羊或山羊的一种急性、热性、接触性传染病。主要表现为发热，无毛或少毛部位的皮肤或黏膜发生丘疹和疱疹。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，病死率高，造成的经济损失大，严重影响国际贸易和养羊业的发展。此外，本病在公共卫生方面也有重要意义，中国、蒙古、瑞典、印度都有人类感染羊痘病毒的报道，受到世界各国的高度重视，世界各国都严格限制从有本病存在的国家和地区进出口易感动物及其有关的产品。

目前，羊痘的诊断方法主要有血清学诊断方法、分子生物学诊断方法以及病毒培养和电镜观察方法。虽然以上方法的建立在羊痘的预防、诊断和监测中发挥了重要作用，但由于其操作复杂、耗时并且需要特殊的仪器设备而使其在现场检验检疫中受到限制，所以建立快速、敏感、特异并能用于羊痘现场直接检疫的方法迫在眉睫。

免疫胶体金技术在人类医学上是一种常用的免疫标记技术，有其独特的优点，在生物医学各领域中得到了日益广泛的应用。目前该技术在医学检验中的应用主要是胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法，用于检测人类乙肝表面抗原、人绒毛膜促性腺激素、艾滋病病毒等。近几年随着该技术的不断发展，已在兽医临床上得到了广泛应用。免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物，应用于抗原抗体反应中的一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒之间因静电作用形成一种稳定的胶体状态，也称金溶胶。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合，因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，在显微镜下金标蛋白结合处，可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测。

胶体金免疫层析技术具有简单、快速、灵敏、可现场操作等优点，本研究拟应用胶体金免疫层析技术，建立羊痘病毒快速检测试纸条，为羊痘病毒的检测提供特异性强、灵敏度高、方便快捷的方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测羊痘病毒胶体金试纸条；

本发明的目的之二是提供一种制备检测羊痘病毒胶体金试纸条的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先提供了一种检测羊痘病毒胶体金试纸条，包括：样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和被衬；其中，样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘附于不吸水的支撑薄片上；所述金标结合垫是结合有金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜；在硝酸纤维素膜上各有一条由兔抗P32蛋白IgG喷制成的检测线以及由羊抗鼠多克隆抗体喷制成的质控线，其中检测线靠近金标结合垫，质控线靠近吸收垫。

硝酸纤维素膜的种类对于检测结果的特异性、灵敏度、显色带宽度及背景颜色等方面有显著的影响，为了提升检测的特异性、灵敏度并便于观察，本发明分别考察了不同种类的硝酸纤维素膜对于检测结果的影响，最终发现，Millipore HF135膜在流速、特异性、灵敏度、显色带宽度及背景颜色等方面都比较适合，尤为重要的是其在层析反应中性能良好；因此，本发明优选Millipore的Miliipore HF135膜作为本发明检测羊痘病毒胶体金试纸条的硝酸纤维素膜。

检测线和质控线的间隔优选为3.0-10.0mm,优选为5.0mm。

所述的背衬可以是PVC板、木板、金属板等各种不吸水的具有支撑作用的薄片。

本发明的另外一个目的是提供一种制备所述检测羊痘病毒胶体金试纸条的方法，该方法包括：

（1）制备金标结合垫：将玻璃纤维膜用封闭液封闭；将金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体稀释后涂覆于用封闭液封闭的玻璃纤维膜上，干燥后备用；

（2）制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素：将兔抗P32蛋白IgG以及羊抗鼠多克隆抗体分别用包被缓冲液稀释后喷印在硝酸纤维素膜上形成检测线和质控线，干燥后备用；

（3）制备样品垫：将玻璃纤维膜用封闭液封闭后，干燥即得；

（4）将样品垫、金标结合垫、含有检测线和质控线的硝酸纤维素和吸收垫依次粘帖在被衬上。

封闭液在胶体金快速检测方法的建立过程中非常重要，封闭液中往往添加一些高分子物质或者表面活性剂。封闭液的组成及用量直接影响着检测的特异性和灵敏度。本发明考查了不同组成及用量的封闭液对试纸条反应速度、膜的背景颜色、金标水化均匀度、特异性和灵敏度等方面的影响，以从中选择出最佳的封闭液组成；本发明通过实验发现，金标水化均匀度主要和吐温-20的添加量有关，吐温-20的添加浓度大，则均匀度好，反之均匀度变差；而随着PEG20000的添加，反应的灵敏度也增加，但是同时也会对特异性产生负面的影响；而PVP K30在封闭液中主要起到提高反应的特异性的作用，但是高浓度的PVP K30却会引起反应速度减慢、膜的背景颜色加深和反应灵敏度降低等。通过综合分析比较，本发明最终发现，采用下述成分作为本发明的封闭液具有最佳的检测效果：10mM pH7.4 PBS+2%BSA+0.5%PVP K30+1.0%Tween-20+0.02%NaN₃。

包被缓冲液的种类及用量对于检测的特异性和灵敏度均有非常显著的影响，为了筛选获得合适的包被液，本发明使用含有0.5%Tween-20的两种包被缓冲液(10mM pH7.2 PBS+0.5%Tween-20，10mM pH7.2 PBS+3%Methanol+0.5% Tween-20)包被兔抗羊痘病毒IgG时，检测带均不显色；使用另外几种包被液(10mM pH7.2 PBS+3%Methanol+1% BSA、10mM pH7.2 PBS+3%Methanol+1%Suerose、10mM pH7.2 PBS+1%sucrose、10mM pH7.2 PBS+1%BSA)时，可以在一定程度上提高检测的特异性，但是同时降低了灵敏度，使检测带显色变浅，不利于结果的判断；使用10mM pH7.2 PBS作为包被液时，检测带颜色深，但是带太宽且边缘粗糙，也不利于试纸条的制作；而使用10mM pH7.2 PBS+3%Methanol作为包被液时，检测带颜色深、均匀清晰、灵敏度高且宽度适中，所以经综合比较，本发明优选采用10mM pH7.2 PBS+3%Methanol作为最佳的包被缓冲液。

本发明检测羊痘病毒胶体金试纸条的判定标准：当试纸条的质控线和检测线同时出现肉眼可见的紫红色条带，结果判为阳性，记为“+”；若仅在质控线出现而检测线不出现紫红色条带，结果判为阴性，记为“-”；两条线均不出则判为检测试纸条失效。

本发明检测羊痘病毒胶体金试纸条特异性和灵敏度试验结果表明，本发明试纸条特异性强、灵敏度高。

附图说明

图1为本发明的检测羊痘病毒胶体金试纸条的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

预备实施例1兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的制备

1材料和方法

1.1载体、菌株

表达载体pET-21a质粒以及表达菌株Rosetta(DE3)购自上海基音生物有限公司。

1.2主要试剂

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Ex Taq酶、T₄DNA连接酶及BamH I和XholI限制性内切酶均购自Takara公司。质粒DNA提取试剂盒与胶回收试剂盒购自Takara公司。His-tag Column亲和纯化柱购自Sigma公司。LB培养基购自北京陆桥公司。葡聚糖凝胶(SePhadex G200)层析柱和PEG-20000购自上海化学试剂厂。弗氏完全佐剂(CAF)和弗氏不完全佐剂(IAF)购自GIBCO公司。硫酸铵购自中国金山化工厂。

1.3溶液的配制

磷酸盐缓冲液(PBS)：取0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液40.5mL与9.5mL0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液混和，加入8.2g NaCl，用双蒸水定容至1000mL即为0.01mol/L pH7.4的PBS。

饱和硫酸铵溶液：取双蒸水500.0mL，加热至80℃，称取400.0g(NH₄)₂SO₄缓慢加入水中并不断搅拌，直到(NH₄)₂SO₄完全溶解且溶液变澄清透明后，置4℃过夜至结晶析出，用前取上清，用氨水将pH调至7.0。

氯化钡溶液(2%)：取0.2g BaCl₂溶于10.0mL双蒸水。

磺基水杨酸(20%)：2.0g磺基水杨酸溶于10.0mL双蒸水。

1.4开放阅读框的选择与引物设计合成

根据GeneBank发布的山羊痘病毒P32基因序列（登陆号为AY881707.1），选取其中67-543部分序列，上游加限制性内切酶BamH I酶切位点，下游加XholI限制性内切酶酶切位点，序列全长477bp（SEQ ID No.1），利用Oligo 6.0软件设计了扩增此片段的一对引物，上游引物为5’- TTAAAAAGTGGCAATGATAT-3’，下游引物为5’- ATATCCCCCTGTGTACGAAT-3’，（斜体字为酶切位点和保护碱基）。

1.5表达载体的构建及鉴定

提取山羊痘病毒DNA，PCR扩增后经BamH I/XholI双酶切后回收纯化，将其定向连接到经BamH I/XholI双酶切的pET-21a表达载体中并转化到表达菌株Rosetta(DE3)细胞中，提取质粒经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后，将重组质粒命名为pET-21a-P32。

PCR反应体系为：Ex Taq（5U/μL）0.5μL、10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP（2.5mmol/L）5μL、上下游引物(25nmol/μL)各1μl、模板5μL，加水至50μL；PCR反应条件为：94℃1min；94℃45s，54℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。酶切鉴定反应体系为：10×Buffer for EcoR I2μL,EcoR I和XholI酶各0.5μL，BSA0.5μL，质粒7μL，加水至20μL。

1.6pET-21a-P32重组蛋白的诱导表达和亲和纯化

用阳性重组质粒pET-21a-P32转化表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞，挑取单菌落，加入到10mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜进行增菌。取3mL细菌培养物接种到50mL含氨苄青霉素的LB中，37℃继续培养至OD600为0.6～1.0时加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L。37℃继续培养，于4h后取菌液离心收集细菌沉淀，按照His-tag Column亲和纯化柱的操作说明书进行。

1.7兔抗羊痘病毒P32蛋白多克隆抗体的制备

将表达P32蛋白用His-tag Column亲和纯化后，取500μg纯化蛋白溶于2mL弗氏完全佐剂中,使之充分乳化,皮下多点注射新西兰家兔。加强免疫时用弗氏不完全佐剂,抗原剂量为首次的1/4。每2周～3周加强免疫1次。在第1次加强免疫之后2周,从耳缘静脉取血2mL～3mL，分离血清,间接ELISA法检测抗体效价,至抗体效价达到1:10000以上。2周后取血约50mL,室温凝固后,4℃冷藏4h,离心分离血清，分装小份后于-80℃冷东保存。

1.8兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的提取及纯化

1.8.1兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的提取

20.0mL血清与等量生理盐水混合后，持续搅拌下逐滴加入饱和(NH₄)₂SO₄溶液40.0mL，使成50%饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液；4℃放置30min后取出，4℃下3000r/min离心30min，弃上清；沉淀用40.0mL生理盐水溶解后，缓慢加入20.0mL饱和(NH4)₂SO₄溶液，使成33%饱和度的(NH₄)₂SO₄溶液；4℃放置30min后取出，4℃下3000r/min离心30min，弃上清；沉淀重复进行上述操作后，将沉淀溶于2.0mL生理盐水(原血清量的1/10)，装入透析袋内对生理盐水透析除盐，用2%BaCl₂溶液检测(NH₄)₂SO₄是否已被透析完全；透析完全后，蛋白溶液用PEG-20000浓缩至适当体积，4℃下12000r/min离心10min，收集上清，核酸蛋白测定仪测定其蛋白含量，即得到粗提的IgG。

1.8.2兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG的纯化

对粗提后的兔抗羊痘病毒P32蛋白lgG分别用葡聚糖凝胶(SePhadex G200)层析柱过滤纯化。根据样品容积及柱管的比差，按如下公式计算确定柱床的体积。

Vt=∏r²h

(Vt-柱床的体积;∏-圆周率;r-半径;h-柱床高)

纯化的具体过程如下:

称取2.5g Sephadex G200倒入数倍体积的蒸馏水混合均匀，置室温浸泡3天，其间每天换水2次，每次换水时慢慢将上层含漂浮颗粒的部分倒掉后，再加入原体积的蒸馏水，浸泡好后置4℃冰箱保存。

将清洁层析柱垂直固定于实验架上，在橡胶塞上加与之大小相当的定量滤纸片，加少量洗脱液(0.01 mol/L，pH7.4 PBS)，检查出液管畅通后，关闭下口。从4℃冰箱取出溶胀好的Sephadex G200，平衡到室温后灌装层析柱，在凝胶的上方留出1cm-2cm高的液层，以备加样。在装好的层析柱凝胶上轻轻放上与管内径相等的圆形定量滤纸片并用0.01mol/L pH7.4的PBS洗脱过夜。

次日将柱中的蓄液放出，待液面与滤纸片持平时，立即关闭下口，用吸管吸取样品，在接近滤纸处沿管壁流下，取少许生理盐水冲洗样品瓶，将洗瓶液加入，最后用洗脱液冲洗管壁上样品流经的路线。随即打开下口，当样品全部进入柱床刚露出滤纸时，立即加入洗脱液，使柱床上部形成5cm～10cm厚的液层。样品上柱后，不时以20%磺基水杨酸液测试，发现有轻微乳浊状反应时，用事先编号的1.5mL EP管收集流液，每管10滴，直到用20%磺基水杨酸检测不出现浑浊为止。用核酸蛋白测定仪测定每管蛋白质含量，以管编号为横坐标，蛋白质含量为纵坐标绘制曲线图，将蛋白质含量在曲线峰值的瓶内溶液合并在一起，装入透析袋，用PEG-20000浓缩至适当体积。4℃下12000r/min离心10min，收集上清，用核酸蛋白测定仪测定含量，作好标记，置-20℃冻存。

预备实施例2抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的制备

1材料和方法

1.1材料

1.1.1抗原

山羊痘病毒P32表达蛋白制备及纯化方法见预备实施例1。

1.1.2细胞、实验动物

BALB/c小鼠、鼠源单抗亚类鉴定试剂盒和SP2/0骨髓瘤细胞购自上海吉尔生化有限公司。

1.1.3试剂和培养基

RPMI-1640、新生小牛血清(超级)、HAT盐(100×)、HT盐(100×)、羊抗鼠IgG-HRP、青、链霉素购自GIBCOL公司；融合剂50%PEG、淋巴细胞分离液、秋水仙素、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

1.1.4主要溶液的配制

1640基础培养基：RPMI-1640粉剂一袋，补加2.0g碳酸氢钠(NaHCO₃)，于1000mL容量瓶内用三蒸水溶解，在即将定容前摇匀并用1.0mol/L HCL调节pH至7.0-7.2后定容至1000mL，过滤除菌。

完全培养基:1640基础培养基补加20%新生牛血清和1.0%双抗。

双抗贮存液(100×)：将青、链霉素分别用无菌水溶解配制成含10000U/mL青霉素和10000U/mL链霉素的贮存液，于-20℃保存。

HAT选择培养基：完全培养基补加1.0%商品化HAT。

HT选择培养基：完全培养液补加1.0%商品化HT。

50倍8-杂氮鸟嘌呤溶液：8-杂氮鸟嘌呤10mg，1.0mol/L NaOH 2mL，用无菌三蒸水定容至10mL。

8-杂氮鸟嘌呤筛选培养液：50倍8-杂氮鸟嘌呤溶液2mL，用完全培养液加至100mL。

细胞冻存液：新生牛血清和二甲亚矾(DMSO)按9:1混合。

1.2方法

1.2.1动物免疫

分别取适量经His-tag Column亲和纯化的P32表达蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔14d加强1次，换用弗氏不完全佐剂乳化。最后于融合前3d(72h)腹腔强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

1.2.2SP2/0骨髓瘤细胞的活化

将细胞瓶中培养的SP2/0细胞，离心后用0.5mL 1640基础液悬浮(0.5×10⁶～1×10⁶个细胞)注射BALB/c小鼠背部皮下。待肿瘤生长后，根据肿瘤大小选择制备瘤细胞的时间。

1.2.3单克隆抗体的制备

1.2.3.1饲养细胞的制备

取1只未免疫的BALB/c小鼠，眼眶放血处死，收集阴性血清，在75%酒精中浸泡5min消毒。将消毒好的老鼠固定于解剖板上，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮肤露出腹膜，换一套镊子和剪刀，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管吸取3.0mL1640液注入小鼠腹腔，轻轻吹吸几次，再将液体转入一无菌50.0mL离心管中，重复一次，此为腹腔巨噬细胞。将小鼠后肢交叉(左后肢在上固定，换1套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连在脾脏上的脂肪组织，剪破脾脏外膜，放入灭菌的匀浆器中。加适量1640基础液于匀浆器中研磨，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加适量1640基础液，静置2min，吸取上层细胞悬液放入腹腔巨噬细胞离心管中，重复2次。1200r/min离心10min去上清，细胞重悬备用。

1.2.3.2骨髓瘤细胞制备

将背部生长骨髓瘤细胞的小鼠颈椎脱臼法处死。浸泡在75%乙醇内2min～5min消毒皮毛。小鼠背向固定，无菌条件下取出瘤组织，匀浆，用基础培养液20mL悬起。将悬液缓慢加入己有20mL淋巴细胞分离液的离心管内。1,800r/min离心10min,吸取培养液和分离液中间致密的白色细胞层。用基础培养液洗涤细胞两次，用10mL基础培养液重悬细胞，计数备用。

1.2.3.3免疫脾细胞的制备

取1只免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集阳性血清后。按1.2.3.1中脾细胞的制备方法，摘取脾脏，研磨，制备免疫脾细胞悬液。将制备好的脾细胞悬液放入另一支无菌离心管中备用。

1.2.3.4免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞的融合

先将饲养细胞1000r/min离心5min，去掉上清，用适量HAT培养基悬浮，于37℃放置备用。将1×10⁷～2×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞与10⁸个免疫脾细胞(1:10～1:5)于50.0mL离心管中混匀，1500r/min离心10min。弃上清，倒扣在灭菌的滤纸上使管中液体尽量吸干。轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动，将离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%PEG0.8mL，边加边轻轻用吸尖搅拌。继续搅拌1min,然后慢慢加入37℃预温的1640基础液10.0mL。具体方法为:第1min逐滴滴入1.0mL,第2min加1.0mL，第3min～4min加3.0mL，第5min加其余的5.0mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌，最后慢慢加入30.0mL 1640液。1000r/min离心5min，去上清。同上用1640基础液清洗一次后，用HAT培养基悬浮混合的细胞，加入HAT培养基悬浮的饲养脾细胞，根据需要补加适量的HAT培养基，混合均匀，分种于96孔培养板中，约250μL/孔。将细胞融合后培养板置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养，5d后用HAT选择培养液置孔内1/2培养液。此后用HT培养液培养，并逐渐减少HT含量。7～10d后细胞集落在2mm大小时计算融合率(杂交细胞生长孔数/培养孔总数×100%)，准备检测。

1.2.3.5 P32杂交瘤细胞上清的检测

采用间接ELISA方法进行检测:用His-P32和His间隔包被酶联板，用洗涤液洗3次，37℃封闭液封闭1h，洗涤三次，然后加入杂交瘤细胞的培养上清，于37℃温育45min，洗涤液洗3次后，加入1:20倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30min。洗涤3次，加入底物TMB显色，用硫酸终止反应之后，在450nm的波长下测OD值，同时设小鼠阴性和阳性血清对照。OD₄₅₀大于阴性对照2倍为阳性判定标准，His-P32反应阳性而His反应为阴性的孔判为阳性孔，计算阳性率(检到阳性孔数/杂交细胞生长孔数×100%)。

1.2.3.6杂交瘤细胞的克隆化

对细胞上清检测为阳性的杂交瘤细胞采用有限稀释法进行克隆，具体如下:克隆前参照1.2.3.1方法制备小鼠饲养细胞，平铺于细胞培养板中，置培养箱中备用。用剪断尖端的200μL枪头在待克隆孔内吹打数次使细胞重悬，用血球计数板对细胞计数，将细胞用完全培养基稀释到5、50个/mL。将浓度约为5个/mL的细胞加到铺好饲养细胞96孔培养板的前8列，并将浓度约为50个/mL的细胞加到同一块96孔培养板的后4列，每孔100μL，加完置CO₂培养箱培养。培养第4d换液一次，第5d～6d仔细观察各孔内细胞的生长情况，作好标记。待克隆后第7d～9d细胞克隆长满1/4～1/3个视野时，即可检测，计算杂交瘤细胞阳性孔比率(阳性孔数/杂交细胞生长孔数×100%)。如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的细胞孔，继续用同样方法再克隆或扩大培养。阳性孔细胞可移至24孔培养板，并在原孔中补加另一批培养基，以防二者同时污染或细胞死亡。待24孔板中的细胞生长良好时，可转移至细胞培养瓶中培养，并冻存2支以上的细胞。

克隆一般需进行2次以上，直到细胞集落生长孔的阳性率达到100%，则可以认为己得到能分泌单一抗体的单克隆杂交瘤细胞系。

1.2.3.7杂交瘤细胞染色体计数

细胞传代培养48h加入秋水仙素，使其终浓度达0.04μg/mL。继续培养4h，贴壁细胞吹下移入离心管，1200r/min离心10min，弃上清。沉淀细胞用37℃预温的0.075mol/L的KCl低渗溶液5mL重悬，置37℃水浴20min。加入新鲜配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)1mL混匀，1200r/min离心10min，弃上清。加入固定液5mL轻轻混匀,静置30min，1200r/min离心10min，弃上清。再次加入固定液5mL，轻轻混匀，静置30min，1200r/min离心10min，弃上清。再加入固定液5mL，轻轻混匀，封闭管口，4℃静置过夜。上清液约留0.5mL，其余吸去弃掉，混匀细胞悬浮。滴管吸取细胞悬液，滴在己用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即吹散，火焰固定，自然干燥。10%Giemsa染色液染色10min，洗去染液，自然干燥。于显微镜下观察计数。每株细胞计数10个细胞染色体数，算出平均值。

1.2.3.8杂交瘤细胞的冻存与复苏

将待冻存细胞液计数，1200r/min离心10min。沉淀细胞按1×10⁶个/mL 用细胞冻存液悬浮，移入细胞冻存管(1.6mL/管)。冻存管放入小布袋置液氮罐上层气相30min，移入下层气相过夜，再移入液氮。一周及六个月后，冻存管从液氮中取出。立即放入37℃～40℃水浴，迅速融化。冻存管内细胞液移入离心管，加入基础培养液，1200r/min离心10min，弃上清，再加入基础培养液，1200r/min离心10min，弃上清。用完全培养液悬浮，移入细胞培养瓶，置37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。

1.2.3.9单克隆抗体的生产与效价测定

取8～10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL/只，7d～10d后将对数生长期杂交瘤细胞用基础培养液调整细胞密度约10⁷个/mL。腹腔注射杂交瘤细胞0.5mL/只，7d～10d后小鼠腹腔膨大，抽取小鼠腹水，离心取上清，按照1.2.3.5的方法进行效价测定并冻存。

1.2.4单克隆抗体的纯化

采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化:取小鼠腹水10.0mL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心管中，4℃，1800r/min离心20min；取上清液18.0mL，加入36.0mL0.06mol/L醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297μL；继续搅拌10min，然后转入4℃冰箱静置2h，4℃，1500r/min离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤后体积为50mL；加入5.0mL0.1mol/L的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL；4℃冰箱静置2h后，4℃，1500r/min离心30min，弃上清；沉淀用5.0mL0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000mL0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲液充分透析后，再对2000mL蒸馏水透析，最后对3000mL三蒸去离子水透析；然后4℃，1200r/min离心30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。作SDS一PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。

预备实施例3金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的制备

1胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法来制备胶体金，具体操作为：用容量瓶量取100mL的三蒸去离子水，倒入规格为500.0mL的平底烧瓶中，将烧瓶放在磁力加热搅拌器的加热套内，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度，打开加热旋钮，加热至沸腾。加入1.0mL1%HAuCL₄溶液，继续加热2min，然后按表1所示体积一次性迅速加入1%柠檬酸三钠溶液，继续加热。浅黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后2min内逐渐由黄变灰再变黑最后变红或橙红色。待溶液变为亮红色或橙红色后，再继续加热搅拌15min。关掉加热旋扭，自然冷确至室温。

2金标单抗复合物的制备与纯化

于50.0mL的小烧杯中加入20.0mL的胶体金，调pH至8.0，在搅拌的状态下缓慢加入稀释好的1mg/mL的抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体（预备实施例2制备），搅拌30min；加入10%BSA至终浓度为1%，继续搅拌30min；4℃放置2h后，将上述胶体金标记物分装于7.0mL的离心管中，以2000r/min离心15min，吸出上清，弃沉淀；以8700r/min离心45min，弃去上清液，加入标记洗涤液至原体积；再次以10000r/min离心30min，弃去上清液，加入标记洗涤液至原体积；以10000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用1.0mL标记洗涤液重悬，置4℃冰箱备用。

实施例1检测羊痘病毒胶体金试纸条的制备及组装

首先将样品垫(玻璃纤维)和金标结合垫(玻璃纤维)用封闭液（10mM pH7.4 PBS+2%BSA+0.5%PVP K30+1.0%Tween-20+0.02%NaN₃）封闭，于37℃温箱中干燥。用点膜仪将制备好的金标抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体喷于玻璃纤维上，立即放入冷冻真空干燥机中抽干，得到金标结合垫。兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗体（购自SIGMA公司）分别用包被缓冲液（10mM pH7.2 PBS+3%Methanol）稀释后用点膜仪喷涂于NC膜上，间隔5.0mm，作为检测线和质控线，37℃温箱中干燥30min后取出得到含有检测线和质控线的NC膜。

最后将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水纸依次粘帖在塑料底板上。

实验例1检测羊痘病毒胶体金试纸条制备中有关参数的优化实验

1、试剂和材料

氯金酸和羊抗鼠多克隆抗体购自SIGMA公司；兔抗羊痘病毒P32蛋白IgG（预备实施例1制备）、抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体（预备实施例2制备）、金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体（预备实施例3制备）；硝酸纤维素膜、样品垫、金标垫、吸收垫及背衬等层析材料购自Millipore和S&S公司；

2溶液的配制

1%HAuCL₄水溶液的配制：将1.0g氯金酸溶解于三蒸去离子水中，待完全溶解后，用100.0mL容量瓶定容，配成1%的水溶液。将配好的溶液倒在棕色试剂瓶中，于4℃冰箱内保存备用。

柠檬酸三钠水溶液配制：准确称取1.0g二水合柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶解于三蒸去离子水中，待完全溶解后，用100.0mL容量瓶定容，配成1%的水溶液，再用0.22mm滤膜滤器过滤。此溶液现配现用。

0.1 mol/L K₂CO₃的配制：用三蒸去离子水配制，0.22mm膜滤过，置4℃备用，有效期三个月。100.0mL0.1 mol/L K₂CO₃溶液配方：1.38g碳酸钾，三蒸去离子水定容至100.0mL。

10%BSA的配制：用三蒸去离子水配制，0.22mm膜滤过，置-20℃备用，有效期三个月。100.0mL10%BSA溶液配方:10.0g BSA，0.05g叠氮钠(NaN3)，三蒸去离子水定容至100.0mL。

标记洗涤液的配制：含0.1%聚乙二醇20000(PEG-20000)及0.02%叠氮钠(NaN₃)的0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液，0.22mm膜滤过，置4℃备用，有效期三个月。1000.0mL标记洗涤液配方：1.0g PEG-20000，0.2gNaN₃的0.002mol/L pH9.0硼酸缓冲液定容至1000.0mL。

包被缓冲液的配制：含6%甲醇的0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲液为包被缓冲液，0.22mm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。100.0mL含6%甲醇的0.01mol/L pH7.2 PBS缓冲液配方：NaCl 0.8g，KCl 0.02g，Na₂HPO₄.12H₂O 0.29g，KH₂PO₄ 0.02g，甲醇6.0mL，双蒸去离子水定容至100.0mL。

封闭液的配制：2%BSA，1%吐温-20，0.5%聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、2.5%蔗糖，0.02%NaN₃，0.01mol/L pH7.4 PBS溶液，0.22mm微孔滤膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000mL封闭液配方:20.0g BSA，0.2gNaN₃，5.0g PVP K30，25.0g蔗糖，10.0mL吐温-20，0.01mol/L pH7.4 PBS溶液定容至1000mL。

2、实验方法

2.1、硝酸纤维素(NC)膜的选择实验

以金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体和兔抗P32蛋白IgG作为检测试剂。先将兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗体分别用包被缓冲液稀释后，分别包被于不同的硝酸纤维素膜上，即：MilliPore HF075、Millipore HF090、MilliPore HF120、Millipore HF135、Millipore HF180、MilliPore HF240、S&S FF60、S&S FF85、S&S FF120、S&S AE100，于37℃温箱烘干备用；同时将金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体用包被缓冲液稀释后，涂覆于金标垫，37℃烘干备用；将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附于背衬上组装成试纸条，将其插入pH7.4的PBS及稀释后的羊痘病毒液中，观察结果，选取最佳的硝酸纤维素膜。

2.2、包被缓冲液的优化实验

以金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体和兔抗P32蛋白IgG作为检测试剂。将兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗体分别用不同的包被缓冲液(10mM pH7.2 PBS、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol、10mM PH7.2 PBS+1% Sucrose、10mM PH7.2 PBS+0.5%Tween-20、10mM PH7.2 PBS+1%BSA、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol+1%BSA、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol+1%Suerose、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol+0.5%Tween-20)稀释后，包被于硝酸纤维素膜上，37℃烘干，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；同时将金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体也用上述不同的包被缓冲液稀释后，涂覆于玻璃纤维膜表面，37℃烘干，得到金标结合垫；

将玻璃纤维膜用封闭液封闭后得到样品垫；

将样品垫、金标结合垫、含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附于背衬上组装成试纸条，将其插入pH7.4的PBS及稀释后的羊痘病毒液中，观察结果，筛选获得最适的包被缓冲液。

2.3、封闭液的优化实验

封闭液在胶体金快速检测方法的建立过程中非常重要，封闭液中往往添加一些高分子物质或者表面活性剂。本实验以金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体和兔抗P32蛋白IgG作为检测试剂。

先将兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗体分别用包被缓冲液稀释后，包被于硝酸纤维素膜上，37℃烘干，得到含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；；

同时将金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体稀释后，涂覆于按表1中所示不同封闭液封闭后的玻璃纤维膜上，37℃烘干，得到金标结合垫；

将玻璃纤维膜用表1的封闭液封闭后得到样品垫；

将样品垫、金标结合垫、含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附于背衬上组装成试纸条，将其插入pH7.4的PBS及稀释后的羊痘病毒液中，观察结果，筛选最适的封闭液。

表1不同封闭液的配制

3结果与分析

3.1硝酸纤维素(NC)膜的选择结果

结果如表2所示。

表2最适硝酸纤维素膜的选择

从表2中可以看出，膜的层析速度以S&S FF60最快，S&S FF85、S&S AE100和Millipore HF090次之，但是这几种膜均存在灵敏度低，显色带宽的缺点，不适合本发明使用；S&S AE100、S&S FF125、Millipore HF180、Millipore HF240虽然表现出灵敏度较高，但是背景颜色较深，不利于结果的观察，也不适用于本发明使用；而Millipore HF120、Millipore HF135两种膜在流速、特异性、灵敏度、显色带宽度及背景颜色等方面都比较适合，但相比而言，Miliipore HF135的灵敏度最高，尤为重要的是，Miliipore HF135在层析反应中性能良好。经综合比较，本发明检测试纸条中的硝酸纤维素(NC)膜优选采用Millipore的Miliipore HF135膜。

3.2包被缓冲液的优化实验结果

由表3的实验结果可以看出，使用含有0.5%Tween-20的两种包被缓冲液(10mM pH7.2 PBS+0.5%Tween-20，10mM pH7.2 PBS+3%Methanol+0.5%Tween-20)包被兔抗羊痘病毒IgG时，检测带均不显色；使用另外几种包被液(10mM pH7.2PBS+3%Methanol+1%BSA、10mM PH7.2 PBS+3%Methanol+1%Suerose、10mM PH7.2PBS+1%sucrose、10mM pH7.2 PBS+1%BSA)时，可以在一定程度上提高检测的特异性，但是同时降低了灵敏度，使检测带显色变浅，不利于结果的判断；使用10mM PH7.2 PBS作为包被液时，检测带颜色深，但是带太宽且边缘粗糙，也不利于试纸条的制作；而使用10mM PH7.2 PBS+3%Methanol作为包被液时，检测带颜色深、均匀清晰、灵敏度高且宽度适中，所以经综合比较，本发明优选采用10mM pH7.2 PBS+3%Methanol作为最佳的包被缓冲液。

表3包被缓冲液的优化实验结果

3.3封闭液的优化实验结果

按表1方法配制封闭液，本实验对三种封闭液添加物质分别从高中低三种浓度考察了对试纸条反应速度、膜的背景颜色、金标水化均匀度、特异性和灵敏度等方面的影响，以从中筛选出最佳的封闭液组成。

优化实验结果见表4。从表4中可以看出，随着PEG20000的添加，反应的灵敏度也增加，但是同时也会对特异性产生负面的影响；而PVP K30在封闭液中主要起到提高反应的特异性的作用，但是高浓度的PVP K30却会引起反应速度减慢、膜的背景颜色加深和反应灵敏度降低等。

从实验结果可见，5号封闭液（10mM pH7.4 PBS+2%BSA+0.5%PVP K30+1.0%Tween-20+0.02%NaN₃）在反应速度、膜的背景颜色、金标水化均匀度、特异性以及灵敏度等综合性能指标上均显著优于其它的封闭液，因此，本发明优选采用5号封闭液作为制备检测试纸条的封闭液。

表4封闭液的选择

实验例2试纸条特异性和敏感性实验

1试纸条特异性实验

用最佳反应体系制备试纸条，对已知的标准山羊痘病毒液、分离绵羊痘病毒液、兰舌病病毒(BTV)、粘膜病病毒(BDV)液、传染性鼻气管炎病毒（IBRV）液、新城疫（NDV）液、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等进行特异性交叉试验，同时设空白对照。

特异性试验结果表明，只有标准山羊痘病毒液、分离绵羊痘病毒液在试纸条检测线上呈阳性反应，而空白对照、兰舌病病毒(BTV)、粘膜病病毒(BDV)液、传染性鼻气管炎病毒（IBRV）液、新城疫（NDV）液、传染性法氏囊病病毒(IBDV)等均呈阴性反应，重复3次后结果相同，说明本发明胶体金检测试纸条具有较强的特异性。

2试纸条敏感性实验

用PBS对TCID₅₀滴度为10⁷的羊痘病毒作10倍系列稀释，分别用试纸条检测。检测结果发现，当病毒稀释至10^-4时仍呈阳性反应。说明本发明胶体金检测试纸条具有高度的敏感性。

Claims

1.一种检测羊痘病毒胶体金试纸条，包括：样品垫（1）、金标结合垫（3）、硝酸纤维素膜（6）、吸收垫（7）和被衬（2）；其中，样品垫（1）、金标结合垫（3）、硝酸纤维素膜（6）和吸收垫（7）依次粘附于不吸水的支撑薄片（2）上；其特征在于：所述金标结合垫是结合有金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体的玻璃纤维膜；在所述硝酸纤维素膜上各有一条由兔抗P32蛋白IgG喷制成的检测线（4）以及由羊抗鼠多克隆抗体喷制成的质控线（5），其中检测线4靠近金标结合垫3，质控线5靠近吸收垫7。

2.按照权利要求1所述的检测羊痘病毒胶体金试纸条，其特征在于：所述的硝酸纤维素膜为Miliipore HF135膜。

3.按照权利要求1所述的检测羊痘病毒胶体金试纸条，其特征在于：检测线（4）和质控线（5）的间隔为3.0-10.0mm，优选为5.0mm。

4.按照权利要求1所述的检测羊痘病毒胶体金试纸条，其特征在于：所述的背衬是不吸水的具有支撑作用的薄片。

5.按照权利要求1或4所述的检测羊痘病毒胶体金试纸条，其特征在于：所述的背衬是PVC板、木板或金属板。

6.一种制备权利要求1-5任何一项所述检测羊痘病毒胶体金试纸条的方法，包括：

（1）制备金标结合垫：将玻璃纤维膜用封闭液封闭；将金标记抗羊痘病毒P32蛋白单克隆抗体稀释后涂覆于封闭后的玻璃纤维膜上，干燥后备用；

（2）制备含有检测线和质控线的硝酸纤维素：将兔抗P32蛋白IgG和羊抗鼠多克隆抗体分别用包被缓冲液稀释后喷印在硝酸纤维素膜上印制成检测线和质控线，干燥后备用；

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述封闭液为：10mMpH7.4 PBS+2%BSA+0.5%PVP K30+1.0%Tween-20+0.02%NaN₃。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被缓冲液为：10mM pH7.2 PBS+3%Methanol。