CN107727862A - 一种利巴韦林检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利巴韦林快速检测试纸条，该试纸条包括底板、样品垫、吸水纸、NC膜、金标垫。本发明的优点在于利用利巴韦林单克隆抗体制作了特异性强、灵敏度高的快速检测试纸条。制作方法简单，保存时间久。检测时操作方便，可肉眼于5min内直接判断结果，从而得到是否有利巴韦林药物残留的存在。

Description

一种利巴韦林检测试纸条

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利巴韦林检测试纸条。

背景技术

利巴韦林(Ribavirin，Ri)又名病毒唑，是第一个人工合成的 广谱抗病毒药，具有高效性，临床应用于人抗病毒治疗。然而由于其 价格低廉、药效高，畜牧养殖滥用造成残留，最终使得该其通过食物 链进入人体内产生一系列毒副作用，引起免疫系统的损伤和人体致畸。 我国农业部2005年公布第五百六十号号文件《兽药地方标准废止目 录》等法律明确规定了：“禁止利巴韦林及其盐、醇的单、复方制剂 等制剂生产、经营和使用。”

利巴韦林是目前治疗肝炎病毒的重要药物。为防止人类通过食品 性药物残留导致人类对利巴韦林的耐药性，利巴韦林极性强，且结构 与核苷类似，容易受到血浆中的核苷的影响，因此研制出一种灵敏高 效、快速简捷、操作简单、低成本的检测方式势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏高效、快速简捷、操作简单、 低成本的利巴韦林检测试纸条。

一种利巴韦林检测试纸条，包括：底板，在底板上设置有样品 垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；

所述样品垫与吸水纸设置在底板的两端，在样品垫与吸水纸 之间为硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上标记有检测线和质控线； 所述金标垫在样品垫与硝酸纤维素膜之间；

所述质控线靠近吸水纸一侧，检测线靠近样品垫一侧；

所述金标垫带有胶体金颗粒标记利巴韦林单克隆抗体，检测线 为利巴韦林包被原，质控线为羊抗鼠IgG；

所述金标垫通过以下方法制备得到：

(1)将利巴韦林抗体溶液加入胶体金中混匀后静置10min得 到胶体金溶液；

(2)调节胶体金溶液的pH值到7.4后加入封闭液进行封闭， 混匀后静置20min、离心弃上清液，留沉淀；

(3)用胶体金稀释液复融沉淀得到复融金标抗体溶液；

(4)将复融金标抗体溶液喷涂到玻璃纤维布上并烘干最终得 到所述金标垫；

所述玻璃纤维布使用PBS+0.5％吐温+0.5％BSA构成的混合液 浸润液浸润并烘干后制得。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述利巴韦林 抗体溶液的浓度为12.8μg/mL。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述胶体金的 吸收波长为528nm、吸光度为1.26。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述胶体金稀 释液的浓度为胶体金溶液浓度的1/10。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述封闭液为 质量百分比为10％的BSA溶液，其溶剂为蒸馏水。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，金标垫其1/3的 长的一段与样品垫重合。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述底板(7) 为PVC底板，样品垫(1)为经过0.02M PBS浸润均匀并烘干的玻 纤。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述硝酸纤维 素膜的材料为UniSart CN 140。

进一步地，如上所述的利巴韦林检测试纸条，所述PBS+0.5％ 吐温+0.5％BSA构成的混合液其体积比为：PBS占99％，吐温占 0.5％，BSA占0.5％。

有益效果：

本发明的优点在于利用利巴韦林单克隆抗体制作了特异性强、 灵敏度高的快速检测试纸条。制作方法简单，保存时间久。检测 时操作方便，可肉眼于5min内直接判断结果，从而得到是否有利 巴韦林药物残留的存在。

附图说明

图1为本发明利巴韦林检测试纸条结构示意图；

图2为利用本发明利巴韦林检测试纸条检测结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明 中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实 施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的利巴韦林检测试纸条，该试纸条包括PVC底板 7，样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3(nitrocellulose，NC)和吸 水纸6；所述的样品垫1和吸水纸6在底板7两端，金标垫2在样 品垫1下面，金标垫2上带有胶体金标记好的利巴韦林单克隆抗 体，在金标垫2和吸水纸6中间为NC膜3，NC膜3上标记有质 控线5(C)和检测线4(T)，质控线5和检测线4互相平行，且 与试纸条的长相垂直，质控线5靠近吸水纸6方向，检测线4靠 近样品垫1方向，检测线4为利巴韦林包被原，质控线为羊抗鼠 IgG。

具体制备方法如下：

1、胶体金颗粒标记利巴韦林单克隆抗体

选择最大吸收波长为528nm、Abs(吸光度)为1.26颗粒大小 的胶体金，利巴韦林抗体浓度为12.8μg/mL，将利巴韦林抗体溶液 加入胶体金中混匀后静置10min得到胶体金溶液；

给胶体金溶液加入K₂CO₃调节pH值，混匀，静置10min，加 入封闭液封闭混匀后静置20min；离心，8min/10000r，弃上清液， 留沉淀；

用胶体金稀释液复融沉淀得到复融金标抗体。

具体地，所述胶体金稀释液的浓度为胶体金溶液浓度的1/10。

本发明采用吸收波长为528nm、Abs(吸光度)为1.26颗粒大 小的胶体金与利巴韦林单克隆抗体结合其效果最好。

所述胶体金稀释液的配制为：PBS+2％蔗糖+0.5％BSA(体积 比)。

由于传统的蛋白标记方法耗时较长，本发明通过对胶体金的 pH值的调节，氯金酸被还原后，以基础金核(原子金Au)为中心， 在静电的影响下构成的多相不均匀体系，结合方法是静电结合。 采用本发明制备方法在不改变结合效率的同时缩短了标记时间。

2、金标垫的制备

金标垫使用33Glass(北京博尔优生物技术有限公司购买的玻 璃纤维)，处理方法如下：PBS+0.5％吐温+0.5％BSA浸润均匀后， 37℃鼓风烘干过夜，切条为1cm宽度放入装有干燥剂的自封袋中 待用。取烘干后的金标垫利用喷膜仪将复融金标抗体喷涂均匀， 37℃鼓风烘箱2h，后装自封袋待用。

具体地，本发明使用PBS+0.5％吐温+0.5％BSA浸润33Glass 的目的是增加离子浓度，使样品在样品垫上游动速度增加。并且 吐温增加纤维的亲和性，使抗体结合效率更高。

3、试纸条的制作：

底板选用PVC底板，样品垫选用国产玻纤(北京博尔优生物 技术有限公司)，处理方法如下：0.02M PBS浸润均匀后，37℃鼓 风烘箱烘干过夜，切条为1.5cm宽度放入装有干燥剂的自封袋中 待用。

具体的，本发明使用0.02M PBS浸润的目的是增加离子浓度， 使样品在样品垫上游动速度增加。

4、硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)

NC膜的材料使用UniSart CN 140(Sartorius stedim公司)， 需包被C线羊抗鼠IgG抗体，T线选用利巴韦林包被原(实验室 自制)，稀释液使用0.01mol/L的PBS溶液，使用喷膜机包被好 之后，包被宽度为1mm，37℃鼓风机烘干2h取出放入装有干燥剂 的自封袋中待用。

本发明NC膜上点喷检测线(T线)包被抗原蛋白质复合物，控 制线(C线)相应的二抗，经过大量实验，UniSart CN 14更利于本实 验的C、T线蛋白结合固定。

吸水纸选用470paper(北京博尔优生物技术有限公司)，切 为1.5cm宽度放入干燥自封袋中待用。

本发明利巴韦林检测试纸条的检测原理：

如图1所示，当样品从左边的样品垫1加入后，根据渗透作 用，样品从左往右移动。

当样品中不含利巴韦林时，金标垫2中的金标抗体随样品一 起移动到T线4与其上面固定的抗原复合体结合，显示出颜色,剩 余的金标抗体量及金标抗体-抗原复合物与C线5上羊抗鼠结合， 显示出颜色,此时C、T线均显色；

当样品中含有利巴韦林时，利巴韦林首先与金标抗体结合形 成抗原复合物。此时分为两种情况，若利巴韦林的量远远大于金 标抗体的量，金标抗体完全被结合，当样品经过时，金标抗体不 再与T线4上的抗原复合物结合，T线不显色，样品继续移动， 利巴韦林与金标抗体的结合物与C线5上羊抗鼠结合，显示出颜 色；当利巴韦林的量小于金标抗体量的时候，部分金标抗体被利 巴韦林结合，余下的金标抗体与T线4上抗原复合物结合，显示 出较浅的颜色，抗原抗体复合物与C线5上结合，显示出颜色， 形成C线；

若C线不显色，则表示试纸条实效。

检测结果的判定：

如图2所示，加入待测样，无论是否有目标抗原，C线皆显 色；若其中不含目标抗原或含目标抗体小于检测限，则C、T线 皆出线，颜色为红色；若待测样本中含有目标抗原，则目标抗原 通过吸收点的虹吸作用向吸水纸方向移动，由于竞争反应抗原与 胶体金中抗体结合，剩余少部分抗体与检测线上包被原结合，抗 原抗体复合物、金标抗体抗原结合物继续移动至质控线，与其结 合，形成红色质控线。

检测实例一：利巴韦林快速检测试纸条的检测实例

在经检验无利巴韦林的猪尿液中加入不同浓度标准的利巴韦 林，通过利巴韦林快速检测试纸条检测样品中的利巴韦林浓度， 从而验证利巴韦林快速检测试纸条的有效性。

从猪场采集回来的猪尿检验：8000g离心，弃沉淀，取上清液。 并将配置好的1mg/mL的标准利巴韦林逐级配成4ng/mL、3 ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0ng/mL的标准利巴韦林尿液样品。

分别取各浓度的尿样80mL滴到样品垫上，3min以后，5min 以内判断结果。结果显示，检测含有0、1、2、3、4ng/mL的利巴 韦林标准样品的试纸条，NC膜上的质控线皆为红色，0、1、2ng/mL 时检测线出现和质控线颜色相同的红色，表示样品中的含量低于 最低检测限，3ng/mL时检测线比质控线稍浅，4ng/mL时检测线不 显色，质控线仍然为红色，表示样品中的含量高于最低检测限。 因此，利巴韦林快速检测试纸条在检测猪尿过程中，灵敏度可达 到4ng/mL。

根据以上结果可以得到以下结论：本发明的利巴韦林快速检 测试纸条可快速灵敏的检测样品中是否含有利巴韦林。检测结果 可方便清晰判断。

检测实例二：抗病毒药物的交叉反应试验

在经检验无利巴韦林的猪尿中加入0ng/mL和5ng/mL的利巴 韦林标准品和其他抗病毒药盐酸吗啉胍、阿昔洛韦以及利巴韦林 代谢产物2H-1,2,4-三氮唑-3-酰胺和1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酸进行交 叉反应试验，检测方法是用试纸条进行检测，每组重复三次，记录下结果。

单抗与其他药物的交叉反应率

通过检测结果发现，此试纸条的质控线均显色，对利巴韦林 的标准品阳性样品检测不显色，对其他抗病毒药物的阳性样品检 测限均显色，且颜色与质控线相同。

因此，本发明的利巴韦林快速检测试纸条只对利巴韦林标准 品检测有效果，对其他抗病毒药物及代谢产物无交叉反应，特异 性强。且结果易于判断，快速简捷。

假阳性率和假阴性率试验

取已知利巴韦林含量大于5μg/L的猪尿、牛尿和羊尿样品各 10份，用三批实施例1中所述的试纸条进行检测，计算其假阴性 率，结果见表1。取含量小于5μg/L的猪尿、牛尿和羊尿样品各10 份，用三批实施例1中所述的试纸条进行检测，计算其假阳性率， 结果见表2。

表1 假阴性率

表2假阳性率

结果表明：用三批试纸条利巴韦林的浓度小于5μg/L猪尿、牛 尿和羊尿样品时，结果全为阴性，假阳性率为0。可知试纸条阴性符 合率为100％。

用三批试纸条利巴韦林的浓度大于5μg/L猪尿、牛尿和羊尿样 品时，结果全为阳性，假阴性率为0。可知试纸条阳性符合率为100％。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而 非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领 域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技 术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修 改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方 案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种利巴韦林检测试纸条，其特征在于，包括：底板(7)，在底板(7)上设置有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水纸(6)；

所述样品垫(1)与吸水纸(6)设置在底板(7)的两端，在样品垫(1)与吸水纸(6)之间为硝酸纤维素膜(3)，在硝酸纤维素膜(3)上标记有检测线(4)和质控线(5)；所述金标垫(2)在样品垫(1)与硝酸纤维素膜(3)之间；

所述质控线(5)靠近吸水纸(6)一侧，检测线(4)靠近样品垫(1)一侧；

所述金标垫(2)带有胶体金颗粒标记利巴韦林单克隆抗体，检测线为利巴韦林包被原，质控线为羊抗鼠IgG；

所述金标垫(2)通过以下方法制备得到：

(1)将利巴韦林抗体溶液加入胶体金中混匀后静置10min得到胶体金溶液；

(2)调节胶体金溶液的pH值到7.4后加入封闭液进行封闭，混匀后静置20min、离心弃上清液，留沉淀；

(3)用胶体金稀释液复融沉淀得到复融金标抗体溶液；

(4)将复融金标抗体溶液喷涂到玻璃纤维布上并烘干最终得到所述金标垫；

所述玻璃纤维布使用PBS+0.5％吐温+0.5％BSA构成的混合液浸润液浸润并烘干后制得。

2.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述利巴韦林抗体溶液的浓度为12.8μg/mL。

3.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述胶体金的吸收波长为528nm、吸光度为1.26。

4.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述胶体金稀释液的浓度为胶体金溶液浓度的1/10。

5.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述封闭液为质量百分比为10％的BSA溶液，其溶剂为蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，金标垫其1/3的长的一段与样品垫重合。

7.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述底板(7)为PVC底板，样品垫(1)为经过0.02M PBS浸润均匀并烘干的玻纤。

8.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜的材料为UniSart CN 140。

9.根据权利要求1所述的利巴韦林检测试纸条，其特征在于，所述PBS+0.5％吐温+0.5％BSA构成的混合液其体积比为：PBS占99％，吐温占0.5％，BSA占0.5％。