CN108956992A - 一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法，包括采用碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺，偶联带羧基水溶性Cd Se/ZnS量子点和利巴韦林抗体、结合垫的制备、包被硝酸纤维素膜、样品垫的制备和试纸的组装等步骤；本发明制备的基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条使用方便，可快速、准确、灵敏地检测鸡肉中利巴韦林。

Description

一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，尤其涉及一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法。

背景技术

利巴韦林属于高效广谱核苷酸类抗病毒药物，是临床常用药物，易使机体产生耐药性，使病毒发生变异，长期使用对人体产生遗传毒性、生殖毒性和致癌性等。

利巴韦林应用动物病毒性疫病的治疗和预防，在饲养过程中违规使用利巴韦林严重影响了食品安全。2005年农业部公告明确规定禁止利巴韦林等抗病毒作为兽药销售和使用。美国FDA也明令禁止利巴韦林、金刚烷胺等抗病毒药物用于动物饲养过程中。目前，国内外尚无关于检测利巴韦林残留的标准方法。免疫层析法以其操作简便，耗时短，成本低，无需专业的技术人员等优点，更适用于大量样品的现场筛选，弥补了仪器分析的缺点。

免疫层析法的标记物主要有胶体金、上转换材料和量子点(Quantum Dots，QDs)、纳米磁性颗粒等材料。胶体金试纸条灵敏度不够高，而纳米磁性颗粒试纸条读数设备需要昂贵的仪器和磁信号阅读装置来进行信号读出，且灵敏度有限。上转换材料需要红外线对样品进行照射，而红外线对样品本身的影响未知。上述缺点都导致了传统的标记材料无法满足检测需求。量子点又称半导体纳米晶，一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长、无非特异性等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。

发明内容

本发明从利巴韦林的分子结构出发，合成了利巴韦林抗原，制备了灵敏度高的单克隆抗体，并基于相应的单克隆抗体开发了高灵敏度的量子点标记试纸条产品，本发明制备的基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条使用方便，可快速、灵敏地检测鸡肉中利巴韦林。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，偶联带羧基水溶性Cd Se/ZnS量子点和利巴韦林抗体：将50μl 1～10μM的QDs和100μl 0.5～2mM的EDC室温下搅拌反应10min，然后加入0.1～2mM的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸和200μl～1ml 0.2mg/ml利巴韦林单克隆抗体，室温下反应2小时，12000rpm离心10min后，弃掉上清，沉淀用含0.01M PH8.0的硼酸盐缓冲液重悬，硼酸盐缓冲液中含有质量终浓度为0.1～1％BSA、0.1～3％蔗糖、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮，4度冰箱备用；

(2)结合垫的制备：将切割好的玻璃纤维浸泡在0.02M PH7.0～8.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.5％吐温-20和0.1～5％蔗糖，37℃下过夜干燥，然后将上述(1)制备好的标记物稀释至适当浓度喷在处理好的结合垫上，25℃过夜干燥备用；

(3)包被硝酸纤维素膜：将利巴韦林抗原和羊抗小鼠抗体使用划膜仪划膜包被于硝酸纤维素膜检测区和质控区，37℃过夜干燥备用；

(4)样品垫的制备：利用pH为7.4、摩尔浓度为0.02M的磷酸缓冲液浸泡玻璃纤维样品垫，37℃过夜干燥，切割备用；缓冲液中，含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.1％吐温-20、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮；

(5)试纸的组装：按样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，切割、包装。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明提供了一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条，用荧光强度高于普通荧光素数十倍的量子点代替传统的胶体金作为标记物，与利巴韦林单克隆抗体偶联，使试纸条的灵敏度达到1ng/g。并且由于量子点标记物与抗体的偶联方式，降低了试纸的非特异性吸附。同时，通过对量子点结合物和结合垫的处理使试纸条稳定性良好。

2、该试纸检测快速、灵敏度高、操作简单、特异性强，可实现大量样本的快速筛查，在食品药品监管中具有重要意义。

附图说明

图1是本发明的实施例的结构示意图；

1.PVC底板；2.样品垫；3.结合垫；4.测试线(T线)；5.控制线(C线)；6.NC膜(硝酸纤维素膜)；7.吸水滤纸；8.样品；9.层析方向。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结果具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

本发明提供了一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，偶联带羧基水溶性Cd Se/ZnS量子点和利巴韦林抗体：将50μl 1～10μM的QDs和100μl 0.5～2mM的EDC室温下搅拌反应10min，然后加入0.1～2mM的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸和200μl～1ml 0.2mg/ml利巴韦林单克隆抗体，室温下反应2小时，12000rpm离心10min后，弃掉上清，沉淀用含0.01M PH8.0的硼酸盐缓冲液重悬，硼酸盐缓冲液中含有质量终浓度为0.1～1％BSA、0.1～3％蔗糖、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮，4度冰箱备用；

(2)结合垫的制备：将切割好的玻璃纤维浸泡在0.02M PH7.0～8.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.5％吐温-20、0.1～5％蔗糖，37℃过夜干燥，然后将上述(1)制备好的标记物稀释至适当浓度喷在处理好的结合垫上，25度过夜干燥备用；

(3)包被原的制备：利巴韦林抗原和羊抗小鼠抗体用PBS分别稀释至0.2～0.5mg/ml和0.1～0.4mg/ml(PBS的配制：氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水磷酸氢二钠3.63g，磷酸二氢钾0.24g，蒸馏水定容至1升)，用划膜仪划膜包被于硝酸纤维素膜检测区和质控区，37℃过夜干燥备用；

(4)样品垫的制备及试纸的组装：利用pH为7.4、摩尔浓度为0.02M的磷酸缓冲液浸泡玻璃纤维样品垫，37度过夜干燥，切割备用；缓冲液中，含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.1％吐温-20、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮。按样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，切割成4mm宽的试纸条、包装。

以下为本发明试纸条的应用试验例

(1)样品制备方法

称取2g鸡肉样品于10ml离心管中，加入2～8ml1％三氯乙酸-甲醇溶液(1:1，v/v)，充分涡漩混匀，超声提取10～20min，于8000r/min离心10min，取上清液，加入2～4ml正己烷涡漩混匀，于8000r/min离心10min，去除正己烷层后，50度氮气吹干，用300μlPBS溶解后分析。

(2)试纸条的检测方法

用刻度吸管吸取混合均匀的待检样品，滴加2滴于样品垫上，反应10min后，用量子点检测仪观察结果。

结果判定：

阴性：T线(检测线，靠近样品溶液的一端)比C线(对照线)深或一样深，判断为阴性，表示样品中利巴韦林浓度低于检测限或不含利巴韦林残留。

阳性：T线比C线浅，或T线无显色，判断为阳性，表示样品中利巴韦林浓度高于检测限，利巴韦林浓度越高，检测线显色越浅。

无效：C线未显色，表明不正确的操作过程或检测条已失效。

(3)试纸检测限确定

称取2g空白鸡肉样品于10ml离心管中，在鸡肉中添加利巴韦林标准品，并使其终浓度分别为0ng/g、0.5ng/g、1ng/g、2ng/g，按上述(1)的样品制备方法处理样本后检测，每个浓度重复5次，结果如下表1：由表1结果可见，试纸条对鸡肉样本的检测限为1ng/g。

表1鸡肉样品的检测结果

注：“-”：代表检测结果为阴性；“+”：代表检测结果为阳性。

(4)性能指标

灵敏度：应用本实施例，利巴韦林浓度在1ng/g以上为阳性。

使用目的：本品用于鸡肉中利巴韦林的现场快速筛查，保障食品安全。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于量子点荧光的利巴韦林检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，偶联带羧基水溶性Cd Se/ZnS量子点和利巴韦林抗体：将50μl 1～10μM的QDs和100μl 0.5～2mM的EDC室温下搅拌反应10min，然后加入0.1～2mM的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸和200μl～1ml 0.2mg/ml利巴韦林单克隆抗体，室温下反应2小时，12000rpm离心10min后，弃掉上清，沉淀用含0.01M PH8.0的硼酸盐缓冲液重悬，硼酸盐缓冲液中含有质量终浓度为0.1～1％BSA、0.1～3％蔗糖、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮，4度冰箱备用；

(2)结合垫的制备：将切割好的玻璃纤维浸泡在0.02M PH7.0～8.0的磷酸缓冲液中，缓冲液中含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.5％吐温-20和0.1～5％蔗糖，37℃下过夜干燥，然后将上述(1)制备好的标记物稀释至适当浓度喷在处理好的结合垫上，25℃过夜干燥备用；

(3)包被硝酸纤维素膜：将利巴韦林抗原和羊抗小鼠抗体使用划膜仪划膜包被于硝酸纤维素膜检测区和质控区，37℃过夜干燥备用；

(4)样品垫的制备：利用pH为7.4、摩尔浓度为0.02M的磷酸缓冲液浸泡玻璃纤维样品垫，37℃过夜干燥，切割备用；缓冲液中，含有质量终浓度为0.2～1％BSA、0.05～0.1％吐温-20、0.5～1％聚乙烯吡咯烷酮；

(5)试纸的组装：按样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺序粘附于支撑底板上组装试纸，切割、包装。