CN110940806B - 腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用 - Google Patents

腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条及其制备方法和应用，所述试纸条包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体。本发明试纸条以量子点作为示踪物，利用免疫层析技术和双抗体夹心原理，结合量子点的荧光特性，实现了采用量子点免疫层析的方法对腺病毒抗原、轮状病毒抗原进行灵敏、快速、特异、简便的联合检测，且应用范围广。

Description

腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用。
背景技术
人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)是一种分布十分广泛的具有双螺旋DNA基因组的病毒，属腺病毒科。轮状病毒和腺病毒的混合感染最为常见，是一个不容忽视的问题。人轮状病毒(Human rotavirus，HRV)最早是在20世纪由Bishop在澳大利亚腹泻儿童的肠活检上皮细胞内发现，由于形状似车轮而得此名。根据抗原性的不同可将轮状病毒划分为A-G7个组，当前人们关注的重点仍是A组HRV引起的重症腹泻，是造成发展中国家5岁以下婴幼儿腹泻死亡的主要原因，在幼儿病毒感染中，腺病毒仅次于轮状病毒。
目前，腹泻相关病毒的实验室检测方法主要包括:电镜法、病毒分离培养法，免疫学和分子生物学检测。其中电镜观察、细胞培养等检测方法由于操作复杂，耗时长，已不能满足要求；PCR技术检测相对费时费力，自动化检测仪器昂贵，不适合单人份和较小批量检测用，因此限制了它们在基层医院、诊所的应用。近年来出现了胶体金免疫层析法来联合检测腺病毒和轮状病毒，快速，便捷，单人份操作，但是胶体金试条检测样品只能定性，不能定量，且灵敏度低。因此，发展一种快速，敏感和精确的方法来同时检测腺状病毒和轮状病毒迫在眉睫。
量子点(quantum dot)是在把激子在三个空间方向上束缚住的半导体纳米结构。量子点的制造方法可以大致分为三类：化学溶液生长法，外延生长法，电场约束法。量子点的激发光谱较宽，可用一种激发波长激发多种不同发射波长的量子点；荧光半峰宽比较窄，可以减少不同荧光发射光谱之间的重叠，降低它们之间的干扰；目前，已出现了将量子点作为生物荧光标记，应用于活细胞体系的标记检测等技术，掀起了量子点的研究热潮。量子点免疫层析技术利用层析和荧光检测的原理，通过制成条状结构，可随时随地随身携带，对样品进行检测，在紫外线灯光或专用设备照射激发后，出现肉眼可见的反应条带，具有结构简单、灵敏度高、检测快速以及使用方便等的特点。
目前，尚未见基于量子点标记联合检测腺病毒抗原和轮状病毒抗原的相关产品。
发明内容
本发明旨在提供一种腺病毒和轮状病毒量子点联检试纸条及制备方法和应用。该试纸条能够实现对腺病毒和轮状病毒的同时快速、准确的检测，且经过改进，灵敏度和稳定性更高。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条，包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体。
进一步地，所述量子点为羧基水溶性量子点或聚乙二醇功能化水溶性量子点，粒径12nm-18nm，最大发射波长在600-630nm，激发波长450nm。
进一步地，所述被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体采用量子点复溶液稀释后再按一定比例混合后包被到结合垫上。
进一步地，所述量子点复溶液为含有松二糖2-15wt％、吐温-60 0.01-0.15wt％、氨基乙酸0.1-1.5wt％、庆大霉素0.5-2.5wt％和ProClin 200 0.02-0.15v％的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M，pH为7.2。
进一步地，所述样本垫经样本垫处理液处理后，烘干制得。
进一步地，所述样本垫处理液为含聚乙烯吡咯烷酮0.1-1wt％、聚乙二醇-6000.5-3wt％、Triton-100 0.5-3wt％和乙醇胺0.5-3wt％的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M，pH为7.2。
进一步地，所述硝酸纤维素膜设置有检测线1、检测线2和质控线，所述检测线1上包被有腺病毒捕获抗体，所述检测线2上包被有轮状病毒捕获抗体；所述质控线上包被有羊抗鼠lgG。
本发明另一目的在于提供一种制备上述的腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条的方法，包括以下步骤：
将所述样本垫采用样本处理液处理，烘干；
将腺病毒检测抗体和轮状病毒检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上；将上述量子点采用量子点复溶液稀释后包被到结合垫上；
使用抗体稀释缓冲液分别将腺病毒捕获抗体、轮状病毒捕获抗体以及羊抗鼠IgG抗体稀释后分别包被到硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2和质控线上；
在所述底板上从左往右依次相互交错地贴上样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。
进一步地，所述样本垫处理具体过程为：将样本垫处理液以20-40μL/cm的量喷涂于样本垫上后，室温浸泡1-2小时后，37℃恒温箱烘干16-36h。
进一步地，所述将腺病毒检测抗体和轮状病毒检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上具体过程为：
使用第一缓冲液重悬量子点，加入活化剂活化量子点，室温避光活化反应，其中量子点活化剂的质量比例为1：1-10；
纯化得到的量子点，使用第一缓冲液重悬，再加入腺病毒检测抗体，混匀，其中量子点与腺病毒检测抗体的质量比为1：1-10；
加入封闭液封闭，封闭后再次纯化，使用第二缓冲液重悬量子点，得到量子点标记的腺病毒检测抗体，备用；
按照上述同样的方法将轮状病毒检测抗体标记在量子点上，其中量子点与轮状病毒检测抗体的质量比为1：1-10。
更进一步地，所述活化剂为NHS和/或EDC，量子点活化剂的质量比例为1：0；
更进一步地，所述封闭液为BSA；所述第一缓冲液为MES缓冲液；所述量子点与腺病毒检测抗体的质量比为1：10；所述第二缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
更进一步地，所述量子点与轮状病毒检测抗体的质量比为1：10。
更进一步地，所述将上述量子点采用量子点复溶液稀释后包被到结合垫上具体为：所述量子点标记的腺病毒检测抗体和量子点标记的轮状病毒检测抗体按1:1的体积比混合后，以25μL/cm的量喷涂于结合垫上，室温浸泡，烘干16-36h，干燥后加入干燥剂封存备用。
本发明另一目的在于提供上述试纸条在制备检测或辅助检测腺病毒抗原和轮状病毒抗原试剂盒中的应用。
本发明试纸条检测原理为：待测样本滴加到样本垫上，然后在层析作用下，样本到达结合垫，结合垫上的量子点-腺病毒检测抗体、量子点-轮状病毒检测抗体分别与待测样本中的腺病毒抗原、轮状病毒抗原发生特异性反应，到达检测线1时，量子点-腺病毒检测抗体-腺病毒抗原复合物与检测线1上的腺病毒捕获抗体特异性结合；到达检测线2时，量子点-轮状病毒检测抗体-轮状病毒抗原复合物与检测线2上的轮状病毒捕获抗体特异性结合；之后通过检测试纸条检测线1、检测线2上结合的量子点的荧光效应，定性半定量的测得腺病毒抗原、轮状病毒抗原的阳性率，为疾病的诊断提供依据。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明提供了一种腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条，以量子点作为示踪物，利用免疫层析技术和双抗体夹心原理，结合量子点的荧光特性，实现了采用时间量子点免疫层析的方法对腺病毒抗原、轮状病毒抗原进行灵敏、快速、特异、简便的联合检测，可广泛应用于医院、血站、防疫站、体检等大批量使用单位，也可用于一些农村和基层诊所等小批量或单人份使用的单位使用。
2)本发明通过对比多种试剂配方，筛选出更具有优势的样本垫处理液，经该样本垫处理液处理确保样本垫钝化和稳定。
3)本发明通过对量子点复溶液进行大量的资料调查和实验研究，得到了具有独创性的量子点复溶液，该所述复溶液可确保量子点-抗体的稳定，以及样本垫上量子点-抗体的充分释放，从而显著提高了试纸条的检测性能。
附图说明
图1为本发明试纸条结构示意图。
图中，1底板；2样品垫；3结合垫；4硝酸纤维素膜；401检测线1；402检测线2；403质控线；5吸水垫。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方法，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法,所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中腺病毒抗体和轮状病毒抗体购自珠海博美生物科技有限公司；量子点购自武汉珈源量子点技术开发有限公司。
实施例一、腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条
如图1所示，本实施例提供一种腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条，包括底板1，设置在所述底板上依次搭接的样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，所述结合垫上包被有被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体；所述硝酸纤维素膜设置有401检测线1、402检测线2和质控线403，所述检测线1上包被有腺病毒捕获抗体，检测线2上包被有轮状病毒捕获抗体；所述质控线上包被有羊抗鼠lgG。
其中，在本实施例中，所述样本垫与所述结合垫部分重合，重合部分长度不少于结合垫的1/3；所述结合垫与NC膜有部分重合，重合部分长度为NC膜的1/7-1/8；所述NC膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度为NC膜的1/7-1/8；所述两条检测线和质控线的长度为0.1cm；所述检测线1与检测线2之间，检测线2与质控线之间的距离均为0.5cm。
实施例二、腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条制备方法
(1)样本垫处理：
将样品垫剪切成与结合垫相匹配的合适大小及长度，将每个样本垫用样本垫处理液以40μL/cm的量喷涂于样本垫上后，室温浸泡2小时后，37℃恒温箱烘干不少于16h；其中，样本垫处理液为含聚乙烯吡咯烷酮0.5wt％、聚乙二醇-600 1.0wt％、Triton-100 2.0wt％和乙醇胺0.5wt％的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M，pH为7.2。
(2)结合垫的制备：
①取1mg羧基水溶性量子点，然后将量子点悬浮在800μL的0.05M，pH6.0 MES缓冲液中，该量子点粒径12nm-18nm，最大发射波长在600-630nm，激发波长450nm；
②使用0.05M pH6.0 MES缓冲液配制NHS(50mg/ml)和EDC(50mg/ml)，各取20μl加到量子点中，终浓度是NHS(1mg/ml)和EDC(1mg/ml)；
③活化20min左右后离心洗涤，4℃下16000g，10min×2次，弃上清，最后重悬于800μl 0.05M pH6.0 MES缓冲液中；
④取0.1mg腺病毒检测抗体加入到量子点中，震荡混匀，室温摇床反应3h；
⑤加入BSA(20mg/ml)100μl封闭，室温摇床反应2h；
⑥纯化量子点，使用0.05M Tris-HClpH8.0溶液重悬；
⑦将上述量子点-腺病毒检测抗体复合物用量子点复溶液做适当稀释(1:100)后震荡混匀，得到量子点-腺病毒检测抗体重悬液；所述量子点复溶液为含有松二糖8％、吐温-60 0.01wt％、氨基乙酸1.0wt％、庆大霉素1.5wt％和ProClinTM200 0.05v％的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液浓度为0.01M，pH为7.2；
⑧按照上述同样的方法制备得到量子点-轮状病毒检测抗体重悬液，将量子点-腺病毒检测抗体重悬液和量子点-轮状病毒检测抗体重悬液按1:1的体积比混合均匀得到混合重悬液，将上述混合重悬液按照每25μl一个结合垫的量浸泡玻璃纤维膜，室温下静置20min；
⑨将上述浸泡好的结合垫置于37°恒温箱中过夜，使其彻底干燥，将量子点-抗体固定在结合垫上，待用。
(3)NC膜的制备：
将硝酸纤维素膜膜剪切成与结合垫、样品垫都相匹配的合适大小及长度，并在距离吸水垫端0.5cm处包被浓度为1mg/ml的兔抗小鼠IgG多抗1μg，作为质控线C线；在距离结合垫0.5cm处包被浓度为1mg/ml的腺病毒捕获单抗1μg，作为检测线T1线；在T1线和质控线C线中间部位包被浓度为1mg/ml的轮状病毒捕获单抗1μg，作为检测线T2线。
(4)组装试纸条：在粘性底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫搭接组装，其中，样品垫的右端压住结合垫的左端约0.5cm，结合垫的右端压住硝酸纤维素膜的左端约0.5cm，吸水垫的左端压住硝酸纤维素膜的右端约0.5cm，即组装成为腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条。
实施例三、不同量子点复溶液处理对试纸条检测信号的影响
采用不同的量子点复溶液重悬量子点标记的腺病毒检测抗体和量子点标记的轮状病毒检测抗体，处理1：量子点复溶液为含有松二糖8wt％、吐温-60 0.01wt％、氨基乙酸1.0wt％、庆大霉素1.5wt％和ProClinTM200 0.05v％的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.2)；处理2：量子点复溶液为含有吐温-60 0.01wt％、氨基乙酸1.0wt％、庆大霉素1.5wt％和ProClinTM200 0.05v％的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.2)；处理:3：量子点复溶液为含有松二糖8wt％、吐温-60 0.01wt％、庆大霉素1.5wt％和ProClinTM200 0.05v％的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.2)；处理4：量子点复溶液为含有松二糖8wt％、吐温-60 0.01wt％、氨基乙酸1.0wt％和ProClinTM200 0.05v％的磷酸盐缓冲液(0.01M,pH 7.2)。采用上述不同量子点复溶液按照实施例二所述方法制备得到各组试纸条样品，使用上述制备的各组试纸条样品滴加阴性对照组进行检测，实验结果显示，处理1得到的试纸条信号明显强于其他处理的试纸条，这说明，本发明量子点复溶液可时样本垫上量子点-抗体达到最大程度的充分释放。
实施例四、采用本发明试纸条检测样品方法
取待测样品90-100μl，所述待测样品可以是粪便悬液，加入到样本垫上。在室温放置反应15-20min后，用450nmLED灯照射反应膜，即可肉眼判读结果。
实施例五、应用效果例
用本发明实施例二制备得到的试纸条和腺病毒和轮状病毒抗原胶体金法检测试剂盒检测收集到的270份临床腹泻病人标本，对以上两种检测试剂不一致的检测结果，再用腺病毒和轮状病毒荧光PCR检测试剂盒进行复测，结果如下表1所示：
Figure BDA0002276554450000081
上述胶体金检测出的181份阳性标本(腺病毒72份；轮状病毒109份)，采用本发明实施例二制备的量子点试纸条进行检测结果也为阳性。同时，对本发明实施例二制备的量子点联检试纸检测出阳性而胶体金法检测出阴性结果的44份标本(腺病毒阳性24份；轮状病毒阳性20份)，用腺病毒和轮状病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果为腺病毒阳性21份阳性和轮状病毒阳性18份，经统计学检验后，两种检测方法存在较好的一致性。因此，提示本发明所制备的量子点联检试纸条能够很好的应用于实际样品的检测，甚至其检出率更高，假阴性更少，结果更可靠。
试验3、交叉试验
此外，采用本发明实施例二制备得到的试纸条对12份星状病毒及45份诺如病毒(GI阳性31份；GII阳性14份)阳性标本进行检测，两种试剂检测结果均未出现阳性，说明量子点联检试纸条的特异性较好，与常见的病毒没有交叉反应。
试验4、灵敏度试验
取已鉴定的腺病毒和轮状病毒的细胞物，倍比稀释后，分别用本发明实施例二制备得到的试纸条和市售的腺病毒和轮状病毒抗原胶体金法检测试剂盒，进行检测，结果如下表2所示：
表2检测结果
Figure BDA0002276554450000082
Figure BDA0002276554450000091
从表2看看出，本发明的量子点联检试纸条的灵敏度较高，相比胶体金试纸条高8倍，与现有技术相比取得了显著的进步。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所述技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (5)

1.一种腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条，其特征在于，包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体；
所述硝酸纤维素膜设置有检测线1、检测线2和质控线，所述检测线1上包被有腺病毒捕获抗体，所述检测线2上包被有轮状病毒捕获抗体；所述质控线上包被有羊抗鼠lgG；
所述被量子点标记的腺病毒检测抗体和被量子点标记的轮状病毒检测抗体采用量子点复溶液稀释后再按一定比例混合后包被到结合垫上；
所述量子点复溶液为含有松二糖2-15wt％、吐温-60 0.01-0.15wt％、氨基乙酸0.1-1.5wt％、庆大霉素0.5-2.5wt％和ProClin 200 0.02-0.15v％的磷酸盐缓冲液；
所述样本垫经样本垫处理液处理后，烘干制得；所述样本垫处理液为含聚乙烯吡咯烷酮0.1-1wt％、聚乙二醇-600 0.5-3wt％、Triton-100 0.5-3wt％和乙醇胺0.5-3wt％的磷酸盐缓冲液。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述量子点为羧基水溶性量子点或聚乙二醇功能化水溶性量子点，粒径12nm-18nm，最大发射波长在600-630nm，激发波长450nm。
3.一种制备如权利要求1-2任一所述的腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述样本垫采用样本垫处理液处理，烘干；
将腺病毒检测抗体和轮状病毒检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上；将上述量子点采用量子点复溶液稀释后包被到结合垫上；
使用抗体稀释缓冲液将腺病毒捕获抗体、轮状病毒捕获抗体以及羊抗鼠IgG抗体稀释后分别包被到硝酸纤维素膜的检测线1、检测线2和质控线上；
在底板上从左往右依次相互交错地贴上样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。
4.如权利要求3所述的制备腺病毒和轮状病毒抗原量子点联检试纸条的方法，其特征在于，所述将腺病毒检测抗体和轮状病毒检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上的具体过程为：
使用第一缓冲液重悬量子点，加入活化剂活化量子点，室温避光活化反应；
纯化得到的所述量子点，使用第一缓冲液重悬，再加入腺病毒检测抗体，混匀；
加入封闭液封闭，封闭后再次纯化，使用第二缓冲液重悬量子点，得到量子点标记的腺病毒检测抗体，备用；
按照同样的方法将轮状病毒检测抗体标记在量子点上。
5.如权利要求1-2任一所述的试纸条在制备检测或辅助检测腺病毒抗原和轮状病毒抗原试剂盒中的应用。
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