CN114264820A - 一种流感病毒a型和b型量子点联检试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条及其制备方法和应用。本发明公开了一种以量子点为标记物，可同时检测流感病毒A型和B型的联检试纸条及其制备方法和应用，所述联检试纸条包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有量子点标记的流感病毒A型检测抗体和量子点标记的流感病毒B型检测抗体。本发明以量子点作为标记物，易于与抗体分子偶联，激发后荧光强度高，稳定性强不易衰减，故检测具有更高的灵敏度，便于流感病毒感染的早期筛查。联检试纸条与免疫层析技术相结合可制备成条状结构，配合手持式激发器，适用于现场筛查及床旁检测。

Description

一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，尤其涉及一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

流行性感冒病毒(Influenza virus)，简称流感病毒，是引起流行性感冒(Influenza)的主要病原体。该病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，进一步基于其NP(核糖核蛋白)和MP(基质蛋白)的抗原性的不同分为甲(A)，乙(B)，丙(C)，丁(D)四型(mBio.2014；5(2):e00031-14；JVirol.2015；89(2):1036-42)。流感病毒感染后的临床症状有，急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状等。其传播主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触，或与被污染物品的接触而传播，秋冬季节高发。由于其基因结构、病毒体结构、抗原变异种类和主要感染群体等不同，感染后机体的严重程度都各有不同。人的流感主要是A型和B型流感病毒引起。A型流感病毒最为常见，也容易造成大规模性传染。B型病毒相对只在地区流行，而C型病毒由于抗原性非常稳定所以不太容易广泛传播，它的症状很轻。A型流感病毒常发生抗原的变异，进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型(其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。因此，临床上，病原体的检测，常以检测A和B型流感病毒为主。

流感的确诊有赖于实验室检出流感病毒或其特异性抗体，流感病毒的检测方法包括病毒核酸的检测、病毒的培养分离、病毒特异抗原检测，以及血清学检测病毒特异抗体。前2种均是基于呼吸道标本(鼻、咽拭子、痰、鼻咽或气管吸取物)进行病毒检测；后2种则是通过免疫学检查，间接证明病毒感染。近年，已经开发了多种呼吸道病原体的联合检测平台，但技术平台需要特殊仪器设备和专业人员进行操作，且耗时相对较长，成本较高，难以适用于大规模，以及基层现场的筛查。POCT，即时检验(point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测(bedside testing)，已广泛应用于临床标本的检测中，其中，目前最主流的技术是，以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应的检测技术，但胶体金示踪技术的敏感性较低，广受行业诟病，特别是疾病早期病原体数量较低的情况下，存在漏检的风险。

近年来，以量子点(quantum dot)为代表的新型示踪物，指半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米晶体，其荧光发射波长具有尺寸大小的依赖性，科研人员可通过调整其粒径的大小，进而获得具有不同发射波长的特殊量子点；同时，量子点的激发光谱较宽，用一种激发波长可激发多种具有不同发射波长的量子点；并且，量子点的荧光半峰宽窄，可减少不同的荧光发射光谱之间的重叠干扰；更为重要的是，量子点的荧光稳定性非常好，与生物分子(蛋白、抗体、核酸等)偶联后，其可以作为一种新型的检测探针，常用于POCT等。近年来，以量子点为示踪物的免疫层析技术，制备成条状结构，可制成POCT产品。现场应用时，用紫外线灯光或者专用的设备光源照射激发后，肉眼可见反应条带，用特殊仪器可定量检测其强度，该类POCT具有结构简单、灵敏度高、检测快速，以及使用方便等特点，在大规模筛查或基层现场，应用前景广阔。但目前，尚未见基于量子点标记联合检测流感病毒A型和B型抗原的相关产品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条及其制备方法和应用。

本发明旨在提供一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条及其制备方法和应用，该试纸条可对流感病毒A型和B型抗原进行联合检测，还可提高流感病毒检测的灵敏度和稳定性，同时成本低，操作简便，所用操作时间短的试剂盒，使其更适用于现场筛查及床旁检测。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下解决方案：提供一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条，包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有量子点标记的流感病毒A型检测抗体和量子点标记的流感病毒B型检测抗体。

进一步地，所述硝酸纤维素膜设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线上包被有小鼠或兔流感病毒A型捕获单克隆抗体；所述第二检测线上包被有小鼠或兔流感病毒B型捕获单克隆抗体；所述质控线上包被有抗鼠多克隆抗体或抗兔多克隆抗体。

进一步地，所述流感病毒A型检测抗体为小鼠或兔流感病毒A型单克隆抗体；所述流感病毒B型检测抗体为小鼠或兔抗流感病毒B型单克隆抗体。

进一步地，所述量子点为羧基水溶性量子点，粒径8nm-20nm，最大发射波长在600-630nm，激发波长450nm。

进一步地，所述量子点标记的流感病毒A型检测抗体和量子点标记的流感病毒B型检测抗体采用量子点复溶液稀释后再按一定比例混合后包被到结合垫上。

进一步地，所述量子点复溶液为含有含松三糖1-12wt％、氨基乙酸0.15-1.2wt％、硫酸庆大霉素0.05-1.5wt％、肉桂醛0.02-1.2wt％和TritonX-1000.05-0.15wt％的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01-0.05M，pH 7.0-7.3。

进一步地，所述样本垫经样本垫处理液处理后，烘干制得；所述样本垫处理液为PVP10(聚乙烯吡咯烷酮)0.05-1.5wt％、聚乙二醇-3000.8-3.2wt％、TritonX--1000.5-2.6wt％和2-羟基乙胺0.3-2.6wt％的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01-0.05M，pH 7.0-7.3。

本发明另一目的在于提供一种制备所述的流感病毒A型和B型量子点联检试纸条的方法，包括以下步骤：

S1.将所述样本垫采用样本处理液处理，烘干；

S2.将流感病毒A型检测抗体和流感病毒B型检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上；将上述量子点采用量子点复溶液稀释后包被到结合垫上；

S3.使用抗体稀释缓冲液将流感病毒A型捕获抗体、流感病毒B型捕获抗体以及羊抗鼠或兔IgG抗体稀释后分别包被到硝酸纤维素膜的第一检测线、第二检测线和质控线上；

S4.在底板上从左往右依次相互交错地贴上样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。

进一步地，步骤S2具体为：

(1)使用第一缓冲液重悬量子点，加入活化剂活化量子点，室温避光活化反应；

(2)纯化得到的所述量子点，使用第一缓冲液重悬，再加入流感病毒A型检测抗体，混匀；

(3)加入封闭液封闭，封闭后再次纯化，使用第二缓冲液重悬量子点，得到量子点标记的流感病毒A型检测抗体，备用；

(4)按照步骤(1)-(3)同样的方法将流感病毒B型检测抗体标记在量子点上。

更进一步地，所述第一缓冲液为pH6.0的MES缓冲液；所述活化剂为NHS和/或EDC，所述量子点与活化剂的质量比例为1：8。

更进一步地，所述封闭液为BSA；第二缓冲液为pH 8.2的Tris-HCl缓冲液。

更进一步地，所述量子点与流感病毒B型检测抗体或流感病毒A型检测抗体的质量比为1：8。

本发明另一目的在于提供上述试纸条在制备检测或辅助检测流感病毒A型和B型抗原试剂盒中的应用。

本发明另一目的在于提供上述流感病毒A型和B型抗原量子点联检试纸条的使用方法，步骤包括：

(1)取待测样品80-100μl，所述待测样品可以是粪便悬液，加入到样本垫上；

(2)在室温放置20-25min后，用450nmLED灯照射反应膜，即可肉眼判读结果；

(3)判读方法为：如标本中有流感病毒A抗原，则第一检测线出现肉眼可见的荧光；如标本中有流感病毒B型抗原，则第二检测线出现肉眼可见的荧光；不论标本中是否含有流感病毒A型和B型抗原，质控线均会发出肉眼可见的荧光，否则试剂条无效。

本发明试纸条检测原理为：样本滴加到样本垫上在层析作用下，样本到达结合垫，结合垫上的偶联了量子点的流感病毒A型检测抗体和流感病毒B型检测抗体，分别与待测样本中的流感病毒A型抗原、流感病毒B型抗原发生特异性抗原抗体反应，形成“量子点-检测抗体-抗原”复合物，当复合物到达第一检测线时，A型抗原被第一检测线上的A型捕获抗体捕获，从而形成“量子点-A型检测抗体-A型抗原-A型捕获抗体”复合物；同理，当到达第二检测线时，复合物中的B型抗原被第二检测线上的B型捕获抗体捕获，形成“量子点-B型检测抗体-B型抗原-B捕获抗体”复合物。最后，通过检测试纸条第一检测线、第二检测线上结合的量子点的荧光强度，定性半定量的测得流感病毒A型抗原、流感病毒B型抗原的阳性率，为流感病毒感染的的诊断提供依据。

本发明的有益效果：

(1)本发明结合免疫层析技术和双抗体夹心的原理，实现了流感病毒A型和B型两种基因型的联合检测，并且两项指标之间不会相互干扰，提高了流感病毒感染检测的准确性，省时且高效。

(2)本发明以量子点作为示踪物，一方面，其易于与生物活性分子(如抗体、抗原等)偶联；另一方面，其是一种新型的检测示踪物，荧光强度高，且稳定性好，故以其作为示踪物，检测具有更高的灵敏度，便于呼吸道病毒感染等疾病的早期筛查，结合免疫层析技术，可制备成条状结构，轻便易携，无需复杂的仪器设备，可广泛的适用于现场筛查及床旁检测。

(3)本发明通过系统的文献复习和开展系列试验，优化了量子点的独特的复溶液配方，可让样本垫上的量子点标记检测抗体几乎完全释放，同时确保量子点标记检测抗体的稳定性，因此提高了该检测试纸检测结果的准确度和灵敏度。

附图说明

图1为本发明试纸条结构示意图；其中，1：试纸的底板；2：试纸的样品垫；3：试纸的结合垫；4：试纸上的硝酸纤维素膜；401：第一检测线；402：第二检测线；403：质控线；5：试纸上的吸水垫。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中流感病毒A型检测抗体和流感病毒B型检测抗体购自广州瑞姆生物科技有限公司；流感病毒A型捕获单克隆抗体和流感病毒B型捕获单克隆抗体购自广州瑞姆生物科技有限公司。

实施例1流感病毒A型和B型抗原量子点联检试纸条

本实施例试纸条结构如图1所示，包括底板1，在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，所述结合垫3上包被有量子点标记的流感病毒A型检测抗体和量子点标记的流感病毒B型检测抗体；所述硝酸纤维素膜设置有第一检测线401、第二检测线402和质控线403，所述第一检测线401上包被有流感病毒A型捕获单克隆抗体，第二检测线402上包被有流感病毒B型捕获单克隆抗体；所述质控线403上包被有兔抗鼠IgG多抗。

其中，在本实施例中，所述样本垫与所述结合垫部分重合，重合部分长度不少于结合垫的1/3；所述结合垫与NC膜有部分重合，重合部分长度为NC膜的1/6-1/7；所述NC膜与吸水垫有部分重合，重合部分长度为NC膜的1/6-1/7；所述两条检测线和质控线的长度为0.3cm；所述第一检测线401与第二检测线402之间，第二检测线402与质控线403之间的距离均为0.6cm。

当待测标本中含有流感病毒A型和B型抗原时，抗原会分别先和结合垫上偶联了量子点的标记抗体发生特异反应，分别形成量子点-流感病毒A标记抗体-流感病毒A抗原复合物和量子点-流感病毒B标记抗体-流感病毒B抗原复合物；随着层析作用的进行，复合物向前移动到达第一检测线401处，量子点-流感病毒A标记抗体-流感病毒A抗原复合物与事先包被好的流感病毒A捕获抗体结合形成双抗体夹心复合物，从而聚集在第一检测线401处；同理，量子点-流感病毒B标记抗体-流感病毒B抗原复合物与事先包被好的流感病毒B捕获抗体结合形成双抗体夹心复合物，从而聚集在第二检测线402处。未被捕获的量子点复合物会继续前行，到达质控线403时，与兔抗鼠IgG多克隆抗体结合，从而在质控线403处同样出现量子点聚集，整个反应可在10min内进行完成。

实施例2本发明试纸条的制备方法

(1)样品垫的制备

将样品垫剪切成与结合垫相匹配的合适大小及长度，用样本垫处理液以50μL/cm的量喷涂于样本垫上后，室温浸泡1.5h后，37℃恒温箱烘干不少于15h；干燥待用；所述样本处理液为含PVP10(聚乙烯吡咯烷酮)0.1wt％、聚乙二醇-300 1.8wt％、TritonX—1001.0wt％和2-羟基乙胺1.6wt％的磷酸盐缓冲液(0.015M，pH 7.2)。

(2)结合垫的制备

①取1.5mg羧基水溶性量子点，然后将量子点悬浮在1200μL的浓度为0.05M、pH为6.0的MES缓冲液中；

②使用0.05M pH6.0 MES缓冲液配制NHS(50mg/ml)和EDC(50mg/ml)，各取30μl加到量子点中，终浓度是NHS(1mg/ml)和EDC(1mg/ml)；

③活化25min后离心洗涤，4℃下16000g，8min×2次，弃上清，最后重悬于1200μl，浓度为0.05M的pH6.0的MES缓冲液中；

④取0.15mg流感病毒A检测单抗加入到量子点中，震荡混匀，室温摇床反应3h；

⑤加入BSA(20mg/ml)150μl封闭，室温摇床反应1.5h；

⑥纯化量子点，使用0.05M Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)重悬；

⑦将上述量子点-流感病毒A型检测单抗复合物用量子点复溶液做适当稀释(1:100)后震荡混匀，得到量子点-流感病毒A型检测单抗重悬液；

⑧按照上述同样的方法将流感病毒B型检测抗体标记在量子点上得到量子点-流感病毒B检测单抗复合物，采用量子点复溶液做适当稀释(1:100)后震荡混匀，得到量子点-流感病毒B检型测单抗重悬液；将量子点-流感病毒A型检测单抗重悬液和量子点-流感病毒B检型测单抗重悬液按1:1的体积比混合，备用，其中，量子点复溶液为含松三糖1.5wt％、氨基乙酸0.2wt％、硫酸庆大霉素0.1wt％、肉桂醛0.5wt％和TritonX-100 0.1wt％的磷酸盐缓冲液，该磷酸盐溶液浓度为0.015M，pH为7.2。

⑨将重悬液按照每25μl一个结合垫的量浸泡玻璃纤维膜，室温下静置20min，将上述浸泡好的结合垫置于37℃恒温箱中过夜，使其彻底干燥，将量子点-抗体固定在结合垫上，待用。

(3)硝酸纤维素膜的制备

将硝酸纤维素膜剪切成与结合垫、样品垫都相匹配的合适大小及长度，使用抗体包被缓冲液(该抗体包被缓冲液为含1.5％海藻糖和5％牛血清的pH7.2的浓度为0.01M的PBS缓冲液)分别将流感病毒A型捕获单克隆抗体、流感病毒B型捕获单克隆抗体以及兔抗鼠IgG多克隆抗体稀释到1.5mg/mL浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，后于室温干燥不少于3小时，加入干燥剂封存备用。

其中具体为：在距离吸水纸端0.5cm处包被浓度为1.5mg/ml的兔抗小鼠IgG多抗1.5μg，作为质控线C线；在距离结合垫0.5cm处包被浓度为1.5mg/ml的A捕获单抗1.5μg，作为检测线T₁线；在T₁线和质控线C线中间部位包被浓度为1.5mg/ml的B捕获单抗1.5μg，作为检测线T₂线。

(4)流感病毒A型和B型抗原量子点联检试纸条的组装

如图1所示，在粘性底板上依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸搭接组装，其中，样品垫的右端压住释放垫的左端约0.5cm，释放垫的右端压住硝酸纤维素膜的左端约0.5cm，吸水纸的左端压住硝酸纤维素膜的右端约0.5cm，即组装成为流感病毒A型和B型抗原量子点联检试纸条。

实施例3量子点复溶液的筛选实验

采用不同的量子点复溶液重悬量子点标记的流感病毒A型检测抗体和量子点标记的流感病毒B型检测抗体，处理1：量子点复溶液为含松三糖2.5wt％、氨基乙酸0.25wt％、硫酸庆大霉素0.2wt％、肉桂醛0.12wt％和TritonX-100 0.1wt％的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)；处理2：量子点复溶液为含氨基乙酸0.25wt％、硫酸庆大霉素0.2wt％、肉桂醛0.12wt％和TritonX-100 0.1wt％的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)；处理3：量子点复溶液为含松三糖2.5wt％、硫酸庆大霉素0.2wt％、肉桂醛0.12wt％和TritonX-100 0.1wt％的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.2)。采用上述不同量子点复溶液按照实施例2所述方法制备得到各组试纸条样品，使用上述制备的各组试纸条样品滴加阴性对照组进行检测，实验结果显示，处理1得到的试纸条信号明显强于其他处理的试纸条，这说明，本发明量子点复溶液可使样本垫上量子点-抗体达到最大程度的充分释放。

实施例4性能检测

试验1：采用实施例2制备的试纸条和流感病毒A/B抗原胶体金法检测试剂盒对174份感冒患者的咽拭子标本进行了检测，对以上两种检测试剂不一致的检测结果，再用流感病毒A/B型检测试剂盒(RT-PCR探针法)进行复测，结果如下表1所示：

表1检测结果

试验2：取上述胶体金检测出的51份阳性标本(A型43份；B型8份)，采用本发明实施例2制备的量子点试纸条进行检测，结果显示均为阳性。同时，对实施例2制备的量子点试纸条检测出阳性而胶体金法检测出阴性结果的11份标本，用流感病毒A/B检测试剂盒(RT-PCR探针法)检测，结果11份为阳性，与本发明量子点联检试纸的检测结果一致。说明本发明所制备的量子点联检试纸条，与胶体金试纸比较，具有检出率更高，假阴性更少，结果更可靠，能够很好的应用于实际样品的检测。

试验3：交叉试验

采用实施例2制备的试纸条检测15份腺病毒及17份轮状病毒阳性标本，结果显示，均为阴性结果，这提示本发明量子点试纸条特异性较好，与常见的病毒没有交叉反应。

试验4：灵敏度试验

取已鉴定的流感病毒A型和B型阳性的咽拭子标本，分别进行混合，然后倍比稀释后，分别用本发明实施例2制备得到的试纸条和市售的流感病毒A/B型抗原胶体金法检测试剂盒检测，进行检测，结果如下表2所示：

从上表可看出，本发明的量子点联检试纸条的灵敏度较高，相比胶体金试纸条高约8倍。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种流感病毒A型和B型量子点联检试纸条，其特征在于，包括底板，以及在所述底板上从左往右依次搭接的样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫上包被有被量子点标记的流感病毒A型检测抗体和被量子点标记的流感病毒B型检测抗体。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜设置有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线上包被有流感病毒A型捕获抗体，所述第二检测线上包被有流感病毒B型捕获抗体；所述质控线上包被有羊抗鼠或兔IgG。

3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述量子点为羧基水溶性量子点或聚乙二醇功能化水溶性量子点，粒径为8nm-20nm，最大发射波长为600-630nm，激发波长为450nm。

4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述被量子点标记的流感病毒A型检测抗体和被量子点标记的流感病毒B型检测抗体采用量子点复溶液稀释后再按一定比例混合后包被到结合垫上。

5.如权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述量子点复溶液包括：松三糖1-12wt％、氨基乙酸0.15-1.2wt％、硫酸庆大霉素0.05-1.5wt％、肉桂醛0.02-1.2wt％和TritonX-1000.05-0.15wt％的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求5所述的试纸条，其特征在于，所述样本垫经样本垫处理液处理后，烘干制得。

7.如权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述样本垫处理液包括：聚乙烯吡咯烷酮0.05-1.5wt％、聚乙二醇-300 0.8-3.2wt％、TritonX-100 0.5-2.6wt％和2-羟基乙胺0.3-2.6wt％的磷酸盐缓冲液。

8.一种制备如权利要求1-7任一所述的流感病毒A型和B型量子点联检试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将所述样本垫采用样本处理液处理，烘干；

S2.将流感病毒A型检测抗体和流感病毒B型检测抗体以共价偶联的方式偶联到量子点上；将上述量子点采用量子点复溶液稀释后包被到结合垫上；

S3.使用抗体稀释缓冲液将流感病毒A型捕获抗体、流感病毒B型捕获抗体以及羊抗鼠或兔IgG抗体稀释后分别包被到硝酸纤维素膜的第一检测线、第二检测线和质控线上；

S4.在底板上从左往右依次相互交错地贴上样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，即得到量子点免疫层析试纸条。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤S2具体为：

(1)使用第一缓冲液重悬量子点，加入活化剂活化量子点，室温避光活化反应；

(2)纯化得到的所述量子点，使用第一缓冲液重悬，再加入流感病毒A型检测抗体，混匀；

(3)加入封闭液封闭，封闭后再次纯化，使用第二缓冲液重悬量子点，得到量子点标记的流感病毒A型检测抗体，备用；

(4)按照步骤(1)-(3)同样的方法将流感病毒B型检测抗体标记在量子点上。

10.如权利要求1-7任一所述的试纸条在制备检测或辅助检测流感病毒A型和B型试剂盒中的应用。

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