CN102435746A

CN102435746A - 一种检测病毒的方法及检测试剂盒

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Publication number: CN102435746A
Application number: CN2011102879414A
Authority: CN
Inventors: 庞代文; 赵蔚; 张万坡; 张志凌; 王汉中
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2012-05-02

Abstract

本发明涉及一种病毒的检测方法，包括步骤：通过将目标病毒外膜的糖蛋白的抗体与磁性纳米/微球偶联得到免疫磁性纳米/微球，用该免疫磁性纳米/微球捕获样品中的目标病毒得到磁球病毒复合物，将生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白的抗体与磁球病毒复合物孵育，再与链霉亲和素偶联的量子点孵育得到磁球-病毒-量子点复合物，通过检测磁球-病毒-量子点复合物的荧光信号检测病毒。运用该方法，本发明实现了H9N2亚型禽流感活病毒的特异性识别，富集分离和高灵敏度的检测。本发明还提供了用于该方法的检测试剂盒。本方明具有操作简单，特异性强，灵敏度高等特点，整个检测过程可在一个小时内完成。

Description

一种检测病毒的方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法，本发明还涉及应用于该方法的检测试剂盒，属于病毒学及化学生物学领域。

背景技术

高灵敏高特异性的病原体快速检测新技术对全世界（我国）食品安全、疾病防控与有效诊治、国民生命安全至关重要。随着SARS、艾滋病、甲型H1N1流感病毒等传染病的爆发，人们急需发展新的病原体检测方法用于有效控制传染病的流行。禽流感病毒因为其高传染性，易致病性以及对人和禽类带来的危害，得到越来越多的关注。例如，目前检测禽流感病毒方法主要有核酸检测，鸡胚病原分离等。但是这些方法都存在步骤繁琐，耗时较长等问题，不利于病毒的快速检测和鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测病毒的方法，以克服现有技术检测步骤繁琐耗时较长的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

提供一种检测病毒的方法，该方法包括如下步骤：通过将目标病毒外膜的糖蛋白的抗体与磁性纳米微球偶联得到免疫磁性纳米微球，用该免疫磁性纳米微球捕获样品中的目标病毒得到磁球病毒复合物，将生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白抗体与磁球病毒复合物孵育，再与链霉亲和素偶联的量子点孵育得到磁球-病毒-量子点复合物，通过检测磁球-病毒-量子点复合物的荧光信号检测病毒。

上述磁性纳米微球是表面经过修饰的能够与蛋白偶联的磁性微球，例如表面带有-NH₂基团，微球的大小一般为纳米级，优选直径为150nm~250nm，在本发明实施例中，磁性微球直径为200nm。

上述病毒一般是指内部具有核酸，外面具有衣壳的蛋白，包括但不限于，例如流感病毒、肠道病毒等等，或者是朊病毒。

基于上述方法，本发明还进一步提供检测H9N2的方法，该方法用商品化的磁性纳米微球偶联抗H9N2外膜HA的单克隆一抗抗体富集分离H9N2病毒，并利用H9N2外膜HA抗体的免疫作用使分离后的病毒与生物素（biotin）化的抗体相互作用，并被偶联了链酶亲和素（SA）的量子点（QDs）识别，通过量子点（QDs）。具体地，其包括如下步骤：

①制备免疫磁性纳米微球：利用EDC活化法将抗H9N2外膜糖蛋白HA的单克隆一抗抗体连接到表面带-NH2的磁性纳米球表面，并用BSA对偶联了抗体后的磁球进行封闭；

②富集分离H9N2病毒：将该免疫磁性纳米微球与加入到样品溶液中，37℃下孵育15分钟，用磁力架吸附微球除去溶液中未反应的病毒，得到磁球-病毒的复合物；

③制备生物素化抗体：利用蛋白生物素标记试剂对抗H9N2 外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体进行生物素化标记，得到biotin-mAb；

④量子点标记：将biotion-mAb与磁球-病毒复合物在溶液中于37℃下孵育15min，用磁力架吸附磁球，去除溶液中未反应的biotion-mAb，再往磁球-病毒复合物溶液中加入链霉亲和素偶联量子点，37℃下反应15min，磁力架分离洗涤，除去未反应的量子点，沉淀加入溶液重悬均匀，形成磁球-病毒-量子点的复合物；

= 5 \* GB3 ⑤量子点检测：利用荧光显微镜或者荧光分光光度计对磁球-病毒-量子点复合物进行检测。

此外，还可以增加阴性对照实验，如重复①步骤后，分别用纯水，灭活的H5N1病毒以及其他禽类病毒代替H9N2，重复②— = 5 \* GB3 ⑤步骤。

进一步本发明提供一种用于病毒检测的检测试剂盒，其包括：

1）免疫磁性纳米微球，所述微球表面偶联有目标病毒外膜的糖蛋白抗体；

2）生物素化目标病毒外膜的糖蛋白；

3）链霉亲和素偶联的量子点。

本发明通过具有靶向性的磁性纳米球分离富集目标病毒，并利用病毒表面蛋白的免疫作用，和量子点的荧光特性作为检测病毒的方法。由于磁性纳米球分离操作简单，量子点的荧光强度高，该方法具有易操作，无需对样品进行预处理，灵敏度高，特异性强等特点。

附图说明

图1为本发明检测禽流感H9N2流程示意图。

图2为本发明所检测的禽流感H9N2的荧光光谱，可以看出H9N2的样品在602nm处有量子点的特殊发射峰，对照样品H5N1和空白样品H₂O的荧光光谱中没有明显的量子点的发射峰。

图3为本发明所检测的禽流感H9N2样品的荧光共聚焦显微镜照片，只有当磁性靶向纳米球捕抓到目标病毒，目标病毒经过biotin化抗体的免疫反应，再被SA-QDs识别，才能在共聚焦显微镜下实现磁球与量子点的共定位。在对照实验中，用H5N1病毒代替H9N2病毒，从共聚焦图片可以看出，磁球上没有出现量子点荧光。用空白样品代替病毒样品，共聚焦显微镜的图片中也没有看到量子点的荧光。

图4为用DIO染料为病毒染色的实验结构，以证明H9N2病毒被特异性的捕获和识别。在病毒被磁球捕获后，用DIO染料对磁球-病毒的复合物进行染色，DIO染料是一种亲脂染料，可以和病毒的囊膜结合而显色。如图所示，磁球（a）与病毒上的DIO荧光（b）和与病毒上结合的量子点荧光（c）可以共定位。同时，病毒在被捕获前，先将病毒用DIO染料染色，用磁球捕获被染色的病毒，再用量子点的识别病毒，如图所示，磁球（e）与DIO荧光（b）和量子点的荧光（g）可以共定位。

图5显示的是本发明检测方法的特异性。除了用空白样品做对照外，还应用了几种禽类的常见的病毒作为对照，图中，单纯磁球的背景值，减蛋综合症病毒(EDS)，传染性法式囊病毒（IBDV），新城疫病毒（NDV），传染性支气管炎病毒（IBV）和H5N1禽流感病毒，这些病毒均已经过高温灭活处理。对照病毒的信号均在阴性域值的范围内。

图6显示的是本发明方法检测禽流感病毒的工作曲线，即被检测病毒的浓度与量子点荧光强度的关系，将已知浓度的病毒成倍稀释，在保证磁球，抗体和量子点用量保持不变，并过量的情况下，用该方法对病毒进行捕获并检测，得到荧光与病毒浓度的关系曲线。如图所示，在低浓度下，量子点的荧光与病毒的浓度成正比，随着病毒浓度的增加，量子点荧光与病毒的浓度不再成正比的关系。

图7显示的是模拟实际环境的样品检测结果：为了更好的运用该方法，本发明模拟了实际检测环境中的禽类组织（鸡肝，鸡肺，鸡粪）样品的环境，在禽类组织环境存在的情况下，用该方法对于低浓度和高浓度的H9N2病毒进行检测。

具体实施方式

以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1 禽流感病毒H9N2的检测

下面以禽流感病毒H9N2为例，对荧光磁性免疫夹心法检测病毒的方法进行详细的说明。

一、方法

1、H9N2抗体的制备

（一）实验材料

1）免疫原：禽流感病毒（AIV）H9N2亚型毒株（中科院病毒所）。

2）试剂和培养基：RPMI-1640购自GIBCOL，新生小牛血清(超级)购自杭州四季青生物工程公司;融合剂 50%PEq购自Sigma；HAT盐(l0()x)，GIBCOL；HT盐(100x)，GIBCOL; 淋巴细胞分离液:天津颧洋生物制品科技有限公司; 链霉素为华北制药厂产品; 羊抗鼠IgG-HRp:华美公司;秋水仙素:sigma公司; 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，Sigma

3）实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

（二）杂交瘤细胞系的建立

1）动物免疫

分别取适量经纯化的抗原 (100μg)与等体积的弗氏完全佐剂乳化，小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔14d加强1次，换用弗氏不完全佐剂乳化。最后于融合前3d(72h)，腹腔强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。

2）杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗AIV H9膜蛋白HA的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μl的AIV H9膜蛋白HA包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000 HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。

3）杂交瘤细胞系的建立

重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株AIV H9膜蛋白HA，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系，将其中一株命名为H94C4。

4）应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

（i）细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为：1：50000-1：100000。

（ii）小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000-1：1000000。

5）杂交瘤细胞系的传代培养

将上述杂交瘤细胞系在含有10%太牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。

以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗AIV H9膜蛋白HA的单克隆抗体。

（三）单抗制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种第16 代杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶-2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。采用辛酸一硫酸钱法对小鼠腹水进行纯化:取小鼠腹水 10.0mL，加入等体积的巴比妥缓冲液，适量的二氧化硅混合，室温振荡30min。室温静置15min后，取上清于洁净离心管中，4℃，1800 r/min离心20min;取上清液 18.0mL，加入36.0 mL0.06mo比醋酸钠缓冲液，用HCL调pH值至4.5，充分搅拌下在30min内缓慢加入辛酸297μL;继续搅拌10min，然后转入4℃冰箱静置2h，4℃，15000r/min离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤后体积为50mL;加入5.omL0.1mol/L的磷酸缓冲液，用NaOH调pH值至7.6，搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为0.277g/mL；4℃冰箱静置2h后，4℃，12000r/min离心30min，弃上清;沉淀用5mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液重悬，装入透析袋，对5000mL 0.01mol/L pH7.2PBS缓冲液充分透析后，再对2000 L蒸馏水透析，最后对3000m超纯水透析;然后4℃，12000r/min离心 30min，弃沉淀，收集上清液，测蛋白浓度。作SDS-PAGE电泳，鉴定单克隆抗体的纯度。

2、禽流感病毒H9N2的检测

①将1μg抗H9N2病毒表面蛋白（viral surface protein）HA蛋白的一抗H94C4与200nm表面带-NH₂的磁球（购自法国ademtech公司）按约为5：1（w/w）比例在（500μl）PBS（0.1M pH7.2）中混合，涡旋均匀，加入活化剂EDC使其最终浓度为1mg/mL，室温下孵育两小时。磁力架将磁球聚集除去上清，加入100μl PBS（0.1M pH7.2）涡旋使磁球均匀分散。加入1μl 0.5mg/mL bovine serum albumin(BSA)-PBS溶液对偶联了抗体的磁球进行封闭。4℃保存。

②将100μL10⁶copy/mL目标的病毒（H9N2）加入到由①得到的靶相磁性纳米球中，加入PBS缓冲溶液使反应体系至200μl，在37℃摇床缓慢摇动条件下反应15min，用磁力架聚集磁球除去溶液中未反应的病毒，并加入200μl 0.1M PBS溶液重悬，形成磁球-病毒的复合物溶液。

③ 将抗体H94C4与biotin-reagent（Pierce Biotechnology公司）混合，按试剂盒说明操作，室温下反应半小时，通过脱盐柱NAP-5（购自GE公司）按试剂盒说明操作除去未反应的biotion-reagent小分子，浓缩得到biotin-H94C4，用紫外分光光度计测量在280nm处的吸收计算biotin-H94C4的浓度。

④ 将1μg biotion-H94C4加入到由②得到磁球-病毒的复合物溶液，室温下孵育15min，磁力架吸附磁球与溶液分离，除去溶液中未反应的蛋白，再加入PBS重悬磁球，重复两次，最终磁球重悬至200μl的pH7.4 0.1M PBS缓冲液中。

⑤ 往④重悬的200μl磁球溶液中加入1μl 10^-7mol/L SA-QDs（购自武汉珈源量子点公司），室温下反应15min，磁力架分离磁球，除去溶液后，再用PBST缓冲（0.01%tween in PBS）重悬，如此反复洗涤三次，除去未反应的量子点，最终加入150μl pH7.4 0.1M PBS重悬磁球，形成磁球-病毒-量子点的复合物溶液。

⑥ 荧光分光光度计检测：设置激发光380nm，记录602nm处的荧光发射峰。

⑦ 荧光显微镜检测：取10μl磁球-病毒-量子点的复合物溶液用于显微镜制片，荧光场，使用蓝光紫外光激发。

按照上述方法，以H5N1为阳性对照以及H₂O为空白对照，分别测定荧光值。

3、检测曲线

将2×10⁷ copy/mL浓度的病毒成倍稀释至300 copy/mL共17个样品，按照1描述的步骤进行检测，并记录每个样品的荧光强度，绘制浓度与荧光强度关系曲线。

4、特异性实验

将步骤1中的禽流感病毒H9N2替换成高温灭活的减蛋综合症病毒(EDS)，传染性法式囊病毒（IBDV），新城疫病毒（NDV），传染性支气管炎病毒（IBV）和H5N1禽流感病毒作为阴性样品进行检测，并记录荧光强度并与1步骤中的阳性样品H9N2进行比较。

5、重复性实验

将浓度为2×10⁹copy/mL病毒原液按随机比例稀释4.0×10⁶，1.0×10⁵，5.0×10⁴，1.0×10³倍，并用同一批按步骤1中①步骤修饰的免疫磁球进行检测，每个样品重复实验5次，记录每次检测结果的荧光值，计算批次内差异系数Intra-assay CV。同时，用5种不同批次修饰的免疫磁球对上述样品进行检测，记录检测结果的荧光值，计算批次间差异系数Inter-assay CV。

6、模拟实际环境检测

将病毒溶液加入到鸡组织（鸡肝，鸡肺，鸡粪）混合溶液中，将组织捣碎，离心，取上清。用免疫磁球按步骤1对上清溶液以及将上清溶液稀释1000倍的溶液进行检测，并用空白样品作为对照，比较检测结果。

7、与PCR的比较

30个临床H9N2咽拭子样品，分别用荧光定量PCR（H9亚型荧光PCR检测试剂盒(购自北京北方奇丰科技有限公司，货号cat.06150441，按照试剂盒中的说明进行操作）和该磁性免疫荧光夹心法进行比较，比较两种方法检测结果的符合率。

二、结果

1、禽流感病毒H9N2的检测

如图2所示，根据本发明所检测的禽流感H9N2的荧光光谱，可以看出H9N2的样品在602nm处有量子点的特殊发射峰，对照样品H5N1和空白样品H₂O的荧光光谱中没有明显的量子点的发射峰。

通过禽流感H9N2样品的荧光共聚焦显微镜照片（图3）可以看出，只有当磁性靶向纳米球捕抓到目标病毒，目标病毒经过biotin化抗体的免疫反应，再被SA-QDs识别，才能在共聚焦显微镜下实现磁球与量子点的共定位。在对照实验中，用H5N1病毒代替H9N2病毒，从共聚焦图片可以看出，磁球上没有出现量子点荧光。用空白样品代替病毒样品，共聚焦显微镜的图片中也没有看到量子点的荧光。

在病毒被磁球捕获后，用DIO染料对磁球-病毒的复合物进行染色，DIO染料是一种亲脂染料，可以和病毒的囊膜结合而显色。如图4所示，磁球（a）与病毒上的DIO荧光（b）和与病毒上结合的量子点荧光（c）可以共定位。同时，病毒在被捕获前，先将病毒用DIO染料染色，用磁球捕获被染色的病毒，再用量子点的识别病毒，如图所示，磁球（e）与DIO荧光（b）和量子点的荧光（g）可以共定位。

2、工作曲线

图6显示的是本发明方法检测禽流感病毒的工作曲线，即被检测病毒的浓度与量子点荧光强度的关系，将已知浓度的病毒成倍稀释（2×10⁷ copy/mL浓度的病毒成倍稀释至300 copy/mL共17个样品），在保证磁球，抗体和量子点用量保持不变，并过量的情况下，用该方法对病毒进行捕获并检测，得到荧光与病毒浓度的关系曲线。如图所示，在低浓度下，量子点的荧光与病毒的浓度成正比，随着病毒浓度的增加，量子点荧光与病毒的浓度不再成正比的关系。

3、特异性

以几种禽类的常见的病毒作为对照进行检测，结果如图5所示，图中，单纯磁球的背景值，减蛋综合症病毒(EDS)，传染性法式囊病毒（IBDV），新城疫病毒（NDV），传染性支气管炎病毒（IBV）和H5N1禽流感病毒，这些病毒均已经过高温灭活处理。对照病毒的信号均在阴性域值的范围内。

4、重复性

计算该方法的批次内差异系数Intra-assay CV 和批次间差异系数Inter-assay CV。CV是变异系数也可称为相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。计算批次内差异系数是将同一病毒样品稀释到不同浓度，用同一批次的磁球重复实验5次后计算各个浓度的标准偏差，然后取平均值。计算批间差异系数是将同一病毒样品，稀释到不同浓度，用五种不同批次的磁球对每种浓度病毒进行检测记录荧光强度，每个浓度取平均值后计算各个浓度的标准偏差，再取平均计算相对标准偏差。计算得到，批次内差异系数为1.35±0.47% ，批次间差异系数为 3.0±2.06%，差异较小均在合理的范围内，说明该方法有较好的重复性。

表1显示的是本发明方法的重复性

Figure 2011102879414100002DEST_PATH_IMAGE002

批内变异系数 1.35±0.47% 批间变异系数 3.0±2.06%

5、模拟实际环境检测

为了更好的运用该方法，本发明模拟了实际检测环境中的禽类组织（鸡肝，鸡肺，鸡粪）样品的环境，在禽类组织环境存在的情况下，用该方法对于低浓度和高浓度的H9N2病毒进行检测。结果如图7所示，在实际环境中本发明也可准确检测出相关病毒。

6、与荧光定量PCR的比较

与荧光定量PCR方法比较，对30个临床样品进行检测，结果如表2所示，检测结果的符合率达到96.6%。

表2 本发明方法与荧光定量PCR比较结果

通过以上各项检测，证明本发明方法可以高灵敏高选择性的检测禽流感H9N2病毒，重复性好，操作简单，结果可靠，用获得的5株单抗均取得了上述类似的效果。本发明方法可以推广到其他的病原体检测。

Claims

1.一种检测病毒的方法，该方法包括如下步骤：通过将目标病毒外膜的糖蛋白的抗体与磁性纳米微球偶联得到免疫磁性纳米微球，用该免疫磁性纳米微球捕获样品中的目标病毒得到磁球病毒复合物，将生物素化的所述病毒的外膜的糖蛋白抗体与磁球病毒复合物孵育，再与链霉亲和素偶联的量子点孵育得到磁球-病毒-量子点复合物，通过检测磁球-病毒-量子点复合物的荧光信号检测病毒。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性纳米微球的直径为150nm~250nm，表面带有-NH₂ 。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述病毒为流感病毒H9N2，所述抗体为其外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体。

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

①制备免疫磁性纳米微球：利用EDC活化法将抗H9N2 外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体连接到表面带-NH₂的磁性纳米球表面，并用BSA对偶联了抗体后的磁球进行封闭；

③制备生物素化抗体：利用蛋白生物素标记试剂对抗H9N2表外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体进行生物素化标记，得到biotin-mAb；

量子点检测：利用荧光显微镜或者荧光分光光度计对磁球-病毒-量子点复合物进行检测。

5.一种病毒检测试剂盒，其包括：

1）免疫磁性纳米微球，所述微球表面偶联有目标病毒外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体；

2）生物素化目标病毒外膜的糖蛋白HA的单克隆一抗抗体；

3）链霉亲和素偶联的量子点。

6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述目标病毒为H9N2。

7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫磁性纳米微球的直径为150~250nm。