CN102363634A

CN102363634A - 拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法

Info

Publication number: CN102363634A
Application number: CN2011103625398A
Authority: CN
Inventors: 徐敦明; 黄蓬英; 周昱; 张缙; 林立毅; 方恩华
Original assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Current assignee: INSPECTION AND QUARANTINE CENTER OF XIAMEN ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-02-29

Abstract

本发明提供一种拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：（a）合成人工抗原；（b）合成包被原；（c）制备抗体。本发明的抗体不仅能识别半抗原，而且识别含半抗原结构在内的大分子化合物，抗体对氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多种菊酯化合物都有一定的交叉识别。本发明根据几种拟除虫菊酯类农药的共性结构特点设计制备了广谱性抗体，并且可以建立针对多种常见菊酯类药剂快速筛选检测方法。

Description

拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及拟除虫菊酯类农药检测领域，具体涉及一种拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法。

背景技术

拟除虫菊酯类农药因其具有杀虫谱广、活性高、用量少、残留量低等特点而在农业、林业、卫生业等领域被广泛应用。近年来，随着一批高毒农药的禁用，菊酯类农药在中国的使用量越来越大，其在农产品中的残留也越来越引起人们的重视。

目前拟除虫菊酯农药残留量检测的常规方法有气相色谱法和高效液相色谱法等。这些方法的检测限低、灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考，但样品前处理复杂、仪器昂贵、操作技术要求高，对于中国农产品安全监控中要求的大批量样品快速初筛工作无法胜任。

免疫分析是一种快速、灵敏的用于痕量检测的方法，近十年来研究应用发展迅速，据文献报道约有60 多种农药可用于酶免疫分析。由于免疫方法特异性强，多残留分析就需要采用不同的农药抗体进行多次检测分析，这就增加了检测成本和工作量，将单种药剂的检测研究发展为对多种类似化合物通用检测筛选法，测定每类农药的总残留量，是较为适用的现场筛选检测方法。

有鉴于此，本发明根据几种拟除虫菊酯类农药的共性结构特点设计制备了广谱性抗体，并且可以建立针对多种常见菊酯类药剂快速筛选检测方法，本案由此产生。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，该方法得到的多克隆抗体可用于对多种类似化合物同时进行通用检测筛选。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（a）合成人工抗原：PBA 溶于DMF中，加入等摩尔数的DCC和NHS，室温搅拌过夜，再将混合液慢慢滴加至含BSA 的缓冲液，室温磁力搅拌30min，然后在4℃温度下反应6 h，最后反应液在4℃温度下且pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析过夜；

（b）合成包被原；

（c）制备抗体：取雄性新西兰大白兔，在免子疫前1周采血制备阴性血清；免疫程序为：免疫剂量为每kg兔子体重1 mg免疫原，加入FCA将免疫原制成油包水乳浊液，在兔子背部皮下进行多点注射；隔2周进行第2次免疫，免疫方法是先加入FICA将免疫原制成油包水乳浊液，再在兔子背部皮下进行多点注射；此后，每隔3周免疫1次，方法同第2次免疫；从第4次免疫开始，每次免疫1周后在兔子耳缘静脉采少量血，分离血清，采用间接非竞争ELISA法测定抗体效价；当效价达2×10⁴后，进行最后一次免疫，用加倍量抗原的生理盐水稀释液在兔子耳缘静脉注射，1周后心脏采血致兔子死，分离血清；采用硫酸铵二步沉淀法纯化抗体，制成冻干粉于-20℃保存备用。

步骤（b）中合成包被原的方法为：PBA 溶于DMF中，加入等摩尔数的DCC和NHS，室温搅拌过夜，再将混合液慢慢滴加至含OVA 的缓冲液，室温磁力搅拌30min，然后在4℃温度下反应6 h，最后反应液在4℃温度下且pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析；

步骤（b）中另外一种合成包被原的方法为：取6-氨基己酸、EDC和OVA 溶于水中，用稀NaOH 调到溶液pH=7.5，室温下在暗中反应18 h 后用Sephadex G-10 纯化、冷冻并干燥保存，再溶于含体积比20%DMF的水溶液中；另将PBA先溶于DMF中，再缓慢滴加入到上述DMF的水溶液中，然后再加入溶于DMF的DCC，调整DMF的最终浓度为30%（v/v）；最后在室温暗中反应18 h，得到的混合物过滤除去沉淀，再透析。

本发明中的化合物及其简称的对应关系表述如下：N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），环二己基碳酰亚胺（DCC），水溶性碳化二亚胺（EDC），二甲基甲酰胺（DMF），卵清蛋白(OVA)，牛血清蛋白（BSA），弗氏完全佐剂（FCA），弗氏不完全佐剂（FICA），间苯氧基苯甲酸（PBA）。

绝大多数农药是小分子物质，只具有反应原性，而没有免疫原性。本发明通过活性酯法将半抗原PBA与BSA偶联，这就相当于在PBA与BSA之间搭了一座桥，从而避免了BSA大分子的屏蔽作用，将PBA作为抗原决定簇尽量暴露于免疫系统，获得的高亲和力抗体就可能识别含有PBA结构的化合物。但“桥”结构也有不利的影响，即免疫系统不仅识别半抗原，而且识别“桥”，因此制得的多克隆抗体中可能含有识别“桥”的抗体，本发明中的包被原采用6-氨基己酸法合成，在PBA与OVA之间引入一个6C“桥”，避免“桥”抗体对包被原的识别，从而提高了IC-ELISA的灵敏度。

本发明的抗体不仅能识别半抗原，而且识别含半抗原结构在内的大分子化合物，抗体对氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多种菊酯化合物都有一定的交叉识别。

具体实施方式

实施例1：

人工抗原的合成：

免疫原的合成活性酯法：0.0196 g PBA 溶于2 ml DMF，加入等摩尔数的DCC，NHS，室温搅拌过夜。将上述混合液慢慢滴加至含0.0900 g BSA 的10 ml 缓冲液（PBS∶CBS=4∶1），室温磁力搅拌30min，然后4℃反应6 h，反应液在4℃ 1L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2)透析过夜（换液4 次）。透析后的溶液用BECKMAN DU640 紫外扫描仪扫描，并计算结合比。

包被原的合成：

采用活性酯法，具体制备方法与免疫原合成类似，其用量分别为PBA0.0301 g、DCC0.0722 g、NHS0.0347 g、OVA0.0805 g。透析后的溶液用BECKMAN DU640 紫外扫描仪扫描，计算结合比。

抗体的制备与纯化：

取雄性新西兰大白兔3 只，体重1.5 kg 左右，免疫前1 周分别采血制备阴性血清。免疫程序：首免，剂量为每kg 兔子体重1 mg 免疫原，加FCA 将免疫原制成油包水（W/O）乳浊液，背部皮下多点注射；隔2 周第2 次免疫，加FICA；此后，每隔3 周免疫1 次，方法同第2 次免疫；第4 次开始，每次免疫后1 周兔耳缘静脉采少量血，分离血清，采用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，效价达2×104 后，进行最后1 次免疫，用加倍量抗原的生理盐水稀释液耳缘静脉注射，1周后心脏采血致死，分离血清。并采用硫酸铵二步沉淀法纯化抗体，制成冻干粉，于-20℃保存备用。

以3只兔子的阴性血清作IC-ELISA分析，OD450接近为0，表明兔子体内不存在本研究半抗原对应的抗体，3只兔子均可用于制备抗体的免疫动物。经过多次加强免疫后，以间接非竞争性ELISA测定抗体效价。

实施例2：

人工抗原的合成以及抗体的制备与纯化按照实施例1中的步骤进行。

包被原的合成采用如下方法：

取6-氨基己酸0.0693 g，EDC0.0796 g，OVA0.2072 g 溶于水中，用稀NaOH 调pH=7.5，室温暗中反应18 h 后，用Sephadex G-10 纯化，冷冻，干燥保存。将上述样品溶于含20%DMF 水中，另称PBA0.1090 g 溶于DMF中，慢慢滴加入到上述样品中，然后再加入溶于DMF的DCC（0.0932g），使DMF 最终浓度为30%（v/v）室温暗中反应18 h，混合物过滤除沉淀，透析。透析后的反应液用BECKMAN DU640 紫外扫描仪扫描，计算结合比。

实施例3：

标准抑制曲线的建立

根据方阵滴定原则，确定抗原抗体最佳工作浓度。在最佳工作条件下，测定不同浓度PBA 对2 种包被原与抗体结合反应抑制率（I%），I=100[（OD_对照—OD_药剂）/OD_对照]。以抑制率为纵坐标，标样浓度（C）为横坐标绘制标准曲线。通过回归分析，建立回归方程I=B lgC+A，计算抑制中浓度I₅₀ 和检测下限I₁₀。

特异性分析

分别测定氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯等菊酯类农药对抗体反应的I₅₀值，PBA 的I₅₀ 与菊酯类其它农药I₅₀ 的百分比值，即为交叉反应率。

表1 不同农药对抗体的抑制力

由表1可知：抗体不仅能识别半抗原，而且识别含半抗原结构在内的大分子化合物，抗体对氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等多种菊酯化合物都有一定的交叉识别。氰戊菊酯识别弱，是因为受邻近基团苯环的影响。

可以理解，很多细节的变化是可能的，但这并不因此违背本发明的范围和精神，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化，皆应视为不脱离本发明专利的范畴。

Claims

1.拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

（b）合成包被原；

2.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤（b）中合成包被原的方法为：PBA 溶于DMF中，加入等摩尔数的DCC和NHS，室温搅拌过夜，再将混合液慢慢滴加至含OVA 的缓冲液，室温磁力搅拌30min，然后在4℃温度下反应6 h，最后反应液在4℃温度下且pH为7.2的磷酸盐缓冲液中透析。

3.根据权利要求1所述的拟除虫菊酯类农药多克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤（b）中合成包被原的方法为：取6-氨基己酸、EDC和OVA 溶于水中，用稀NaOH 调到溶液pH=7.5，室温下在暗中反应18 h 后用Sephadex G-10 纯化、冷冻并干燥保存，再溶于含体积比20%DMF的水溶液中；另将PBA先溶于DMF中，再缓慢滴加入到上述DMF的水溶液中，然后再加入溶于DMF的DCC，调整DMF的最终浓度为30%（v/v）；最后在室温暗中反应18 h，得到的混合物过滤除去沉淀，再透析。