CN104263701B - 一株氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
一株氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。本发明采用甲砜霉素的类似物1‑(4‑氨基苯基)‑2‑二氯乙胺‑1,3‑丙二醇作为半抗原，将半抗原通过重氮化偶联牛血清蛋白（BSA），得到完全抗原，与弗氏佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠；用重氮化法合成包被抗原用于小鼠血清和细胞上清的筛选。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株群选性的杂交瘤细胞株。本发明提供的细胞株对甲砜霉素、氯霉素、氟苯尼考均具有较好的抑制，可以满足目前市场上对氯霉素类多残免疫检测产品的需求。
Description
技术领域
本发明涉及一株氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及氯霉素类通用单克隆抗体的制备方法，属于食品安全免疫学检测技术领域。
背景技术
氯霉素类抗生素是广泛使用的兽药之一，目前主要有氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF）三种药物。然而氯霉素会导致人体再生障碍性贫血，这种毒性作用与剂量和疗程无关，引起许多国家和地区的重视。美国仅允许CAP用于非食用动物，在动物性食品中不得检出；欧盟不允许CAP用于产奶母牛和产蛋鸡，在其它大动物的使用也受到限制。我国农业部2002年2月发布《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》，明文禁止在所有食品动物中使用CAP。TAP的血液系统毒性较低，抑制红细胞、白细胞和血小板，免疫抑制作用较强，目前除我国与日本外，欧共体和美国均限制或禁用于食品动物。
FF作为新一代的CAP替代品，以其广谱、高效、吸收迅速、分布广泛、安全、动物专用等特点，在国内外畜牧和水产养殖、防疫上迅速获得广泛应用。但是，繁殖毒性试验结果表明，FF具有胚胎毒性，使F1代雄性大鼠附睾重量明显减轻，F2幼仔的哺乳指标降低，存活率也较低，建议培育的种牛以及怀孕、哺乳期的牛（包括奶牛）禁用。美国FDA规定，FF的宰前停药期为28天。国内休药期一般畜禽30天，水产类7天。FF在动物体内的主要代谢产物为氟苯尼考胺（FFA），同时还有氟苯尼考醇、氟苯尼考草氨酸及一些还未辨明的代谢物，在不同动物及不同脏器中代谢物的比例和成分又有所不同，根据FF代谢特点及样本处理程序，通常以FFA作为残留标示物。目前，许多国家都规定了其在食品性动物中的最高残留限量。
动物饲料和组织中氯霉素类药物残留是兽药残留研究领域的重点监控对象，因此，亟待建立一种快速、灵敏、准确的氯霉素类药物残留检测方法，确保动物性食品的安全。
目前检测氯霉素类抗生素的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）等仪器检测方法，而免疫分析方法相对较少。其中仪器检测方法检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，时间长，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
发明内容
本发明的目的在于提供一株氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，通过细胞株的筛选，得到的抗体对CAP、TAP、FF都具有较好检测灵敏度，可以用来建立氯霉素类总量的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株氯霉素类通用性单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9306。
氯霉素类通用性单克隆抗体，其由氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCC No.9306所分泌产生。所述氯霉素类通用性单克隆抗体应用于氯霉素类的多残免疫检测。
提供的氯霉素类通用性单克隆抗体的制备方法基本步骤为：
（1）完全抗原的制备：采用重氮化法分别合成免疫原和包被原。合成的具体步骤如下：
A液制备：以甲砜霉素（TAP）的类似物即1-(4-氨基苯基)-2-二氯乙胺-1,3-丙二醇(TAP-NH2)作为半抗原，取0.023mmol半抗原于25mL烧杯中，加入2mL DMF、0.2mL水和0.2mL的1mol/L盐酸溶液，形成黄色溶液，冷至0-5℃；然后逐滴滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉-碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h；
B液制备：称取20mg的KLH、100mg的BSA及150mg的OVA分别溶于均为6mL pH 9.0硼酸盐缓冲液，得三支不同的B液，4℃保存；
在4℃搅拌下，将A液逐滴滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，使保持pH 9，4℃搅拌过夜，透析，即分别得到免疫原TAP-NH2-KLH，包被原TAP-NH2-BSA及TAP-NH2-OVA；
（2）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg 偶联抗原TAP-NH2-KLH与等量福氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg 偶联抗原TAP-NH2-KLH与等量福氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原TAP-NH2-KLH加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；
其具体ELISA 程序如下：
a、包被：将包被抗原（TAP-NH2-OVA）用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，加入酶标板孔中100μL/孔，37℃孵育2h；
b、洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
c、封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；
d、加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的氯霉素类标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原（TAP-NH2-OVA）的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
e、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1:5），37℃避光反应15min；
f、终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
g、结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度；
（3）细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
h、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
i、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
j、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用TAP、CAP、FF为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对三个标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌氯霉素类通用性单克隆抗体的细胞株CGMCC No.9306。
（4）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞CGMCC No.9306，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
本发明的有益效果：本发明采用氯霉素的含苯氨基的类似物作为半抗原，用重氮化法分别合成免疫原和包被原；免疫BALB/c小鼠，获得了对TAP、CAP、FF等均具有较好亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体；该抗体使得氯霉素类的多残免疫检测方法成为了可能。
生物材料样品保藏：一株氯霉素类通用性单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年5月28日，保藏编号为CGMCC No.9306。
附图说明
图1是完全抗原的紫外表征图。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对CAP、TAP、FF均有较好灵敏度的通用性单克隆抗体。
实施例1 氯霉素类通用性单克隆抗体的制备
1、完全抗原的制备
A液制备：取0.023mmol半抗原TAP-NH2于25mL烧杯中，加入2mL DMF、0.2mL水和0.2mL的1mol/L盐酸溶液，形成黄色溶液，冷至0-5℃。然后逐滴滴加1mol/L亚硝酸钠溶液，用淀粉-碘化钾试纸监测，直到试纸变蓝灰色停止滴加，4℃下搅拌1h。
B液制备：称取20mg的KLH、100mg的BSA及150mg的OVA分别溶于均为6mL pH9.0硼酸盐缓冲液，得三支不同的B液，4℃保存。在4℃搅拌下，将A液逐滴滴加到B液中，并用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH，使保持pH 9，4℃搅拌过夜，透析，即分别得到免疫原TAP-NH2-KLH、包被原TAP-NH2-BSA及 TAP-NH2-OVA。
2、动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c 小鼠进行免疫。取免疫原与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后，通过皮下注射免疫BALB/c小鼠，每只100μg；每间隔21天，采用免疫原与等体积弗氏不完全佐剂进行加强免疫，三免后7-10天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在四免后21天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制。
其具体ELISA 程序如下：
1)包被：将包被抗原（TAP-NH2-OVA）用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，加入酶标板孔中100μL/孔，37℃孵育2h；
2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；
4)加样：酶标板上半部分加入PBS，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的氯霉素类标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原（TAP-NH2-OVA）的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；
5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液比例1︰5），37℃避光反应15min；
6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD450；
7)结果判读：以OD450值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
3、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；
4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用TAP、CAP、FF为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对三个标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌氯霉素类通用性单克隆抗体的细胞株CGMCC No.9306。
5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞CGMCC No.9306，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对CAP、TAP、FF的IC50分别为：0.13ng/mL、0.55ng/mL、1.5ng/mL；可以满足目前市场上对氯霉素类免疫检测产品的需求。
该单克隆抗体对CAP、TAP、FF的IC50和交叉反应率如表1所示。
表1
| IC50(ng/mL) | 交叉反应率 | |
| TAP | 0.55 | 100.00% |
| CAP | 0.13 | 423.07% |
| FF | 1.5 | 36.67% |
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
Claims (4)
1.一株氯霉素类通用性单克隆细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9306。
2.权利要求1所述细胞株分泌产生的氯霉素类通用性单克隆抗体，其特征在于：其由氯霉素类通用性单克隆抗体杂交瘤细胞株CGMCC No.9306所分泌产生。
3.权利要求2所述氯霉素类通用性单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤为：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞CGMCC No.9306，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的氯霉素类通用性单克隆抗体，置于-20℃保存。
4.权利要求2所述氯霉素类通用性单克隆抗体的应用，其特征在于：所述氯霉素类通用性单克隆抗体应用于氯霉素类的多残免疫检测。
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