CN101921730B - 一种莱克多巴胺的单克隆抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体、其制备方法及应用，属于免疫化学技术领域。本发明采用混合酸酐法将莱克多巴胺和载体蛋白BSA、HSA及OVA偶联，合成人工免疫原RAC-BSA，RAC-HSA和包被原RAC-OVA；用合成的人工免疫原RAC-BSA，RAC-HSA免疫Balb/c鼠，取免疫鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，用包被原RAC-OVA包被，建立间接ELISA法和间接竞争ELISA法筛选出能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株(5D8)。用获得的细胞株免疫Balb/c鼠制备腹水，用辛酸-硫酸铵法和离子交换法纯化腹水，纯化后的抗体效价达到5.12×10⁵以上。该单克隆抗体特异性强，应用于制备莱克多巴胺残留检测试剂盒和胶体金试纸条，可灵敏快速地检测莱克多巴胺残留。

Description

一种莱克多巴胺的单克隆抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。

背景技术

莱克多巴胺·盐酸(Ractopamine hydrochloride，RAC)，是一种苯酚胺类β₂一肾上腺素激动剂，临床上普遍用于支气管哮喘治疗。除此之外，作为目前最实用的β-兴奋剂之一，还会被用于体育比赛中，增强动物或人的肌肉以提高运动成绩，国际奥委会已将其列为禁用药物。在20世纪80年代的一系列动物试验表明，当用药量为治疗剂量的5-10倍时，莱克多巴胺具有增强脂肪分解代谢，促进蛋白质合成，显著增加酮体瘦肉率，提高饲料转化率的作用，所以，在畜产品生产中可将莱克多巴胺作为促生长添加剂使用，但是，人类食用含有该残留的畜产品会引发食物中毒。虽然在欧洲和中国已经禁止将莱克多巴胺作为饲料添加剂，但非法使用的情况时有发生。我国农业部、卫生部和国家药品监督管理局共同发布的176公告中明确规定，禁止在饲料中使用β₂-兴奋剂药物。176公告中明确规定的此类药物除莱克多巴胺、盐酸克仑特罗外，还有沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴胺、西吗特罗、硫酸特布他林等。商务部、海关总署公告2009年第110号，公布自2009年12月9日起，禁止进出口莱克多巴胺和盐酸莱克多巴胺。因此，做好莱克多巴胺残留检测，对于保障食品安全至关重要。由于作为半抗原的莱克多巴胺本身不能诱导机体产生抗体，必须将其与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原才具有抗原性。而小分子抗原与载体蛋白的偶联效果及细胞融合后阳性克隆的筛选都直接影响着抗体的制备效果，是抗体制备的关键。为了建立莱克多巴胺酶免疫分析方法和金标试纸，需要制备特异性强、可大量生产的莱克多巴胺的单克隆抗体。但目前制备所得的莱克多巴胺的单克隆抗体特异性不强，也无法大量生产。申请人检索发现，核农学报(2005，19(5)：393-396)的一篇文献中介绍了莱克多巴胺单克隆抗体的制备与鉴定，在ELISA分析中抗体的IC50为14.1ng/ml，这说明抗体的灵敏度不高，难以检出样品中所含的极微量的莱克多巴胺残留。2009年12月4日，我国商务部、海关总署叫停莱克多巴胺的进出口，欧盟也早已叫停莱克多巴胺用于食用性动物，为了满足各国对莱克多巴胺残留限量检测的需求，所获得的抗莱克多巴胺抗体的灵敏度越高越好，由文献记载所获得的莱克多巴胺抗体已不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明要解决技术问题是：针对现有莱克多巴胺单克隆抗体灵敏度不高的现状，提出一种莱克多巴胺的单克隆抗体，利用其灵敏度高和特异性强的特点应用于莱克多巴胺的检测中，满足实际应用的需要。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案如下：

一种产生莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D8，是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.3571。该细胞系已于2009年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是CGMCCNo.3571。

由以上杂交瘤细胞系CGMCC No.3571分泌的单克隆抗体5D8’。所述单克隆抗体5D8’的亚型为IgG1型。

该单克隆抗体5D8’的制备方法，包括以下步骤：

a.制备免疫原和包被原：采用混合酸酐法将载体蛋白与莱克多巴胺偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原进行免疫以及加强免疫；

c.筛选免疫动物血清：用间接酶联免疫吸附法和间接竞争酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

d.制备杂交瘤细胞：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得稳定分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体细胞株5D8；

e.制备并纯化单克隆抗体：对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5D8，采集腹水，以及腹水的液相层析纯化，获得单克隆抗体5D8’。

本发明的目的由以下技术方案进一步实现：

所述步骤a中，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白和卵清白蛋白的至少一种，对应的免疫原为RAC-BSA、RAC-HSA，包被原为RAC-OVA；所述混合酸酐法中，先用三丁胺和氯甲酸异丁酯对莱克多巴胺进行活化1-2小时，再将莱克多巴胺加入载体蛋白中反应20-26小时，得到莱克多巴胺与载体蛋白的偶联产物，测定偶联比，与常规方法不同的是采用质谱法测定偶联比。

所述步骤b中的各次免疫注射剂量是50-100μg/只。

所述步骤c中，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按2∶1-10∶1进行细胞融合。

本发明还提供了单克隆抗体5D8’在检测动物性食品中莱克多巴胺残留的应用。

本发明通过小鼠杂交瘤细胞株5D8产生特异性强的莱克多巴胺单克隆抗体5D8’，其与盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、特布他林无交叉反应，能够大量生产，可用于制备检测莱克多巴胺的酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条，达到快速灵敏地检测猪尿、猪肉及猪内脏中的莱克多巴胺药物残留的效果。其有益效果是：灵敏度高，使用方便，可以满足实际应用的需要。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1：BSA载体蛋白质谱图

图2：RAC-BSA免疫原质谱检测图。

图3：OVA载体蛋白质谱图

图4：RAC-OVA包被原质谱检测图。

图5：HSA载体蛋白质谱图

图6：RAC-HSA免疫原质谱检测图。

图7：本发明的单克隆抗体5D8’的标准抑制率曲线。图中横坐标表示RAC浓度的对数。

图8：本发明的单克隆抗体5D8’与其他药物的交叉反应图。图中横坐标表示抑制物浓度，单位ng/ml；纵坐标表示OD值。

具体实施方式

实施例一

试剂与材料准备

莱克多巴胺(sigma，34198)，戊二酸酐(sigma，G3806)，硼酸钠(sigma，S9640)，吡啶(国药集团化学试剂有限公司)，三正丁胺(国药集团化学试剂有限公司)，氯甲酸异丁酯(国药集团化学试剂有限公司)，1，4-二氧六环(国药集团化学试剂有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(Jackson，001-000-173)，卵清白蛋白(OVA)(Sigma，A5503)，人血清白蛋白(HSA)(Sigma，A9511)，氯化钠(Amresco，0241)，氯化钾(Amresco，0395)，磷酸二氢钾(Sigma，P9791)，磷酸氢二钠(Sigma，71639)，弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)，弗氏不完全佐剂(Sigma，F5506)，四甲基联苯胺(TMB)(Amresco，0759)，HAT(Sigma，H0262)和HT(Sigma，H0137)，羊抗鼠二抗IgG-HRP(Jackson，115-035-044)，二甲基亚砜(DMSO)(Applichem，0231)，聚乙二醇4000(PEG4000)(Sigma，P7306)，DMEM高糖培养基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco，C2027050)，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(Shimadzu，Axima-CFRplus)。

实验动物与细胞：Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，购自扬州大学动物中心，SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)由中科院生物物理研究所感染与免疫研究中心唐捷教授惠赠。

本发明的实验步骤如下：

a.制备免疫原RAC-BSA、RAC-HSA和包被原RAC-OVA：

本发明所述的人工抗原采用多元酸酐法和混合酸酐法^【1】制备莱克多巴胺药物与载体蛋白复合物，步骤如下：

(1)将5mg莱克多巴胺盐酸盐与2mg戊二酸酐在400ul吡啶溶液中室温反应24h。

(2)将(1)中反应液经旋转蒸发仪蒸干后溶于1ml DMF-1，4二氧六环溶液中，加入三丁胺5ul，冰浴振荡10min以上，再加入氯甲酸异丁酯3ul振荡1.5小时。

(3)将(2)得到的反应产物滴入BSA溶液、HSA溶液或OVA蛋白溶液中，滴加完毕后25℃下搅拌反应25h。

(4)将(3)得到的反应产物进行透析，高速离心30min，收集上清，保存于-20℃备用。

(5)对BSA，HSA，OVA蛋白标准品及透析后的免疫原RAC-BSA，RAC-HSA和包被原RAC-OVA，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪分别进行质谱检测，从图2、图4和图6的结果可以判定偶联成功，免疫原RAC-BSA、RAC-HAS的偶连比分别为9∶1和11∶1，包被原RAC-OVA的偶连比为24∶1。利用质谱方法直接比较分子量大小的差异测定偶联比，结果更加准确。

b.动物免疫：

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原是CAP-HSA或CAP-BSA，每次免疫剂量为50-100μg/只小鼠，共免疫三次。

c.筛选免疫小鼠血清：

以上免疫鼠在最后一次免疫后7-10天，用间接ELISA法和间接竞争ELISA方法测血清抗体效价^【2】。选取血清效价高的小鼠进行加强免疫，免疫的剂量为50-100μg/只，免疫三天后取小鼠脾脏进行下一步实验。

d.制备杂交瘤细胞：

取上述免疫Balb/c小鼠的脾细胞，以50％的PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按6∶1进行细胞融合。采用间接ELISA法检测融合后存活的细胞培养上清，对阳性克隆进行亚克隆，检测有单克隆生长孔的细胞培养上清，阳性率达到100％，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D8。

该步骤中建立间接ELISA法的步骤如下：

最佳抗原包被浓度的选择，采用方阵法确定包被原浓度：

(1)包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释成一系列浓度加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)一抗：加入系列浓度的抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2M的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：选择抗体稀释度为8k、OD₄₅₀＞1.0，抗原用量最少的浓度为包被原最佳包被稀释度，具体结果见表1，此包被原的包被稀释度为1∶128000。

表1抗原、抗体最佳工作浓度

该步骤中建立间接竞争ELISA法的步骤如下：

(1)包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释为0.125ug/ml，加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)加样：先将相邻两孔酶标板孔内加入稀释液，50μL/孔，与此两孔相邻的孔内加入适当浓度的莱克多巴胺标准品，50μL/孔，最后加入稀释好的抗体，50μL/孔，酶标板稍作震荡混匀，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入1∶10000稀释的羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2mol/L的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：首先，从肉眼可以看出，抑制孔与未抑制孔颜色的变化，若抑制孔颜色较浅或者无色，说明有特异性抗体产生，反之则无特异性抗体产生。其次，根据OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，说明有特异性抗体产生。采用同样浓度下抑制效果明显的小鼠进行加强免疫，然后取其脾细胞进行细胞融合，并筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

抗体特异性的强弱可根据竞争抑制率的大小来判定。

竞争抑制率＝1-(B/B₀)(B为加竞争物的抑制孔OD值，B₀为不加竞争物的阳性对照孔OD值)。

e.制备并纯化单克隆抗体，效价测定：

首先制备和鉴定单克隆抗体：细胞复苏时取出冻存管，立即于37℃水浴中融解，之后移入培养皿内扩大培养，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。其中，冻存管内冻存的是对数生长期的能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D8。

用灭菌石蜡免疫Balb/c小鼠，7天后分别对每组小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5D8，注射剂量为1×10⁶个/只，7-10天采集腹水，得到单克隆抗体，命名为5D8’。采用购自Pierce公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Monoclonal Antibody Subtype IdentificationKit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，其亚型鉴定结果表明，单克隆抗体5D8’为IgG1亚型，结果见表2。

抗体亚型	5D8 clone
		IgA	0.223
IgG3	0.200
		IgM	0.190
IgG1	1.444
		IgG2a	0.296
IgG2b	0.197
		κ链	0.929
λ链	0.244
		blank control	0.204
negative	0.220

表2抗体亚型鉴定结果

纯化单克隆抗体(以下简称单抗)：用液相层析法对上述腹水进行处理，具体步骤如下：

(1)取1倍体积的腹水，加入4倍体积的NaAC-HAc缓冲液；

(2)按每ml腹水加入10-50％的辛酸的量，加好后，室温于摇床上摇30min，之后4℃静置3h；

(3)高速离心30min，取上清，用NaOH调pH至7.4；

(4)向上清中加入一定体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置1h。之后高速离心10min；

(5)弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀；

(6)将单抗悬液转入透析袋内透析12h；

(7)透析后的单抗做进一步纯化，所用上样缓冲液为20mMTris-HCL，pH8.6，洗脱缓冲液为20mM Tris-HCL，1M NaCL，pH8.6，1ml/管收集单抗；

(8)将(7)中纯化后的单抗进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。利用紫外分光光度计测定其浓度和效价，低温保存；

(9)单抗效价的测定：以1∶12800稀释的包被原RAC-OVA包被ELISA板，将纯化的5D8’单抗进行1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000，1∶256000，1∶512000稀释，加入酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，最后用TMB显色，结果见表3。

表3单抗5D8’的效价测定结果

效价判定标准：当P/N≥2.1时的抗体最大稀释度。

5D8’抗体检测结果：当纯化抗体浓度为1mg/ml时，效价可达5.12×10⁵以上；

(10)检测纯化单抗的特异性：采用步骤d中建立的间接竞争ELISA法进行，包被有抗原的ELISA板内，加入纯化后的5D8’(0.05μg/ml抗体，同时加入不同浓度的莱克多巴胺标准品，莱克多巴胺浓度分别为10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.313ng/ml、0ng/mL，重复测定3次，结果分别见表4。以药物浓度的自然对数为横坐标，以B/B₀值为纵坐标绘制标曲线，结果见图7。根据试验数据计算5D8’单抗的IC₅₀值分别为2.6ng/ml。从标准曲线的OD值和IC₅₀值可以看出，本发明中筛选到的单克隆抗体具有很高的特异性和敏感性。

表4单克隆抗体5D8’的抑制效果

(11)单克隆抗体亲和力的测定

根据Gosling介绍的ELISA方法进行抗体亲和力的测定，其亲和力的大小用亲和常数Ka的大小来表示，公式为：

$\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-V)$

亲和常数的单位为浓度的倒数，即：克分子浓度(L/moL)，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。其检测过程如下：

第一步、确定抗原，抗体最佳作用浓度：

1、将人工抗原分别进行13000，26000，52000，104000，208000，416000倍稀释后各包被4条，100L/孔，37℃，温育2h，洗涤、封闭；

2、将抗体进行7500，15000，30000，60000，120000，240000，480000倍稀释，分别加于2条中，100L/孔，室温温育1h；

3、将这两条中的抗体分别移入第二条中，室温温育1h；

4、将这两条洗涤加酶标二抗，继续做ELISA，最后测定OD值A1；

5、后两条按上述步骤，最后测定OD值A2。

6、根据公式 $f=\frac{A_1\left(c\right)-A_2\left(c\right)}{A_1\left(c\right)}$

计算f值，选取所有f值都小于10％的抗原，抗体稀释度，根据OD值大小确定最佳抗原浓度为128000倍稀释，最佳抗体浓度为8000倍稀释。

第二步、测定亲和力

1、配制一系列浓度抗原6个；

2、在加有最佳浓度抗体的EP管内加入等量系列浓度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀释液，室温下过夜；

3、同时将抗原进行128000倍稀释后进行包被，室温下过夜，洗板，封闭；

4、将第二步的反应产物取100μL加入以上封闭的板孔内，室温下进行ELISA，最后测定OD值A；

5、根据Scatchard公式 $\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-V)$ 计算其斜率值，

其中，α为游离抗原的浓度，V为结合抗体位点与总抗体位点的比，所得亲和力的大小即亲和常数Ka，为斜率值的负数。得到的结果是单克隆抗体5D8’的亲和常数为3.6×10¹⁰。由此得出本发明的单克隆抗体5D8’灵敏度较高。

实施例二

药物交叉反应试验

按实施例一中建立的单抗筛选间接竞争ELISA方法，进行莱克多巴胺的单克隆抗体与克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林的间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，如图8。计算竞争物的IC₅₀值和交叉反应率，其交叉反应率均小于0.01％。因此，本发明中所制备的抗莱克多巴胺的单克隆抗体具有非常好的特异性。

实施例三

1、本实施例是本发明中单克隆抗体5D8’在建立检测莱克多巴胺残留ELISA方法的应用举例，可以用于猪尿、猪肉、猪内脏中莱克多巴胺残留的检测。

2、本发明中试剂盒的检测原理是间接竞争ELISA方法，操作步骤同常规间接ELISA方法，将包被原OVA-RAC包被于微孔板上，在前两列孔内分别加入10、5，2.5，1.25，0.616，0.313ng/ml的莱克多巴胺标准品，其余孔内加入样品，再加入抗莱克多巴胺的单克隆抗体(本实施例中选取的单克隆抗体是5D8’)，样品中残留的莱克多巴胺与包被的抗原同时与抗莱克多巴胺的抗体竞争性结合，然后加入酶标二抗，TMB显色，显色后在酶标仪上读取OD₄₅₀，样品中莱克多巴胺的含量与样本吸光度值呈负相关，与标准曲线相比，即可得出相应残留物莱克多巴胺的含量。

3、本发明中抗莱克多巴胺的单克隆抗体的高特异性、高亲和力，使得检测的灵敏度大大提高，标准曲线范围为0.313-10ng/ml。

实施例四

本实施例是本发明中的单克隆抗体5D8’在制备莱克多巴胺残留的胶体金试纸条中的应用举例，主要是应用于检测猪尿、猪肉、猪内脏中的莱克多巴胺残留。

反应原理采用竞争法对小分子药物莱克多巴胺进行半定量检测，样品中存在的莱克多巴胺分子在沿试纸条上移过程中先与金颗粒标记的5D8’抗体结合，固定在NC膜上的包被原与莱克多巴胺同时竞争结合金标抗体，T线的显色强弱与样品中残留莱克多巴胺的含量成反比。若样品中无莱克多巴胺残留，则试纸条的T线和C线显色一致；若样品中莱克多巴胺残留大于1ng/mL，则T线比C线显色明显减弱甚至消失；当C线不显色，T线显色或不显色都表示试纸条失效。

具体操作步骤如下：

1.将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上；

2.静置反应5-10分钟时读取测试结果，10分钟以后判定无效。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

参考文献：

1.洪孝庄，孙曼霁.《蛋白质连接技术》.中国医药科技出版社，1992.

2.杨利国，《酶免疫测定技术》，南京大学出版社，1998.

3.Gary C.Howard.Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook.CRC Press，2006.127-130.

Claims (4)

1.一种产生莱克多巴胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D8，是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.3571。

2.一种由杂交瘤细胞系CGMCC No.3571分泌的单克隆抗体5D8’。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体5D8’，其亚型为IgG1型。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体5D8’在检测动物性食品中莱克多巴胺残留的应用。

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