CN102168072B - 一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体及检测盐酸克伦特罗的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法及检测盐酸克伦特罗的试剂盒。将盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔，取腹水，经饱和硫酸胺获沉淀，沉淀溶解后透析，最后经Protein G亲和层析纯化，收集吸收峰而得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。本方法制得的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体能够用于建立快速检测食品中盐酸克伦特罗(即瘦肉精)残留的竞争法酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条，满足大批量样品的检测需要。

Description

一种抗盐酸克伦特罗单克隆抗体及检测盐酸克伦特罗的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗盐酸克伦特罗抗体的制备、检测盐酸克伦特罗的试剂盒以及胶体金试纸条的检测方法。 

背景技术

瘦肉精即盐酸克伦特罗(CLB) ，是一种β2-受体激动剂，上世纪90年代初在国外曾用于饲料添加剂，后因对人的不良反应而被禁用。一些养猪户为了使猪肉不长肥膘，不顾农业部的规定，在饲料中掺入瘦肉精。在猪的代谢过程中，瘦肉精会促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精。 

目前，国内外用于检测CLB的常用方法有试纸条检验法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(CG-MS)、毛细管区带电泳法(CE)和免疫分析(IA)等技术，但都不是十分理想，主要由于单克隆抗体的特异性低，IC50(半数抑制浓度)较高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高特异性的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，该单克隆抗体具有较高效价及抑制价；本发明还提供检测盐酸克伦特罗的试剂盒。 

本发明提供一种产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为：CGMCCNo.4302，分类命名为：盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

该产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤： 

(1)制备长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物： 

所述载体蛋白为钥孔嘁血蓝蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白，所述长臂盐酸克伦特罗的结构如下： 

(2)动物免疫 

以步骤1所述长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物为免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，检测该血清抗盐酸克伦特罗的效价和抑制价，选取效价和抑制价最高的免疫小鼠； 

(3)细胞融合 

取步骤(2)所得免疫小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，培养； 

(4)杂交瘤细胞株的筛选 

检测各融合细胞培养后的上清液的抗体效价及抑制价，选取抗体效价及抑制价最高者即为盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株。 

本发明还提供所述盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤细胞株分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。 

制备该抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的方法，包括如下步骤： 

(1)腹水的制备：将所述杂交瘤细胞株注入BALB/c雌性小鼠腹腔，5-7后天产生腹水；取腹水上清； 

(2)抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的纯化： 

初步纯化：所述腹水上清经饱和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，获得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品； 

Protein G亲和层析纯化：将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品经Protein G亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，即为抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。 

本发明所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体可以应用于盐酸克伦特罗的定性或定量检测。 

本发明还提供一种利用所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体检测盐酸克伦特罗的试剂盒，该试剂盒的组成如下： 

(1)用含有长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物的缓冲液包被过的酶标板； 

(2)HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液； 

(3)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L； 

(4)终止液：浓度为2M的H₂SO₄； 

(5)盐酸克伦特罗标准液：浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.7μg/L； 

(6)20倍浓缩洗液：浓度为0.2M，pH为7.4的PBST。 

本发明抗盐酸克伦特罗单克隆抗体具有较高效价和特异性，能够用于建立快速检测食品中盐酸克伦特罗残留的免疫学方法，所述的方法为竞争法酶联免疫试剂盒与胶体金试纸条，该方法对仪器设备和人员操作的要求较低，检测成本低，能够满足对大批量样品检测的需要。 

具体实施方式

实施例1抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备 

1.长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物制备 

(1)长臂盐酸克伦特罗的合成 

a.取0.1mol化合物A于50ml圆底烧瓶中，加入充分除水的CH₂Cl₂30ml使其充分溶解； 

b.在室温搅拌下加入三乙胺0.22mol，冷却， 

d.搅拌，加入丁二酸酐0.1mol，室温反应8h，旋转蒸发掉熔剂， 

d.所得反应混合物采用柱层析纯化(甲醇∶氯仿＝1∶5)，得白色固体产物半抗原C，即长臂盐酸克伦特罗，产率60％。 

(2)长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物(免疫原)的制备 

a.取1-5mg长臂盐酸克伦特罗溶于0.5ml的无水DMF(二甲基甲酰胺)中，再加入6mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和10mgEDC(1-乙基-3-(3-二甲丙氨基)碳化二酰亚胺)，室温搅拌过夜。 

b.将20mg载体蛋白溶解于2ml的碳酸盐或磷酸缓冲液中，获得载体蛋白溶液。 

c.将步骤a所得反应混合物以4000r/min离心5-10min，离心去除沉淀后，将上清液缓慢搅拌加入载体蛋白溶液中(半个小时内慢慢加完)。4℃搅拌反应4-6h。 

d.反应结束后，取清液装入透析袋，用pH7.4的磷酸或碳酸缓冲液在4℃透析2天，每天更换3次透析液。 

e.收集透析袋中液体，即为长臂克伦特罗与载体蛋白的耦连物。-20度保存。 

载体蛋白可以为KLH(钥孔嘁血蓝蛋白)、BSA(牛血清蛋白)、OVA(卵清蛋白)或相关蛋白。 

2.动物免疫 

以长臂盐酸克伦特罗-载体蛋白藕联物(免疫原)按免疫程序免疫BALB/c小鼠； 

用1份弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂(SIGMA公司)乳化免疫原(长臂盐酸克伦 特罗-载体蛋白藕联物)，获得免疫原浓度为800μg/ml的疫苗。 

选取6～8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠接种上述疫苗，每两周免疫一次，免疫程序如下表。 

注：第二次和第四次免疫一周后尾静脉采血，用间接ELISA和竞争ELISA检测血清对盐酸克伦特罗的效价和半数抑制价，选取血清效价和抑制价最高的小鼠，进行免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合。 

说明书中常用试剂配方：(以下检测方法中CB包被液、20倍浓缩洗液、封闭液、TMB显色剂、终止液均一致) 

CB包被液：pH9.6，具体成分及浓度为：无水碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g/l，碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93gg/l。 

20倍浓缩洗液：Na₂HPO₄·12H₂O 21g/l，NaH₂PO₄·2H₂O 2.80g/l，氯化钠170g/l，吐温20ml/l。 

10mM PBS(pH7.4)配方：：Na₂HPO₄·12H₂O 2.2g/l，NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g/l，NaCl 8.5g/l。 

封闭液：2.9g/l的Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g/l的NaCl，0.2g/l的KCl，0.2g/l的KH₂PO₄·2H₂O，200ml/l的小牛血清，50g/l的蔗糖，0.5g/l的吐温20。 

TMB显色剂：溶液中的TMB浓度是0.3g/L，来源于sigma 

终止液：浓硫酸66.154ml/L。 

血清效价检测方法(间接ELISA)： 

1.配制包被液：将免疫原(长臂盐酸克伦特罗-OVA偶联物)溶解于CB包被液，使其浓度为5μg/ml。 

2.在对应的孔中加入100μl包被溶液，室温孵育2h或4℃过夜。 

3.倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗液(将20倍浓缩洗液稀释20倍)清 洗两次。 

4.每个孔中加300μl封闭液，孵育1h. 

5.倒空液体并拍干残留液体，用300μl洗液清洗两次。 

6.每个孔中加100μl免疫小鼠血清稀释液(免疫小鼠血清稀释100倍)，37℃孵育1h或室温孵育3h。 

7.倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 

8.每个孔中加100μl二抗(1∶20000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，HRP标记的羊抗鼠IgG来源于sigma)，室温孵育1h。 

9.倒空液体并拍干残留液体，每个孔中加满洗液，倒空液体并拍干残留液体，重复3次。 

10.每个孔中加100μlTMB显色剂，显色20min。 

11.终止反应：加终止液每孔50μL，立即在450nm读数。 

竞争法检测血清抑制价(竞争ELISA)： 

1.包被：同血清效价检测方法中的步骤1、2 

2.洗涤：甩掉包被液，用洗液洗3次，在吸水纸上拍干。 

3.封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃水浴中2h，然后用洗液洗涤3次。 

4.竞争反应：将三聚氰胺的PBS溶液按一系列浓度32、16、8、4、1、0.4、0.2、0ng/mL分别加入孔中，然后加入免疫小鼠血清50μL/孔，竞争反应1h。 

5.加酶标二抗(即HRP标记的羊抗鼠IgG)：洗板3次，加1∶20000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(sigma)，每孔100μL，37℃孵育1h。 

6.显色反应：洗板3次，加TMB显色剂每孔100μL，37℃，避光温浴10min。 

7.终止反应：加终止液每孔50μL。 

8.测定OD₄₅₀。 

选取血清效价和抑制价最高的免疫小鼠进行融合。 

3.细胞融合 

(1)饲养细胞的制备 

取8～10周龄的ICR小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10min；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10ml HAT 培养基(SIGMA)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。最后将含有小鼠腹腔细胞的培养基抽出移入预冷的盐水瓶中。分铺到6～8块96孔细胞培养板中，每孔50μl，置37℃，置于6％(V/V)CO₂的细胞培养箱中培养24h～48h备用。 

(2)融合 

选择处于对数生长期的SP2/0细胞株(小鼠骨髓瘤细胞株)，用无抗无血清DMEM(HyClone公司)将其吹下，收集。取0.1ml细胞加入0.9ml浓度为0.4％(w/v)台盼蓝染液，计数。 

将免疫后血清对盐酸克伦特罗的效价和抑制价最高的小鼠摘眼球采阳性血清并断颈椎处死，用75％酒精浸泡10min，无菌取脾脏，用DMEM(HyClone公司)洗涤数次，以除去附着的结缔组织。将脾脏移入含微孔滤网的新鲜DMEM中，用研磨棒轻轻研磨，制成单细胞悬液，并移至10ml离心管中，沉淀5min，弃肉眼可见组织或团块，离心(800rpm，8min)，弃上清，重新用10ml的DMEM悬浮，并计数(方法同骨髓瘤细胞)。 

取约10⁸个脾细胞与2×107个SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000r/min离心10min后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散；将融合管置42℃水浴中预热，60s内先慢后快地加入1ml预热的浓度为50％(v/v)的PEG1500((聚乙二醇1500)SIGMA公司)，边加边轻轻摇动融合管；继续轻轻摇动1min；再于90s内先慢后快加入无血清DMEM培养基30mL；37℃水浴静置10min；1000rpm离心10min，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入适量的预热的HAT培养基，将融合后的细胞混匀，移入100mL盐水瓶中，定容至80mL，分别加入6～8块96孔细胞培养板中，每孔2～3滴，置37℃，6％CO₂的细胞培养箱中培养。 

5天后用HAT培养基进行半换液，10天用HT培养基(也是来源于SIGMA)全部换出HAT，以后每天观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，且上清变黄时取上清进行检测。 

(3)阳性克隆的筛选 

a.检测板抗原包被浓度的确定 

融合前，摘取免疫后血清效价、抑制价最高的小鼠眼球获得阳性血清，作为筛选时的阳性对照，非免疫鼠的血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。利用方阵试验来确定抗原(长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物)的包被浓度：取96孔ELISA检测板(深圳金灿华实业有限公司)，用0.05mol/L的CB包被液自左向右倍比稀释抗 原，每一稀释浓度为一列，第一列不加抗原作为空白对照，100μL/孔，4℃包被过夜，用洗液洗涤三次，每次5min，洗后于吸水纸上拍干；封闭液37℃封闭2h，同前洗涤拍干；将血清依次倍比稀释，自上而下，每一稀释度加一排，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤拍干；加入1∶20000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h，洗涤。加入TMB显色剂，100μL/孔，37℃反应10～15min；终止液终止反应，50μL/孔，读OD₄₅₀值。取OD值在1左右的孔，最终确定包被浓度为5μg/ml。 

b.检测板的准备 

用CB包被液稀释长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物至方阵试验确定的包被浓度，包被96孔ELISA检测板，100μL/孔，4℃包被过夜，洗涤拍干，10％小牛血清封闭，37℃封闭2h，PBST洗涤拍干，-20℃保存，备用。 

(4)抗盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株的筛选及单克隆抗体制备 

a.筛选(间接ELISA) 

吸取待检孔上清100μL加入上述检测板孔中，37℃水浴作用1h后洗涤并拍干，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃水浴作用1h后洗涤，拍干，加TMB显色剂100μL/孔，37℃避光显色10min，终止液终止显色，读取OD₄₅₀值。阳性孔确定原则：OD₄₅₀值/阴性对照值≥2.1。共检测到10个阳性孔，选取效价较高，半数抑制剂最好的一株留种。 

其中杂交瘤株检测效价1∶800，半数抑制率为30ng/mL，命名为抗盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株B-8H10-G12-B10，简称杂交瘤株B-8H10-G12-B10 。 

以上抗盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株B-8H10-G12-B10，已经送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2010年9月30日，保藏号CGMCC No.4302。 

b.抗盐酸克伦特罗单克隆抗体制备 

以杂交瘤株B-8H10-G12-B10进行抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备。 

腹水制备：在杂交瘤细胞株B-8H10-G12-B10培养上清抑制价达到30ng/mL后，收集培养瓶中细胞，打小鼠腹水方法如下： 

1.小鼠选择：10周龄BALB/c雌性小鼠，小鼠毛发油光，活泼约30克体重。 

2.打腹水前小鼠准备：选优鼠在打腹水前的7-30天内，用石蜡油(或其它矿物油)0.5ml/只IP(腹腔)注射致敏。 

3.打腹水：收集杂交瘤细胞株B-8H10-G12-B10加于10mM PBS(pH值7.4)或生理盐水(无菌)中，200万-500万/只鼠，注入小鼠腹腔。 

4.腹水收集：杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。(小鼠状态：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思饮)此时，可用无菌注射器抽取约2-5ml/只。腹水特点：血性或乳白色或微黄、脂性，略浓。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可处死。) 

腹水保存：抽取腹水后置4℃过夜。500rpm离心10min，取腹水上清，短期(3-7天)存放于4℃，中期(1-2月)放于-20℃，长期(6月)存放于-80℃。 

抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的纯化： 

1.单克隆抗体的初步纯化：腹水上清经50％饱和硫酸胺(SAS)沉淀，4℃条件下经15000r/min离心，用PBS溶解沉淀物，溶解液置PBS透析24h，其间换液6次，获得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品。 

2.Protein G亲和层析纯化具体方法如下： 

配制缓冲液：起始缓冲液为20mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0；洗脱缓冲液为0.1mmol/L甘氨酸盐酸，pH2.7。 

准备收集管：取1.5ml离心管，每支离心管加70μl的1mol/L Tris-HCl(pH9.0)。 

样品准备：抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品，置起始缓冲液进行透析过夜后经0.22m微孔滤膜滤过。 

纯化过程：用足够的起始缓冲液(8～10ml)平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱(HiTrap Protein G 1ml，Pharmacia Biotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2～21.1mg)15～25ml上柱，流速为0.5ml/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7～8ml、洗脱缓冲液6～7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液，测每管OD₂₈₀吸收值。收集洗脱峰(OD大于0.2)，即得到抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。BCA法(Sigma，USA)测蛋白含量，4℃保存备用。 

3.抗盐酸克伦特罗单克隆抗体亚类鉴定 

将杂交瘤细胞培养上清液离心，间接ELISA法鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型和亚类。以包被抗原包被酶标板，加入杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，洗涤，分别加入羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA抗体反应，37℃孵育1h，洗涤，再加入HRP标记的兔抗山羊酶标二抗，37℃孵育1h，洗涤，TMB显色测定。 

间接ELISA法检测结果表明，该抗克伦特罗的单克隆抗体亚类为IgG1。 

纯度及活性鉴定：抗盐酸克伦特罗单克隆抗体、腹水上清、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品用SDS-PAGE鉴定其纯度。用10％分离胶、5％浓缩胶，设标准分子量(94KD，67KD，43KD，20.1KD及14.4KD)(Pharmacia)，恒流下电泳2h，考马斯亮蓝R250(Pharmacia)染色。结果表明：腹水上清中含大量的杂蛋白，以白蛋白(分子量约为67000Da左右)为主。经初步纯化后，去除了大量的杂蛋白，电泳图谱上显示出较清晰的轻、重链两条带，仅在重链上方还有少许杂蛋白。经蛋白G亲和层析后，抗体纯度得到进一步提高，基本没有其它杂蛋白。 

抗体活性：经间接ELISA法(血清效价检测方法)证明抗体均有良好活性(效价为1∶20000)，IC50为0..5ng/ml。 

免疫原免疫动物，包括兔子，绵羊，山羊，牛或家禽等动物。 

实施例2检测盐酸克伦特罗的试剂盒 

1、酶标板制备：将检测抗原长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物用CB包被液稀释至1-0.5μg/ml，加入到酶标板的微孔中，100μl/孔，2～8℃过夜，次日用封闭液150μl/孔室温封闭2h，弃去液体，干燥，封装。 

2、HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液的制备 

HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备：称取5mg的HRP(辣根过氧化物酶)溶于1ml蒸馏水中，加入200μl新配的浓度为0.1M的NaIO₄，室温下避光搅拌20分钟，将混合液装入透析袋，用1mM的醋酸盐缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜。然后取透析袋中的溶液，加20μl浓度为0.2M的碳酸盐缓冲液(pH 9.5)使pH为9.0～9.5，然后立即加入实施例1制备的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液(10mg的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶解在1ml浓度为0.01M碳酸盐缓冲液中)，室温避光轻轻搅拌2小时，加入100μl新配的4mg/ml的NaBH₄溶液，混匀，在4℃放置2小时。将上述液体放入透析袋中用0.15M的pH7.4的PBS透析，4℃过夜，取出透析袋内液体，加入等量甘油后放置-20℃保存。 

配制稀释液：0.01M的PBST(pH7.4)缓冲液，含有10％小牛血清。 

HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液的制备：用稀释液中将HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体稀释200倍，混匀，分装为12ml/瓶。 

3、TMB显色剂、终止液及盐酸克伦特罗标准液 

①TMB显示剂，TMB(SIGMA)的浓度是0.3g/L，分装为6ml/瓶； 

②终止液：2M的H₂SO₄，分装为6ml/瓶； 

③、④、⑤、⑥、⑦、⑧盐酸克伦特罗标准液：各2mL，浓度分别为0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.7μg/L盐酸克伦特罗标准液。 

4、20倍浓缩洗液(pH7.4)：0.2M的PBST，分装为30ml/瓶。 

5、组装：将所有瓶装试剂插于盒托的对应孔内，与酶联板、说明书、自封袋、封板膜一起放入纸盒，储存于2～8℃，检验合格后贴检封签。 

实施例3试剂盒的使用方法 

试剂准备：将20倍浓缩洗液和蒸馏水(或去离子水)按1∶19充分混匀，即为洗液，临用前配制。 

编号：将盐酸克伦特罗标准液和待测样本对应微孔按序编号，建议每个标准液和待测样本均做重复孔。 

加样：每孔加入盐酸克伦特罗标准液或样本50μL，然后每孔分别加入HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体50μL。 

温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温反应20min。 

洗涤：小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，加入洗液250-300μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔小于5秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。 

显色：加TMB显色剂100μL，盖上封板膜，37℃避光显色10min。 

测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，5min内测定450nm处吸光度值。 

结果分析： 

1.半定量的结果 

由样品的吸光率与标准的吸光率(盐酸克伦特罗标准液对应的吸光率)的简单对比而来判定：样品的颜色比标准的颜色浅则样品中盐酸克伦特罗的浓度比标准样的浓度高，样品的颜色比标准的颜色深则样品中盐酸克伦特罗的浓度比标准样的浓度低。 

2.定量分析 

绘制以标准的吸光率为X轴，以标准的浓度的半对数为Y轴的曲线图。依据标准的吸光率的点画成一直线。这样，样品的吸光率可在线上找到，与此相对应的Y轴则 为样品的浓度，样品光吸收率范围应比标准样的最底范围高，比最高范围低，即可说明此样品中克伦特罗的含量大于0.1ng/ml或小于8.7ng/ml。 

实施例4检测盐酸克伦特罗的试条 

将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体用胶体金标记后，制备胶体金垫，将羊抗鼠IgG、长臂盐酸克伦特罗-OVA耦联物分别划线于C、T线，装条。 

检测样品制备： 

饲料、组织样：将样品磨细，以0.1M盐酸进行1∶2～1∶5稀释，静置沉淀，取上清液作为用于检测的样品液。 

尿液直接检测，如果特别混浊，5000转离心10分钟，取上清作为用于检测的样品液。 

测试时，将待测样品液滴入样品垫中；约2分钟后观察检测结果。如只出现一条棕红色印迹线，则判定样品为阳性，表示样品内含有克伦特罗。如同时出现两条棕红色印迹线“||”，则判定为阴性，样品内不含盐酸克伦特罗。如果没有棕红色线显示，则表明本试条已失效。 

Claims (5)

1.一种产生抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCCNo.4302，分类命名为盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。

3.一种权利要求2所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)腹水的制备：将所述盐酸克伦特罗特异性淋巴细胞杂交瘤株注入BALB/c雌性小鼠腹腔，5-7天后产生腹水；取腹水上清；

(2)抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的纯化：

初步纯化：所述腹水上清经饱和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，获得抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品；

Protein G亲和层析纯化：将抗盐酸克伦特罗单克隆抗体粗品经Protein G亲和层析柱进行纯化，收集洗脱峰，即为抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。

4.一种权利要求2所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体在盐酸克伦特罗的定性或定量检测中的应用。

5.一种利用权利要求2所述抗盐酸克伦特罗单克隆抗体检测盐酸克伦特罗的试剂盒，其特征在于该试剂盒的组成如下：

(1)用含有长臂盐酸克伦特罗-OVA藕联物的缓冲液包被过的酶标板；

(2)HRP标记的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液；

(3)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L；

(4)终止液：浓度为2M的H₂SO₄；

(5)盐酸克伦特罗标准液：浓度分别为0，0.1，0.3，0.9，2.7，8.7μg/L；

(6)20倍浓缩洗液：浓度为0.2M，pH为7.4的PBST。