CN107988168A - 抗可卡因单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及制备方法 - Google Patents

抗可卡因单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种能产生抗可卡因单克隆抗体的杂交瘤细胞株COC 2B1，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201727。本发明还提供了杂交瘤细胞株COC 2B1分泌的抗可卡因单克隆抗体。本发明又提供了用于用于检测尿液中可卡因的试剂盒。本发明还提供了一种可卡因检测试剂盒的检测方法及制作方法。本发明所具有的有益效果：利用溴乙酸乙酯作交联剂活化可卡因，所获得的可卡因人工抗原保持了可卡因的结构特异性。本发明采用连续免疫法，有效的节省了抗原用量、缩短了免疫时间，杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产量高，其分泌得到的抗可卡因单克隆抗体具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点。本发明提供的检测产品在灵敏度、特异性、检出限等方面更有优势。

Description

抗可卡因单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗可卡因单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株
本发明还涉及可卡因检测试剂盒及其制作方法。
背景技术
可卡因是一种莨菪烷型生物碱，提炼自古柯叶，是一种天然的中枢神经兴奋剂，在医学中，被用作局部麻醉药或血管收缩剂，由于其麻醉效果好，穿透力强，主要用于表面麻醉，但因毒性强，不宜注射，临床上有其盐酸盐、硫酸盐等形式。
但是，可卡因具有抑制中枢神经系统的功能，因而被滥用。可卡因对消化系统、免疫系统、心血管系统和泌尿生殖系统都有损伤作用，尤其作为剂量依赖性肝毒素，可导致肝细胞坏死。过量使用可卡因时，吸食者会呼吸加速、血压及体温升高、心跳数增加、瞳孔放大、口部乾燥、磨牙等。用药者觉得自己兴奋、愉悦、自信、精力充沛、充满智慧。长期使用或使用量大者常觉得紧张、生病、无法放松、焦躁易怒、视力模糊、盗汗、耳鸣、抽筋、失去协调性，而导致人格异常或妄想性精神病症状，若突然停用，就会出现不安、焦虑、忽冷忽热、起鸡皮疙瘩、流泪、流涕、出汗、恶心、腹痛等，并可能发生严重的忧郁及昏昏欲睡现象即为成瘾发作症状。这种戒断反应的痛苦，反过来又促使吸毒者为避免这种痛苦而千方百计地维持吸毒状态。
国内外对可卡因的分析研究多采用血液、尿液、毛发在体内的代谢水平具有重要的意义，血样中毒品的成分相对稳定，萃取率高，但采集血样不方便并要避免污染，毛发中毒品的含量大大低于其它生物检材，常规分析方法难于检测，很长时间里被认为缺乏实用价值。尿样中毒品原体和代谢物浓度较高，相对于其他生物检材，尿液的采取方便，有利于分析。
目前，可卡因的尿液检测主要依赖于高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）这些方法具有极高的灵敏度和精密度,但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员，不能实现现场即时检测；而化学显色法（薄层层析检测法TLC）操作简单、方便，但样品用量大，检测灵敏度和精密度均不高。
鉴于上述检测方法的弊端，可卡因胶体金试纸条产品基于胶体金免疫层析技术，具有快速，操作简单等优点，提供了一种有效的现场检测手段，克服以上缺点，在滥用药物后24h内即可检出，可以替代传统的检测方法，满足公安、征兵、出入境、戒毒所等毒品检测的需要。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种能产生抗可卡因单克隆抗体的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1。该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201727，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
进一步的，所述抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。
本发明第二个目的是提供一种抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）、制备可卡因人工抗原；
（2）、通过连续短时间的快速免疫内刺激小鼠脾细胞使其产生的具有特异性的B淋巴细胞；
（3）、将上述小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到抗可卡因杂交瘤细胞株COC2B1，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。
进一步的 ，步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用丁二酸酐与N-去甲基可卡因缩合得到含有羧基的可卡因半抗原Hapten1，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag1）。
或，进一步的，步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用溴乙酸乙酯亲和取代N-去甲基可卡因，用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因半抗原Hapten2，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag2）。
或，进一步的，步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag3)。
另外，在步骤（2）中，小鼠免疫过程如下：将可卡因人工抗原、弗氏佐剂按1：1的体积通过注射器法乳化得到乳剂，选择6周龄的BALB/c雌鼠进行皮下免疫、腹腔免疫、静脉免疫，共免疫6次，免疫时间为第1天、第7天、第21天、第28天、第30天、32天。
更进一步的，具体步骤是取6周龄的BALB/c雌鼠，第一次免疫，靠近淋巴结皮下部位注射免疫量为50μg的可卡因人工抗原乳剂；第二次皮下免疫，免疫量为25μg的可卡因人工抗原乳剂；第三次腹腔免疫，免疫剂量为25μg的可卡因人工抗原乳剂，第四次、第五次、第六次为追加免疫，用免疫量为10μg可卡因人工抗原不加佐剂经静脉免疫，连续免疫，最后一次免疫3天后处死小鼠取血清。
本发明还提供了抗可卡因单克隆抗体，该抗体由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生。
本发明又提供了一种用于检测尿液中可卡因的试剂盒，所述试剂盒包括：
（1）携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为CCTCCNO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因单克隆抗体。
（2）包被有可卡因-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。
另外，本发明还提供过来上述试剂盒的制作方法，它包括以下步骤：
（1）可卡因人工抗原的制备：
以可卡因盐酸盐为原料，游离后经高锰酸钾氧化后与溴丁酸乙酯进行亲核取代反应或者与丁二酸酐缩合或者直接水解得到含羧基的可卡因半抗原，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与载体蛋白（BSA或者BGG）结合制备可卡因人工抗原。
（2）可卡因单克隆抗体的制备：
提取由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因克隆抗体，纯化该单克隆抗体；
（3）胶体金的制备：
取1ml 1%氯金酸（HAuCl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化，此时制得的胶体金颗粒为30nm；
（4）金标制备：
取步骤（3）中制备好的胶体金，用1M NaOH调节pH至8.5，然后加入上述抗体1份，磁力搅拌器上搅拌，然后加入一定量的BSA至终浓度0.5-2%，搅拌待用；将上述已经偶联好抗体的胶体金溶液离心，弃去沉淀，保留溶液；沉淀用含20%的蔗糖的金标抗体稀释液复溶，转入棕色瓶内保存备用；
（5）金标条的制备：
将金标工作液均匀喷到金标垫上:将喷好金标工作液的金标垫干燥切条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；
（6）NC膜的包被：
将一定量的可卡因抗原偶联物（COC-BSA）和羊抗鼠多克隆抗体（GAM）纯化，上述可卡因抗原偶联物及羊抗鼠多克隆抗体分别上样到点膜机的T、C柱中，T、C线溶液包被到NC膜上；将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；
（7）玻纤的处理：
将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。
（8）试剂条的组装：
将处理好的NC膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到PVC板上，然后切割成4.0mm条，组装好的可卡因尿液检测试剂适用于尿液可卡因的检测。
由于采用了本发明的技术方案，具有以下优势：
1.本发明在制备可卡因人工抗原过程中，2号抗原用高锰酸钾氧化后用溴丁酸乙酯偶联水解后再用碳二亚胺作交联剂活化可卡因，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在可卡因半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的可卡因人工抗原保持了可卡因的结构特异性，有利于相应可卡因抗体的产生。
2.本发明在制备抗可卡因单克隆抗体过程中，采用新型免疫方法——“连续刺激法”免疫方法，用时不到1个月，抗原用量不足100μg，大大缩短了单克隆抗体制备的时间，同时通过皮下免疫+静脉免疫的“连续刺激法”方法，有效的节省了抗原用量、缩短了免疫时间，但又保留了传统免疫方法的IgG类抗体稳定，亲和力强等优点。是一种突破传统的有效免疫方法。
3. 本发明所述的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产量高，其分泌得到的抗可卡因单克隆抗体具有高亲和力、高特异性、高灵敏度特点，适用于300ng/ml阈值的尿液检测。本发明提供的检测产品与现有的其它产品相比，在灵敏度、特异性、检出限等方面都更有优势。
附图说明
图1为小鼠血清效价图。
图2为抗可卡因单克隆抗体亚型鉴定示意图。
图3为热稳定性评估示意图。
图4为抗可卡因单克隆抗体的亲和力常数测定示意图。
具体实施方式
以下对本发明作进一步说明。
实施例一：
能产生抗可卡因单克隆抗体的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1。该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201727，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
具体的，所述抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。
更具体的，所述抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1由可卡因人工抗原诱导小鼠产生，在制备可卡因人工抗原过程中，方法一是利用高锰酸钾氧化得到去甲基可卡因，然后用丁二酸酐活化可卡因，交联蛋白后得到可卡因抗原（COC Ag1）。方法二是利用高锰酸钾氧化得到去甲基可卡因，然后用溴丁酸乙酯亲和取代去甲基可卡因，再用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因衍生物，交联蛋白后得到可卡因抗原（COC Ag2）。方法三是利用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，活化后交联蛋白后得到可卡因抗原(COC Ag3)。经检测这三种抗原均能于抗体特异性结合。其中可卡因人工抗原COC Ag2更接近可卡因的结构特异性，所以选择可卡因人工抗原COC Ag2作为免疫抗原，有利于获得亲和力高的抗可卡因单克隆抗体，是一种突破传统的有效免疫方法。
更具体的，所述小鼠淋巴细胞通过以下免疫方法获得: 该免疫方法为“连续刺激法”免疫方法，将皮下免疫、静脉免疫结合，具有抗原用量少、免疫时间短、稳定性好、亲和力强等优点。
实施例二：
以下实施例中PBS缓冲液为含有0.008M十二水磷酸氢二钠、0.15M氯化钠、0.002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.4；靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；1×HAT的DMEM培养液含有体积分数15﹪的FBS；1×HT的DMEM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。
上述抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）、制备可卡因人工抗原；
（2）、通过连续短时间的快速免疫内刺激小鼠脾细胞使其产生的具有特异性的B淋巴细胞；
（3）、将上述小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到抗可卡因杂交瘤细胞株COC2B1，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。
以下具体描述上述三个步骤。
在步骤（1）中，制备可卡因人工抗原有三种方式：
方法一：以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用丁二酸酐与N-去甲基可卡因缩合得到含有羧基的可卡因半抗原Hapten1，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag1）。方法二：以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用溴乙酸乙酯亲和取代N-去甲基可卡因，用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因半抗原Hapten2，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag2）.方法三：以可卡因盐酸盐为原料，游离后用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag3)。
本实施例中，再描述三种方式的详细实施方式：
方法一：以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用丁二酸酐与N-去甲基可卡因缩合得到含有羧基的可卡因半抗原Hapten1，可称作半抗原1号，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COCAg1），可称为可卡因人工抗原1号。
具体的：1000 mg可卡因盐酸盐溶于20ml水，用浓氨水调pH为9-10，产生大量白色沉淀，加入20ml二氯甲烷转移到125ml的分液漏斗中萃取分离，水相用20ml二氯甲烷萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过滤后，减压蒸干得到白色晶体固体925mg，即可卡因。
将得到的可卡因925mg固体溶于25ml乙腈和25ml纯化水的混合液中，用适量冰醋酸调PH=5，缓慢滴加高锰酸钾溶液（953mg高锰酸钾溶于37.5ml纯化水）37.5ml，滴加时间3h，滴完后室温搅拌反应16h以上。
反应结束，用薄板层析（TLC）分析，原料Rf=0.7，产物Rf=0.3，将反应液过滤，滤液用碳酸钾中和，调PH=8，用乙醚将上述反应液萃取3次，混合有机相干燥过滤后减压蒸去溶剂。用TLC法分离，展开剂1：乙酸乙酯：石油醚=1：1（v/v）的比例作为展开剂，紫外下收集Rf=0.3的产物点，收集的硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到淡黄色一油状物N-去甲基可卡因510mg，待用。
将上述得到的N-去甲基可卡因溶于10ml吡啶，加入丁二酸酐（丁二酸酐）510mg，回流反应16h以上，TLC检测。
停止反应，减压蒸去溶剂，用TLC法分离，展开剂2：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8：1：8：1（v/v）的比例作为展开剂，紫外下收集Rf=0.4-0.5的产物点，收集的硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到一油状物，即可卡因半抗原Hapten1，即半抗原1号。
化学式示意：
方法二：以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用溴乙酸乙酯亲和取代N-去甲基可卡因，用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因半抗原Hapten2，可称作半抗原2号，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag2），可称作可卡因人工抗原2号。
具体的：1000 mg可卡因盐酸盐溶于20ml水，用浓氨水调pH为9-10，产生大量白色沉淀，加入20ml二氯甲烷转移到125ml的分液漏斗中萃取分离，水相用20ml二氯甲烷萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过滤后，减压蒸干得到白色晶体固体925mg，即可卡因。
将得到的可卡因925mg固体溶于25ml乙腈和25ml纯化水的混合液中，用适量冰醋酸调PH=5，缓慢滴加高锰酸钾溶液（953mg高锰酸钾荣誉37.5ml纯化水）37.5ml，滴加时间3h，滴完后室温搅拌反应16h以上。
反应结束，用薄板层析（TLC）分析，原料Rf=0.7，产物Rf=0.3，将反应液过滤，滤液用碳酸钾中和，调PH=8，用乙醚将上述反应液萃取3次，混合有机相干燥过滤后减压蒸去溶剂。用TLC法分离，乙酸乙酯：石油醚=1：1（v/v）的比例作为展开剂，紫外下收集Rf=0.3的产物点，收集的硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到淡黄色一油状物N-去甲基可卡因510mg，待用。
将上述得到的油状物溶于10ml乙腈，加入510ul溴丁酸乙酯，搅拌80℃回流4h以上，TLC检测（展开剂1），检测出反应完全后，减压蒸干，加入氢氧化钠-甲醇溶液，保持PH=12，室温反应16h，TCL检测（展开剂2），检测出现产物点（Rf=0.5），停止反应，减压蒸干溶剂。TLC法分离，取Rf=0.5，收集的硅胶用无水乙醇反复提取，混合后，减压蒸去无水乙醇，得到淡黄色一油状物Hapten2，即半抗原2号。利用高锰酸钾氧化可卡因后用溴丁酸乙酯活化可卡因，水解后交联后得到可卡因抗原，该可卡因抗原保持了可卡因的结构特异性，有利于获得亲和力高的抗可卡因单克隆抗体，是一种突破传统的有效免疫方法。
化学式示意：
方法三：以可卡因盐酸盐为原料，游离后用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白（BSA）结合制备可卡因人工抗原（COC Ag3)，可称作可卡因人工抗原3号。
1000 mg可卡因盐酸盐溶于20ml水，用浓氨水调pH为9-10，产生大量白色沉淀，加入20ml二氯甲烷转移到125ml的分液漏斗中萃取分离，水相用20ml二氯甲烷萃取2次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥过滤后，减压蒸干得到白色晶体固体925mg，即可卡因。
加入27ml甲醇和21ml四氢呋喃溶解，再加入10ml蒸馏水，并不断加入氢氧化锂粉末使PH=8，2h后TLC检测，展开剂2，检测到产物点Rf=0.6，减压蒸干溶剂，加入10ml二氯甲烷溶解，过滤，减压蒸干得到产物Hapten3。
分别将 100mg 含羧基的衍生物(Hapten1 、Hapten2或Hapten3)溶于 5ml 二甲基甲酰胺（DMF）中，加入 45mg 的 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和 75mg 的N，N-二环己基碳二亚胺 （DCC），室温下搅拌过夜。4℃离心，设定 10000rpm，5min。取上清，待用。
分别配制 50ml 的10mg/ml 的BSA/PBS 溶 液、10mg/ml 的 BGG/PBS 溶液。
以 1：5（V/V）的比例，将上清分别加10mg/ml 的 BSA/PBS、10mg/ml 的 BGG/PBS溶液中，混合均匀后，室温搅拌反应2h后，静置于 2～8℃过夜。将反应液置入 pH为7.4、0.1M的PBS缓冲液中进行透析三天，期间每天换缓冲液两次。透析结束后，将反应液离心，取上层清液即为可卡因人工抗原。其中COC-BSA是免疫抗原，COC-BGG是检测抗原。
具体的，可卡因人工结合抗原 ELISA 效价检测包括以下步骤：
（1）包板：96孔酶标板中加入1µg/ml待检抗原（用 CB buffer稀释），每孔100µl，2~8℃冰箱过夜或37℃ 32h.
（2）封闭：倒掉孔中液体，每孔加入1%BSA-PBST 液 200µl 37℃封闭2h，甩去剩余液，0.1MPBST洗板，三次，拍干，4℃保存。
（3）加样：抗体用PBS稀释至1mg/ml，再稀释至附录相应浓度。取包好的酶标板，第一孔空白，第二孔加待测标本50µl，以后各孔用 PBS 倍比稀释。阴性孔加50µl的PBS，阳性对照用CK代替，稀释方法同样品，37℃孵育30min。
（4）加酶联二抗：甩去液体，每孔加入 HRP-耦联的羊抗鼠二抗溶液 100µl充分混匀封板，置 37℃孵育 30min。
（5）洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置 5 秒，甩干，重复 5 次 后拍干。
（6）加底物显色：每孔加入 TMB 100µl，充分混匀，封板，室温显色 5min。
（7）终止： 每孔加入终止液 50µl，混匀。
（8）结果判定：在 450nm 下，测定样品的 OD450 值，样品 OD 值 /阴性对 照 OD值大于等于 2.5 判断为阳性，否则为阴性。阴性对照 OD 值低于 0.05 作 0.05 计算，高于 0.05 按实际 OD 值计算。
Ag1 Ag2 Ag3 抗体浓度
COC-BSA-1 COC-BSA-2 COC-BSA-3
1.759 1.815 1.349 1
1.391 1.461 0.924 0.5
0.789 0.921 0.547 0.25
0.135 0.221 0.149 0.125
0.102 0.156 0.073 0.0625
0.07 0.093 0.044 0.03125
0.051 0.068 0.035 阴性孔
0.031 0.041 0.031 空白
结果表明COC Ag2相比于COC Ag1和COC Ag3与抗体的结合能力更强，选用COC Ag2为免疫抗原。
再对步骤（2）中，小鼠的免疫过程进行描述：
如图1所示,将可卡因人工抗原、弗氏佐剂按1：1的体积通过注射器法乳化得到乳剂。选择6周龄的BALB/c雌鼠进行皮下免疫、腹腔免疫、静脉免疫，共免疫6次，免疫时间为第1天、第7天、第21天、第28天、第30天、32天，具体步骤是取6周龄的BALB/c雌鼠，第一次免疫，靠近淋巴结皮下部位注射免疫量为50μg的可卡因人工抗原乳剂（其中佐剂用弗氏完全佐剂）；第二次皮下免疫，免疫量为25μg的可卡因人工抗原乳剂（其中佐剂用弗氏不完全佐剂）；第三次腹腔免疫，免疫剂量为25μg的可卡因人工抗原乳剂（其中佐剂用弗氏不完全佐剂），第四次、第五次、第六次为追加免疫，用免疫量为10μg可卡因人工抗原不加佐剂经静脉免疫，连续免疫，最后一次免疫3天后处死小鼠取血清（1-3次免疫4天后采血检测效价，4-6次免疫1天后采血检测效价）。
所述的靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部。
该免疫方法为连续免疫法，通过连续短时间的快速免疫内刺激脾细胞使将其产生大量的具有特异性的B淋巴细胞，免疫时结合皮下免疫、腹腔免疫、静脉免疫结合，提高融合率从而得到有效的细胞株。具有免疫时间短、稳定性好、亲和力强等优点。
再对步骤（3）中小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合进行描述，该步骤还包括以下步骤：
2-1：饲养细胞制备：小鼠摘眼球放血处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入37℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液。
2-2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合。
2-3：脾细胞制备：取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死，泡75%的酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏。将脾脏放在连接着50ml离心管的不锈钢滤网上，立即加入5ml无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌的注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液至30ml，离心。弃上清用无血清培养液重复离心一次，待用。
2-4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入0.7ml 37℃预温的PEG4000，一分钟内加完，然后静止90秒。再加入25ml 37℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养。24小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
此外，杂交瘤细胞的筛选过程如下：
3-1：初筛：
融合细胞隔3天后换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3-2：复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株COC做克隆培养。
3-3：杂交瘤细胞株COC的克隆化：
杂交瘤细胞株COC的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含10﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的单克隆，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；进一步筛选得到一株能稳定分泌专一性抗体的的抗可卡因单克隆细胞，命名为抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1（保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏号CCTCC NO.C201727），扩大培养后进行可卡因单克隆抗体纯化。
本发明再对抗可卡因单克隆抗体制备与纯化方法步骤进行描述：
4-1：可卡因单克隆抗体制备
采用动物体内诱生法-腹水制备法。将筛选到的单克隆细胞株COC 2B1用含体积分数为10﹪FBS的DMEM培养基接种到24孔细胞培养板中，培养1-2天后接种到小号细胞培养瓶中，在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/2视野时,接种到大号细胞培养瓶中，培养1-2天后，观察细胞生长在对数期，离心收集杂交瘤细胞。用0.9%的生理盐水稀释，注射到已注射液体石蜡1-2周的小鼠腹腔内，每只注射1×106个杂交瘤细胞。约7-10天后，小鼠腹部明显涨大，此时用75%的乙醇消毒腹部，用注射针头收集腹水。
4-2：可卡因单克隆抗体纯化
用G-蛋白亲和层析法纯化可卡因单克隆抗体
1、取一定量腹水，在室温下解冻，量腹水体积，10000转 4°离心20分钟，除去较大凝块。
2、将1.5g Protein G-Sepharose CL-4B 干粉用6-7ml 三蒸水溶解，再用0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（上样缓冲液）浸泡24 h,然后装入层析柱中。
3、用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min,试纸测出流出液体pH为7.4。
4、取预处理过的腹水5ml,用上样缓冲液稀释至10ml,用0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。
5、用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min，随后用0.02M，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用A KTA explorer 进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，每收集3ml后，立即用1M，pH9.0的Tris-Hcl缓冲液调整pH至7.0。
6、收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平和5-10倍柱床体积，流速调整至1ml/min。再用三蒸水平衡10倍柱床体积。
7、透析液过滤。测试蛋白浓度并送检.蛋白浓度（mg/ml）=OD280值*稀释倍数/1.35=蛋白浓度）。
实施例三：
本发明再对抗可卡因单克隆抗体亚型鉴定的步骤进行描述：
如图2所示，参照单克隆抗体分型试剂盒对实施例二制备的抗可卡因单克隆抗体进行亚型鉴定，抗可卡因单克隆抗体属于2B1是IgG2b亚型，轻链是kappa链，7E2是IgG1亚型，链是kappa链，9A1是IgG2b亚型，轻链是kappa链。
1、抗体稳定性评估
如图3所示，初步评估，3个株细胞所获得的抗体均符合要求，但 2B1的梯度优于 7E2和9A1，因此确认2B1作为量化生产的原始细胞株。
2、抗可卡因单克隆抗体的亲和力常数测定
如图4所示，用抗体竞争结合抗原测定亲和力实施例
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释可卡因单克隆抗体（COC-BSA）至1μg /ml，然后在96孔酶标板每孔中分别加入100µl稀释后的可卡因人工抗原，4℃包被过夜（2块板）；然后用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；②每孔中加入200µl含10%BSA的0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，置37℃60分钟，再用0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干备用；③取纯化后的抗体配制5ml浓度为40ng/ml和5ml浓度为1000ng/ml的可卡因抗原，然后将可卡因抗原倍比稀释，分别为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.812ng/ml，取等体积的抗体分别与8个浓度抗原混合得8个待测样，37℃孵育60分钟。④以每孔100µl将8个待测样加入到已包被的酶标板中，置37℃60分钟，将孵育后的剩余液体加到另一块板中孵育60分钟，用0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板5次；⑤将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到4000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100µl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应60分钟，用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；⑤每孔加入50µl底物TMB 37℃反应8分钟后，用浓度为2M 的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值.然后根据亲和力常数计算公式:Kd(i0-a0B)=B/(1-B)求得亲和力Kd值，其中a0为抗体初始浓度，i0为抗原初始浓度，B是抗体结合率，B=(A0-Ai)/A0, A0和Ai分别为检测初始抗体和已结合抗原的抗体的D450值。单抗2B1亲和力常数为1.82×10-10mol/L。
抗体的亲和力常数（K），作为表征抗体抗原亲和力的参数，反映了抗体分子上的抗原结合部位与对应的抗原决定簇之间相互作用的强度。一般认为亲和力常数为107～1010M-1,抗体亲和力高。亲和力常数105～106M-1,抗体亲和力低。采用ELISA方法测定得出，该可卡因单克隆抗体亲和力常数为1.82×10-10mol/L，亲和力较高，满足可卡因尿液检测试剂盒制备的要求。
3、抗可卡因单克隆抗体反应活性测试
间接ELISA方法检测实施例1制备的抗可卡因单克隆抗体，450nm测定其OD值，以抗可卡因单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值。从表二可以看到，制备的抗可卡因单克隆抗体反应活性可以到达0.0005μg /ml。
不同浓度下实施例1制备的抗可卡因单克隆抗体的OD450值
抗体浓度 OD450值 抗体浓度 OD450值
1μg/ml 2.665 0.008μg/ml 0.641
0.5μg/ml 2.423 0.004μg/ml 0.535
0.25μg/ml 2.011 0.002μg/ml 0.309
0.125μg/ml 1.832 0.001μg/ml 0.258
0.0625μg/ml 1.763 0.0005μg/ml 0.195
0.032μg/ml 1.169 0.00025μg/ml 0.142
0.016μg/ml 0.906 PBS（空白对照） 0.022
实施例四：
本发明还提供一种用于检测尿液中可卡因的试剂盒，所述试剂盒包括：
（1）携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为CCTCCNO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因单克隆抗体。
（2）包被有可卡因-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。
实施例五：
本发明又提供可卡因检测试剂盒的制作方法如下：
1.可卡因人工抗原的制备：
以可卡因盐酸盐为原料，游离后与溴丁酸乙酯、丁二酸酐进行亲核取代反应，得到含羧基的可卡因半抗原。通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与载体蛋白（BSA或者BGG）结合制备可卡因人工抗原。
2.可卡因单克隆抗体的制备：
提取由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因单克隆抗体，纯化该单克隆抗体，纯度达98%以上。
3.胶体金的制备
取1ml 1%氯金酸（HAuCl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化。此时制得的胶体金颗粒为30nm。
4.金标制备
取制备好的胶体金，用1M NaOH调节pH至8.5，然后加入上述抗体1ml，磁力搅拌器上搅拌，然后加入一定量的BSA至终浓度1%，搅拌待用。将上述已经偶联好抗体的胶体金溶液离心，弃去沉淀，保留溶液。沉淀用含20%的蔗糖的金标抗体稀释液复溶，转入棕色瓶内，4℃保存备用。
5.金标条的制备
将金标工作液均匀喷到30cm*6.5cm的金标垫上。将喷好金标工作液的金标垫干燥切条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。
6.NC膜的包被
将一定量的可卡因抗原偶联物（COC-BSA）和羊抗鼠多克隆抗体（GAM）纯化，上述抗原及多抗分别上样到点膜机的T、C柱中，T、C线溶液包被到NC膜上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。
7.玻纤的处理
将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。
8.试剂条的组装
将处理好的NC膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到PVC板上，然后切割成4.0mm条。
组装好的可卡因尿液检测试剂适用于可卡因的检测。产品灵敏度达到300ng/ml，并且与100μg/ml的纳曲酮、丁丙诺啡样品，50μg/ml的纳洛酮样品，100μg/ml的甲基安非他明、麻黄碱、伪麻黄碱、可卡因、地西泮、苯巴比妥、氯胺酮、美沙酮、曲马多、加替沙星、普鲁卡因，浓度为10μg/ml的Δ9-四氢大麻酚酸等非阿片类毒品的样品以及阴性尿液样本均不发生交叉反应。
本发明抗可卡因杂交瘤细胞株分泌的可卡因单克隆抗体主要用于可卡因的尿液检测，亲和力强，产品检测限可达300ng/ml，达到国内领先水平。
实施例六：
一种抗可卡因单克隆抗体，该抗可卡因单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生，分泌出的抗可卡因单克隆抗体是IgG2b亚型，轻链是kappa链。

Claims (9)

1.产生抗可卡因单克隆抗体的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201727。
2.抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）、制备可卡因人工抗原；
（2）、通过连续短时间的快速免疫内刺激小鼠脾细胞使其产生的具有特异性的B淋巴细胞；
（3）、将上述小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到抗可卡因杂交瘤细胞株COC2B1，其产生的抗可卡因单克隆抗体与可卡因抗原有高度特异的反应活性。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用丁二酸酐与N-去甲基可卡因缩合得到含有羧基的可卡因半抗原Hapten1，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后利用高锰酸钾氧化得到N-去甲基可卡因，然后用溴乙酸乙酯亲和取代N-去甲基可卡因，用氢氧化钠-甲醇水解得到带羧基的可卡因半抗原Hapten2，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，可卡因人工抗原的制备以可卡因盐酸盐为原料，游离后用氢氧化锂来水解可卡因得到苯甲酰爱康宁，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与牛血清蛋白结合制备可卡因人工抗原。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中，小鼠免疫过程如下：将可卡因人工抗原、弗氏佐剂按1：1的体积通过注射器法乳化得到乳剂，选择6周龄的BALB/c雌鼠进行皮下免疫、腹腔免疫、静脉免疫，共免疫6次，免疫时间为第1天、第7天、第21天、第28天、第30天、32天。
7.抗可卡因单克隆抗体，其特征在于它由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生。
8.一种用于检测尿液中可卡因的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：
（1）携带有单克隆抗体的胶体金标记复合物；所述单克隆抗体是保藏号为CCTCCNO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因单克隆抗体；
（2）包被有可卡因-蛋白质复合物的硝酸纤维膜。
9.制作如权利要求8所述试剂盒的方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）可卡因人工抗原的制备：
以可卡因盐酸盐为原料，游离后经高锰酸钾氧化后与溴丁酸乙酯进行亲核取代反应或者与丁二酸酐缩合或者直接水解得到含羧基的可卡因半抗原，通过碳二亚胺法使可卡因半抗原与载体蛋白结合制备可卡因人工抗原；
（2）可卡因单克隆抗体的制备：
提取由保藏号为CCTCC NO.C201727的抗可卡因杂交瘤细胞株COC 2B1分泌产生的抗可卡因克隆抗体，纯化该单克隆抗体；
（3）胶体金的制备：
取1ml 1%氯金酸（HAuCl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化，此时制得的胶体金颗粒为30nm；
（4）金标制备：
取步骤（3）中制备好的胶体金，用1M NaOH调节pH至8.5，然后加入上述抗体1份，磁力搅拌器上搅拌，然后加入一定量的BSA至终浓度0.5-2%，搅拌待用；将上述已经偶联好抗体的胶体金溶液离心，弃去沉淀，保留溶液；沉淀用含20%的蔗糖的金标抗体稀释液复溶，转入棕色瓶内保存备用；
（5）金标条的制备：
将金标工作液均匀喷到金标垫上:将喷好金标工作液的金标垫干燥切条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；
（6）NC膜的包被：
将一定量的可卡因抗原偶联物和羊抗鼠多克隆抗体纯化，上述可卡因抗原偶联物及羊抗鼠多克隆抗体分别上样到点膜机的T、C柱中，T、C线溶液包被到NC膜上；将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；
（7）玻纤的处理：
将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；
（8）试剂条的组装：
将处理好的NC膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到PVC板上，然后切割成4.0mm条，组装好的可卡因尿液检测试剂适用于尿液可卡因的检测。
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