CN101921731A - 一种氟喹诺酮类药物的单克隆抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体、其制备方法及应用，尤其是氟喹诺酮类药物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。本发明的氟喹诺酮类药物单克隆抗体4G11’是由小鼠杂交瘤细胞株4G11产生，其亚型是IgG1型。本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株4G11产生的单克隆抗体4G11’与多种氟喹诺酮类药物交叉反应率高，能够大量生产，可用于制备检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测牛奶，肌肉及水产品中的氟喹诺酮类药物残留的目的，为检测多种氟喹诺酮类药物残留的试剂盒研制打下基础。

Description

一种氟喹诺酮类药物的单克隆抗体、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体、其制备方法及应用，尤其是氟喹诺酮类药物的单克隆抗体、其制备方法及应用，属于免疫化学技术领域。

背景技术

氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)为一族人工合成的新型杀菌性抗菌药物，因其抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性、毒副作用小等特点而广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗。随着该类药物在食源性动物中的广泛应用，其残留问题已引起广泛的关注。FQs残留除了其毒副作用，同时由于该类药物在动物性食品中的残留容易诱导人类致病菌产生耐药性，进一步加深了人们对该药的认识。为了监控FQs在动物性食品中的残留，FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会(JCEFA)制定的单诺沙星在牛、猪、禽的最高残留限量(MRLs)，牛、家禽：肝、肾400μg/kg，肌肉200μg/kg，脂肪及鸡的皮肤100μg/kg；猪：肾脏200μg/kg，肌肉、脂肪100μg/kg，肝脏50μg/kg[2]。欧盟(EC)在1999年3月4日公布了508/1999号法规，对4种FQs药物(单诺沙星、二氟沙星、诺氟沙星、沙拉沙星)MRLs作了规定。诺氟沙星在家禽及猪所有可食用组织中的允许残留量(tolerance limit)为50μg/kg。其他FQs的安全浓度或MRL尚未制定。因此加强对该类药物在动物性食品中的残留检测和监督显得尤为突出。

现行的检测食品中氟喹诺酮类药物残留的方法以仪器分析法为主，但是由于仪器分析法价格昂贵，对操作人员要求较高，不适合普及应用。而常用的免疫学检测方法由于获得的抗体常常只针对氟喹诺酮类药物的1种或2种，因此，不能达到通过一次反应检测多种药物残留的目的。

发明内容

本发明要解决技术问题是：针对以上现有技术存在的缺点，提出一种氟喹诺酮类药物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测氟喹诺酮类药物，其特异性强，使用方便。

本发明所涉及的杂交瘤细胞株4G11已于2009年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.3572。

由以上杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为4G11’，其制备步骤如下：

a.制备免疫原和包被原：采用碳二亚胺法将封闭后的载体蛋白与诺氟沙星偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原免疫，首次免疫后进行2-3次加强免疫；

c.筛选动物免疫血清：用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

d.制备杂交瘤细胞：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得可以稳定分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G11；

e.制备并纯化单克隆抗体：对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4G11，采集腹水，以及腹水的液相层析纯化，获得氟喹诺酮类药物单克隆抗体4G11’。

其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白，人血清白蛋白或卵清白蛋白的至少一种，对应的免疫原为NOR-BSA，包被原为NOR-OVA；所述碳二亚胺法中，载体蛋白封闭2-4小时，交联剂活化载体蛋白的时间为1-2小时，用诺氟沙星与载体蛋白偶联反应8-10小时。所述步骤b中的各次免疫注射剂量为50-100μg/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为(1-5)×10⁶个/只。

通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgG1型。

常规制备氟喹诺酮类药物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本发明采用小分子的亚胺基与载体蛋白的羧基偶联，这样，暴露氟喹诺酮类药物的共有结构，在后期筛选过程中可以获得针对多种氟喹诺酮类药物的抗体。

本发明的再一个目的是提供该单克隆抗体在制备检测氟喹诺酮类药物中的应用。其主要是将其应用于制备氟喹诺酮类药物多残留检测试剂盒和胶体金试条纸。

本发明的有益效果是：通过小鼠杂交瘤细胞株4G11产生的单克隆抗体4G11’与多种氟喹诺酮类药物交叉反应率高，能够大量生产，可用于制备检测氟喹诺酮类药物的酶联免疫分析法试剂盒和胶体金试纸条，达到快速且灵敏地检测牛奶，肌肉及水产品中的氟喹诺酮类药物残留的目的，为检测多种氟喹诺酮类药物残留的试剂盒研制打下基础。

附图说明

图1：封闭氨基后的BSA蛋白质谱检测图。

图2：NOR-BSA免疫原质谱检测图。

图3：封闭氨基后的OVA蛋白质谱检测图。

图4：NOR-OVA免疫原质谱检测图。

具体实施方式

实施例一

试剂与材料准备

诺氟沙星(中国药品生物制品检定所，130450-200705)，DMF(sigma，D4551)，醋酸钠(sigma，S2889)，乙酸酐(国药集团化学试剂有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(Jackson，001-000-173)，卵清白蛋白(OVA)(Sigma，A5503)，弗氏完全佐剂(Sigma，F5881)，弗氏不完全佐剂(Sigma，F5506)，四甲基联苯胺(TMB)(Amresco，0759)，HAT(Sigma，H0262)和HT(Sigma，H0137)，氯化钠(Amresco，0241)，氯化钾(Amresco，0395)，磷酸二氢钾(Sigma，P9791)，磷酸氢二钠(Sigma，71639)，羊抗鼠IgG-HRP(Jackson，115-035-044)，二甲基亚砜(DMSO)(Applichem，0231)，聚乙二醇4000(PEG4000)(Sigma，P7306)，DMEM高糖培养基(Gibco，11995)，胎牛血清(Gibco，C2027050)。

实验动物与细胞：Balb/c小鼠(6-8周龄，雌性)，购自扬州大学动物中心，SP2/0(小鼠骨髓瘤细胞)由中科院生物物理研究所感染与免疫研究中心唐捷教授惠赠。

本发明的实验步骤如下：

a.制备免疫原NOR-BSA和包被原NOR-OVA：

本发明所述的人工抗原采用封闭载体蛋白上的氨基，利用诺氟沙星哌嗪基团上的亚氨基和载体蛋白上的羧基进行偶联，从而合成氟喹诺酮类抗原。

1、载体蛋白氨基的封闭：

(1)准确称取20mg BSA或OVA溶解于2ml PBS溶液中；

(2)向其中加入2ml醋酸钠溶液；

(3)再加入20ul醋酸酐，反应3h；(4)将上述反应产物透析。

2、人工抗原合成：

(1)取1ml DMF溶解7mg的诺氟沙星，得A液；

(2)准确称取5mg NHS，10mg EDC溶于200ul去离子水，得B液；

(3)将B液加到BSA和OVA溶液中，得C液；

(4)将A液加入C液中，反应12h；

(5)将步骤(4)的反应产物进行透析，离心，收集上清，保存于-20℃，备用；

(6)对反应产物进行质谱检测，结果见图1～图4。从图示结果可以判定偶联成功。

b.动物免疫：

采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原是CAP-HSA或CAP-BSA，每次免疫剂量≥50μg/只小鼠，免疫四次。

c.筛选动物免疫血清：

以上免疫小鼠在第三次免疫后7-10天用ELISA法和间接竞争ELISA方法检测血清效价^[2]。选取血清效价高的小鼠进行加强免疫。

d.制备杂交瘤细胞：

取上述免疫Balb/c小鼠的脾细胞，以50％的PEG4000作融合剂，将免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例进行细胞融合。采用间接ELISA法检测融合后存活的细胞培养上清，对阳性克隆进行亚克隆，检测有单克隆生长孔的细胞培养上清，阳性率达到100％，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G11；

该步骤中建立间接ELISA法的步骤如下：

最佳抗原包被稀释度的选择，采用方阵滴定法确定包被原浓度：

(1)包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释成一系列浓度加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)一抗：加入系列浓度的抗体，100μL/孔，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2M的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：根据阳性血清OD值及P/N≥2.1，确定包被原最佳包被稀释度为1∶28000(浓度为0.1μg/ml)。抗原、抗体的最佳工作浓度见表1。

表1

该步骤中建立间接竞争ELISA法的步骤如下：

(1)包被：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将包被原稀释到合适浓度，加入酶标板中，100μL/孔，包被过夜；

(2)洗涤：甩净包被液，洗涤液是含1‰吐温的pH7.4的PBS，用洗板机洗板3次，并在吸水纸上拍干；

(3)封闭：每孔加入200μL的BSA封闭液，37℃孵育1h；

(4)洗涤同上；

(5)加样：先将相邻两孔酶标板孔内加入稀释液，50μL/孔，与此两孔相邻的孔内加入适当浓度的氟喹诺酮类药物标准品，50μL/孔，最后加入稀释好的抗体，50μL/孔，酶标板稍作震荡混匀，37℃孵育1h；

(6)洗涤同上；

(7)酶标二抗：加入羊抗鼠-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；

(8)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，20-25℃显色10min；

(9)终止反应：加入2mol/L的H₂SO₄终止液终止反应，50μL/孔，并于酶标仪上读取OD₄₅₀值。

判定标准：首先，从肉眼可以看出，抑制孔与未抑制孔颜色的变化，若抑制孔颜色较浅或者无色，说明有特异性抗体产生，反之则无特异性抗体产生。其次，根据OD值可以判定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，说明有特异性抗体产生。采用有抑制效果血清的免疫小鼠脾细胞进行细胞融合，并筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。

抗体特异性的强弱可根据竞争抑制率的大小来判定。

竞争抑制率＝1-B/B0(B为加竞争物的抑制孔OD值，B0为不加竞争物的阳性对照孔OD值)。

e.制备并纯化单克隆抗体，效价测定：

首先制备和鉴定单克隆抗体：细胞复苏时取出冻存管，立即于37℃水浴中融化，之后移入培养皿内扩大培养，培养基为含10％FBS的DMEM培养基。其中，冻存管内冻存的是对数生长期的能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4G11。

用灭菌石蜡免疫Balb/c小鼠，7天后小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4G11，注射剂量为5×10⁶个/只，7-10天采集腹水，得到单克隆抗体，命名为4G11’。

然后纯化单克隆抗体(以下简称单抗)：用辛酸-硫酸铵盐析法对上述腹水进行处理，具体步骤如下：

(1)取1倍体积的腹水，加入4倍体积的NaAC-HAc缓冲液；

(2)按每ml腹水加入10-50％的辛酸的量，加好后，室温于摇床上摇30min，之后4℃静置3h；

(3)以12000rpm转速离心30min，取上清，用NaOH调pH至7.4；

(4)向上清中加等体积的饱和硫酸铵溶液，静置，之后12000rpm离心10min；

(5)弃上清，用适量的PBS悬浮沉淀；

(6)将单抗悬液透析12h；

(7)透析后的单抗做进一步纯化，液相柱层析洗脱缓冲液为20mM Tris-HCL，1M NaCL，pH8.6，1ml/管收集单抗。

(8)纯化后的单抗进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。利用紫外分光光度计测定其浓度，效价，分装，低温保存；

(9)单抗效价的测定：以0.1μg/ml的包被原NOR-OVA包被ELISA板，将纯化的4G11’单抗进行1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000稀释，加入酶标板孔内，反应后加入HRP标记的羊抗鼠IgG，最后用TMB显色，4G11’的效价测定结果见表3。

表3

阳性判定标准：P/N≥2.1

4G11’抗体检测结果：当纯化抗体浓度为1mg/ml时，效价可达1.28×10⁵以上；

(10)单克隆抗体亲和力的测定

根据Gosling介绍的ELISA方法进行抗体亲和力的测定，其亲和力的大小用亲和常数Ka的大小来表示，公式为：

$\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-V)$

亲和常数的单位为浓度的倒数，即：克分子浓度(L/moL)，其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高。其检测过程如下：

第一步、确定抗原，抗体最佳作用浓度：

1、将人工抗原分别进行13000，26000，52000，104000，208000，416000倍稀释后各包被4条，100L/孔，37℃，温育2h，洗涤、封闭；

2、将抗体进行7500，15000，30000，60000，120000，240000，480000倍稀释，分别加于2条中，100L/孔，室温温育1h；

3、将这两条中的抗体分别移入第二条中，室温温育1h；

4、将这两条洗涤加酶标二抗，继续做ELISA，最后测定OD值A1；

5、后两条按上述步骤，最后测定OD值A2。

6、根据公式 $f=\frac{A_1\left(c\right)-A_2\left(c\right)}{A_1\left(c\right)}$

计算f值，选取所有f值都小于10％的抗原，抗体稀释度，根据OD值大小确定最佳抗原浓度为208000倍稀释，最佳抗体浓度为120000倍稀释。

第二步、测定亲和力

1、配制一系列浓度抗原6个；

2、在加有最佳浓度抗体的EP管内加入等量系列浓度抗原，共7管，最后一管加入抗原稀释液，室温下过夜；

3、同时将抗原进行208000倍稀释后进行包被，室温下过夜，洗板，封闭；

4、将第二步的反应产物取100μL加入以上封闭的板孔内，室温下进行ELISA，最后测定OD值A；

5、根据Scatchard公式 $\frac{V}{\mathrm{\α}}=K_a(1-V)$ 计算其斜率值，

其中，α为游离抗原的浓度，V为结合抗体位点与总抗体位点的比，所得亲和力的大小即亲和常数Ka，为斜率值的负数。得到的结果是单克隆抗体4G11’的亲和力为1.2*10¹⁰。

实施例二

药物交叉反应试验

按实施例一中建立的单抗筛选间接竞争ELISA方法进行，诺氟沙星的单克隆抗体与诺氟沙星半抗原结构类似物如盐酸环丙沙星，氧氟沙星，甲磺酸达氟沙星，甲磺酸培氟沙星，盐酸二氟沙星，恩诺沙星，洛美沙星进行竞争试验，将这些标准品稀释成不同浓度进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，计算竞争物的IC₅₀值和交叉反应率，结果显示本抗体除了与甲氧磺酸达氟沙星和洛美沙星交叉反应率较低以外，与其他所测的5种氟喹诺酮类药物均有较高的交叉反应率，具体结果见表4。

种类	％CR	种类	％CR
				诺氟沙星	100％	盐酸环丙沙星	23.4％
甲氧磺酸培氟沙星	120％	盐酸二氟沙星	0.03％
				氧氟沙星	79.7％	沙拉沙星	1.66％
恩诺沙星	25.0％	甲氧磺酸达氟沙星	82.1％

表4

实施例三

本实施例是本发明中单克隆抗体4G11’在建立检测诺氟沙星残留ELISA方法的应用举例，可以用于鸡肉，水产品，牛奶及蜂蜜中氟喹诺酮类药物残留的检测。以鸡肉(市场购买)为例，说明检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留的主要步骤如下：

1、样品前处理：称取15g鸡肉样品进行匀浆，称取0.5g匀浆液，加入1.5ml样品提取液，震荡混匀，离心，取100μL上清与900μL样品稀释液混匀，取50μL进行检测。

2、本发明中试剂盒的检测原理是间接竞争ELISA方法，将包被原NOR-OVA包被于微孔板上，分别加入50μL的10，5，2.5，1.25，0.625和0.313ng/ml的诺氟沙星或者样品，再加入50μL抗氟喹诺酮类药物的单克隆抗体4G11’，样品中残留的氟喹诺酮类药物与包被的抗原同时与抗氟喹诺酮类药物的抗体竞争性结合，然后加入100μL酶标二抗，TMB显色，显色后在酶标仪上读取OD₄₅₀，样品中氟喹诺酮类药物的含量与样本吸光度值呈负相关，与标准曲线相比，当OD值低于提供的参考值时可判定样品中含有的氟喹诺酮类药物超过检测限。

实施例四

本实施例是本发明中的单克隆抗体4G11’在制备诺氟沙星残留的胶体金试纸条中的应用举例，主要是应用于检测肌肉(鸡肉，鱼肉，猪肉)、牛奶、蜂蜜中的氟喹诺酮类药物残留。

反应原理采用竞争法对氟喹诺酮类药物进行半定量检测，样品中存在的氟喹诺酮类药物分子在沿试纸条上移过程中先与金颗粒标记的抗体4G11’结合，固定在NC膜上的包被原与氟喹诺酮类药物同时竞争结合金标抗体，T线的显色强弱与样品中残留氟喹诺酮类药物的含量成反比，若样品中无氟喹诺酮类药物残留，则金标抗体全部与包被原反应，试纸条的T线显色。当C、T线均显色时表示阴性，当C线显色T线不显色时则表示为阳性，当C线不显色，T线显色或不显色都表示试纸条失效。

(1)具体操作步骤如下：

1、样品前处理：本方法中各种样品的处理方法同ELISA方法中的样品前处理方法；

2、将试纸条放于干净平整的台面上，用滴管吸取待测样品溶液，滴加1～2滴于样品垫上；

3、等待紫红色条带的出现，静置反应5-10分钟时读取测试结果，10分钟以后判定无效。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

参考文献

1、Greg T.Hermanson.Bioconjugate techniques.AcademicPress，2008：216-219.

2、杨利国，《酶免疫测定技术》，南京大学出版社，1998.

3.Gary C.Howard.Making and Using Antibodies：A PracticalHandbook.CRC Press，2006.127-130.

Claims (8)

1.一种产生氟喹诺酮类药物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G11，是小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.3572。

2.根据权利要求1所述杂交瘤细胞株4G11产生的单克隆抗体4G11’。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体4G11’，其特征在于：所述单克隆抗体亚型为IgG1型。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体4G11’的制备方法，包括以下步骤：

a.制备免疫原和包被原：采用碳二亚胺法将封闭后的载体蛋白与诺氟沙星偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原免疫，首次免疫后进行2-3次加强免疫；

c.筛选动物免疫血清：用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

d.制备杂交瘤细胞：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得可以稳定分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株4G11；

e.制备并纯化单克隆抗体：对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞4G11，采集腹水，以及腹水的液相层析纯化，获得氟喹诺酮类药物单克隆抗体4G11’。

5.根据权利要求4所述单克隆抗体4G11’的制备方法，其特征在于：所述步骤a中所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清白蛋白的至少一种，对应的免疫原为NOR-BSA，包被原为NOR-OVA；所述碳二亚胺法中，载体蛋白封闭2-4小时，交联剂活化载体蛋白的时间为1-2小时，用诺氟沙星与载体蛋白偶联反应8-10小时。

6.根据权利要求4所述单克隆抗体4G11’的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的各次免疫注射剂量为50-100μg/只。

7.根据权利要求4所述单克隆抗体4G11’的制备方法，其特征在于：所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为(1-5)×10⁶个/只。

8.根据权利要求2所述单克隆抗体4G11’在检测氟喹诺酮类药物中的应用。

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