CN106443025B - 一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法。所述免疫金标卡包括胶体金垫和层析膜；所述胶体金垫喷涂有被胶体金标记的由保藏编号CCTCC NO.C2015221杂交瘤细胞株产生的单抗蛋白；层析膜上的检测线喷涂有恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白的偶联物；层析膜上的对照线喷涂有山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗。本发明选用经间接竞争ELISA测定对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星等药物具有高灵敏度和强通用性的单克隆抗体，再将其应用于检测氟喹诺酮类药物免疫金标卡中，所制备的免疫金标卡对目标物同样具有高灵敏度和强通用性，可应用于多领域中主要氟喹诺酮类药物的快速定性筛查。

Description

一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法。

背景技术

氟喹诺酮类药物作为人工合成抗生素类药物，以抗菌能力强、机体利用率高、与其它种类抗生素对细菌无交叉耐药性等优点广泛应用于医学(作为一线抗菌类药物应用于临床)、农副水产品(作为畜禽水产动物的重要抗菌药用于预防治疗传染性疾病)生产中，当前氟喹诺酮类抗菌药在食品样本中呈多组分混合高残留趋势，更为忧虑的是，相关制药企业、医院和农副水产品生产企业中上述抗生素在环境中扩散造成土壤和地表水源呈极微量残留对人类健康够成巨大潜在威胁，因此对氟喹诺酮药物残留检测不仅有待测样本面多量广的需求(要求对待测样本高通量快速定性筛查)，同时有快速检测定性为阳性样本精确定量分析需求，更有ppt级极微量残留待测样本经高倍富集后的精确定量测定需求。综合各领域氟喹诺酮类药物使用情况目前需检测残留主要对象以恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、双氟沙星(达氟沙星)等为主。

依据目前多种氟喹诺酮类药物残留检测技术特点与应用范围，免疫检测方法已成为氟喹诺酮类药物残留高通量快速定性筛查或半定量分析不可替代的技术手段。目前对氟喹诺酮药物残留快速筛查主要采用间接竞争ELISA和免疫金标卡二种检测模式，二种模式中尽管免疫金标卡灵敏度略低于间接竞争ELISA试验灵敏度(现有文献表明金标卡检测限(T线完全消失)约为间接竞争ELISA的IC₅₀值5-10 倍)，但免疫金标卡以便于保存、试验时间短(5-10min可判读结果)、试验结果直观(可用肉眼直接观察，无需借助任何仪器设备分析)等优点倍受基层检测用户亲睐，占氟喹诺酮药物快检市场大部分份额。

目前商业化氟喹诺酮药物快检免疫金标卡存在二大缺陷：

1、检测限偏低:商品化免疫金标卡氟喹诺酮药物单组分检测限(T线完全消失)约为10ppb，而农业部对上述8种药物最低残留标准为：30-100ppb，以该标准用5-10×缓冲液制备待测样本匀浆上清，不对目标物富集前提下，其含量极有可能已低于该检测限，无法对待测样本进行有效定性筛查，改用小于5×缓冲液制备待测样本匀浆上清不仅不利于待测样本中目标物充分释放影响检测准确性出现假阴性导致漏检，同时也极有可能因样本基质含量过高干扰抗体对目标物识别影响检测特异性出现假阳性导致错检，因而免疫金标卡单组分检测限应小于等于3ppb才能充分满足用户实际需求；

2、通用性不强:赵银丽等在文献中报道利用自主制备恩诺沙星强特异性单克隆抗体作标记抗体研制免疫金标卡检测限(T线完全消失)小于等于3ppb，并以鸡肌肉作模式基质恩诺沙星外标掺入回收试验获得了良好结果，但因与其他喹诺酮药物无交叉反应，仅能作恩诺沙星单组分残留强特异性分析，更为不利的是恩诺沙星经体内代谢部分转化为环丙沙星，利用该卡无法界定恩诺沙星给药后体内恩诺沙星和环丙沙星混合残留是否超标，其他氟喹诺酮类药物如诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星等目标物的免疫检测产品亦有一些零星报道，但多以对其目标物强特异性等特点适用于单组分测定。而食品样本中氟喹诺酮药物的残留呈多组分混合残留趋势，因而无法用单一抗体免疫检测产品对多组分残留同时作定性或半定量分析。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法，使得所述免疫金标卡具有较高的灵敏度，对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星等单组分标样检测限(T线完全消失)小于等于3ppb,对氧氟沙星检测限小于等于20ppb，对洛美沙星、沙拉沙星检测限小于等于100ppb。

本发明的另一个目的在于提供一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法，使得所述免疫金标卡能够同时检测恩诺沙 星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等。

本发明的另一个目的在于提供一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法，使得所述免疫金标卡具有较高的稳定性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡，包括胶体金垫和层析膜，所述胶体金垫搭接在层析膜上靠近检测线的一端；

其中，所述胶体金垫喷涂有被胶体金标记的由保藏编号CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的单抗；所述层析膜上的检测线喷涂有作为包被物的恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白偶联物；所述层析膜上的对照线喷涂有山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗，所述小鼠单抗为CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的鼠源单抗。

针对现有氟喹诺酮类药物免疫检测金标卡检测灵敏度低(单组分T线消失约10ppb)、通用性差不能充分满足现有食品等待测样本中氟喹诺酮类药物多组分混合残留的快速定性筛查需求技术现状，本发明从恩诺沙星作半抗原制备的几株单克隆杂交瘤细胞株中遴选出一株细胞-11F10株，其体外分泌或体内诱生产生的单抗都具有高灵敏度、强通用性。具体地，以几种氟喹诺酮类药物单组分标样分别作竞争物，经间接竞争ELISA测定，所述单克隆抗体对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星等均有极高检测灵敏度(IC₅₀从0.292-0.561ng/ml),该四种药物与恩诺沙星有良好免疫交叉性(交叉率大于50％)；对食品和医药领域使用频率极高另一种氟喹诺酮药物-氧氟沙星有较高亲和力(IC₅₀为1.592ng/ml)，可部分作为氧氟沙星专用检测试剂盒替代品用于氧氟沙星残留的初步筛查；该单克隆抗体对洛美沙星、沙拉沙星有一定亲和力(IC₅₀分别为6.573，7.321ng/ml)。由此可知，本发明所述单抗在极高灵敏度下可同时测定五种氟喹诺酮药物、在高灵敏度下可同时测定六种氟喹诺酮药物，在一般灵敏度下可同时测定八种氟喹诺酮药物。

基于以上所述抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的有益效果，本发明 提供了所述检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡；其中，所述氟喹诺酮类药物优选为恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星和/或沙拉沙星。

作为优选，本发明所述免疫金标卡还包括样品垫、吸收垫、支持底板和外包转塑料壳等，本发明中所述样品垫优选为玻璃纤维，所述支持底板优选为PVC板，所述层析膜优选为NC膜。

本发明所述免疫金标卡结构示意图参见图1，参照此示意图或根据本领域普遍的免疫金标卡结构示意图，本发明免疫金标卡中所述样品垫、胶体金垫、层析膜和吸收垫依次搭接，并整体置于支持底板上。

由于本发明所述单克隆抗体所具备的优异特性，使得本发明所述的免疫金标卡同样具有较优的性能。本发明免疫金标卡对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星单组分标样检测限(T线完全消失)小于等于3ppb,对氧氟沙星检测限小于等于20ppb，对洛美沙星、沙拉沙星检测限小于等于100ppb，同时用上述检测限小于等于3ppb五种药物的三组分混标物(单组分均为1ppb，总浓度为3ppb)均能使T线消失说明对上述药物之间识别无干扰效应，同时有对基质强抗干扰力(以猪肉作模式基质作单组分外标与单组分标样有良好相关性)等特点。

同时，本发明还提供了所述免疫金标卡的制备方法，包括：

步骤1、用保藏编号CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株获取单克隆抗体，制备胶体金悬液并以此标记所获得的单克隆抗体，备用；

通过碳二亚胺偶联法或混合酸酐法将恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白偶联制备出偶联物EF-cBSA并包被；选用山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，备用；所述小鼠单克隆抗体为CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的鼠源单抗；

步骤2、将被胶体金标记的单克隆抗体喷涂在胶体金垫上；将包被的偶联物EF-cBSA喷涂在层析膜上作为检测线，将所述二抗喷涂在层析膜上作为对照线；

步骤3、将胶体金垫搭接在层析膜上靠近检测线的一端，获得所述 免疫金标卡。

本发明免疫金标卡中由保藏编号为CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体可采用本技术领域常规方法进行制备，如用杂交瘤细胞株通过体内诱生方式获取小鼠腹水进而大量生产单抗蛋白，具体可参照如下方法：

从液氮罐中取冻存杂交瘤细胞株-11F10，用10％FBS+RPMI-1640细胞培养液复苏于标准细胞培养瓶中，于5％CO₂ 37℃培养箱中培养，2-3d按1：3-5分瓶传代，待细胞处于对数生长期收集细胞，低速离心去除培养液，用无血清RPMI-1640培养基悬浮细胞用于小鼠接种；

按0.5ml降植烷/只腹腔注射8周龄雄性Balb/c鼠，致敏7天后，按1-2×10⁶细胞/只腹腔注射上述致敏鼠，7-10天后采集腹水，1000r/min离心10min去除腹水中细胞，取上清12000r/min离心30min以去除腹水中细胞碎片，取上清以OD₂₈₀和OD₂₆₀值初步标定总蛋白含量，取少许作抗体滴度、对目标物亲和力以及其结构相似物免疫交叉性等指标的评估、一部分用于抗体蛋白进一步纯化，其余部分分装-80℃冻存备用。

本发明按照上述方法获得诱生腹水并通过protein G resin一步法纯化单抗蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定结果显示：腹水纯化物仅有含50Kd(抗体重链)和25Kd(抗体的轻链)二条明显蛋白条带，无杂蛋白条带，表明通过该细胞株经体内诱生可获得高丰度单抗的腹水样本结合protein G resin一步法纯化进而可获得高纯度单抗蛋白(纯度大于等于99％),可以满足制备实用型免疫金卡中检测抗体需求。

在免疫金标卡的制备中，本发明优选通过碳二亚胺偶联法或混合酸酐法二种偶联方式将恩诺沙星标样与高纯度阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)偶联制备出偶联物为包被抗原做测试线(T线)，以山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗包被作质控，即对照线(C线)，供装配金标卡选择使用；同时，将本发明所述单克隆抗体用胶体金标记并喷涂在结合垫(胶体金垫)上。本发明优选采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，并采用系列稀释单抗蛋白加固定量胶体金微孔孵育法进行优化。

由以上技术方案可知，本发明采用的单克隆抗体对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星等药物的检测具有高灵敏度和强通用性，可应用于检测氟喹诺酮类药物免疫金标卡中，所制备的免疫金标卡对目标物的检测同样具有高灵敏度和强通用性，可广泛应用于农业、食品以及环境领域中主要氟喹诺酮类药物痕量残留定性以及半定量分析。

生物保藏信息说明

用于保藏的杂交瘤细胞株11F10的分类命名为：杂交瘤细胞株11F10

保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；

保藏单位简称：CCTCC

保藏单位地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学内；

保藏日期：2015年12月7日；

保藏编号：CCTCC NO.C2015221。

附图说明

图1所示为本发明所述免疫金标卡结构示意图；

图2所示为本发明单抗纯化后的SDS-PAGE电泳图；图中泳道1为蛋白分子量Marker；泳道2为杂交瘤细胞株11F10腹水；泳道3为3×稀释杂交瘤细胞株11F10腹水；泳道4为纯化单抗蛋白；

图3所示为两种偶联法合成恩诺沙星偶联物紫外检测图；

图4所示为八种氟喹诺酮药物间接竞争ELISA的抑制曲线，各曲线从上到下(或从左到右)依次为诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星；

图5所示为胶体金颗粒紫外可见连续扫描图；

图6所示为胶体金颗粒透射电镜观察图；

图7所示为胶体金粒径分布柱形图；

图8所示为免疫金标卡对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟 沙星、依诺沙星的单组分标样检测结果图；图中1-7分别表示0、0.03、0.1、0.3、1、3、10ppb的浓度；

图9所示为免疫金标卡对氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星的单组分标样检测结果图；

图10所示为免疫金标卡对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星五种氟喹诺酮药物三组分等浓度混标物检测结果图；图中第一组为空白对照，第2-11组依次为如下组合：

恩诺沙星+环丙沙星+诺氟沙星；恩诺沙星+环丙沙星+培氟沙星；恩诺沙星+环丙沙星+依诺沙星；恩诺沙星+诺氟沙星+培氟沙星；恩诺沙星+诺氟沙星+依诺沙星；恩诺沙星+培氟沙星+依诺沙星；环丙沙星+诺氟沙星+培氟沙星；环丙沙星+诺氟沙星+依诺沙星；诺氟沙星+培氟沙星+依诺沙星；环丙沙星+培氟沙星+依诺沙星；

图11所示为不同储存期的免疫金标卡对恩诺沙星检测结果图；图中1-4分别表示0、1、3、10ng/ml浓度。

具体实施方式：

本发明公开了一种检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明在免疫金标卡的制备中，优选通过碳二亚胺偶联法或混合酸酐法二种偶联方式将恩诺沙星标样与高纯度阳离子化牛血清白蛋白(cBSA)偶联制备出偶联物为包被抗原做测试线(T线)，两种方法参考如下：

1、碳二亚胺偶联法

先将乙二胺与牛血清白蛋白混合溶解于0.01M PBS(pH7.0)液中， 在化学偶联剂-二环乙基碳二亚胺作用下，封闭牛血清白蛋白分子中-COOH残基，经透析去除过量乙二胺和二环乙基碳二亚胺，获得阳离子化的牛血清白蛋白作为蛋白载体。

将恩诺沙星(EF)标样溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺室温条件下过夜反应，形成活化酯；低速离心取上清与上述阳离子化处理的BSA液混合，混合液保持33％N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，室温避光振荡反应过夜，高速离心取上清置于透析袋中，冰浴(0–4℃)下在33％DMF/0.01M PBS(pH 7.0)溶液中进行透析。透析液每4小时换一次透析液，每换一次DMF浓度递减5％，重复六次后，加无DMF 0.01M PBS(pH7.0)继续透析过夜后，将反应液从透析袋中小心转移至样品瓶中封口，于-80℃预冷冻并干燥得白色固体粉末EF-cBSA。紫外可见光谱测定偶联比。

2、混合酸酐法

精确称取一定量恩诺沙星(EF)标样，溶于一定量DMF中，室温下加正三丁胺，摇匀后加氯甲酸异丁酯,室温避光搅拌反应1h，得恩诺沙星反应液，精确称取一定量BSA溶于碳酸盐缓冲液CBS(pH9.6)。将恩诺沙星反应液滴加BSA液中，室温下搅拌反应3h，分别用100倍CBS透析24h，每4h换液一次，再用PBS透析2d，取少许进行紫外分光(测200-400nm峰)和SDS-PAGE电泳鉴定，其余部分制备成冻干粉，并估算出盐份比。

本发明采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒，即在氯金酸(HAuCl₄.3H₂O)水溶液中滴加柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)溶液经还原获取胶体金颗粒，再经0.22um微孔膜过滤去除大颗粒，通过优化反应条件获取粒径约为20nm均一胶体金颗粒，离心取沉淀备用。

本发明采用系列稀释单抗蛋白加固定量胶体金微孔孵育法，并以反应孔不出现蛋白聚沉同时胶体金仍保持红色不变的最高稀释度为标准标定待标单抗蛋白与胶体金最适标记浓度，以上述蛋白与胶体金合适的比例按实际需要进行单抗与胶体金标记，标记后的单抗胶体金探针悬浮于胶体金缓冲液中。

下面就本发明提供的一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法做进一步说明。

实施例1：本发明所述单克隆抗体蛋白的制备

1、杂交瘤细胞株-11F10的复苏增殖

从液氮罐中取杂交瘤细胞株-11F10的冻存管，于37℃水浴中迅速融化，600r/min离心5min,弃上清，加新鲜15％FBS/RPMI-1640培养液悬浮细胞，各补加上述培养液至5ml后，种植于50ml细胞培养瓶中，置二氧化碳培养箱培养，待细胞生长至30％密度后半换液，待细胞生长60％左右(处于对数生长期)传代，每隔2-3天按1:3-4传代一次。

2、单抗蛋白的体内诱生与腹水获取

在体内种植杂交瘤细胞前7-10d，取12只8-10周龄雄性BALB/c鼠按0.5ml/只腹腔注射降植烷，注射后精心饲养备用。

取上述处于对数生长期细胞培养瓶，轻轻拍打细胞瓶壁使细胞脱落，计数后将细胞悬液转至50ml离心管中，600r/min离心12min,弃培养液，加等体积无血清RPMI-1640重悬细胞，再离心一次弃RPMI-1640，按1-2×10⁶/0.5ml用无血清RPMI-1640重悬细胞备用。

致敏7-10天后，按1～2×10⁶个杂交瘤细胞/只腹腔注射上述致敏鼠，7～10天后采集腹水，1000rpm离心10min，以去除腹水中细胞，取上清后12000rpm离心30min，以去除腹水中细胞碎片，再取上清，紫外分光光度计分别测OD₂₈₀和OD₂₆₀值，按1.51×OD₂₈₀-0.73×OD₂₆₀公式粗估其总蛋白量，并将上述腹水分成三份，一分用抗体效价测定，一分用于抗体蛋白的纯化，其余-20℃冻存备用。

注射杂交瘤细胞株-11F10 7～10天后，从12只诱生鼠中共采集腹水约30ml，经紫外分光光度计分别测OD₂₈₀和OD₂₆₀值，按1.53×OD₂₈₀-0.71×OD₂₆₀公式其总蛋白量约为50mg/ml。

实施例2：本发明所述单克隆抗体蛋白的纯化

将腹水用冰水浴预冷0.01M PBS(pH 8.0)4倍稀释后作准备液备用。按每50mg总蛋白的腹水取1ml Protein G Resin的量，将胶填充于层析用小柱(10ml)中，用50倍于柱床体积的预冷0.01M PBS(pH 8.0)平衡层析柱，室温下准备液经Protein G Resin柱过滤五次(自然流速)，让腹水中的单克隆抗体蛋白充分与蛋白G进行特异性结合，再用50倍于柱床体积的预冷0.01M PBS(pH 8.0)液充分洗涤层析柱(自然流速)，以去除粘附在层析柱中的杂蛋白。

预先向1.5ml EP管中各加入100μl 1M Tris-Cl(pH 9.6)，上述处理的层析柱中加入冰水预冷0.1M Glycine-HCl(pH 2.7)进行洗脱，滤液按0.9ml/管分部收集于上述处理的EP管中，每管中取少许滤液测量OD₂₈₀蛋白峰，合并蛋白峰管，并将合并液置于透析袋中，于冰水浴0.01M PBS液(pH 7.4)中透析过夜。取该处理液少许，一部分进行SDS-PAGE电泳鉴定，其余部分分装-80℃冻存备用。

按上述方法，用20ml 11F10细胞株诱生腹水作原料，经5次protein G resin一步法纯化共获23.5ml纯化蛋白洗脱液，经0.01M PBS(pH7.4)透析后获得25.8ml透析液，经Bradford法鉴定其蛋白含量为3.05mg/ml，即共获得78.6mg单克隆抗体纯化蛋白。经SDS-PAGE电泳鉴定(见图2)，结果显示腹水纯化物仅有含50Kd(抗体重链)和25Kd(抗体的轻链)二条明显蛋白条带，无杂蛋白条带，表明本发明已经获得高纯度单抗蛋白(纯度大于等于99％),可以满足制备实用型免疫金标卡中检测抗体需求。

实施例3：用于免疫胶体金检测卡(金标卡)和建立间接竞争ELISA包被抗原(EF-cBSA偶联物)的制备

1、恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联(碳二亚胺偶联法，用于间接竞争ELISA包被抗原)

载体蛋白的封闭：将20ul乙二胺，23.6mg BSA，25.6mg EDC，依次溶于1mL 0.01MPBS(pH7.0)中，振荡孵育过夜(20℃110r/min)，PBS透析24h，即为阳离子化BSA备用。

偶联：取15.3mg EF(恩诺沙星)，5.2mg NHS，9.3mg EDC溶于500ul DMF中，室温避光振荡过夜(20℃，110r/min)，3000r/min离心5min，取100ul上清加入2ml含5mg上述蛋白中(含33％DMF/0.01M PBS(pH7.0)配制)，室温避光振荡过夜(20℃，110r/min)，3000r/min离心5min，取上清于透析袋中，分别用100×冰水浴预冷的33％、28％、23％、18％、13％DMF/PBS各透析4h后，再用PBS透析过夜。取少许进行紫外分光(测200-400nm峰)鉴定，其余部分制备成冻干粉。

2、恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联(混合酸酐法，用于免疫金标卡中包被抗原)

精确称取10.8mg EF标样，溶于600ul DMF中，室温下加入9ul正三丁胺，摇匀后加入6ul氯甲酸异丁酯,室温避光搅拌反应1h，得恩诺沙星反应液，精确称取19.8mg BSA溶于6ml碳酸盐缓冲液CBS(0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH9.6)。将恩诺沙星反应液滴加BSA液中，室温下搅拌反应3h，分别用100×CBS透析24h，每4h换液一次，再用PBS透析2d，取少许进行紫外分光(测200-400nm峰)鉴定，其余部分制备成冻干粉，并估算出盐份比。

3、恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物连续波长紫外可见光扫描

通过1中的碳二亚胺偶联法，共获得约100mg(以蛋白含量计)恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物的冻干粉，经波长240-400nm紫外连续检测，偶联物在278nm处(与纯蛋白峰比前置)和330-350nm处均有明显的吸收峰，见图3的碳二亚胺法偶联物检测线；通过2中的混合酸酐法共获得约20mg(以蛋白含量计)恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物的冻干粉，经连续波长紫外检测，偶联物在278nm处(与纯蛋白比前置)和330-350nm处均有明显的吸收峰，见图3的混合酸酐法偶联物检测线；阳离子化BSA在330-350nm处无有明显恩诺沙星特征吸收峰在278nm处有明显的蛋白特征峰级，见图3的牛血清白蛋白检测线；该结果表明通过上述二种偶联法恩诺沙星均已成功偶联在蛋白分子上，经[OD₂₇₈/BSA分子量]/[OD₃₃₄/(3.4×ENF分子量)]公式计算：二种 偶联法获得偶联物的恩诺沙星与BSA摩尔比分别为13:1和15：1，已满足后续免疫试验包被抗原的需要。

实施例4：腹水对恩诺沙星亲和力以及对恩诺沙星类似物免疫交叉分析(用于该单抗制作免疫金标卡的主要试验依据)

1、棋盘ELISA(checker-board ELISA)标定包被抗原工作浓度以及腹水工作稀释度

(1)包被缓冲液：0.05M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH 9.6):1.59g Na₂CO₃,2.93g NaHCO₃加三蒸水至1000ml。

(2)抗原包被：包被抗原EF-cBSA(碳二亚胺合成法合成偶联比为13:1)用碳酸盐缓冲溶液稀释，包被浓度分别是9，3，1，0.333，0.111，0.037,0.012μg/ml(包被于ELISA板的A-G line,100μl/well)。包被抗原对照：cBSA，包被浓度：3μg/mL(包被于ELISA板的H line,100μl/well)，置于37℃湿孵1-1.5h,再置4℃冰箱湿孵过夜。

(3)0.01MPBS(pH7.4)的配制：2.9009g Na₂HPO₄.12H₂O,0.2964g NaH₂PO₄.2H₂O，8.5g NaCl加三蒸水至1000ml。

(4)1％OVA/0.01MPBS(pH7.4)作为封闭液。

(5)洗涤：取包被板甩干，PBS洗涤3次(300μl/well)，拍干。

(6)封闭：按340μl/well加封闭液，于37℃湿孵2.5h。

(7)PBST：0.01M PBS(pH 7.4)加入0.05％Tween20，混匀。

(8)一抗稀释液：0.1％OVA/0.01M PBS(pH 7.4)。

(9)抗体稀释：按一抗稀释液将腹水样本分别稀释成：1:10000，20000，40000，80000，160000五个稀释度，同时设1:10000溴泊特罗单抗细胞株诱生腹水(由本校化学化工材料学院邓安平教授提供)作一抗平行对照，作为一抗孵育液(分别加于ELISA板的1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12列中)。

(10)将板取出，甩干，用PBST洗涤3次，拍干。

(11)加入100μl/well一抗孵育液，37℃湿孵2h。

(12)二抗孵育液。用0.1％OVA/PBS液按1：500稀释酶标二抗(辣 根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L))。

(13)取出板，甩干，用PBST洗涤5次，拍干。

(14)按100μl/well加二抗孵育液，37℃湿孵1.5h。

(15)ELISA显色液：4.86ml 0.1M Citric acid液与5.14ml 0.2M Na₂HPO₄液混合，加6mg OPD充分溶解后再加20μl H₂O₂，避光备用。

(16)取出板，甩干，4次PBST洗涤+2次PBS洗涤。

(17)显色：甩干，按100μl/well加上述显色液，避光显色3min，每孔加50μl 2MH₂SO₄终止反应。

2、间接竞争ELISA分析腹水样本对恩诺沙星亲和力以及与恩诺沙星类似物免疫交叉性

(1)碳酸盐缓冲溶液的配置：同1中；

(2)抗原包被：通过上述间接ELISA试验标定工作浓度的EF-cBSA包被于4块酶标板的A-G line孔中(100μl/well)。包被抗原对照：同浓度cBSA包被酶标板的H line(100μl/well),37℃湿孵1-1.5h，置4℃湿孵过夜。

(3)洗涤：0.01M PBS(pH 7.4)洗涤二次，每次5min.

(4)封闭：加340μl/well封闭液。于37℃湿孵2.5h。

(5)洗涤：0.05％Tween20/0.01MPBS(pH 7.4)洗涤三次，每次5min.

(6)抗体与游离半抗原的预结合：

A:用0.2％OVA/PBS将腹水样本稀释成1/2×标定稀释度作为工作浓度抗体备用。

B:分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星标样，分别用0.03M NaOH液稀释成100μg/ml作为储存液备用。

C:取5×6支1.5ml EP管，上述储存液用0.01M PBS(pH 7.4)将前五种药物分别稀释成0.2、0.6、1.8、5.4、16.2、48.6ng/ml六个稀释度；再取3×6支1.5ml EP管,并将上述储存液用0.01M PBS(pH 7.4)将后三种药物分别稀释成1.8、5.4、16.2、48.6、145.8、437.4ng/ml六个稀释 度；每种药按0.35ml/管分别加上述6支EP管中，另取一支15ml离心管中加5.5ml 0.01M PBS(pH 7.4),加完后每支离心管中均加等体积的上述工作浓度抗体。

D:将上述的离心管于脱色摇床上室温振荡(50-100r/min)孵育一小时。

(7)一抗孵育：将上述含游离8种药物单组分竞争抗原一抗孵育液的六支试管一一对应加上述酶标板的A-F line(100μl/well)×(1-6列或7-12列)的孔中(每个处理6个复孔),酶标板的G\H line孔中加PBS液处理一抗孵育液。37℃湿孵2h。

(8)一抗孵育后的洗涤、二抗孵育、洗涤、显色同上述间接ELISA方法。

结果分析：酶标仪读每孔OD₄₉₀值，按同栏6个复孔求平均值(注：异常值予以剔除)，A-G栏的平均值均减去H栏(调零孔)平均值后作为各栏去除本底值后的实际值，将竞争抗原各浓度点处理栏实际值命名为B，无竞争抗原G栏实际值命名为B₀，每栏的抑制率按:(B₀-B)/B₀×100％计算，再以每栏竞争抗原的浓度作自变量，每栏的抑制率作因变量绘制抑制曲线，插入法求出IC₂₀，IC₅₀，IC₈₀三个关键浓度点，其中IC₅₀代表检测灵敏度，IC₂₀代表最高检测限，IC₂₀-IC₈₀代表有效检测浓度范围，再按(IC₅₀of enrofloxacin)/(IC₅₀ofenrofloxacin analog)×100％求其他7种药物与恩诺沙星免疫交叉率，结果见表1，相关抑制曲线图见图4。

表1八种氟喹诺酮药物间接竞争ELISA试验主要技术参数

以恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白偶联物(碳二亚胺合成法)作包被抗原，阳离子化牛血清白蛋白作抗原阴性对照；11F10细胞株诱生腹水作试验一抗，溴布特罗单抗杂交瘤细胞诱生腹水作一抗对照，棋盘ELISA试验结果显示：1μg/ml牛血清白蛋白包被抗原对照组与1:10000溴布特罗的诱生腹水作一抗对照组的OD₄₉₀均小于等于0.05，该结果表明试验系统无非特异性反应，其他试验组的OD₄₉₀值与包被抗原以及一抗的稀释度均呈强浓度依赖性，棋盘ELISA试验原始数据限于篇幅未详细列出，从中选取OD₄₉₀值(2.0-2.5)的包被抗原浓度与一抗稀释度分别为：0.111μg/ml和1：80000作工作浓度和一抗稀释度用于竞争ELISA试验。

以上述工作浓度包被抗原包被酶标板，用1：80000腹水做一抗与上述系列浓度的八种氟喹诺酮药物标样分别孵育后作竞争ELISA试验后得各浓度OD₄₉₀平均值(三次独立试验)，按(B₀-B)/B₀×100％公式得每种药物各浓度点抑制率，以浓度作横坐标，抑制率作纵坐标得每种竞争物标准抑制曲线结果见图4；按插入法得每种药物20％-80％抑制率(IC₂₀-IC₈₀)的有效抑制浓度范围，得每种药物半抑制浓度(IC₅₀代表系统对该药物检测灵敏度)，以(IC₅₀of enrofloxacin/IC₅₀of enrofloxacin analog)×100％得七种氟喹诺酮药物与恩诺沙星免疫交叉率，上述三大技术参数指标见上表1，从表1和图4得出：

1.该单克隆抗体(腹水样本)对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星有极高检测灵敏度(IC₅₀：0.292-0.561ng/ml),该四种药物与恩诺沙星有良好免疫交叉性(交叉率大于50％)，该结果为下一步研制高灵敏度、强通用性氟喹诺酮类药物其他形式免疫检测产品提供了极其重要的试验数据。

2.该单克隆抗体(腹水样本)对食品和医药领域使用频率极高另一种氟喹诺酮药物-氧氟沙星有较高亲和力(IC₅₀：1.592ng/ml)可部分作为氧氟沙星专用检测试剂盒替代品用于氧氟沙星初步筛查。

3.该单克隆抗体(腹水样本)对洛美沙星、沙拉沙星有一定免疫亲和力(IC₅₀：6.573，7.321ng/ml)。

4.该单抗检测通用性较高：极高灵敏度可同时测定五种氟喹诺酮药物、高灵敏度可同时测定六种氟喹诺酮药物，一般灵敏度可同时测定八种氟喹诺酮药物。

实施例5：胶体金的制备与质量分析

1、胶体金的制备

取1％HAuCl₄溶液0.5ml(由氯金酸加水配制而成)加入到49.5mL超纯水中，所得氯金酸溶液浓度为0.01％，置于带冷凝装置(避免由于水的蒸发导致氯金酸溶液浓度降低)的三角烧瓶中加热至沸腾，在磁力恒温搅拌器加热搅拌下快速加入1％的柠檬酸三钠溶液1.25mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色。冷却后置于棕色瓶中4℃冰箱保存。

2、胶体金的评估

在遴选出一种优质单抗作检测抗体以及合适半抗原蛋白偶联物作包被抗原后，免疫检测金标卡的稳定性和检测灵敏度取决于另一个重要因素即制备胶体金粒径和颗粒均一性，本发明采用粒径约为20nm作为原料制备单克隆抗体金标探针，按100ml 0.01％HAuCl₄加1.5ml1％柠檬酸钠比例经典还原法得胶体金取少许进行400-900nm可见光连续扫描结果见图5，透射电镜鉴定见图6，不同粒径相对数量见图7，扫描图显示该胶体金液在522nm处有明显吸收峰初步说明胶体金液中大多数颗粒的粒径在20nm,透射电镜显示金颗粒饱满均匀，粒径统计分析粒径20nm颗粒数约占60％，粒径为18nm和22nm颗粒数之和大约占30％，粒径为16nm和24nm颗粒数之和仅约占10％。

通过图5-7表明本发明已获得了粒径合适，大小较均一胶体金的颗粒，满足了下一步单克隆抗体胶体金探针的制备。

实施例6：金标抗体的制备

1、抗体的预处理

取本发明纯化单抗蛋白于透析袋(7500-14000MW)中，于5mM NaCl(pH 7.0)溶液4℃透析过夜(每4-6h换液一次)，透析后的蛋白用0.22μM微孔滤膜过滤，过滤后于4℃保存备用。

2、最佳标记量的确定

取8支EP管各加1ml实施例5胶体金悬液后，将上述单克隆抗体蛋白用5mM NaCl(pH7.0)溶液分别稀释成0、10、15、20、25、30、35、40μg/ml,各取蛋白稀释液0.1ml分别加入胶体金液EP管中，5min后加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h观察，并以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该单抗蛋白的最低用量。

3、单抗蛋白的胶体金标记

用0.1M K₂CO₃调节金溶胶pH至8.2,取10ml已调pH值的金溶胶中加入最佳标记量的单抗蛋白液(体积约20μL)，搅拌15min,4℃孵育过夜后，加入0.5ml 5％BSA溶液封闭,3000r/min离心30min，去除粒径较大的颗粒,取上清14000r/min离心30min后取沉淀，将沉淀物重悬为原体积的十分之一制成探针悬液于4℃保存备用。

实施例7：免疫金标卡的组装

实用型免疫金标卡组件包括：(1)样品垫、(2)结合垫(胶体金垫)、(3)层析膜(硝酸纤维素膜)、(4)吸收垫、(5)支持底板(PVC底板)、(6)外包装塑料盒

(1)样品垫：选用了上海杰一生物有限公司提供的Ahlstrom8964(25×30cm)型玻璃纤维，用试纸条展开剂将样品垫37℃封闭2-3h,干燥备用。

(2)结合垫(胶体金垫)：选用上海杰一生物有限公司公司提供的Ahlstrom 8964(25×30cm)型玻璃纤维，将上述胶体金标记的单克隆抗体蛋白液均匀地喷涂在4mm宽的玻璃纤维膜上,室温干燥，干燥后至密封塑料中，于4℃冰箱中保存备用。

(3)层析膜(硝酸纤维素膜)：选用Whatman公司提供硝酸纤维素膜(ImmunoporeRP,25mm×50m)作试验用膜。0.01M Na₂CO₃/NaHCO₃(pH9.6)分别将恩诺沙星牛血清白蛋白偶联物(混合酸酐法合成)和山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体稀释成1mg/ml,置BioDotXYZ3050三维喷点平台上，用BioJet Quanti300非接触微量喷头将上述二种试液均匀平行地喷洒在NC膜上并分别标记为T/C线。37℃培养箱干燥后，放至密封塑料中，于4℃冰箱中保存备用。

(4)吸收垫：选用上海杰一生物有限公司提供(H5072,20×30cm)吸收垫，用试纸条切割机切成宽度为5mm长型小条，放至密封塑料中。

(5)支持底板：选用上海杰一生物有限公司公司提供DB—6免疫金标卡专用PVC板作支持底板(6cm×30cm)。

(6)外包装塑料盒：选用上海捷宁生物有限公司提供C-9-1型免疫金标卡专用包装塑料盒作外包装。

将上述各部件按照图1所示进行有序安装。

实施例8：免疫金标卡对氟喹诺酮药单组分检测灵敏度的分析

分别精确称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星各1mg，用0.03M NaOH分别配制1mg/ml储存液，并于4℃保存备用(有效期为1个月)。分别取一部分用0.03M NaOH再分别配制500ng/ml作工作储存液，再用0.01MPBS(pH7.4)液将每种药工作储存液分别配制成：0、0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/ml(ppb)七个稀释度分别滴加于制备的免疫金标卡加样孔中(200μl/孔)，用实施例7金标卡对每个浓度点药物进行层析测定，10min后观察实验结果并拍照记录，结果见图8和图9。

以本发明单抗纯化蛋白与胶体金交联制备金标抗体作测试抗体，以混合酸酐法合成的恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物作检测抗原，以山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗作质控包被物组装实用型金标检测卡对八种氟喹诺酮药物单组分检测灵敏度测试显示：浓度为3ng/ml的恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星的单组份竞争物均能使检测线(T线)完全消失，说明该卡对上述五种药物的检测限均小于等于3ng/ml，其中诺氟沙星检测灵敏度最高，1ng/ml诺氟沙星作竞 争物能使检测线完全消失说明该金标卡对诺氟沙星的检测限已达到小于等于1ng/ml，结果见图8。

30ng/ml沙拉沙星作竞争物检测线完全消失说明该卡对沙拉沙星的检测限小于等于30ng/ml；10和100ng/ml的氧氟沙星和洛美沙星分别作竞争物检测线大部分和完全消失说明该卡对氧氟沙星的检测限在10-100ng/ml，结果见图9。

实施例9：免疫金标卡对氟喹诺酮药物三组分混标物检测灵敏度的分析

将恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、依诺沙星中作三种药物等浓度任意组合(共计10种组合)混合，每个组合按总浓度计为3ng/ml，每个组合中单个组分浓度为1ng/ml，按实施例8同样的方法进行层析测定与记录，结果见图10。

由图10可见，未加竞争物的空白对照组(第一组)金标卡的T线和C线均有明显的杂交信号说明该金标卡工作正常，单克隆抗体的金标探针能捕捉到恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联物同时亦能被山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗所捕捉。

各试验组(共十种组合，第2-11组)的竞争物均能完全竞争金标抗体探针与恩诺沙星偶联物的结合使T线完全消失，该结果说明该金标卡总浓度为3ng/ml的上述五种氟喹诺酮药物三组分等浓度混标物的检测线小于等于3ng/ml，结合实施例8单组分试验结果说明该金标卡对上述五种氟喹诺酮药物的识别不存在相互干扰效应而为叠加效应，且灵敏度极高。

实施例10：金标卡抗基质干扰能力的分析

以猪肉和猪尿为模式基质，恩诺沙星标样做标准掺入物通过回收率分析该金标卡的抗基质干扰能力，结果见表2。

表2金标卡对恩诺沙星外标猪肉猪尿样本的检测

表2显示：以猪肉、猪尿为基质，恩诺沙星外标后，其检测信号强度与外标目标物呈强浓度依赖性，与标准液中同浓度点外标目标物抑制信号强度基本一致，该结果表明免疫金标卡有强抗基质干扰力，为免疫金标卡的实际应用提供了有力试验依据。

实施例11：金标卡稳定性检测

取4℃干燥保存一、三个月后的免疫金标卡按实施例8同样的方法中的恩诺沙星系列浓度竞争物进行层析测定并与实施例8中对应试验结果进行比较，分析金标卡的稳定性，结果见图11。

图11显示储存1、3月的金标卡与现装配金标卡检测灵敏度无明显差异说明该金标卡有良好的稳定性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡，其特征在于，包括胶体金垫和层析膜，所述胶体金垫搭接在层析膜上靠近检测线的一端；

其中，所述胶体金垫喷涂有被胶体金标记的由保藏编号CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的单抗蛋白；所述层析膜上的检测线喷涂有包被的恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白的偶联物；所述层析膜上的对照线喷涂有山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，所述单抗蛋白为CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞分泌产生的鼠源单抗。

2.根据权利要求1所述免疫金标卡，其特征在于，还包括样品垫、支持底板、吸收垫和外包装塑料盒。

3.根据权利要求2所述免疫金标卡，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维。

4.根据权利要求2所述免疫金标卡，其特征在于，所述支持底板为PVC板。

5.根据权利要求2所述免疫金标卡，其特征在于，所述样品垫、胶体金垫、层析膜和吸收垫依次搭接，并整体置于支持底板上。

6.根据权利要求1所述免疫金标卡，其特征在于，所述层析膜为硝酸纤维素膜。

7.权利要求1所述免疫金标卡的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1、用保藏编号CCTCC NO.C2015221的杂交瘤细胞株获取单克隆抗体，制备胶体金悬液并标记所获得的单克隆抗体，备用；

通过碳二亚胺偶联法或混合酸酐法将恩诺沙星与阳离子化牛血清白蛋白偶联制备出偶联物EF-cBSA并包被；选用山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗备用,所述单克隆抗体为CCTCCNO.C2015221的杂交瘤细胞株分泌产生的小鼠单抗；

步骤2、将被胶体金标记的单克隆抗体喷涂在胶体金垫上；将包被的偶联物EF-cBSA喷涂在层析膜上作为检测线，将所述二抗喷涂在层析膜上作为对照线；

步骤3、将胶体金垫搭接在层析膜上靠近检测线的一端，获得所述免疫金标卡。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，还包括在组装完胶体金垫和层析膜后，组装样品垫、支持底板、吸收垫和外包装塑料盒的步骤。

9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，将所述样品垫、胶体金垫、层析膜和吸收垫依次搭接，并整体置于支持底板上，最后用外包装塑料盒包装。