CN105628923B - 一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用，该试纸条包括控制线，所述控制线至少为两条，不同控制线上包被有不同浓度的二抗。本发明免疫胶体金试纸条能够对食用农产品中氟喹诺酮类药物残留量实现半定量快速检测或现场检测；灵敏度高，特异性好；对农产品中16种氟喹诺酮类药物的最低检出限可达1～10μg·kg^‑1，适用于各类企业及检测机构；对青霉素、氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶等抗菌素的交叉反应率均低于1％。

Description

一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及农产品检测技术领域，尤其涉及一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用。

背景技术

氟喹诺酮类(FluomquinoIones，FQNs)抗生素是一类广谱的化学合成抗菌药物，是喹诺酮类抗生素在其主环6或8位加入氟原子后的衍生物。由于氟喹诺酮类药物价格低廉且治疗效果好，因此近年来被广泛应用到水产养殖中预防、治疗鱼类疾病。但是在长期使用过程中，人们逐渐发现该类药物的过量或不当使用会造成动物产品中残留和蓄积。人食用有FQNs残留的食品后，人体正常的肠道菌群被破坏而引起肠道功道紊乱，此类药物影响儿童骨骼发育，易引起肝损害和关节病变，还可诱发癫痫和神经症状；人类长期食用含较低浓度FQNs药物的食品，容易诱导细菌耐药性的传递，甚至产生超级细菌，从而影响该类药物的临床疗效。

目前，HPLC法和LC-MS/MS法是国际上最常用来测定氟喹诺酮类药物残留的方法，LC-MS/MS法可以利用待测分子的结构来定性，可以排除ELISA和HPLC法检测的假阳性结果，用以确证检测结果。但这两种检测方法涉及到大量的有机溶剂处理，过程比较复杂，周期也比较长，操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。

ELISA测定的基础是抗原抗体反应，该法精确、灵敏，检测时间大大缩短，但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。此外ELISA试剂寿命短，因此需要低温保藏。

基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法灵敏度较高，特异性强，试样预处理简单，分析时间短，使用方便。因此，在现场监控和基层的大规模筛选检测中，免疫学检测方法更实际。

胶体金免疫层析法是在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，除了具备酶联免疫法的诸多优点外，还克服了酶联免疫法的一些不足。该方法将反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中，反应通常只需数分钟，测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。具有简便快速、操作简单、特异性强、不需要额外设备等优点。

不同的国家和地区对FQNs残留限量要求不同，如美国FDA于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用，对海产品中FQNs残留零容忍，对方法检出限要求为5μg·kg^-1。我国农业部235号公告中规定了环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、噁喹酸和氟甲喹等7种喹诺酮药物(QNs)在动物肌肉中的最高残留限量(MRL)为10～500μg·kg^-1；而在奶、肝、肾和蛋中的MRL分别为30～100、80～1900、80～3000和50μg·kg^-1；不同人群对食用农产品质量安全的需求也有差异，尤其是孕妇、儿童和特殊体质人群，即使摄入较低浓度QNs药物的食品，也可能产生一些不良反应。

发明内容

本发明针对不同国家和地区对药物残留限量要求不同，提供了一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用，该试纸条具有两条控制线，符合两种不同限量要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测。

本发明提供了一种免疫胶体金试纸条，包括控制线，所述控制线至少为两条，不同控制线上包被有不同浓度的二抗。

该免疫胶体金试纸条包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；相邻各部分间有1-2mm的重叠以保证层析作用从样品垫到吸水垫部位的顺利进行。

所述免疫胶体金试纸条还包括标记物垫和检测线，所述检测线上包被有抗原，所述标记物垫上包被有能够与所述抗原反应的胶体金标记的抗体。

进一步，当药残限量值与抗体的最低检测限接近的情况下，解决C₁显色太浅的这一问题的办法是加入其它与检测线上抗原不反应的抗体，提高质控线显色效果的稳定性，提高半定量试纸条的检测灵敏度，同时可降低生产线调试的难度。

作为优选，所述标记物垫上还包被有与所述抗原不反应的胶体金标记的抗体。进一步地，所述抗原不反应的胶体金标记的抗体为磺胺二甲嘧啶多克隆兔抗或呋喃妥因代谢物鼠抗。

作为优选，所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体；所述抗原为氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联的偶联物。

具体地，所述免疫胶体金试纸条反应膜的检测线(T线)处包被有环丙沙星-卵清蛋白偶联物(CIP-OVA)或环丙沙星-牛血清蛋白偶联物(CIP-BSA)，所述反应膜的质控线(C1和C2线)处包被有二抗。

所述抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.C2015118；中国典型培养物保藏中心的地址为：中国.武汉.武汉大学。

所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：

(1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得能够产生抗喹诺酮类药物抗体的脾细胞；

(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；

其中，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10～30；所述偶联物的偶联比为2～6:1。

作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。

具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。

所述单克隆抗体的亚型为IgG₁λ链，与喹诺酮类药物有特异性反应。所述单克隆抗体通过体外培养的方式获得。

所述的氟喹诺酮类药物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星中的至少一种。

作为优选，所述胶体金的粒径范围为20～80nm。

具体地，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。

本发明提供了一种免疫胶体金试剂板，包含所述的免疫胶体金试纸条。

本发明试剂条和试剂板采用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测样品中的氟喹诺酮类药物残留水平。

本发明还提供了所述免疫胶体金试纸条在检测食用农产品中药物残留的应用。所述食用农产品为畜禽肉或水产品。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

(1)本发明免疫胶体金试纸条能够对食用农产品中氟喹诺酮类药物残留量实现半定量快速检测或现场检测。

(2)本发明免疫胶体金试纸条灵敏度高，特异性好，对农产品中16种氟喹诺酮类药物的最低检出限可达1～10μg·kg^-1，适用于各类企业及检测机构；对青霉素、氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶等抗菌素的交叉反应率均低于1％，可见，本发明免疫胶体金试纸条对氟喹诺酮类药物反应具有高度专一性。

(3)本发明免疫胶体金试纸条的操作简单快捷，将反应所需的大部分原料整合到PVC背衬中，滴样后，抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后1-5分钟即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和控制线的颜色深浅读取结果。检测实施过程不依赖任何实验设备，普通人员均可操作，不需专业培训。

(4)本发明免疫胶体金试纸条成本低，易推广，生产工艺简单，流程成熟，投资少，收效快。

(5)本发明为解决C₁显色太浅的问题又在标记物垫上包被了与检测线上抗原不反应的抗体，提高了质控线显色效果的稳定性，提高了半定量试纸条的检测灵敏度，同时也降低了生产线调试的难度。

附图说明

图1为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板背衬的结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线(T)，5为高含量控制线(C₂)，6为低含量控制线(C₁)，7为吸水垫，8为不干胶，9为PVC底板。

图2为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C₁、C₂为控制区，T为检测区。

图3为氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图；

其中，C₁为低含量控线、C₂为高含量控制线，T为检测线。

图3.a，T比C₁显色深，表示样品中FQNs残留量X＜C₁；图3.b T与C₁显色一样深，表示样品中FQNs残留量X＝C₁；图3.c T比C₁显色浅，但比C₂显色深，表示样品中FQNs残留量C₁＜X＜C₂；图3.d T与C₂显色一样深，表示样品中FQNs残留量X＝C₂；图3.e T比 C₂显色浅，表示样品中FQNs残留量X＞C₂；图3.f T不显色，表示样品中FQNs残留远高于C₂；图3.g表示试剂板已部分失效；图3.h表示试剂板已完全失效。

图4为免疫抗原环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的质谱图。

图5为单抗对环丙沙星(CIP)间接竞争ELISA的标准曲线。

图6为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12的染色体标本。

图7为重组纯化蛋白(Protein G)纯化抗体电泳图。

图8为不同胶体金标标记抗体标计量的显色情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的解释。

本发明试剂板的制备包括了载体蛋白偶联物的制备，抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备和氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板的组装。

具体如下：

一、半抗原与载体蛋白的偶联

免疫抗原合成：称取牛血清白蛋白(BSA)125mg，碳二亚胺(EDC)90mg，加4.5mL水溶解，制成A液；称取盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride，简称CIP)15mg，加水1.5mL溶解后制成B液，将B液加入A液。在摇床上4℃避光震荡18h以上，上下颠倒5次；收集反应液，先用0.1mol/L NaOH溶液透析5h，再用PBS(7.4)透析3天，换水6次，得免疫抗原(CIP-BSA)溶液，反应产物无菌分装后－20℃冰箱保存备用。

用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同样方法制备环丙沙星-卵清蛋白偶联物(CIP-OVA)。

二、抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

(一)杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12的制备

杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12于2015年8月26日送达中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，该细胞株的存活性于2015年9月10日检测结果为存活，保藏编号CCTCC No:C2015118。

该杂交瘤细胞株通过环丙沙星(CIP)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(CIP-BSA)为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫后小鼠的脾脏细胞与经复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经过筛选和4次克隆获得。具体过程如下：

1.免疫抗原(CIP-BSA)的合成

(1)称取牛血清白蛋白(BSA)125mg，碳二亚胺(EDC)90mg，加4.5mL水溶解，制成A液。

(2)称取盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride，简称CIP，CAS号:86483-48-9分子式:C₁₇H₁₉ClFN₃O₃分子量:367.8)15mg，加水1.5mL溶解后制成B液，将B液加入A液。

(3)将上述混合后的溶液置于摇床上，4℃避光震荡18h以上，上下颠倒5次。

(4)收集反应液，先用0.1mol/L NaOH溶液透析5h，再用PBS(7.4)透析3天，换水6次，得CIP-BSA溶液。

(5)用考马斯亮蓝染色法检测抗原蛋白浓度：CIP-BSA溶液稀释40倍，测得值0.2420mg/mL，原溶液浓度为9.68mg/mL。

(6)用高分辨率离子肼质谱检测CIP-BSA分子量为67995.2734道尔顿(见图4)，以相同方法测得BSA分子量为66366.2578道尔顿，计算偶联比为：

2.包被抗原(CIP-OVA)的合成

(1)称取卵清蛋白(OVA)125mg，EDC 90mg，加4.5mL水溶解，制成B液。

(2)称取CIP 15mg，加水1.5mL溶解后，加入B液。

(3)将上述混合后的溶液置于摇床上，4℃避光震荡18h以上，上下颠倒2次以上。

(4)收集反应液，先用0.1mol/L NaOH透析5h，再用0.02mol/L PBS(PH7.4)透析3天，换水6次，得CIP-OVA溶液。

(5)用考马斯亮蓝染色法检测抗原蛋白浓度：CIP-OVA溶液稀释40倍，测得值为0.3589mg/mL，原溶液浓度为14.536mg/mL。

3.免疫动物

首次免疫剂量约为100μg/只，例如取9.68mg/mL CIP-BSA溶液30μL+120μL PBS+150μL弗氏完全佐剂，充分乳化后，每批免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，分4～5点皮下注射；第2次～第5次免疫抗原剂量为80μg/只，加弗氏不完全佐剂乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫与皮下免疫间隔实施；第5次免疫3周后，以120μg/只的剂量从尾静脉加免。

4.血清抗体的检测

从第3次免疫开始，每次免疫第10天从小鼠尾部或眼框少量采血，用间接ELISA法检测血清抗体效价和对CIP的抑制率。

ELISA检测方法：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释将CIP-OVA稀释成300ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用；将血清用0.02mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)做10²～10⁷倍梯度稀释测定抗体效价；用竞争ELISA方法检测抑制率，即在对照孔中加50μL PBS，在竞争孔中加50μL 100ng/mL CIP标准溶液，将血清稀释至适当浓度，对照孔和竞争孔各加入50μL血清稀释液，后续步骤按间接ELISA方法操作；选对照孔OD值为0.8～1.2稀释度的一组计算

本发明所涉及的杂交瘤细胞株来源于经5次免疫免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法测得其效价为10⁶，对100ng/mL CIP标准溶液的抑制率为72％，10天后，以120μg/只的剂量从尾静脉进行第六次免疫，3天后取小鼠脾细胞用于细胞融合。

5.SP2/0骨髓瘤细胞的复壮

将10⁶的SP2/0细胞分4点注入Balb/c小鼠背部皮下，当瘤体膨大至约0.3cm时，将小鼠引椎处死，在无菌条件下取出瘤体，将其制成细胞悬液，采用密度梯度离心法纯化SP2/0 细胞；将其用1640培养基+8％小牛血清，在37℃，5％CO₂条件下培养2～3代；当细胞处于对数期时，用液氮冻存F₁～F₃代SP2/0细胞备用。

6.细胞融合

融合前5天复苏一管经复壮的SP2/0F₃代细胞；融合前3天选血清效价在10⁵以上且对CIP的抑制率较高的小鼠，对其进行尾静脉加免抗原；融合前2天SP2/0细胞改用含2％8-AG培养基选择培养24小时，融合前1天换成1640培养基+10％胎牛血清培养；融合当天取6周龄空白小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞作为饲养细胞，加1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT(HAT选择培养基)制成细胞悬液；

将加免后的小鼠引椎处死，在无菌条件下取脾脏，脾细胞与SP2/0细胞以6：1的比例在50％PEG4000介导下融合；经2次200g，12min低速离心去除PEG后，向融合细胞中慢慢加入160mL密度约为5×10⁵个/mL的饲养细胞悬液，小心混匀后，以200μl/孔加入96孔细胞培养板(筛选板)中，共铺8块板。

7.细胞培养

细胞融合后在37℃，5％CO₂条件下培养；第1～2周，用1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT的选择培养基；第3～4周，改HAT为2％HT过渡培养基；第5周后，停用HT，并将胎牛血清添加量降为10％。第10天和第20天，各筛选板分别补充一次饲养细胞，为了提高细胞活力和分泌抗体的特异性，在细胞培养过程中不添加任抗菌素。

8.阳性孔筛选

细胞融合后第4天在显微镜观察到已有少量杂交瘤细胞开始增殖，做第一次半换液，即每孔吸去100μl培养基上清，加入100μL新鲜的HAT选择培养基；融合后第6～30天，每3～4天取细胞上清做ELISA检测，先测效价，按阳性孔与阴性孔的OD值之比(P/N)＞2.1判别阳性孔；一般情况下，选取ELISA测得的OD＞0.8的阳性孔，取其细胞上清做适当稀释后，再检测CIP标准溶液对ELISA反应的抑制率。

9、单克隆细胞株的建立

细胞融合后第7天，选择抗体效价最高，且抑制率较好(200ng/mL CIP抑制率为85％)的阳性孔5C₈进行单克隆，再经过几次亚克隆获得本次融合的第一个细胞株；但本发明细胞株的原始阳性孔5H₁在融合后第20天才被筛选出来，5H₁孔的抗体效价不高，原倍细胞上清的OD值仅为0.61，但因其被100ng/mL CIP抑制率达90％，经过再次ELISA复检确认后，对其进行克隆，经过克隆后的5H₁E₉细胞生长速度明显加快，细胞上清的抗体效价提高了200倍，被20ng/mL CIP抑制率达93％；再做1次亚克隆后，抗体效价进一步提高，将包括5H₁E₉E₈在内的3个细胞系用液氮冻存；再做2次亚克隆后建立5H1E9E8D7H12细胞株(简称CIP H12)，即为本发明所涉及的杂交瘤细胞株。

取CIP H12细胞培养基上清液，做梯度稀释后用ELISA方法测定抗体效价为2×10⁴；取适当(测定抗体效价时OD值最接近1.0)3个梯度的稀释液，分别用0、0.25、0.5、1、2、4、8ng/mL环丙沙星标准溶液做竞争ELISA，测得细胞培养基上清液中单克隆抗体(单抗)对环丙沙星的50％抑制浓度(IC₅₀)为0.396ng/mL(见图5)，且该单抗对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟 沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星均有较高的亲和力；而与青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺嘧啶等其它类别的抗菌素无交叉反应。

CIP H12细胞株扩增后，将其F₀代冻存35管，其中10管于2015年8月26日送中国典型培养物保藏中心，该培养物的存活性由保藏中心于2015年9月10日检测完毕，结果为存活，保藏编号为CCTCC No:C2015118。

10、杂交瘤细胞染色体标本的制作

取一瓶处于对数生长期的CIP H12细胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至终浓度为0.1μg/mL，在37℃，5％CO₂条件下培养约30min后，刮下细胞，离心去上清，收集细胞；加入8mL 0.075mol/L的氯化钾，低渗处理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)进行预固定，用吸管轻轻吹打混匀细胞，200g离心6min，去上清；再加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打混匀细胞，室温下静置30min后，200g离心6min，弃上清液，依法重复固定2次；弃上清液，视细胞数量余留适量固定液，轻轻吹散细胞制备成细胞悬液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的洁净载玻片上，在酒精灯上过火，室温下阴干。将阴干的玻片标本加入Giemsa染液，并进一步做G显带处理。选50个分裂象做众数分析，染色体数目为87-116条，平均染色体数为96条(图6)。

(二)单克隆抗体的体外制备

CIP H12细胞株的F₁和F₂代用于生产单克隆抗体，将5×10⁵的细胞接入1000mL玻璃细胞瓶，加50mL 1640培养基(含10％胎牛血清)；在37℃，5％CO₂条件下培养约72小时后，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，将1瓶细胞分成3瓶，并加入新鲜培养基；约48小时后，再收集细胞上清液；此后，约2～3天收集1次细胞上清液，并将培养量扩大2～4倍，控制细胞量不超过60％培养瓶底面积，细胞可连续传代。收集细胞上清液立即加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置2～16小时，10000g离心30min；弃上清，沉淀用0.02mol·L^-1PBS溶解，再加入2：1体积比饱和硫酸铵，10000g离心30min，弃沉淀，取上清；加饱和硫酸铵至占总体积的42％，4℃放置2小时后10000g离心30min，弃上清，沉淀经透析后获得初步纯化抗体，用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，合计收集10个工作日共获得19.8克初步纯化抗体蛋白，小管分装后，-80℃保存。

1、抗体亚型的确定

通过IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP检测，本发明细胞株所产抗体亚型为IgG1λchain(λ链)。

2、抗体的纯化和保存

Protein G对抗体进一步纯化，以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱抗体后，立即用1mol/L的Tris-HCl(pH9.0)将洗脱液pH值调至中性。用间接ELISA方法检测纯化前、后抗体效价，纯化抗体回收率为70.5％；纯化时流穿液(CT)中未检测到抗体效价。将纯化后抗体、CT和细胞上清做SDS-PAGE电泳检测，检测结果表明抗体重链和轻链的分子量分别约为55kd 和25kd(见图7)，流穿液和细胞上清中的杂蛋白主要是BSA。

将纯化的抗体1mL/管无菌分装，经冷冻干燥后，密封-20℃保存。

三、胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入2mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

四、胶体金标记抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.5。边搅拌边加入1.5mg抗氟喹诺酮类药物单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG20000)，搅拌15min。20,000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用10mL胶体金复溶液重悬并离心2次。将沉淀用5mL含2％海藻糖的复溶液(pH8.5)溶解，用0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存备用。

五、氟喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂板的组装

如图1和2所示，试剂板的各部分组成成分和功能如下：

塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区2和控制区1)的作用。

背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。

样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。

硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线、控制线C₂和控制线C₁，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。

在BIODOT3210三维喷点平台上把载体蛋白偶联物及2种不同浓度的羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别喷在检测线(T)、低含量控制线(C₁)和高含量控制线(C₂)位置，37℃烘箱干燥8h。并将制备好的金标记氟喹诺酮类药物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。

检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

实施例1半定量免疫胶体金试剂板快速检测水产品中氟喹诺酮类药物残留

1、样品预处理

取12个留样水产品样本，各称取2g匀质样本于5mL离心管中，加入4mL酸化乙腈；剧烈振荡3min后，室温下3220g离心5min；取上层溶液1mL到新5mL离心管中，65℃下空气吹干；向吹干的离心管中加入0.3mL正己烷和0.3mL FQNs复溶液(主要成分为PBS)，用试剂板内置的滴管轻轻吹打润洗离心管内壁；静置分层后吸取下层溶液，待检。

2、检测步骤

从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在3～5min读取，其他时间判读无效。观察时，试剂板水平放置于观察者正面，如图2右侧所示。

3、结果判读方法

(1)判读标准

C₁为5μg·kg^-1质控线，即当T线比C₁深，表示样品中FQNs残留量＜5μg·kg^-1，T与C₁显色一样深表示样品中FQNs残留量＝5μg·kg^-1，T比C₁显色浅，表示样品中FQNs残留量＞5μg·kg^-1；C₂为100μg·kg^-1质控线，即当T线比C₂深，表示样品中FQNs残留量＜100μg·kg^-1，T与C₂显色一样深表示样品中FQNs残留量＝100μg·kg^-1，T比C₂显色浅，表示样品中FQNs残留量＞100μg·kg^-1。

(2)检测结果

检测12个留样水产品，检出10个样本的T线比C₁深，即FQNs残留量＜5μg·kg^-1，2个样本的T比C₁显色浅，但比C₂显色深，表示FQNs残留量为5～100μg·kg^-1个，与液相色谱-串联质谱法检测结果一致。

实施例2半定量免疫胶体金试剂板现场检测鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留

1.检测操作：取一个鸡蛋，打碎后，将蛋黄和蛋清搅拌均匀，用试剂盒内小滴管吸取1mL蛋液加入装有FQNs复溶液的小管内，吹吸数次后待检；从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；在加样后1～5min内读取结果。

2.判读标准

C₁为2μg·kg^-1质控线，即当T线比C₁深，表示样品中FQNs残留量＜2μg·kg^-1，T与C₁显色一样深表示样品中FQNs残留量X＝2μg·kg^-1，T比C₁显色浅，表示样品中FQNs残留量＞2μg·kg^-1；C₂为20μg·kg^-1质控线，即当T线比C₂深，表示样品中FQNs残留量＜20μg·kg^-1，T与C₂显色一样深表示样品中FQNs残留量X＝20μg·kg^-1，T比C₂显色浅，表示样品中FQNs残留量＞20μg·kg^-1。

3.检测结果

检测30个鸡蛋样品，检出FQNs残留量＜2μg·kg^-117个(阴性鸡蛋)，FQNs残留量为2～20μg·kg^-19个，FQNs残留量＞20μg·kg^-14个。

4.留样加标试验

取上述3个阴性鸡蛋的蛋液，分别添加1.0、2.0、5.0、20、100μg·kg^-1环丙沙星标准溶液。添加1.0μg·kg^-1CIP，T比C₁显色深；添加2.0μg·kg^-1CIP标液，2个T与C₁显色一样深(如图3.b所示)，1个T比C₁显色浅(经液相色谱-串联质谱法验证，该阴性样品中含有1.3μg·kg^-1FQNs)；添加5.0μg·kg^-1CIP标液，T比C₁显色浅，但比C₂显色深；添加20μg·kg^-1CIP标液，T与C₂显色一样深；添加100μg·kg^-1CIP标液，T比C₂显色浅。

取上述1个阴性鸡蛋的蛋液，分别添加5μg/kg恩诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星、达氟沙星、氟甲喹、噁喹酸、氟罗沙星、双氟沙星、沙拉沙星和司帕沙星的检出限为，及15μg/kg麻保沙星、培氟沙星、依诺沙星和加替沙星T比C₁显色浅，但比C₂显色深。

5.交叉反应试验

取上述的2个阴性鸡蛋的蛋液，20μL 100mg/L氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶标准品做不同类型抗菌素的交叉反应试验，试验表明试剂条上的T线显色均比C₁线略深，判断为阴性，因此该GICT试剂条与氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶的交叉反应率＜1％。

实施例3添加同源抗体制备FQNs高灵敏度半定量免疫胶体金试纸条

(1)胶体金标记抗体：取胶体金100mL，用0.1mol/L Tris-HCl溶液调胶体金溶液pH到8.6，置于磁力搅拌器上，边搅拌边加入0.2mg·mL^-1FQNs单抗1mL，开始计时，2min后，加入0.5mg·mL^-1的呋喃妥因代谢物(AHD)鼠抗0.4mL，4min后加入0.5mg·mL^-1的BSA 1mL，搅拌15min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，搅拌15min。4℃放置于过夜，15,000rpm离心60min，弃上清液。将沉淀用10mL胶体金复溶液溶解，再15,000rpm离心60min，弃上清液，以去除未标记上的抗体，重复纯化金标抗体一次。将沉淀用5mL胶体金复溶液溶解，以0.22μm无菌滤膜过滤后，4℃保存备用。

(2)开启BIODOT 3210三维喷点平台的气动喷头(AirJet)，将上述胶体金标记的抗体均匀喷洒在胶体金结合垫，37℃烘箱干燥过夜。

(3)开启BIODOT 3210三维喷点平台的BioJet喷头，用3mg·mL^-1CIP-BSA喷NC膜的T线，以0.03mg·mL^-1羊抗鼠IgG喷C₂线，再以0.3mg·mL^-1羊抗鼠IgG喷C₁线，37℃烘箱干燥8h。

(4)检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

(5)添标测试：取阴性鸡肉样品提取液，分别添加CIP标液至终浓度为0、2、20ng·mL^-1，每个添标浓度滴3片试剂板。添标0ng·mL^-1，T线显色比C₁深；添标2ng·mL^-1，T与C₁显色一样深；添标20ng·mL^-1，T与C₂显色一样深。在阴性鸡肉样品提取液添加AHD标液至终浓度为500、1000ng·mL^-1，滴板测试时T线显色比均C₁深。说明试剂板的C₁和C₂质控线对应FQNs浓度分别为2ng·mL^-1和20ng·mL^-1，与AHD无交叉反应。

杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12所产抗体ELISA方法检测对CIP的50％抑制浓度(IC₅₀)为0.396ng·mL^-1，制备只有1条质控线的普通免疫胶体金试纸条，其对CIP最低检出限可达2μg·kg^-1，但如果不加其它抗体制备有2条质控线半定量免疫胶体金试纸条，其对CIP最低检出限只能达到5μg·kg^-1，标记时加入其它同源抗体后，半定量免疫胶体金试纸条最低检出限才能达到2μg·kg^-1。

因为试纸条的反应原理为竞争法抗原-抗体反应，样品中的FQNs与抗体结合后抑制了抗体与T线上抗原的结合，所以当金标FQNs抗体量较少时，试剂条的检测灵敏度较高，例如以2μg·mL^-1FQNs抗体量进行单独标记，制备半定量试纸条，因金标抗体量太少，会出现C₁线显色太浅(如图8.a)或不显色(如图8.b)的情况；只有提高标记时所用FQNs抗体量，才能确保有足够的金标抗体在C₁线显色(如图8.c)，因此，如果不加其它抗体制备有2条质控线半定量免疫胶体金试纸条，最低检出限只能达到5μg·kg^-1，而当标记时加入其它同源抗体后，半定量免疫胶体金试纸条最低检出限才能达到2μg·kg^-1。

实施例4添加不同源抗体制备FQNs高灵敏度半定量免疫胶体金试纸条

(1)取胶体金100mL加入0.2mg·mL^-1FQNs单抗1mL进行标记，将金标FQNs抗体喷洒在胶体金结合垫1，烘干备用。

(2)取胶体金100mL加入0.3mg·mL^-1磺胺二甲嘧啶(SMZ)多克隆兔抗1mL进行标记，将金标FQNs抗体喷洒在胶体金结合垫2，烘干备用。

(3)开启BIODOT 3210三维喷点平台的BioJet喷头，用2mg·mL^-1CIP-OVA喷NC膜的T线，以0.03mg·mL^-1羊抗鼠IgG喷C₂线，再以0.35mg·mL^-1羊抗兔IgG喷C₁线，37℃烘箱干燥8h。

(4)检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫2、、胶体金结合垫1、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

(5)添标测试：取阴性鸡肉样品提取液，分别添加CIP标液至终浓度为0、2、20ng·mL^-1，每个添标浓度滴3片试剂板。添标0ng·mL^-1，T线显色比C₁深；添标2ng·mL^-1，T与C₁显色一样深；添标20ng·mL^-1，T与C₂显色一样深。在阴性鸡肉样品提取液添加SMZ标液至终浓度为500、1000ng·mL^-1，滴板测试时T线显色比均C₁深。说明试剂板的C₁和C₂质控线对应FQNs浓度分别为2ng·mL^-1和20ng·mL^-1，与SMZ无交叉反应。

生产线的调试过程简单、易操作，标记方法和C₂线调整程序与生产普通的定性免疫胶体金试纸条相同，C₁线调整时直接根据在添标量为C₁浓度时T线显色深度调整即可。

Claims (6)

1.一种免疫胶体金试纸条，包括控制线，其特征在于，所述控制线至少为两条，不同控制线上包被有不同浓度的二抗；

还包括标记物垫和检测线，所述检测线上包被有抗原，所述标记物垫上包被有能够与所述抗原反应的胶体金标记的抗体；

所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体，所述抗氟喹诺酮类药物单克隆抗体由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，保藏编号为CCTCC NO.C2015118；

所述抗原为氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联的偶联物。

2.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述标记物垫上还包被有与所述抗原不反应的胶体金标记的抗体。

3.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金的粒径范围为20～80nm。

4.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条，其特征在于，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG。

5.一种免疫胶体金试剂板，其特征在于，包含如权利要求1～4任一所述的免疫胶体金试纸条。

6.如权利要求1所述的免疫胶体金试纸条在检测食用农产品中药物残留的应用。