CN103323592B

CN103323592B - 高通量毒品毒物快速检测芯片及系统

Info

Publication number: CN103323592B
Application number: CN201210077078.4A
Authority: CN
Inventors: 曾立波; 陈连康; 胡小龙; 张玉荣
Original assignee: Individual
Current assignee: Shanghai Eight Way Biological Polytron Technologies Inc; SHANGHAI INSTITUTE OF CRIMINAL SCIENCE AND TECHNOLOGY
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2012-03-22
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2032-03-22
Also published as: CN103323592A

Abstract

本发明涉及高通量毒品毒物快速检测芯片及系统，具体地，本发明首次制备了一种毒品检测芯片，所述芯片包括基片以及位于所述基片上的检测点，所述检测点固定有与选自下组至少4种毒品的特异性结合的检测抗体：吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、三环类抗抑郁剂和度冷丁。检测抗体为由完全抗原分子诱导产生的免疫球蛋白。本发明的芯片能一次性高通量同时检测多种毒品，自动化程度高、特异性强、灵敏度高，可进行定性定量检测。

Description

高通量毒品毒物快速检测芯片及系统

技术领域

木发明涉及违禁药品的检测领域，尤其涉及高通量毒品毒物快速检测芯片及系统。

背景技术

毒品泛滥作为当今世界最严重的公害之一，越来越引起国际社会的关注。据联合国有关资料显示：毒品问题已对人类的生存和发展构成重大威胁，全世界至少有5100万人遭受毒品之害，全球每年毒品交易额已超过5000亿美元。近年来我国的毒品问题日趋严重，毒品滥用的趋势更为迅猛。上海地区的毒品犯罪形势也十分严峻。

在打击毒品犯罪案件中，毒品检验工作在其中发挥极其重要的作用，它不仅为侦破毒品犯罪提供了线索，也为法庭量刑、定刑提供了科学的依据。目前，气质联用(GC-MS)检测法是毒品检测的标准方法，但其存在以下缺点：1、仪器价格昂贵，一般单位无法购买，不易普及；2、检测仪器要在良好的实验室才能操作，对仪器操作都要求严格的培训；3、对检材都需要提取及衍生化，其操作繁琐时间长；4、上述仪器不能快速用于现场检测。

特定的结合反应，例如抗原-抗体反应，已经广泛用于检测生物样品中存在的各种物质的免疫测试中。与GC-MS比较，抗原-抗体反应技术具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读、无需任何仪器设各等优点。然而研究证明，大多数毒品是小分子物质，不具备免疫原性，因此不能用来直接免疫动物产生抗体，此外，吸毒人员吸食的毒品成分复杂，针对单一毒品分子的检测手段远不能满足目前毒品刑侦的需求。

因此目前本领域目前还没有一种成熟有效迅速的检测多种毒品的方法，因此急需开发一次性高通量快速检测多种毒品的方法和系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种高通量毒品毒物快速检测芯片及系统。

在本发明的第一方面，提供了一种毒品毒物检测芯片，包括基片、位于基片上的检测点以及固定于检测点的检测抗体，所述检测抗体与选自下组的至少4种毒品毒物特异性地结合：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂。

在另一优选例中，所述的检测抗体还与选自下组的毒品毒物特异性结合：可待因、海洛因、或福尔可定。

在另一优选例中，固定于检测点的检测抗体与选自下组的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、氯胺酮、大麻、和甲基苯丙胺。

在另一优选例中，所述的检测抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体由完全抗原分子诱导单克隆抗体杂交瘤产生。

在另一优选例中，所述的单克隆抗体杂交瘤选自下组：度冷丁单克隆抗体杂交瘤细胞株DLT-001CCTCC.C2011118、小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.1404、小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200915、或小鼠单抗杂交瘤细胞株Met1CCTCC NO.C200914。

在本发明的第二方面，提供了所述芯片的用途，所述芯用于检测样品中毒品毒物。

在另一优选例中，所述样品是生物样品。

在另一优选例中，所述样品为血样、尿样、唾液，或其组合。

在另一优选例中，所述样品来源于人或非人哺乳动物。

在本发明的第三方面，提供了一种毒品毒物检测芯片的制备方法，包括步骤：

(a)将一粘着中间介层连接于基片表面上；和

(b)将至少4种检测抗体固定在该表面层上，所述的检测抗体与选自下组的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂。

在另一优选例中，步骤(a)所述的粘着中间介层为硅烷化包被物。

在另一优选例中，步骤(a)所述的粘着中间介层通过化学键与基片表面连接。

在另一优选例中，步骤(a)所述的检测抗体与选自下组的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、氯胺酮、大麻、和甲基苯丙胺。

在本发明的第四方面，提供了一种检测样品中是否存在毒品毒物的方法，所述毒品选自下组：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂，包括步骤：

(a)将所述样品与本发明第一方面所述的芯片接触；

(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在所述毒品毒物。

在本发明的第五方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的本发明第一方面所述的芯片。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示吗啡完全抗原的制备流程。

图2显示苯丙胺完全抗原的制备流程。

图3显示甲基苯丙胺完全抗原的制备流程。

图4显示大麻完全抗原的制备流程。

图5显示氯胺酮完全抗原的制备流程。

图6显示丁丙诺啡完全抗原的制备流程。

图7显示美沙酮完全抗原的制备流程。

图8显示可卡因完全抗原的制备流程。

图9显示摇头丸完全抗原的制备流程。

图10显示三唑仑完全抗原的制备流程。

图11显示巴比妥完全抗原的制备流程。

图12显示麦角二乙胺完全抗原的制备流程。

图13显示芬太尼完全抗原的制备流程。

图14显示三环类抗抑郁剂(TCA)完全抗原的制备流程。

图15显示盐酸哌替啶完全抗原的制备流程。

图16显示纯化后抗体经2-ME还原后聚丙烯酰氨凝胶电泳图。

图17显示氯胺酮抗血清效价测定结果。

图18显示氯胺酮单克隆抗体效价测定结果。

图19显示醛基化玻璃芯片和氧化铝基片芯片的比较，第一行的图为不同批次的醛基化玻璃芯片，第二行的图为氧化铝基片芯片。

图20显示不同活化方法制备的芯片检测的信号强度结果。

图21显示不同活化方法制备的芯片检测的信噪比结果。

图22显示用GOPTS和PL活化方法制备的芯片宝贝毒品抗体，其信号强度检测结果。

图23显示用不同的缓冲体系对芯片封闭的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种毒品检测芯片，具体地，所述芯片包括基片以及固定于基片上的探针，探针特异性地与选自下组的至少4种物质结合：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、三环类抗抑郁剂，所述探针为由完全抗原分子诱导产生的免疫球蛋白。本发明的芯片能一次性高通量同时检测多种毒品，自动化程度高、特异性强、灵敏度高，可进行定性定量检测。在此基础上完成了本发明。

小分子毒品完全抗原的制备

单克隆抗体的制备，必须在有免疫原性的大分子蛋白质之间免疫产生单抗，毒品和毒物均是分子量很小的半抗原，本身没有免疫原性，因此不能用于直接免疫动物而获得抗体的。为了获得抗毒品毒物小分子物质的单克隆抗体，首先必须制备具有免疫原性的完全抗原。具体地，首先将小分子进行活化，在其结构上引入一个活性基团，使其具有活泼的化学性质。在本发明的一个优选例中，优选在毒品小分子上引入氨基或羧基，以便与大分子的载体蛋白发生缩合反应，形成完全抗原，然后采用同源双功能氨基偶联剂，将活化的小分子与大分子蛋白偶联，在本发明的一个优选例中，优选的大分子蛋白是KLH、BSA或OVA，这样就使小分子毒品、毒物成为完全抗原而具有免疫原性。

吗啡及其完全抗原的制备

式1

吗啡属于阿片类生物碱，是易为滥用的毒品之一，吗啡的结构如式1所示。吗啡的药理作用为：镇痛作用、镇静、改善疼痛病人的紧张情绪、抑制呼吸中枢、降低呼吸中枢对二氧化碳的敏感性、抑制咳嗽中枢、产生镇咳作用，有镇吐、缩瞳等作用。

吗啡的完全抗原采用二步反应方法进行制备：1.先将吗啡进行羧基化；2.将羧基化的吗啡与蛋白质进行偶联反应。吗啡分子上的6位羟基是异喹啉结构上的活性基团，所以选择在该部位进行活化，使吗啡分子上带有羧基，然后与蛋白质的氨基形成肽键，从而与载体蛋白偶联。具体步骤如下：

称取硫酸吗啡20mg，与3倍的琥珀酸酐在吡啶中反应4h，蒸干溶剂，用乙醇洗涤，得到6-琥珀酰吗啡(M-6-S)的固体粉末；称取10mg的BSA(牛血清白蛋白)或KLH(血蓝蛋白)溶于10mL PBS(磷酸盐缓冲液)中，加入60mg EDC(碳二亚胺)室温下搅拌反应2～3h，将反应液10000rpm离心除去不溶物，将上述得到的6-琥珀酰吗啡(M-6-S)20mg溶于0.5mL水中，逐滴滴入BSA(牛血清白蛋白)或KLH(血蓝蛋白)溶液中，室温反应12h。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图1。

苯丙胺完全抗原的制备

苯丙胺(Amphetamine)是一个分子量很小的半抗原物质(分子量135.2)，结构见式2。制备具有苯丙胺性质的完全抗原采用二步反应方法进行：1.先将苯丙胺进行硝化，在其苯环上接入一个硝基基团；2.将接上去的硝基还原为氨基，使其具有活泼的化学性质；3.与蛋白质偶联。

式2

在反应瓶中加入苯丙胺原料0.52g和10mL浓硫酸，搅拌使之溶解，置于冰盐浴中冷却至-5℃，在1小时内分4次加入由浓硝酸(0.25ml)和浓硫酸(0.75ml)1∶3组成的混合酸液。加完后，0℃条件下反应2小时，然后倒入10g碎冰中，待碎冰融化后，再在0℃条件下反应半小时，当有白色固体析出时，抽滤得白色固体物。将上部反应所得产物对硝基苯丙胺0.5g溶于1.4mL水中，搅拌下加入0.55mL浓盐酸，逐渐升温，30-40℃时开始加入锌粉(分4批)共0.62g，直至50-60℃，加完后，在此温度条件下反应2小时，过滤，滤液用20％NaOH溶液中和至弱碱性(PH＝8)，抽滤，滤出白色固体(为氢氧化锌)并用温水洗涤，合并收集的滤液，用30mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷溶剂，用饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，溶剂挥干，得半固体状黄色物质，用硅胶柱层析纯化，得浅黄色固体。利用对氨基-苯丙胺(p-NH2-AMP)与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(血蓝蛋白)偶联。反应过程见图2。

甲基苯丙胺完全抗原的制备

甲基苯丙胺(Metamphetamine)是一个小分子半抗原物质(分子量149.25)，结构如式3。

式3

甲基苯丙胺完全抗原的制备步骤如下，取2.00g甲基苯丙胺，4.17g N-溴代丁基邻苯二甲酰亚胺和3.14g碳酸氢钠，在100mL苯中回流16h。待反应完全后，将溶剂除去，残余物用薄层层析分离提纯。展开剂用甲醇和氯仿以5∶95的比例配制，Rf值为0.7。硅胶板中产物用甲醇提取，得1.59gN-(4-苯二甲酰亚胺丁基)甲基苯丙胺(PIBMA)。将1.50g PIBMA溶于5mL 95％乙醇中，再加入0.25g水合肼。该混合物回流1.5h直至形成白色沉淀，过滤后，滤液用1N盐酸酸化，除去生成的白色沉淀。剩余滤液用氢氧化钠溶液碱化，分离出油层，油层用乙醚提取，再除去乙醚。残余物同样用薄层层析(硅胶)分离提纯，得到0.75g N-(4-胺基丁基)甲基苯丙胺(ABMA)。称取10mg的BSA或KLH溶于10mL PBS中，加入60mg EDC(碳二酰胺)室温下搅拌反应2～3h，将反应液10000rpm离心除去不溶物，将ABMA20mg溶于0.5mL水中，逐滴滴入BSA或KLH溶液中，室温反应12h。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图3。

大麻完全抗原的制备

大麻的有效的成分为四氢大麻酚(THC)，其结构见式4。

式4

大吗完全抗原的制备如下：称取四氢大麻酚100mg，溶于10mL吡啶中，加入300mg的琥珀酸酐，60℃下4h，蒸去吡啶，用乙醇洗涤，得到固体粉末。称取20mg上述固体粉末溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和65mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和，室温下反应3h，10000rpm离心除去不溶物。配置10mg/mL KLH或BSA溶液10mL，缓慢加入上述上清液，室温反应2h，反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图4。

氯胺酮完全抗原的制备

氯胺酮(Ketamine)分子量237.5，其结构见式5。

式5

将氯胺酮与碘丁酸甲酯溶于DMF中，加入三乙胺，在60℃左右搅拌，用TLC跟踪反应。待完全反应后，减压蒸去溶剂，剩余物溶于乙酸乙酯中，并用水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，得到产物。如果该产物不纯，可通过柱层析提纯。将上一步得到的酯溶于10％的KOH甲醇溶液，在室温下搅拌，用TLC跟踪反应。待完全反应后，减压蒸去溶剂，剩余物溶于水中，并用乙醚萃取(2次)，除去有机相，将水相置于冰水浴中，用2N盐酸酸化，调节pH值6～7。将析出的固体过滤，干燥后得到水解产物。如果酸化后所得的是较粘物质，可用乙酸乙酯萃取，得到水解产物。如果没有形成固体，可将水与甲苯共沸除去水，所得的固体残留物溶于乙醇中，滤除不溶固体，再将溶剂蒸去，得到水解产物。将上一步得到的酸与NHS溶于DMF中，在冰浴中搅拌，加入过量的EDC，继续在冰浴中搅拌5～6小时，最后搅拌过夜。蒸去溶剂，残留物用乙酸乙酯萃取，并用冰水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，得到缩合产物。如果该产物不纯，可通过柱层析提纯。将BSA或KLH(溶于0.2M的碳酸钠溶液，将半抗原溶于DMSO中(5mg/ml)滴加于上述溶液，该混合物在冰浴中搅拌5小时左右。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图5。

丁丙诺啡完全抗原的制备

盐酸丁丙诺啡(Buprenorphine)分子式C29H41NO4.HCl，分子量503.5，其结构如式6所示。

式6

将50mg盐酸丁丙诺啡溶于5mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入30mg氢化钠室温下搅拌20min，再加入100mL溴戊酸乙酯，室温下继续反应48h。通过挥发除去DMF，剩余物经硅胶层析柱纯化，得到反应产物57mg。将所得产物溶于4mL 90％的甲醇中，加入100mg NaOH，55℃反应1h，甲醇挥发后用50mL氯仿溶解反应产物，用2N盐酸调节pH值至2.0，分离有机相，用无水硫酸钠干燥，获得活化小分子。取30mg活化的丁丙诺啡，溶解于3mL四氢呋喃中，然后缓慢加入25mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，摇匀后室温下反应16h，离心后去沉淀。配置2mg/mL KLH或4mg/mL BSA溶液10mL，于4℃缓慢加入以上丁丙诺啡反应物，pH值调节至8.0，在4℃下反应16h。反应产物过Sephadex25凝胶柱，除去未反应的活化的丁丙诺啡，收集蛋白峰，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，即得完全抗原。反应过程见图6。

美沙酮完全抗原的制备

盐酸美沙酮(Methadone)分子式为C₂₁H₂₇NO.HCl，分子量345.5，是一种人工合成的麻醉药品，为强效镇痛药，作用与吗啡相似，其结构见式7。

式7

在反应瓶中加入美沙酮原料0.62g和20mL浓硫酸，搅拌，使之溶解，置于冰盐浴中冷却至-5℃，在1小时内分4次加入由浓硝酸(0.5mL)和浓硫酸(1.5mL)1∶3组成的混合酸液。加完后，0℃下反应2小时，然后倒入10g碎冰中，再反应半小时，当有白色固体析出时，抽滤得白色固体物。将上部反应所得产物对硝基美沙酮0.6g溶于1.6mL水中，搅拌下加入0.65mL浓盐酸，逐渐升温，30-40℃时开始加入锌粉(分4批)共0.72g，直至50-60℃，加完后，在此温度条件下反应2小时，过滤，滤液用20％NaOH溶液中和至弱碱性(PH＝8)，抽滤，滤出白色固体(为氢氧化锌)并用温水洗涤，合并收集的滤液，用30mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷溶剂，用饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，溶剂挥干，得半固体状黄色物质，用硅胶柱层析纯化，得浅黄色固体。取20mg上述浅黄色固体溶于1mL水中，加入15mg EDC，5分钟后加入20mg BSA或KLH溶液(在2mL磷酸盐缓冲液PBS中)，室温反应过夜。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，即得完全抗原。反应过程见图7。

可卡因完全抗原的制备

式8

可卡因(cocaine)，是最强的天然中枢兴奋剂，可卡因一般呈白色晶体状，无臭，味苦而麻。可卡因对中枢神经系统产生兴奋作用，是导致滥用的重要原因，可卡因的结构见式8。

取1g盐酸去甲可卡因、0.86g三乙胺溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.614g琥珀酸酐，在45℃下反应过夜，用硅胶柱纯化反应物，得1.0g中间产物。取14mg上述中间产物溶于1mL水中，加入10.4mg EDC，5分钟后加入14mg BSA或KLH溶液(在3ml磷酸盐缓冲液PBS中)，室温反应过夜。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图8。

MDMA(摇头丸)完全抗原的制备

摇头丸(MDMA)，二亚甲基双氧甲基苯丙胺，为苯丙胺类毒品，有较强的成瘾性。摇头丸有很强的精神依赖性，食用数次后即可成瘾，过量食用会产生急性中毒，摇头丸的结构见式9。

式9

取MDMA 2.4g溶于乙腈，加入2.42g的4-溴丁酸乙酯和0.2mg碘化钾，回流反应4～5小时，过滤除去乙腈，得固体产物。取上述所得产物溶于10mL四氢呋喃和10mL水中，加入0.37g氢氧化钾，室温反应过夜，用1N盐酸中和，真空干燥，用20mL乙醇溶解沉淀，过滤后真空干燥，得到0.529g MDMA-COOH。取100mg MDMA-COOH溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入49.7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和88.9mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和，室温下反应过夜，10000rpm离心除去不溶物。配置10mg/mL KLH或BSA溶液10mL，缓慢加入上述上清液，室温反应2h，反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，以除去未反应的小分子物质。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图9。

三唑仑完全抗原的制备

三唑仑(Triazolan)是一种快速吸收和半衰期短的苯二氮卓安定类催眠药物，有显著的镇静、催眠作用，多次使用可在体内有轻微程度的积累作用，其结构见式10。

式10

在反应瓶中加入三唑仑1.0g和10mL浓硫酸，搅拌使之溶解，置于冰盐浴中冷却至-5℃，在1小时内分4次加入由浓硝酸(0.25mL)和浓硫酸(0.75mL)1∶3组成的混合酸液。加完后，0℃条件下反应2小时，然后倒入10g碎冰中，待碎冰融化后，再在0℃条件下反应半小时，当有白色固体析出时，抽滤得白色固体物。将上部反应所得产物对硝基三唑仑0.5g溶于1.4mL水中，搅拌下加入0.55mL浓盐酸，逐渐升温，30-40℃时开始加入锌粉(分4批)共0.62g，直至50-60℃，加完后，在此温度条件下反应2小时，过滤，滤液用20％NaOH溶液中和至弱碱性(PH＝8)，抽滤，滤出白色固体(为氢氧化锌)并用温水洗涤，合并收集的滤液，用30mL二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷溶剂，用饱和食盐水洗至中性，用无水硫酸钠干燥，溶剂挥干，得半固体状黄色物质，用硅胶柱层析纯化，得氨基产物。利用对氨基-三唑仑与BSA或KLH偶联。反应过程见图10。

巴比妥完全抗原的制备

巴比妥(Barbital)是普遍性中枢抑制药。随剂量由小到大，相继出现镇静、催眠、抗惊厥和麻醉作用。10倍催眠量时则可抑制呼吸，甚至致死，其结构见式11。

式11

称取巴比妥2.0g和琥珀酸酐0.87g，置于100mL三口瓶中，在氮气保护下注入15mL经无水无氧处理的吡啶，60℃反应24h。待反应冷却至室温，加入50mL水，用6N盐酸调节pH值至5.0。用乙酸乙酯提取，再用1mol/L碳酸氢钠溶液提取有机相，收集水相，用乙醚洗涤水相，弃去乙醚层，再以6N盐酸调节pH值至5.0，用乙酸乙酯提取水相，收集乙酸乙酯层，经干燥、浓缩，用用硅胶柱层析纯化得到白色固体。取所得产物100mg溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和90mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和，室温下反应过夜，反应液经4000rpm离心10min后吸取上层清液0.5mL缓慢滴加到6mL溶于0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液的20mg/mL KLH或BSA溶液，室温反应6h。待反应完成后，先用蒸馏水透析2次，再用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次。最后用紫外广谱法鉴定，即得完全抗原。反应过程见图11。

LSD完全抗原的制备

麦角二乙胺(LSD)，分子量323，是一种致幻剂，具有较强的滥用倾向，滥用后可造成精神和行为的改变，其结构见式12。

式12

取110mL 2M乙胺的四氢呋喃溶液，在0℃下逐滴加入丙烯酸乙酯(8.0mL溶于40mL四氢呋喃中)，室温反应过夜。减压蒸去四氢呋喃，得到3-乙胺基丙酸乙酯。将麦角酸934mg溶于40mL四氢呋喃，加入795mg CDI，在氮气保护下反应1h，加入1.9g 3-乙胺基丙酸乙酯，反应过夜。得到2.2g油状反应物。将油状反应物溶于5mL四氢呋喃、5mL水，加入12.5mg氢氧化钾，室温反应3h。用1N盐酸调节pH值至7.0。滤出固体，烘干。将上述所得固体45mg溶于1mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入15.6mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和29.7mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)和，室温下反应过夜，反应液缓慢滴加到15mL10mg/mL KLH或BSA溶液，室温反应6h。待反应完成后，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，即得完全抗原。反应过程见图12。

芬太尼完全抗原的制备

芬太尼(Fentanyl)，分子量336，结构见式13。为阿片受体激动剂，属强效麻醉性镇痛药，药理作用与吗啡类似，镇痛作用产生快，但持续时间较短，副作用比吗啡小。用于麻醉前、中、后的镇静与镇痛，也用于各种原因引起的疼痛。

式13

将2.02g苯乙基哌啶酮与0.99g苯胺溶于20mL甲苯中，搅拌回流，15min后加入0.05g催化剂对甲基苯磺酸钠，回流反应20h。减压蒸去溶剂，得到中间产物亚胺。将中间产物亚胺溶于10mL异丙醇，加入4N的硼氢化钠回流10h，减压蒸去溶剂，加入碳酸氢钠溶液，用苯萃取，得到中间产物胺。将中间产物胺和琥珀酸酐置于三口瓶中，在氮气保护下注入5mL经无水无氧处理的吡啶，回流反应24h。减压蒸去溶剂，用硅胶柱纯化反应物，得带有羧基的中间产物。取100mg上述中间产物溶于2mL DMA，加入400mg EDC溶于5mL蒸馏水的溶液，将混合物滴加入200mg BSA或KLH溶液(在30mL磷酸盐缓冲液PBS中)，室温反应过夜。反应产物用0.05M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析16h，然后冷冻干燥，即得完全抗原，反应过程见图13。

三环类抗抑郁剂(TCA)完全抗原的制备

三环类抗抑郁药物的主要适应症为各类抑郁症，对内源性抑郁症(躁狂抑郁性抑郁症)疗效尤佳。三环类抗抑郁药物有10多种，如阿米替林、丙咪嗪、氯丙咪嗪、多塞平、多虑平等，其中阿米替林(Amitriptyline，分子量277)在三环类抗抑郁药中镇静效应最强。阿米替林的结构见式14。

式14

取1g盐酸去甲替林、0.86g三乙胺溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.614g琥珀酸酐，在45℃下反应过夜，用硅胶柱纯化反应物，得1.0g中间产物。取14mg上述中间产物溶于1mL水中，加入10.4mg EDC，5分钟后加入14mgBSA或KLH溶液(在3mL磷酸盐缓冲液PBS中)，室温反应过夜。反应产物在4℃，用0.01M，pH7.4磷酸盐缓冲液透析，期间更换缓冲液3～4次，然后冷冻干燥，即得完全抗原，反应过程见图14。

盐酸哌替啶完全抗原的制备

盐酸哌替啶Pethidine，又名度冷丁，分子量283.5，作用及机理与吗啡相似，其结构见式15。

式15

反应瓶中加入原料盐酸哌替啶0.5g和5ml浓硫酸，搅拌溶解，冰盐浴冷至-5℃，在1小时中分4次加入由浓硝酸(0.135mL)和浓硫酸(0.375mL)组成的混合物。加完后在0℃下反应2小时，倒入10g碎冰中，搅拌半小时，有白色固体析出，抽滤得白色固体0.6g。将硝化后化合物0.5g溶于1.4mL水中，搅拌下加入0.55mL浓盐酸，逐渐升温，30-40℃时开始加入锌粉(分4批)共0.62g，直至50-60℃，加完后，在此温度下反应2小时，过滤，滤液用20％NaOH溶液中和至偏碱性(PH＝8)，抽滤，滤出白色固体(为氢氧化锌)并用温水洗涤，滤液合并用二氯甲烷提取(30mL*3次)，二氯甲烷层用饱和食盐水洗至中性，无水硫酸钠干燥，溶剂抽干，得半固体状黄色物质，用硅胶柱层析(展开剂比例乙酸乙酯∶石油醚＝1∶2)，得浅黄色固体胺基度冷丁52mg。称取100mg牛血清白蛋白，在搅拌下溶解于3ml pH 7.2的0.1M磷酸缓冲液中，溶解后加入15mg胺基度冷丁，加入20mg缩水剂EDC，在室温下(20-25℃)搅拌反应25小时。反应物在磷酸缓冲液中透析，更换磷酸缓冲液3～4次。然后冷冻干燥，即得完全抗原。，反应过程见图15。

单克隆抗体的制备

本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即除了可能存在少量可能的自发突变外，组成该群体的抗体个体都相同。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明完全抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞系，例如鼠类的骨髓瘤细胞系，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞系(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，AcademicPress(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(ProteinG-Sephrose)纯化。本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明用到的部分杂交瘤见表1。

表1

生物芯片的基片材料

连接检测探针的基片是制备生物芯片的关键，各个批次的批间差会极大的影响实验误差。例如当样品中的毒品含量在临界点处，由于生物芯片的基片材料引起的批间差，使的不同批号的同一种生物芯片在检测中产生阴性、阳性两种完全不同的检测结果，造成案件检验鉴定的误判。引起批间差的主要原因是同一种基片材料存在不同的密度产生不同的散射作用，与生物芯片的检测方法无关。

在本发明的一个优选例中，制备生物芯片的基片为氧化铝陶瓷。氧化铝基片在制备过程中会产生不同的厚度，不同的厚度产生不同的介质密度，主要有七种不同的介质密度，不同的介质密度会发生不同的光束散射，使检测的吸收能与检测线性关系严重偏离，氧化铝基片发生散射后，可以使用Kubelk-Munk定律的散射系数有效矫正其散射。

芯片的活化处理

生物芯片的目的是为了使生物活性物质(如抗体、抗原、DNA等)更有效地与芯片载体结合。本领域技术人员可以使用通用的方法进行芯片活化，如醛基化处理、多聚赖氨酸处理、硅烷化处理以及光学处理。硅烷化活化技术成熟、成本较低，所制备的芯片具有良好的信噪比，是其他种类的基片的3-4倍以上，且经硅烷化处理后的芯片表面有活化的基团，不但可以通过氨基，还可以通过巯基、醛基和蛋白分子牢固的结合，具有良好的稳定性。

在本发明的一个优选例中，硅烷化处理的方法选自下组种：

GOPTS(3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷)法：芯片经预处理后，浸入含20g/L GOPTS的邻二甲苯溶液中，55℃加热5小时，室温下在硅烷混合物中过夜，甲苯中清洗2次，丙酮清洗1次，立即放在干燥箱中低压条件下过夜。

ICPTES(异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷)法：将氧化铝基片在50mL/L碱性清洁剂溶液超声清洗1小时，再用去离子水冲洗，在120℃下干燥，在50℃，氮气环境下，50g/L ICPTES的10mL/L无水甲苯溶液中硅烷化，过夜。用甲苯洗涤2次，丙酮洗涤1次，120℃条件下硬化。

APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)法：在50mL/L碱性清洁剂溶液中超声波清洁1小时，去离子水冲洗，120℃干燥，在含20g/L APTES的1mmol/L醋酸溶液中活化1小时，用二蒸水清洗，氮气环境下干燥，120℃硬化处理30分钟。

PL(多聚赖氨酸)法：用0.01％多聚赖氨酸，0.1MPBS处理芯片2小时，用去离子水洗涤后干燥。

芯片的点样

如本文所用，术语“芯片的点样”是指将探针固定于活化的基片材料的过程。本领域技术人员可以使用通用的技术(如喷射技术)进行芯片的点样。喷射技术使用直径小于100微米的孔来产生微滴，可将微量样品点到芯片表面，形成微阵列。在本发明的一个人优选例中，采用非接触式喷射技术，将少至10nl的抗体(浓度在300-500ug/mL)精确地点在固体芯片上，并进行包被，形成分离测试区，而且不会破坏抗体的活性。抗体溶液的分配量由电脑严格控制，不同的抗体在芯片表面预先确定的x，y坐标上进行分配，形成抗体阵列。

每张芯片上可以包被多达数万种不同的抗体，在本发明的一个优选例中，选用吗啡、MDMA、苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、苯二氮卓、巴比妥、大麻、丁丙喏啡、可卡因、美沙酮、麦角二乙胺(LSD)、三环类抗抑郁剂(TCA)、度冷丁、芬太尼共十五类毒品、毒物单克隆抗体进行。芯片点样仪通过电脑软件程序来控制所有系统操作，具有高度的精确性。

免疫竞争反应

毒品小分子的检测是基于抗体结合在芯片表面的分离测试区域，然后添加酶标记的完全抗原。如果样本中不含有毒品毒物成分，标记的完全抗原会结合到芯片表面的抗体位点上，添加光化学底物试剂后，发光强度与标记的完全抗原浓度成比例。如果样本中含有毒品，它会与标记的完全抗原竞争抗体结合位点。这将会降低标记的完全抗原的结合的数量，发光信号会减弱。在竞争反应中，光信号的强弱与样本中出现的毒品的浓度成相反的比例关系。

信号采集和处理

信号采集的原理基于化学发光，化学发光的反应基础是氧化-还原反应生成自由基，并发光。经过增强的化学发光可以在生物芯片表面很小的检验区域上得到较高的灵敏度。芯片表面分离测试区发生化学发光反应，可以使用(CCD)照相机进行检测和定量。CCD照相机同时记录芯片架上9个芯片每个芯片上所有的分离测试地区的发射光。然后使用软件成像程序对信号进行量化和确认，除去背景噪音；CCD对芯片表面发射光线进行空间量化。

本发明还提供了信号处理软件，所述软件具有以下功能：除去图像中的背景噪音，提高信噪比；确定分离测试区的形状、大小以及亮度设立是否有效；根据芯片的化学发光信号密度，确定相对发光单位值(RLU)，并在每个分析物的相关校准曲线的基础上，计算样本检测中每个分析物的相应浓度。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有容器以及位于容器内的本发明的芯片。

本发明的主要优点：

1.一次性高通量同时检测多种毒品，如度冷丁、吗啡、MDMA、苯丙胺、甲基苯丙胺、氯胺酮、苯二氮卓、巴比妥、大麻、丁丙喏啡、可卡因、美沙酮、麦角二乙胺(LSD)、三环类抗抑郁剂(TCA)、芬太尼等毒品毒物；

2.按不同的需求量，一次性同时检测多人份样品中毒品的含量，自动化程度高；

3.特异性强、灵敏度高，可进行定性定量检测；

4.开放性的芯片平台简便快速、易于操作，适应于多种不同物质的芯片检测；

5.本发明的芯片可以长期保存，质量稳定可靠。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1单克隆抗体的制备、纯化和鉴定

1.1免疫试剂配制：

先将抗原与弗氏佐剂(Freund’s adjuvant)乳化，把完全抗原氯胺酮-KLH用PBS配制成1mg/mL的溶液，然后将完全抗原溶液与弗氏佐剂等体积混合，用高速震荡器震荡形成均匀乳浊液，将此乳浊液用于动物的免疫。

1.2小鼠免疫：

选择8周龄的小鼠进行注射免疫，取8周龄的健康Balb/C小鼠12只，在第0天，每只腹腔注射完全弗氏佐剂乳化抗原100ul；第14天，每只小鼠腹腔再注射不完全弗氏佐剂乳化抗原100ul；第21天，以摘小鼠眼球法采血，用ELISA方法检测血清中抗体效价；第28天，再次腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化抗原100ul。在细胞融合反应前一周，用100ug/100uL抗原生理盐水再次加强免疫。采血后经测定，所得抗血清效价在1∶8000。

1.3细胞融合操作

HAT培养基贮存液的制备：10mM次黄嘌呤-16mM胸腺嘧啶核苷(100×HT)贮存液：称取次黄嘌呤136.1mg和胸腺嘧啶核苷38.8mg，溶于100mL50～60℃的双蒸水中；微孔滤膜过滤后按需要量分装，-20℃保存；

4×10⁵M氨基喋呤(100×A)贮存液：称取氨基喋呤1.76mg加入90mL双蒸水，滴加1NNaOH至氨基喋呤溶解。然后用1N HCl调节pH＝7.5；用双蒸水定容至100mL；过滤灭菌；分装并避光于-20℃保存。

1.4培养液的制备

完全培养基：DMEM(改良的Eagle’s培养基)或RPMI-1640培养基450mL；100mM丙酮酸钠5mL；青-链霉素溶液(青霉素500IU/ml，链霉素5mg/mL)5mL；200mM L-谷氨酰胺5mL；灭活的胎牛血清50ml，4℃保存；

HT培养基的制备：每100ml完全培养基中，加入1ml 100×HT贮存液即成；

HAT培养基的制备：每100ml完全培养基中各加入1ml HT贮存液和1ml A贮存液(均为100×A)即成；

50％(w/v)PEG的配制：将固体PEG(MW1500或4000)高压灭菌，PEG即融化，冷却至50℃(在此温度下仍为液体)。加入等体积无血清的DMEM或RPMI-1640培养基。-20℃贮存。

1.5细胞悬液的制备

小鼠脾细胞：将免疫好的小鼠引颈处死，70％酒精消毒皮肤后，无菌条件取出脾脏，移到盛有5ml无血清RPMI-1640的培养皿中。将脾脏无菌研磨成单细胞悬液，将细胞吸至一无菌管中，静置使组织块沉降。将无团块的脾细胞悬液吸入另一试管，800rpm/min离心5min。用无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞2次。用Tris-NH₄Cl裂解红细胞。计算每ml悬液中的有核细胞数。每只小鼠的脾脏可得10⁸淋巴细胞。

小鼠腹腔巨噬细胞：处死小鼠，消毒皮肤，向腹腔内注入DMEM完全培养基2-3mL，轻压腹部使细胞混悬。提起腹膜中心，插入注射器针头，吸出全部细胞悬液。3000rpm/min离心5min，用DMEM洗涤2次，再离心后计数。一只小鼠可获得3×10⁶个细胞。用加有10％胎牛血清和抗生素的培养基制成10⁵/mL的细胞悬液。

1.6融合程序

准备：将融合用器材全部灭菌，将胎牛血清、HT和A贮存液化冻，连同其它培养基成分和PEG溶液置于37℃水浴中预热；

检查：选择处于对数生长期的sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。计数(密度范围应在10⁸/ml)，通过台盼蓝染色计数，检查细胞活力(应高于95％)后，悬浮于RPMI或DMEM培养基中；

操作：将用RPMI-1640洗涤过的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合，用10⁸脾细胞和2×10⁷骨髓瘤细胞。1000rpm/min离心5min，吸尽上清液。轻弹离心管使细胞沉淀松散，1min内边摇荡边逐滴加入1.5mL的50％PEG4000溶液。用吸管将细胞悬液小心地混匀，随后静置1min，然后在2min内，边轻摇试管边缓慢滴加10mL无血清RPMI-1640培养基，静置放置约3min，800rpm/min离心10min，弃上清液；含HAT和20％胎牛血清的RPMI1640将细胞配成100mL悬液，将细胞均匀铺10块96孔培养板(预先加入腹腔巨噬细胞作饲养层)，培养板置于37℃、5％CO₂的培养箱内培养。

1.7细胞的选择性培养

检查：细胞融合操作2～3天后检查细胞融合情况，此时未融合细胞大量死亡，唯有融合细胞才能成活。

操作：7～10天后加HT+完全培养基，每孔加入1mL。在8～14天间，就可以看到杂交细胞的克隆。当克隆约长到1mm直径时，即可检查孔中培养基的抗体含量。从培养孔取出1mL测定抗体，用氯胺酮-BSA包被的酶联板(ELISA法)来筛选出抗氯胺酮的杂交瘤细胞。将选出的阳性孔中的细胞移至24孔培养板中培养，并进行排除交叉免疫反应的检测工作，以进一步筛选阳性克隆。

1.8有限稀释法进行杂交瘤的克隆

操作：于克隆前1天向96孔培养板中加入巨噬细胞饲养层，每孔加入0.1ml，在37℃C02培养箱中温育。从阳性培养孔中吸取欲克隆的细胞，计数一次克隆化约需1000个细胞。多余的细胞放回24孔板中。用完全培养基稀释细胞成30个/mL，加入两块96孔板中，每孔加0.1mL(孔内已预加饲养层)。将剩下的细胞再度稀释成10个/mL，然后再取两块铺了饲养层的96孔板，每孔中加入0.1mL。再制备3个/mL的细胞悬液，加到另外两块板上。

培养：将培养板置37℃的CO₂培养箱中培育，2-3周可出现可见单细胞集落形成。继续培养，待培养板孔内液体颜色变为橙色。检测上清液的抗体活性，选出阳性孔，再进行扩大培养和再克隆。

筛选：吸取孔中液体，再以氯胺酮-BSA包被的ELISA法酶标板来筛选出抗氯胺酮的特异性杂交瘤细胞。经五次克隆后，得到一株能分泌专一性抗体的抗氯胺酮单克隆细胞，亚型为IgG1，k，命名为Ket-1，用于制备胶体金标记氯胺酮单抗免疫检测板。

杂交瘤扩大培养：当需要大量抗体时，采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体蛋白。将约10⁶-10⁷个杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内。2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水离心，加0.02％的叠氮钠，4℃或-20℃冰箱保存。

1.9抗体的纯化

准备：取1g CL-4B Sepharose-蛋白G，悬浮于200mL的磷酸缓冲溶液(pH＝8.0)中，至少吸胀30min。取约4mL装柱，先后用pH＝8.0的磷酸缓冲液100mL和pH＝3的0.1M柠檬酸钠100mL洗柱，然后用前一种缓冲液重新平衡。腹水或培养上清液对pH＝8的磷酸缓冲液透析(先用饱和硫酸胺沉淀后，再透析效果更好)平衡。

上柱：每mL凝胶可与20-25mg的IgG结合，控制过柱流速为0.5-1ml/min。用5mL的10mM磷酸缓冲液(pH＝8)洗柱，监测流出液的A280nm，按0.5ml级分收集流出液。用5mL的0.1M柠檬酸钠(pH＝6)洗脱IgG1抗体。用5mL的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.5)洗脱IgG2a。用pH＝3.5的同类缓冲液洗脱IgG2b。

1.10单克隆抗体的鉴定

将腹水先经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG，再将粗提的抗体经亲和层析柱(ProteinG-Sephrose)纯化，经SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色，电泳结果见图16。

1.11抗体的效价测定(以氯胺酮为例说明)

抗血清的滴度测定：将氯胺酮-BSA包被的酶联板用于测定此抗血清的滴度，包被抗原10ug/ml稀释于pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液中，100ul/孔加入到96-孔酶标板于4℃过夜。弃去包被液后用1％明胶/PBS在37℃封闭2小时，然后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，再加入稀释后的氯胺酮抗血清或单抗(Ket-1)，置于37℃孵育1小时。用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加入1∶2000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育1小时后用PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H₂O₂底物进行显色10min，并用终止液(0.1N硫酸)终止显色；在450nm光波长下测定吸收值(OD)，与空白对照孔的OD均值比较，最低稀释度作为此抗体的效价。所得氯胺酮抗血清的效价为1∶8000，氯胺酮抗血清效价结果见图17。氯胺酮单克隆抗体滴度的测定∶抗体的滴度为1∶4000(图18)。

1.12用上述同样的方法进行其他抗体的制备，鉴定和纯化。

实施例2抗体特异性测定

供交叉反应实验用的对照样品为62种毒品和药物-甲基苯丙胺，苯丙胺，MDMA，MDA，吗啡，可待因，海洛因，福尔可定，二氢埃托菲，雷米替丁，芬太尼，曲马多，右丙氧芬，纳洛酮，纳曲酮，烯丙吗啡，洛非西丁，东莨菪碱，益安口服液，正通宁片，扑热息痛，阿斯匹林，布洛芬，阿米替林，丙米嗪，氯丙嗪，异丙嗪，安定，三唑仑，阿普唑仑，巴比妥，速可眠，异戊巴比妥，咖啡因，氟哌酸，先锋IV，黄连素，乳糖，普鲁卡因，康复新胶囊，水合氯醛，奥复沙星，非那西丁，去痛片，氯胺酮，美沙酮，美沙酚、度冷丁，麻黄碱，伪麻黄碱、可卡因，蒂巴因，利多卡因，那可丁，丁丙诺啡，苯丙醇胺，苯乙胺，羟考酮，氢吗啡酮，右丙氧酚，苯环己哌啶，甲喹酮(安眠酮)。用上述62种毒品和药物包被的酶标板与抗体反应进行ELISA测定，结果确定本发明的抗体仅与特定的毒品抗原发生免疫结合反应，而与上述其他抗原没有交叉反应，特异性良好。

实施例3生物芯片的基片

本实施例选择氧化铝陶瓷基片制备生物芯片，氧化铝基片发生散射后，可以使用Ku belk-Munk定律的散射系数有效矫正其散射，解决基片材料批间差的问题。选用醛基化玻璃和氧化铝基片互相比较，发现醛基化玻璃芯片的背景要明显高于氧化铝基片，而且每批醛基化玻片的差异也很大(见图19)。

氧化铝基片在制备过程中会产生不同的厚度，不同的厚度产生不同的介质密度，本发明人发现，氧化铝基片主要有七种不同的介质密度，不同的介质密度会发生不同的光束散射。针对七种不同的介质密度，通过Kubelk-Munk定律的散射系数，本发明人可以有效矫正其散射，矫正后得到SX1、SX2、SX3、SX4、SX5、SX6、SX7七种不同散射矫正系数。

经过七种不同散射矫正系数矫正的基片，制备大量的生物芯片，均没有发生批间差结果，最后选择SX3散射矫正系数矫正的基片作为制备生物芯片的基片。

实施例4芯片的表面活化

1.本实施例首先比较四种对芯片基片进行硅烷化处理的方法。

GOPTS方法：芯片经预处理后，浸入含20g/L GOPTS(3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷)和2mL/L DIPEA(N-乙基二异丙胺)的邻二甲苯溶液中，55℃加热5小时，室温下在硅烷混合物中过夜。然后用甲苯中清洗2次，丙酮清洗1次，立即放在干燥箱中低压条件下过夜。

ICPTES方法：将氧化铝基片在50mL/L碱性清洁剂溶液超声清洗1小时，再用去离子水冲洗，在120℃下干燥。在50℃，氮气环境下，50g/L ICPTES(异氰酸酯基丙基三乙氧基硅烷)的10mL/L无水甲苯溶液中硅烷化，过夜。用甲苯洗涤2次，丙酮洗涤1次，120℃条件下硬化。

APTES方法：在50mL/L碱性清洁剂溶液中超声波清洁1小时，然后用去离子水冲洗，120℃干燥。硅烷处理；在含.20g/L APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)的1mmol/L醋酸溶液中进行1小时，用二蒸水清洗。氮气环境下干燥，120℃硬化处理30分钟。

PL方法：多聚赖氨酸包被，0.01％多聚赖氨酸，0.1MPBS处理芯片2小时，用去离子水洗涤后干燥。

4种不同的活化方法所制备的芯片，检测其绝对光信号强度和信噪比。结果表明，用GOPTS、ICPTES和APTES活化方法所获得的信号最强(见图20)，而用PL方法活化的信号最低；信噪比方面，GOPTS方法为最佳(见图21)。

2.交联剂处理：

本实施例采用双硫氰苄(DIPEA)构建连接的桥梁。具体操作如下：

将表面附着聚合物的芯片浸入10g/L交联剂溶液中，在室温下反应6小时，交联溶剂溶液是含有10mL/L双硫氰苄(DIPEA)的氰化甲烷。再用氰化甲烷洗涤3次，丙酮洗涤2次，37℃干燥过夜。

3.芯片表面处理后的验证

3.1不同表面活化方法的XPS分析数据结果见表2。

表2

结果表明，硅烷化基片的碳含量显著高于未包被的芯片，碳含量是是否包被的标志。

3.2选用GOPTS活化方法和PL(多聚赖氨酸方法)比较，包被同样的毒品抗体，进行检测，结果显示GOPTS活化方法所制备的基片的光信号强度明显要强于PL活化的基片(见图22)。

实施例5芯片点样

本实施例采用非接触式喷射技术进行芯片点样，将10nl的抗体精确地点于固体芯片，并上进行包被，形成分离测试区。不同的抗体在芯片表面预先确定的x，y坐标上进行分配，形成9×9毫米的抗体阵列。每个分离测试地区整齐列在300毫米，保证抗体正确的结合在芯片表面，然后在每批产品芯片上操作，保证芯片表面测试区的功能。当检测水平低于基础血清中发现的本底水平时，分析浓度报告为0。本发明人将实施例1中制备的15种抗体进行芯片点样。

实施例6芯片封闭

1.本实施例比较不同的缓冲系统作为封闭液对封闭的影响。缓冲系统分别为：0.01M PBS pH7.4、醋酸缓冲液pH5.5、碳酸缓冲液pH8.5和枸橼酸缓冲液pH4.5。

结果显示，0.01M PBS pH7.4的缓冲效果最佳(图23左)。

2.本实施例还比较了不同浓度的不同蛋白对封闭的影响。结果表明，3％酪蛋白效果最佳(图23右)。

实施例7完全抗原的标记

(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中；

(2)于上述溶液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO₄溶液，于室温下避光搅拌20分钟；

(3)将上述溶液装入透析袋中，用1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；

(4)加20μl 0.2M的PH9.5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg毒品完全抗原，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；

(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH₄液，混匀，置于4℃2小时；

(6)将上述液装入透析袋中，用0.15M的pH 7.4为的PBS进行透析，4℃过夜，即得到标记的完全抗原。

实施例8免疫竞争反应

免疫竞争反应操作程序如下：

1)吸取120μl稀释液至每个槽内；

2)吸取60μl标准品液/质控/样本稀释液至每个槽内；

3)吸取120μl标记物至每个槽内，轻叩使之完全混合；

4)将操作盘置于恒温混匀仪上，摇动频率330rpm，37℃下孵育30分钟；

5)孵育后，弃去反应液；

6)用稀释的清洗缓冲液快速洗涤4次，用清洗缓冲液注满每个槽。再进行4次清洗，在每次清洗时使芯片浸在清洗缓冲液中2分钟，对于6个芯片架的全面清洗过程，应当使用最少为500mL的稀释清洗缓冲液；

7)加发光底物成像，用阅读仪检测。

实施例9芯片检测结果

本发明的毒品检测芯片在体外对人体尿液和全血中的毒品和代谢物进行检测。与GC/MS的结果比较，本发明的芯片检测结果用4个指标进行评估：1.准确性评估，2.灵敏度分析，3.特异性评估，4.稳定性测试。

1.准确性评估结果

吗啡

甲基苯丙胺

苯丙胺

氯胺酮

丁丙诺啡

大麻

可卡因

美沙酮

MDMA

LSD

BZO

BAR

LSD

2、灵敏度分析结果

本项目制备的毒品检测芯片的灵敏度如上表所示，和目前的胶体金快速检测试剂盒相比较，其尿液中检测所有毒品的灵敏度均提高了10倍以上。

3、特异性评估结果选用甲基苯丙胺，苯丙胺，MDMA，MDA，吗啡，可待因，海洛因，福尔可定，二氢埃托菲，雷米替丁，芬太尼，曲马多，右丙氧芬，纳洛酮，纳曲酮，烯丙吗啡，洛非西丁，东莨菪碱，益安口服液，正通宁片，扑热息痛，阿斯匹林，布洛芬，阿米替林，丙米嗪，氯丙嗪，异丙嗪，安定，三唑仑，阿普唑仑，巴比妥，速可眠，异戊巴比妥，咖啡因，氟哌酸，先锋IV，黄连素，乳糖，普鲁卡因，康复新胶囊，水合氯醛，奥复沙星，非那西丁，去痛片，氯胺酮，美沙酮，美沙酚、度冷丁，麻黄碱，伪麻黄碱、可卡因，蒂巴因，利多卡因，那可丁，丁丙诺啡，苯丙醇胺，苯乙胺，羟考酮，氢吗啡酮，右丙氧酚，苯环己哌啶，甲喹酮(安眠酮)62种毒品和药品进行交叉反应试验。

本发明的生物芯片与上述62种毒品和药品进行交叉反应实验，结果为无交叉反应，特异性达到100％。

4、稳定性检测结果

通过加速稳定性破坏试验，将制备的芯片和反应试剂在45oC下保存，定期对芯片的准确性和灵敏度进行测试，结果显示此种芯片可以在45℃保存2周，室温的条件下能够保存2年以上。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种毒品毒物检测芯片，包括基片、位于基片上的检测点以及固定于检测点的检测抗体，其特征在于，所述检测抗体与选自下组的至少4种毒品毒物特异性地结合：

度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂；

并且，固定于检测点的检测抗体至少与选自下组的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、氯胺酮、大麻、和甲基苯丙胺；

所述的检测抗体为单克隆抗体，并且所述的单克隆抗体由完全抗原分子诱导单克隆抗体杂交瘤产生；

并且所述的单克隆抗体杂交瘤包括度冷丁单克隆抗体杂交瘤细胞株DLT-001CCTCC.C2011118、氯胺酮抗体的小鼠杂交瘤细胞系CGMCC No.1404、大麻抗体的小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO.C200915、和甲基苯丙胺抗体小鼠单抗杂交瘤细胞株Met1CCTCC NO.C200914；

且所述的基片为氧化铝陶瓷基片。

2.如权利要求1所述的芯片，特征在于，所述的检测抗体还与选自下组的毒品毒物特异性结合：可待因、海洛因、或福尔可定。

3.如权利要求1所述的芯片，特征在于，固定于检测点的检测抗体与以下的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂。

4.如权利要求1－3中任一所述的芯片，其特征在于，所述的芯片是用以下方法制备的：

(a)将一粘着中间介层连接于基片表面上；和

(b)将至少4种检测抗体固定在该表面层上，所述的检测抗体与选自下组的毒品毒物特异性地结合：度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂；

并且所述的粘着中间介层为硅烷化包被物。

5.权利要求1所述芯片的用途，其特征在于，所述芯片用于检测样品中毒品毒物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的样品是生物样品。

7.一种权利要求1所述的毒品毒物检测芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将一粘着中间介层连接于基片表面上；和

且所述的中间介层为硅烷化包被物。

8.一种检测样品中是否存在毒品毒物的方法，所述毒品选自下组：

度冷丁、吗啡、苯丙胺、甲基苯丙胺、大麻、氯胺酮、丁丙喏啡、美沙酮、可卡因、摇头丸、三唑仑、巴比妥、麦角二乙胺、芬太尼、和三环类抗抑郁剂，其特征在于，包括步骤：

(a)将所述样品与权利要求1所述的芯片接触；

9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器以及位于容器内的权利要求1所述的芯片。