CN108866006A - 一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株、抗体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株、抗体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1，该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201728；本发明还提供了制备抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1的方法。本发明又提供了一种抗丁丙诺啡单克隆抗体。本发明杂交瘤细胞株BUP 9X1可分泌的抗丁丙诺啡单克隆抗体具有高灵敏度特点，适用于10ng/ml阈值的检测。本发明杂交瘤细胞株BUP 9X1可分泌的抗丁丙诺啡单克隆抗体具有高灵敏度特点，适用于10ng/ml阈值的检测。本发明在制备丁丙诺啡人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇，获得的丁丙诺啡人工抗原保持了丁丙诺啡的结构特异性，有利于相应丁丙诺啡抗体的产生。

Description

一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株、抗体的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及杂交瘤细胞株、细胞株分泌的抗体以及制备方法。
具体涉及抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株，该细胞株分泌的抗丁丙诺啡单克隆抗体，以及制备该抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株的方法、分泌抗丁丙诺啡单克隆抗体的方法。
背景技术
丁丙诺啡(buprenorphine，BUP)，是蒂巴因的衍生物，药物制剂为盐酸丁内诺啡，商品名：沙菲片、盐酸丁丙诺啡舌下片、布诺啡、舒美奋、M6029等，分子式：C29H41NO4。丁丙诺啡是O3-去甲蒂巴因类的衍生物，是阿片受体激动-拮抗剂, 化学名称为N-环丙基甲基-7a[I-(S)-1-羟基-1，2，3三甲基]-6，14-桥乙烷-6，7，8，14-四氢东罂栗碱，其化学结构与吗啡相似，由于在第6和7位碳原子分别有甲氧基和异已醇基，这两个基团有增强阿片受体的激动作用，因此丁丙诺啡有激动-拮抗的双重特性。
特别的，丁丙诺啡(buprenorphine，BUP)是国家严控的一类精神药品(中国食品药品监督管理局，国食药监安2005年481号)，属于阿片类部分激动剂，由于其成瘾性低，部分国家用来治疗阿片类成瘾患者。但是，丁丙诺啡的滥用可以导致呼吸抑制。
丁丙诺啡是半合成阿片生物碱蒂巴因(thebaine)衍生物。自20世纪60年代发现后，其实验室研究和临床应用研究逐步扩大和深入。丁丙诺啡在发现初期被归属于阿片受体部分激动剂。由于在某些动物疼痛模型实验中显示的呈钟形量效曲线的镇痛作用模式误推导到人，使其在有些国家不被作为治疗重度疼痛的主要品种，导致其使用范围受到限制，尤其在20世纪90年代初期的癌症疼痛治疗中受到冷遇。但在欧洲和大洋洲，临床应用丁丙诺啡有增无减。临床实践积累的资料显示，尽管丁丙诺啡属于阿片受体部分激动剂，但能有效治疗重度疼痛，其镇痛作用强度比吗啡高25~30倍(肌肉注射给药)，并且呼吸抑制、便秘等副作用较小，药物依赖性较低。经研究证实，丁丙诺啡作为阿片类药物，药理性质不是简单类似于吗啡，而有着不同于其他u阿片受体激动剂的药理特性，与吗啡、芬太尼等比较，丁丙诺啡引起呼吸抑制，戒断反应的危险性较小，不产生如吗啡、芬太尼等药物引起的痛敏反应，预示其颇具临床应用价值。近年来，丁丙诺啡不仅有注射剂用于急性镇痛，还开发了舌下片、透皮贴剂等多种剂型，用于慢性疼痛、癌性疼痛、神经源性疼痛的止痛治疗；并且可替代美沙酮治疗阿片类物质成瘾患者，已成为临床治疗疼痛和药物依赖备受关注的药物。
测定生物检材中BUP及其类似物主要基于GC，GC—MS，HPLC，LC／MS等仪器检测，这些色谱法具有较强的灵敏度和选择性，但操作繁琐、试剂昂贵，不适合现场即时检测。以抗原-抗体特异性结合反应为基础的免疫检测法(Immunoassay)，既摒弃了色谱法的缺点，又具有检测灵敏、特异、简便、准确的优点，已广泛应用于小分子物质的检测。要建立丁丙诺啡的免疫检测方法，必须获得抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株，使其分泌产生抗丁丙诺啡单克隆抗体。
丁丙诺啡胶体金试纸条产品具有快速，操作简单、灵敏、可靠、价格便宜等优点，适用于案发现场即时定性筛选检测。目前受核心原料丁丙诺啡单抗的灵敏度所限，现有商业化产品的检测阈值50ng/ml左右，已经不能满足检测阈值 10ng/ml的要求，所以亟待开发出高灵敏度的丁丙诺啡抗体，以适应检测需要。
发明内容
本发明所要解决的的一个技术问题是提供一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP9X1,该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201728，于2017年2月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1，由小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合得到，其产生的抗丁丙诺啡单克隆抗体与丁丙诺啡抗原有高度特异的反应活性。
所述抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1，由丁丙诺啡人工抗原诱导小鼠产生，在制备丁丙诺啡人工抗原过程中，采取在位引入一个活化的羧基，再通过DCC将其连接于载体蛋白的氨基上。
此方法反应步骤简单，而且对丁丙诺啡的空间结构影响较小，用此方法制备的单克隆抗体对丁丙诺啡的结合具有高度的特异性。该丁丙诺啡抗原保持了丁丙诺啡的结构特异性，有利于获得亲和力高的抗丁丙诺啡单克隆抗体，是一种突破传统的有效免疫方法。此外，采用KLH作为载体蛋白，用免疫动物制备单克隆抗体，主要原因是KLH分子量大，抗原性好，容易使动物产生免疫反应。
更进一步的，在小鼠淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合时添加饲养细胞的同时，在杂交瘤细胞增殖过程，细胞培养的第五天，补加一定量的饲养细胞，既降低了杂交瘤细胞的污染概率，也避免了因饲养细胞数目过多抑制杂交瘤细胞生长，能更有效地保证杂交瘤细胞的存活率。
本发明还提供了一种抗丁丙诺啡单克隆抗体，该抗丁丙诺啡单克隆抗体为保藏号为CCTCC NO.C201728的抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1分泌产生，分泌出的抗丁丙诺啡抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。
本发明的又一个目的是提供制备该杂交瘤细胞BUP 9X1，并分泌抗丁丙诺啡单克隆抗体的方法，该方法步骤如下：
（1）制备丁丙诺啡人工抗原：
以盐酸丁丙诺啡为原料，游离后与溴戊酸乙酯进行亲核取代反应，水解得到含羧基的丁丙诺啡半抗原，通过N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)将其连接于载体蛋白的氨基上，得到丁丙诺啡-KLH(BUP-KLH)人工抗原；
（2）将丁丙诺啡-KLH(BUP-KLH)人工抗原、弗氏佐剂、3%吐温-80生理盐水按1：1：1的体积通过搅拌法得到丁丙诺啡乳剂；选用体重20g左右的8周龄雌性Balb／c小鼠，首次免疫采用含100μg BUP-KLH人工抗原的丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为完全佐剂）靠近淋巴结皮下部位注射；两周后，再用含100μg BUP-KLH人工抗原的丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为不完全佐剂）靠近淋巴结皮下部位注射，连续皮下注射三次丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为不完全佐剂），第四周采血鉴定抗血清效价，在融合前三天，用50μg BUP-KLH人工抗原与PBS 1:1配比，腹腔加强免疫，3天后按常规方法取脾融合；
（3）2-1：饲养细胞制备：小鼠颈断处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，约10min后，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用注射器注入37℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；
小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含10%FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合。通常骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞细胞数量比约为1:4~1:10；
2-3：脾细胞制备：取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死，泡75%的酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏。将脾脏放在连接着50ml离心管的不锈钢滤网上，立即加入5ml无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌的注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液至30ml，离心。弃上清用无血清培养液重复离心一次，待用。
2-4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入0.7ml 37℃预温的PEG4000，一分钟内加完，然后静止90秒。再加入25ml 37℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养。24小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液；
3-1：初筛：
融合细胞隔3天后换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3-2：复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株BUP 9X1做克隆培养。
3-3：杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化：
杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含10﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的单克隆，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗体的的抗丁丙诺啡单克隆细胞。
进一步的，步骤(1)中，丁丙诺啡人工抗原的制备：
更进一步的，丁丙诺啡人工抗原制备过程包括以下步骤：
将50mg盐酸丁丙诺啡加入10ml甲苯中，加入11.1g氢氧化钾，回流带水后，降温分出固体，固体溶于5ml的四氢呋喃中，加入100ul Ethyl 5-bromovalerate，室温下继续反应24小时；
通过挥发除去四氢呋喃，反应物经硅胶层析柱纯化，正己烷/乙酸乙酯（1:1）洗脱得到反应产物共57mg；
将洗脱产物溶于4ml 95%的乙醇中，加入100mg氢氧化钠，50℃下混合1小时，减压下乙醇挥发后用50ml二氯甲烷溶解反应产物，用1N 盐酸调节pH值至2.0，分离有机相，用无水氯化钙干燥；
获得活化的小分子。取30mg活化的丁丙诺啡，在搅拌下溶解于3ml乙醚中，然后缓慢加入25mg的N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）和15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Smlfo-NHS），摇匀后室温下反应16h，离心后去沉淀；
配置2mg/ml KLH （4mg/ml BSA）溶液10ml，于4℃缓慢加入以上丁丙诺啡反应物，pH值调节至8.0，在5℃下反应10小时。反应产物过SephadexG25凝胶柱，除去未反应的活化的丁丙诺啡，收集蛋白峰，对0.01mol/L PBS 进行透析，更换缓冲液3~4次，获得的反应产物即为丁丙诺啡-KLH（BUP-KLH）或丁丙诺啡-BSA（BUP-BSA）完成抗原。
本发明所具有的有益效果：
1、本发明在制备丁丙诺啡人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在丁丙诺啡半抗原选择与BSA或KLH载体蛋白偶联时发现，两种均能成功偶联，且经计算后免疫原BUP-KLH偶联物的结合比比BUP-BSA高，因此选择在丁丙诺啡半抗原和血蓝蛋白之间引起桥结构，暴露抗原决定簇，获得的丁丙诺啡人工抗原保持了丁丙诺啡的结构特异性，有利于相应丁丙诺啡抗体的产生。
2、本发明在制备抗丁丙诺啡单克隆抗体过程中，选择在其恰当的时间多次加入饲养细胞，能有效提高杂交瘤细胞株的存活率，本专利发现在细胞融合完成的第五天补加一定量的饲养细胞可以有效提高杂交瘤细胞株的存活率。
3、本发明杂交瘤细胞株BUP 9X1 可分泌的抗丁丙诺啡单克隆抗体具有高灵敏度特点，适用于10ng/ml阈值的检测。
附图说明
图1为抗丁丙诺啡单克隆抗体的效价测定示意图。
图2丁丙诺啡人工抗原制备嵌合的紫外吸收图谱。
具体实施方式
下面对本发明所述制作方法的每一步骤做详细说明。
实施例1：
本实施例中PBS缓冲液为含有0.008M十二水磷酸氢二钠、0.15M氯化钠、0.002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.4；靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；1×HAT的DMEM培养液含有体积分数15﹪的FBS；1×HT的DMEM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。
本实施例中主要包括，丁丙诺啡人工抗原的制备
以上为丁丙诺啡人工抗原合成路线。
1-1、丁丙诺啡半抗原的制备：以盐酸丁丙诺啡为原料，游离后与溴戊酸乙酯进行亲核取代反应，水解得到含羧基的丁丙诺啡半抗原。通过N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)通过将其连接于载体蛋白的氨基上，得到丁丙诺啡-KLH(BUP-KLH)完全人工抗原。
将50mg盐酸丁丙诺啡加入10ml甲苯中，加入11.1g氢氧化钾，回流带水后，降温分出固体，固体溶于5ml的四氢呋喃中，加入100ul Ethyl 5-bromovalerate，室温下继续反应24小时。通过挥发除去四氢呋喃，反应物经硅胶层析柱纯化，正己烷/乙酸乙酯（1:1）洗脱得到反应产物共57mg。将洗脱产物溶于4ml 95%的乙醇中，加入100mg氢氧化钠，50℃下混合1小时，减压下乙醇挥发后用50ml二氯甲烷溶解反应产物，用1N 盐酸调节pH值至2.0，分离有机相，用无水氯化钙干燥。获得活化的小分子。取30mg活化的丁丙诺啡，在搅拌下溶解于3ml乙醚中，然后缓慢加入25mg的N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）和15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Smlfo-NHS），摇匀后室温下反应16h，离心后去沉淀。配置2mg/ml KLH （4mg/ml BSA）溶液10ml，于4℃缓慢加入以上丁丙诺啡反应物，pH值调节至8.0，在5℃下反应10小时。反应产物过SephadexG25凝胶柱，除去未反应的活化的丁丙诺啡，收集蛋白峰，对0.01mol/L PBS 进行透析，更换缓冲液3~4次。获得的反应产物即为丁丙诺啡-KLH（BUP-KLH）或丁丙诺啡-BSA（BUP-BSA）完成抗原。
1-2、丁丙诺啡半抗原与蛋白偶联率的测定：该步骤操作按一下步骤进行（以BUP-BSA为例）：称量150μg BUP稀释为1ml，然后倍比稀释得75μg/ml，37.5μg/ml，17.8μg/ml系列浓度，分别进行紫外图谱得扫描；从紫外光谱图上读出BUP最大吸收峰得吸光度Amax，作BUP浓度对吸光度的标准曲线Amax-Cbup；称量1.72mg BSA稀释为1 ml，进行倍比稀释成1.62mg/ml，0.86mg/ml，0.43mg/ml，0.215mg/ml，分别做UV图谱；从BSA的紫外光谱图上读出其最大吸收峰处的Amax，作BSA浓度对吸光度的标准曲线Amax-Cbsa；将透析后的液体50μl，稀释为500μl，测定其UV图谱，得出其在max处的吸光值A0;近似认为BSA在反应和透析过程中不发生分解和损失等，则可根据体积比计算出纯BSA浓度A2，按照吸光值的可叠加原理，偶联物中BUP对总吸光值A0的贡献应为偶联物的吸光值减去BSA对吸光值A0的贡献，即A1=A0-A2。由此吸光值所对应标准曲线，即可推算出BUP在偶联物中的浓度；将BSA及BUP的质量浓度转换为摩尔浓度，二者的比值即为偶联率；根据偶联率=（Cbup/Mbup）/（Cbsa/Mbsa）公式计算出BUP-BSA的偶联比率为31：1；同理计算出BUP-KLH的偶联比率为39：1。
丁丙诺啡半抗原选择与BSA或KLH载体蛋白偶联时发现，两种均能成功偶联，由上述计算可知，发现免疫原BUP-KLH偶联物的结合比比BUP-BSA高，因此选择将丁丙诺啡半抗原偶联在血蓝蛋白上。
实施例2：抗丁丙诺啡单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
步骤（1）：小鼠免疫
将BUP-KLH人工抗原、弗氏佐剂、3%吐温-80生理盐水按1：1：1的体积通过搅拌法得到丁丙诺啡乳剂。选用体重20g左右的8周龄雌性Balb／c小鼠，首次免疫采用含100μg BUP-KLH人工抗原的丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为完全佐剂）靠近淋巴结皮下部位注射。两周后，再用含100μg BUP-KLH人工抗原的丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为不完全佐剂）靠近淋巴结皮下部位注射。连续皮下注射三次丁丙诺啡乳剂（其中弗氏佐剂为不完全佐剂），第四周采血鉴定抗血清效价。在融合前三天，用50μg BUP-KLH人工抗原与PBS 1:1配比，腹腔加强免疫。3d后按常规方法取脾融合。
所述的靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；
步骤 (2)脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
2-1：饲养细胞制备：小鼠颈断处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，约10min后，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用注射器注入37℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液。且在细胞融合完成的第五天补加一定量的饲养细胞可以有效提高杂交瘤细胞的存活率。完成一次细胞融合，共铺有12块96孔板，将其标记为1-12，奇数板1，3，5，7，9，11共6块加入一定量饲养细胞，偶数板2，4，6，8，10，12共6块作为对照不加入一定量饲养细胞。在融合细胞后第十天进行ELISA检测前记录统计单克隆细胞团数。观察并统计是否存在差异。共重复3次细胞融合实验。
编号 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12
融合1 65 75 79 86 82 96 55 45 48 52 53 42
融合2 104 110 120 96 99 108 70 66 63 75 58 73
融合2 72 68 88 92 72 85 44 47 50 55 38 42
Day5 加饲养细胞 Day5 不加饲养细胞
融合1细胞团平均值 80.5 49.2 P>0.1
融合2细胞团平均值 106.2 67.5 P>0.1
融合3细胞团平均值 79.5 46 P>0.1
由上述两张表格的统计数据可知，在细胞融合的第五天补加一定量的饲养细胞能显著提高杂交瘤细胞的存活率。
2-2：小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含10%FBS的DMEM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长对数期，生长状态良好用于细胞融合。通常骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞细胞数量比约为1:4~1:10。
2-3：脾细胞制备：取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死，泡75%的酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏。将脾脏放在连接着50ml离心管的不锈钢滤网上，立即加入5ml无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌的注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液至30ml，离心。弃上清用无血清培养液重复离心一次，待用。
2-4：脾细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入0.7ml 37℃预温的PEG4000，一分钟内加完，然后静止90秒。再加入25ml 37℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养。24小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
步骤(3)杂交瘤细胞的筛选
3-1：初筛：
融合细胞隔3天后换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3-2：复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株BUP 9X1做克隆培养。
3-3：杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化：
杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含10﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的单克隆，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗体的的抗丁丙诺啡单克隆细胞。
该细胞株命名为抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1（保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏号CCTCC NO.C201728），扩大培养后进行丁丙诺啡单克隆抗体纯化。
步骤(4)抗丁丙诺啡单克隆抗体制备与纯化
4-1：丁丙诺啡单克隆抗体制备
采用动物体内诱生法-腹水制备法。将筛选到的单克隆细胞株BUP 9X1用含10﹪FBS的DMEM培养基接种到24孔细胞培养板中，培养1-2天后接种到小号细胞培养瓶中，在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/2视野时,接种到大号细胞培养瓶中，培养1-2天后，观察细胞生长在对数期，离心收集杂交瘤细胞。用0.9%的生理盐水稀释，注射到已注射液体石蜡1-2周的小鼠腹腔内，每只注射1×106个杂交瘤细胞。约7-10天后，小鼠腹部明显涨大，此时用75%的乙醇消毒腹部，用注射针头收集腹水。
4-2：丁丙诺啡单克隆抗体纯化
用G-蛋白亲和层析法纯化丁丙诺啡单克隆抗体
1、取一定量腹水，在室温下解冻，量腹水体积，10000转 4°离心20分钟，除去较大凝块。
2、将1.5g Protein G-Sepharose CL-4B 干粉用6-7ml 三蒸水溶解，再用0.02M，pH7.4的磷酸盐缓冲液（上样缓冲液）浸泡24 h,然后装入层析柱中。
3、用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1ml/min,试纸测出流出液体pH为7.4。
4、取预处理过的腹水5ml,用上样缓冲液稀释至10ml,用0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1ml/min。
5、用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1ml/min，随后用0.02M，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用A KTA explorer 进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的4ml离心管收集，每收集3ml后，立即用1M，pH9.0的Tris-Hcl缓冲液调整pH至7.0。
6、收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平和5-10倍柱床体积，流速调整至1ml/min。再用三蒸水平衡10倍柱床体积。
7 透析液过滤。测试蛋白浓度并送检.蛋白浓度（mg/ml）=OD280值*稀释倍数/1.35=蛋白浓度）
实施例3：抗丁丙诺啡单克隆抗体的性能检测
3.1 抗丁丙诺啡单克隆抗体亚型鉴定
参照单克隆抗体分型试剂盒对实施例1制备的抗丁丙诺啡单克隆抗体进行亚型鉴定，抗丁丙诺啡单克隆抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。
3.2 如图1所示，抗丁丙诺啡单克隆抗体的效价测定：
采用间接ELISA测定抗体效价。用100ml 10 ug／ml的BUP-BSA抗原包被96孔酶标板，4℃过夜，包被液采用0.05mol／L pH 9．6碳酸缓冲液，再用0.01mol／L PBS 1％BSA 37℃封闭2h，从1：50倍开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2／0细胞培养上清为阴性对照，每孔加样100ul，37℃孵育30min。洗涤液洗板3次后，加1：2000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠多抗50ul，37℃孵育30min，洗板后加酶底物TMB／H202显色10~15min，用O.2 N HCI终止反应。读取450nm波长吸光值。
3.3抗丁丙诺啡单克隆抗体的亲和力常数测定
用抗体竞争结合抗原测定亲和力实施例
①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释丁丙诺啡单克隆抗体（MOP-BSA）至1μg /ml，然后在96孔酶标板每孔中分别加入100µl稀释后的丁丙诺啡人工抗原，4℃包被过夜（2块板）；然后用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；②每孔中加入200µl含10%BSA的0.01mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液，置37℃60分钟，再用0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干备用；③取纯化后的抗体配制5ml浓度为40ng/ml和5ml浓度为1000ng/ml的丁丙诺啡抗原，然后将丁丙诺啡抗原倍比稀释，分别为500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.812ng/ml，取等体积的抗体分别与8个浓度抗原混合得8个待测样，37℃孵育60分钟。④以每孔100µl将8个待测样加入到已包被的酶标板中，置37℃60分钟，将孵育后的剩余液体加到另一块板中孵育60分钟，用0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板5次；⑤将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到4000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100µl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应60分钟，用含0.05﹪Tween-20的PBS缓冲液洗板3次拍干；⑤每孔加入50µl底物TMB 37℃反应8分钟后，用浓度为2M 的H2SO4终止反应，450nm测定其OD值.然后根据亲和力常数计算公式:Kd(i0-a0B)=B/(1-B)求得亲和力Kd值，其中a0为抗体初始浓度，i0为抗原初始浓度，B是抗体结合率，B=(A0-Ai)/A0, A0和Ai分别为检测初始抗体和已结合抗原的抗体的D450值。分别计算出三种8G2、 9X1、5B9单抗亲和力常数为3.2×10-9mol/L、4.5×10-9mol/L、3.9×10-9mol/L。
抗体的亲和力常数（K），作为表征抗体抗原亲和力的参数，反映了抗体分子上的抗原结合部位与对应的抗原决定簇之间相互作用的强度。一般认为亲和力常数为107～1010M-1,抗体亲和力高。亲和力常数105～106M-1,抗体亲和力低。采用ELISA方法测定得出，BUP9X1该细胞株制备的丁丙诺啡单克隆抗体亲和力常数为4.5×10-9mol/L，亲和力较高。
3.4 抗体特异性和抗体的灵敏度
用胶体金竞争免疫亲和层析方法进行特异性和灵敏度的测定，参试物质为40多种常见药物。在最佳的浓度下将BUP-BSA划膜于尼龙膜上，胶体金标记纯化的单抗，制备免疫亲和层析条。分别加入一系列浓度的各种药物标准溶液，进行测试。阳性结果表明抗体与该物质有交叉反应。同时，配制5—1000ng／ml不同浓度的标准品，测试3种不同抗体制备的胶体金检测条，结果呈阳性的最低样品的浓度即为该抗体的灵敏度。BUP 9X1该细胞株制备的丁丙诺啡单克隆抗体的灵敏度已达到10ng／ml，适用于10ng/ml阈值的检测。
间接ELISA方法检测实施例1制备的抗丁丙诺啡单克隆抗体，450nm测定其OD值，以抗丁丙诺啡单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值。从下表可以看到，制备的抗丁丙诺啡单克隆抗体反应活性可以到达0.0005μg /ml。
不同浓度下实施例1制备的抗丁丙诺啡单克隆抗体的OD450值
3.5 常用药物交叉试验
药物干扰反应准备阴性基质尿和浓度等于或低于100μg /ml的某种药物的测试液，用两根试纸条分别检测两种尿液，记录药物干扰实验结果。不产生干扰反应的药物有：二氢埃托啡、罂粟碱、那可丁、芬太尼、右丙氧芬、曲马多、美沙酮、纳洛酮、纳曲酮、吗啡、洛非西丁、地西泮、苯巴比妥、四氢大麻酚酸、可卡因、利多卡因、雷尼替丁、加替沙星、普鲁卡因、咖啡因、东莨菪碱、非那西丁、安非他明、益安口服液、扑热息痛、阿司匹林、布洛芬、阿米替林、丙咪嗪、水合氯醛、三唑仑、阿普唑仑、氯丙嗪、奥氟沙星、氟哌酸、乳糖、先锋IV、黄连素、速可眠和去痛片。
实施例4：丁丙诺啡胶体金试纸条方法的建立和评估
一、胶体金的制备
取1ml 1%氯金酸（HAuCl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml 1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化。此时制得的胶体金颗粒为30nm。
二、胶体金标记抗体蛋白
1、抗体稀释
取一定量的丁丙诺啡单克隆抗体（BUP-Mab），经过透析、离心处理后，用pH 8.00.1M PB稀释至1mg/ml，4℃保存备用。
2、抗体偶联
取100ml制备好的30nm胶体金，用1M NaOH调节pH至8.5，然后加入上述抗体1ml，磁力搅拌器上搅拌1小时，然后加入一定量的BSA至终浓度1%，继续搅拌0.5小时。
三、金标抗体的纯化
将上述已经偶联好抗体的胶体金溶液离心（4000rpm，15分钟），弃去沉淀，保留溶液。然后进行二次离心（12000rpm，30分钟），弃去上清液，保留沉淀。沉淀用含20%的蔗糖的金标抗体稀释液（pH8.0、0.02M Tris+1%BSA）复溶至10mL，转入棕色瓶内，4℃保存备用。
四、试纸条组装
按常规方法将丁丙诺啡人工抗原（BUP-KLH）点于膜上检测线处，羊抗鼠二抗点于膜上C线处，金标抗体点于金标垫上，然后组装成金标检测试纸条。
五、丁丙诺啡试纸条灵敏度测试
用PBS缓冲液将丁丙诺啡标准品配制成100ng／ml、50ng／ml、25ng／ml、10ng／ml、5ng／ml、0ng／ml，将金标检测试纸条分别插入上述配制好的溶液中，5min后观察结果。
丁丙诺啡试纸条检测不同浓度标准品的结果判定
标准品浓度 100ng／ml 50ng／ml 25ng／ml 10ng／ml 5ng／ml 0ng／ml
结果强弱 - - - +/- ++ +++
结果判定 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性

Claims (5)

1.一种抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1,该细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201728。
2.一种制备抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1的方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）以盐酸丁丙诺啡为原料，游离后与溴戊酸乙酯进行亲核取代反应，水解得到含羧基的丁丙诺啡半抗原，通过N，N-二环己基碳二亚胺将其连接于载体蛋白的氨基上，得到丁丙诺啡-KLH人工抗原；
（2）将丁丙诺啡-KLH人工抗原、弗氏佐剂、3%吐温-80生理盐水按1：1：1的体积通过搅拌法得到丁丙诺啡乳剂，用该乳剂免疫小鼠；
（3）小鼠颈断处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，约10min后，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用注射器注入37℃预热的DMEM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔1-2分钟，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后收集悬液，与腹腔液合并离心，沉淀物用HAT完全培养液重悬，得到饲养细胞悬液；
把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含10%FBS的DMEM培养基进行传代培养；
取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死，泡75%的酒精中消毒后剖腹，无菌取出脾脏，将脾脏放在连接着50ml离心管的不锈钢滤网上，立即加入5ml无血清的DMEM培养液，用眼科剪剪碎脾脏，然后用无菌的注射器柄轻磨脾脏，使脾脏细胞经过网孔滤入离心管内，加无血清培养液至30ml，离心，弃上清用无血清培养液重复离心一次，待用；
采用聚乙二醇融合法，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入0.7ml 37℃预温的PEG 4000，一分钟内加完，然后静止90秒；
再加入25ml 37℃预温的DMEM无血清培养液终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO2培养箱中培养；
24小时后，采用HAT培养基，HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液；
3-1：初筛：
融合细胞隔3天后换液一次，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；
3-2：复筛：
将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株BUP 9X1做克隆培养；
3-3：杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化：
杂交瘤细胞株BUP 9X1的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含10﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液，然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平，选择3个效价最高的单克隆，做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪；得到一株能稳定分泌专一性抗体的的抗丁丙诺啡单克隆细胞。
3.根据权利要求2所述的一种制备抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1的方法，其特征在于步骤(1)中，丁丙诺啡人工抗原的制备：
4.根据权利要求3所述的一种制备抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1的方法，其特征在于丁丙诺啡人工抗原制备过程包括以下步骤：
将50mg盐酸丁丙诺啡加入10ml甲苯中，加入11.1g氢氧化钾，回流带水后，降温分出固体，固体溶于5ml的四氢呋喃中，加入100ul Ethyl 5-bromovalerate，室温下继续反应24小时；
通过挥发除去四氢呋喃，反应物经硅胶层析柱纯化，正己烷/乙酸乙酯（1:1）洗脱得到反应产物共57mg；
将洗脱产物溶于4ml 95%的乙醇中，加入100mg氢氧化钠，50℃下混合1小时，减压下乙醇挥发后用50ml二氯甲烷溶解反应产物，用1N 盐酸调节pH值至2.0，分离有机相，用无水氯化钙干燥；
获得活化的小分子，取30mg活化的丁丙诺啡，在搅拌下溶解于3ml乙醚中，然后缓慢加入25mg的N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）和15mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（Smlfo-NHS），摇匀后室温下反应16h，离心后去沉淀；
配置2mg/ml KLH （4mg/ml BSA）溶液10ml，于4℃缓慢加入以上丁丙诺啡反应物，pH值调节至8.0，在5℃下反应10小时，反应产物过SephadexG25凝胶柱，除去未反应的活化的丁丙诺啡，收集蛋白峰，对0.01mol/L PBS 进行透析，更换缓冲液3~4次，获得的反应产物即为丁丙诺啡-KLH（BUP-KLH）或丁丙诺啡-BSA（BUP-BSA）完成抗原。
5.一种抗丁丙诺啡单克隆抗体，该抗丁丙诺啡单克隆抗体为保藏号为CCTCCNO.C201728的抗丁丙诺啡杂交瘤细胞株BUP 9X1分泌产生，分泌出的抗丁丙诺啡抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。
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