CN103509756A - 一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用，一种牛支原体单克隆抗体的制备方法，其步骤是：1）制备牛支原体抗原；2）抗原免疫小鼠；3）制备分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞以及单抗腹水；4）单抗纯化。本发明用牛支原体地方分离株HB0801抗原免疫小鼠后，用杂交瘤细胞技术获得能高效分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C11，CCTCCNO：C201218，所产生的单克隆抗体可与牛支原体和无乳支原体特异性结合，利用以上单克隆抗体建立了检测牛支原体抗原的夹心ELISA，该方法操作简单，所需时间短，灵敏度高。

Description

一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及牛支原体的检测与鉴定技术领域，具体涉及一种牛支原体单克隆抗体，还涉及一种分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，同时还涉及一种牛支原体单克隆抗体的制备方法，还涉及牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用。 

背景技术

在世界范围内,牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）已经成为肉牛和奶牛场一种最为常见和最为重要的病原，导致以肺炎为主的综合征侯群，包括肺炎、关节炎、房炎和结膜炎等一系列临床疾病。自1961年世界上首次在美国从患乳房炎的奶牛牛奶中分离到牛支原体以来，世界各个国家都证实该病原及相关疾病在牛群中广泛流传，极大地威胁了养牛业的健康发展（Nicholas等，2003）。 

2008年以来,湖北省从外地引进肉牛中,陆续发生呼吸道疾病,牛群引进后不久即发病,表现为发热,咳嗽，流鼻涕，犊牛和体质弱的牛发病严重。发病率为50%～100%,病死率平均10%，可高达60%。剖检时，病理变化主要集中在胸腔，以坏死性肺炎为主，因此老百姓称其为“烂肺病”。本实验室首先确定该病为“传染性牛支原体肺炎”（石磊等，2008）,随后证实该病在全国不同地方广泛流行（胡长敏等，2009；辛九庆等，2008）。由于常规抗菌药治疗效果差，且无疫苗等防控手段，给养牛业造成了严重的经济损失。 

目前用于该病的诊断方法主要是牛支原体的分离和鉴定，至少需要3天时间。常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎的灵敏度低，非特异性高。针对牛支原体的PCR和等温环介导方法方法灵敏高，但前者需要特殊仪器设备，且两种方法都容易因污染核酸而出现假阳性。因此，建立灵敏、特异的抗原检测方法将对该病的快速诊断具有重要意义，而高亲合力单克隆抗体是建立抗原检测方法的前提。虽然国外在牛支原体单克隆抗体制备方面已取得一定的进展（Rasberry等，1992），本课题组进行的基因组测序分析表明（GenBank登录号：CP002058），牛支原体是一种变异性极高的原核生物，其表面脂蛋白与国外菌株比较存在很大变异。因此，申请者以本地分离株为抗原，获得了分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，并利用所分泌的单克隆抗体，建立了检测牛支原体抗原的双抗夹心ELISA方法，该方法将为牛支原体相关疾病的诊断提供灵敏、特异、且适合批量检测的新型检测手段。 

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体，该单克隆抗体特异性高，不与牛的常见病原发生交叉反应，而且能够大量生产，该单抗能够识别牛支原体的表面蛋白，为建立特异性的牛支原体双抗夹心ELISA方法建立的基础。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体的制备方法，该方法利用吡咯灭活的本地流行的牛支原体HB0801的菌体作为抗原，免疫BALB/c小鼠，避免了牛支原体表面蛋白的天然结构的破坏，使制备的单克隆抗体是针对的是牛支原体的表面蛋白的抗体，而且因为牛支原体的快速变异的特性，用本地流行株HB0801作为抗原制备的单抗比国外的牛支原体单抗更容易识别中国流行的牛支原体。另外，本研究通过多次洗涤抗原以及利用马血清作为特异性实验的对照，消除了牛支原体培养基中马血清对单抗制备的干扰，从而避免了制备的单抗出现与马血清反应的现象。 

本发明还有一个目的是在于提供了一种分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，申请人于2012年1月16日将该杂交瘤细胞送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C201218，分类命名：杂交瘤细胞株1C11。 

该杂交瘤细胞株1C11可以在含有20%（v/v）胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5%（v/v）CO₂的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗牛支原体的单克隆抗体。该细胞由骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞融合而得，染色体计数结果显示该杂交瘤细胞株染色体为90条（介于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体数目70条和BALB/c小鼠脾细胞的染色体数目40条之间）。 

本发明的再一个目的是在于提供了一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用，该方法为中国牛支原体相关疾病的诊断提供了灵敏、特异、且适合批量检测的新型检测手段，填补了国内牛支原体抗原检测的空白。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

杂交瘤细胞的获得过程是：用牛支原体本地分离株HB0801株（CCTCC NO：M2010040）抗原免疫小鼠，用获得的免疫鼠脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；进一步用牛支原体抗原筛选，获得能稳定分泌高亲合力牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞命名为1C11，在国家典型培养物保藏中心的保藏号为：CCTCC NO：C201218。 

抗原检测方法建立的基本过程是：利用该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体以及自行制备 的兔抗牛支原体多克隆抗体，建立牛支原体双抗夹心ELISA检测方法；通过检测条件的优化，最终获得灵敏度与特异性均最佳的检测方法。该方法填补了国内牛支原体抗原检测的空白。 

一种分泌牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其步骤是： 

1、牛支原体抗原的制备： 

牛支原体HB0801株（CCTCC No：M2010040）在PPLO培养基37℃培养72h后，取适量作计数用，剩余用0.2﹪终浓度为的吡咯灭活24h，之后于12000r／min离心30min收集菌体，再用灭菌PBS洗涤5次，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，于-20℃冻存。 

计数方法：将上述牛支原体液体培养物用PPLO培养基稀释不同的稀释度，涂于PPLO固体培养基表面，于含5％（v/v）CO2的细胞培养箱中培养，2～3d后，用光学显微镜低倍观察菌落形态。固体培养基上生长的支原体菌落应具有“煎蛋样”典型特征（图1），并用活菌技术法对这些菌落进行计数。 

2、小鼠免疫： 

按步骤1制备的牛支原体抗原与弗氏完全佐剂（Sigma公司产品）混合乳化后颈背部皮下多点注射免疫5只BALB/C小鼠，分别在二周和四周后用抗原加弗氏不完全佐剂（Sigma公司产品）进行两次加强免疫。每次免疫7天后，尾尖采血分离血清，用间接ELISA测其效价。取效价最高的小鼠脾脏进行下一步融合。 

3、杂交瘤细胞以及单抗的制备： 

杂交瘤制备：在细胞融合前三天对效价最高的小鼠进行加强免疫，三天后小鼠断颈处死，无菌取脾脏，研碎，静置3min吸取上层细胞液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的数量比混合，用45%（v/v）PEG 4000（SIGMA公司）介导细胞融合，逐步加入基础培养基稀释PEG，消除PEG的作用来终止融合。将融合细胞加到已有饲养细胞层的96孔培养板中，于37°C CO2培养箱中培养。细胞培养至覆盖10～20％孔底面积时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆。 

杂交瘤细胞克隆采用有限稀释法，选取阳性杂交瘤克隆转接于24孔板扩大培养，并做再次克隆化筛选，连续两次克隆率达到100%后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养。 

单抗腹水的制备：取BALB/c小鼠，先对小鼠进行腹腔注射弗氏不完全佐剂，一周后将获得的杂交瘤细胞腹腔注射接种到小鼠腹腔内，每只老鼠约1×10⁶个杂交瘤细胞，制备腹水，约10天后可产生腹水，待小鼠腹部隆起较大时，处死小鼠，用注射器将腹水吸出，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。 

4、单抗纯化和鉴定： 

（1）单抗纯化：含单克隆抗体的腹水用辛酸-硫酸铵法纯化，并用适当体积的PBS(pH7.4)重悬沉淀，将悬液装进透析袋中，放入PBS(pH7.4)中透析过夜，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定，即为粗提的IgG。-20℃保存备用（图2）。 

（2）单抗的Ig类与亚类的鉴定：采用Clonotyping System-HRP试剂盒（Southern Biotech）鉴定单抗Ig类和亚类。本发明所得单抗被鉴定为IgG2a亚类。 

（3）单克隆抗体的特异性鉴定：用间接ELISA检测牛支原体单抗与临床分离鉴定的牛支原体HB0801、牛支原体PG45、无乳支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体标准株Y98、丝状支原体山羊亚种标准株PG3以及本实验室从牛体内分离并保存的临床常见的病原菌巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌的全菌蛋白的特异性反应，结果显示本研究制备的单抗1C11能识别临床分离株牛支原体HB0801、牛支原体ATCC参考株PG45以及无乳支原体，不与精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体标准株Y98以及丝状支原体山羊亚种标准株PG3反应，也不与支原体以外常见牛病原菌发生反应（表1）。 

（4）牛支原体单克隆抗体1C11针对的抗原表位鉴定：将牛支原体和马血清（购自Hyclone公司）进行SDS-PAGE电泳，然后按照《分了克隆实验指南》（萨姆布鲁克等，2005）介绍方法湿转印（50V，2h）至PVDF膜上，5%（m/v）脱脂奶封闭90min，用TBST洗膜三次，用牛支原体单抗1C11（CCTCC No：C201218）的腹水（1:200稀释）做为一抗在37°C下与膜作用2h，用TBST洗膜三次，与1:10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG作用60min，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜一次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermo scientific)显色。结果显示牛支原体单抗1C11识别牛支原体的26kDa大小的蛋白带，与马血清没有交叉反应（图3）。 

通过上述的步骤获得了牛支原体单抗，分泌该单抗的杂交瘤细胞株已于2012年3月9日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏该细胞，保藏号CCTCC NO：C201218；分类命名：杂交瘤细胞株1C11。该杂交瘤细胞株1C11可以在含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中以半贴壁方式生长，生长环境为37℃，5%CO₂的培养箱。该杂交瘤细胞株为浑圆透亮，成簇生长，并能稳定的分泌抗牛支原体的单克隆抗体。该细胞由骨髓瘤细胞SP2/0和免疫脾细胞融合而得，染色体计数结果显示该杂交瘤细胞株染色体为90条（介于骨髓瘤细胞SP2/0的染色体数目70条和BALB/c小鼠脾细胞的染色体数目40条之间）。 

一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用，其应用过程是： 

双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法的建立 

1、多克隆抗体（多抗）的制备 

将以上制备的牛支原体免疫原，免疫4只日本大耳白兔，四次免疫后，取血清抗体效价最高的兔放血，收集血清，用硫酸铵分级沉淀法纯化，获得抗牛支原体多抗。 

2、ELISA方法建立 

采用碳酸盐法将本发明中制备的牛支原体单抗1C11包被到96孔酶标板上，用含5％（m/v）脱脂奶粉的PBST溶液37℃封闭1小时；加入待检测样本，37℃30分钟后用PBST冲洗3次；将400倍稀释的牛支原体多抗加入酶标板，37℃30分钟后用PBST冲洗3次；加入HRP标记的羊抗兔二抗（Southerm Biotech公司），37℃30分钟后用PBST洗涤4次，加入底物液和TMB 10分钟，氢氟酸终止反应后于630nm测光密度值(OD值)。以终点稀释法确定ELISA灵敏度：阴性样本为PBST，检测灵敏度为待测孔与阴性对照孔的OD630比值（P/N值）大于2时的样本浓度。现建立的ELISA灵敏度定为10⁵CFU。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 

本发明为国内首次报道牛支原体单抗的制备以及利用单抗建立的牛支原体双抗夹心ELISA检测方法，制备牛支原体单抗时所用的免疫原为国内本地分离株HB0801，与国外已有的牛支原体单克隆抗体相比更能够识别中国流行的牛支原体，因为牛支原体具有较强的变异性。另外，本研究中制备的单抗中，建立的牛支原体双抗夹心检测方法与目前常用的牛支原体检测方法PCR方法、抗体检测方法以及病原分离培养法相比具有很大的优势，与PCR相比，牛支原体双抗夹心ELISA方法能够同时检测大量样本，而且对实验仪器要求较低。与抗体检测相比，牛支原体双抗夹心ELISA方法是针对抗原的特异性检测方法，更能直接说明病原的感染。与传统的病原分离培养方法相比，牛支原体双抗夹心ELISA方法操作简单，所需时间短，大约两天出结果，而病原分离培养需要5到7天时间才能完全确定结果。 

附图说明

图1为一种牛支原体分离株HB0801在PPLO固体培养基上煎蛋样菌落示意图 

图2为一种牛支原体单克隆抗体纯化后SDS-PAGE结果示意图 

M.参考蛋白；1纯化后的单抗1C11 

图3为一种牛支原体单克隆抗体1C11免疫印迹反应结果示意图。 

M.参考蛋白；1牛支原体；2马血清对照。 

具体实施方式

实施例1：牛支原体单克隆抗体的制备 

一、牛支原体抗原的制备 

牛支原体HB0801在PPLO培养基37℃培养72h后，取适量作计数用，剩余用0.2﹪（v/v）终浓度为的吡咯灭活24h，之后于12000r／min离心30min收集菌体，再用灭菌PBS洗涤5次，用BCA试剂盒（购自北京赛弛有限公司）测定总蛋白浓度，于-20℃冻存。 

计数方法：将上述牛支原体液体培养物用PPLO培养基(白智迪，2011)稀释不同的稀释度，涂于PPLO固体培养基表面，于含5％（v/v）CO₂的细胞培养箱中培养，2～3d后，用光学显微镜低倍观察菌落形态。固体培养基上生长的支原体菌落应具有“煎蛋样”典型特征(见图1)，并用活菌技术法对这些菌落进行计数。 

二、小鼠免疫 

抗原免疫BALB/C小鼠，免疫程序如下： 

（1）初次免疫,牛支原体抗原100μg/支鼠,加弗氏完全佐剂颈背部皮下多点注射，0.2mL/只鼠。 

（2）二周后，第二次免疫,剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。 

（3）四周后，第三次免疫,剂量100μg/只鼠，加弗氏不完全佐剂颈背部皮下多点注射。 

（4）7天后，剪尾尖采血，分离血清，用间接法ELISA测其效价，即用抗原牛支原体包板，加入小鼠血清稀释品37℃孵育，洗板加入HRP标记的羊抗鼠二抗（购自Southern Biotech公司）37℃孵育，洗板加入TMB底物显色，取效价高者做融合用。 

经牛支原体免疫的小鼠将被处死后用于分离脾细胞以构建单克隆抗体杂交瘤，具体方法描述如后。 

三、杂交瘤构建和单抗制备 

1、杂交瘤融合：采用PEG介导融合 

细胞融合材料： 

（1）骨髓瘤细胞系的准备：本研究选择SP2/0骨髓瘤细胞系。骨髓瘤细胞的培养用RPMI1640培养基（配方见：邹新峰．水牛IFN-Y克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用.[硕士学位论文]．武汉：华中农业大学图书馆，2011）、小牛血清浓度20%（v/v），细胞浓度以104～5×105/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3的比例传代。每3～5天传 代一次。细胞在传代过程中，定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 

（2）饲养细胞：小鼠腹腔巨噬细胞及脾细胞，饲养细胞的量为一般为2×10⁴到10⁵细胞/孔。 

细胞融合的步骤如下： 

（1）制备饲养细胞层：用小鼠腹腔巨噬细胞及脾细胞。 

BALB/C小鼠，6～10周龄，拉颈处死，浸泡在75%（体积比，下同）酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6mL预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液；同时取脾脏，研磨器研磨后用基础1640（购自Hyclone公司）重悬，静置3min，吸取上层细胞液；将上述两种细胞液冲洗液放入50ml离心管，1200rpm/分离10min弃上清，用20%（体积比，下同）新生牛血清（NCS）或胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液（配制方法见邹新峰．水牛IFN-Y克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用.[硕士学位论文]．武汉：华中农业大学图书馆，2011）混悬，调整细胞数至1×10⁵/mL，加入96孔板，100μL/孔，放入37℃ CO₂孵箱培养。 

（2）制备免疫脾细胞 

最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，用基础1640重悬，静置3min，吸取上层细胞液。离心，细胞用培养液洗2次，计数取10⁸脾淋巴细胞悬液备用。 

细胞融合程序： 

（1）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1000rpm，10min；弃上清，吸水纸吸干残余液体。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 

（2）90秒内加入37℃预温的1mL 50%（体积比，下同）PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90秒。 

（3）加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL。 

（4）离心，1000rpm，10min。 

（5）充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。 

（6）将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。 

（7）将培养板置37℃、5%CO₂培养箱中培养，每孔可得到一到多个分泌牛支原体单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系。 

2、抗体的检测 

采用间接ELISA法 

(1)牛支原体在pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，每孔100μL包被96孔板。 

(2)洗板封闭，加入待测得细胞培养上清100μL。37℃孵育，洗板。 

(3)加入HRP标记羊抗鼠二抗，37度孵育洗板。 

(4)洗板加TMB显色选阳性显色高的孔做再克隆。 

3、杂交瘤的克隆化 

杂交瘤克隆化是指将抗体阳性孔的几个杂交瘤细胞株进行稀释，最终保证一个孔内只有一个克隆的步骤。克隆化的原则是：尽早对于抗体检测阳性的杂交克隆进行克隆化；即使克隆化后的单克隆杂交瘤细胞，也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 

采用有限稀释法克隆的基本步骤如下： 

（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。 

（2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。 

（3）调整细胞为3～10个细胞/mL。 

（4）取前一天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL。孵育于37℃、5%CO₂孵箱中。 

（5）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。 

（6）8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。 

（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。 

（8）将细胞从24孔转到培养瓶中，每个克隆应尽快冻存。 

（9）连续三次克隆得到100%表达牛支原体抗体阳性杂交瘤细胞株。2012年3月9日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏该细胞，保藏号CCTCC NO：C201218；分类命名：杂交瘤细胞株1C11。 

4、杂交瘤细胞的冻存与复苏 

（1）杂交瘤细胞的冻存 

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞和每次克隆化得到的亚克隆细胞十分重要。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上每支安瓿的细胞量应在1×10⁶个以上，但原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而数量不同。 

细胞冻存液配方（体积比）：90%小牛血清，10%DMSO（二甲基亚砜）。 

冻存液最好预冷，操作时务必动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 

（2）细胞复苏方法 

将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入前一天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%（v/v）CO₂孵箱中培养。当细胞形成集落时，检测抗体活性。 

5、单克隆抗体的扩大制备 

制备腹水：先腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂于BALB/C鼠，1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多、而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/mL，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、且量多。 

四、单抗纯化和鉴定 

1、单抗纯化 

采用辛酸-硫酸铵法纯化小鼠腹水中的IgG，基本步骤如下： 

（1）将腹水12000r/m离心10min，以去除脂质等杂质。 

（2）向1mL要纯化腹水中加入4mL的0.06mol/L的醋酸缓冲液(pH4.5)。 

（3）冰浴条件下，每mL腹水加辛酸33μL，边加边慢慢搅拌。 

（4）冰浴条件下，继续搅拌30min。 

（5）12000r/m离心30min，取上清液经滤纸过滤后，调节pH至7.4。 

（6）冰浴条件下缓慢加入pH7.4的饱和硫酸铵，硫酸铵饱和浓度不超过45%，搅拌30min，静置2-4h或4℃过夜。 

（7）4℃12000r/m离心30min，收集沉淀物，并用适当体积的PBS（pH7.4）重悬，装进透析袋里放入PBS（pH7.4）透析过夜，即为提取的IgG。 

（8）将纯化出的单抗经SDS-PAGE鉴定，结果见图2。 

2、单克隆抗体的Ig类与亚类的鉴定 

本研究鉴定单抗Ig类和亚类的方法是使用Clonotyping System-HRP试剂盒（SouthernBiotech），步骤如下： 

（1）牛支原体在pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至5ug/mL，每孔100ul包被96孔板。 

洗板封闭。 

（2）加入稀释的待测单抗100μL。37℃孵育，洗板。 

（3）加入Clonotyping System-HRP试剂盒中的HRP标记羊抗鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3亚类二抗，37℃孵育洗板。 

（4）洗板以PBST冲洗4次，甩干；TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10分钟，加入0.25mol/L氢氟酸50μL/孔终止反应,于630nm测吸光度。阳性显色的孔所用的HRP标记羊抗鼠亚类二抗即为单抗的亚类。 

本单抗被鉴定为IgG类IgG2a亚类。（见表1） 

表1使用Clonotyping System-HRP试剂盒鉴定单抗亚类的读数 

HRP标记羊抗鼠二抗亚类	IgA	IgM	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3
							OD630	0.14	0.18	0.13	0.84	0.10	0.15

3、单克隆抗体的特异性鉴定 

采用间接ELISA法检测单抗特异性： 

（1）将牛支原体HB0801株、牛支原体ATCC参考株PG45、无乳支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体标准株Y98、丝状支原体山羊亚种标准株PG3以及临床常见的牛病原菌（多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、变形杆菌等）的全菌蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别稀释至5μg/mL，每孔100μL包被96孔板,4℃过夜。 

（2）洗板封闭，用PBST 1:100稀释单抗1C11，每孔加100μL，37℃孵育。 

（3）以PBST冲洗3次，甩干；加入10000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗鼠二抗（Southern Biotech）各100μL/孔，37℃30分钟。 

（4）以PBST冲洗4次，甩干；TMB底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10分钟，加入0.25mol/L氢氟酸50μL/孔终止反应,于630nm测吸光度。 

（5）结果判定：待测孔与阴性对照孔的OD630比值，即P/N值大于2判定为阳性（表 2）。 

表2单克隆抗体的特异性鉴定 

菌株	单抗1C11反应性
		牛支原体HB0801	+
牛支原体参考株PG45	+
		绵羊肺炎支原体标准株Y98	-
无乳支原体	+
		精氨酸支原体	-
丝状支原体山羊亚种标准株PG3	-
		大肠杆菌	-
链球菌	-
		金黄色葡萄球菌	-
溶血性曼氏杆菌	-
		多杀性巴氏杆菌	-
鼠伤寒沙门氏菌参考株	-
		化脓隐秘杆菌	-
变形杆菌	-

4、单克隆抗体1C11针对的抗原表位鉴定 

将牛支原体和马血清进行SDS-PAGE电泳，然后按照《分了克隆实验指南》（萨姆布鲁克等，2005）介绍方法湿转印（50V，2h）至PVDF膜上，5%脱脂奶封闭90min，用TBST洗膜三次，用牛支原体单抗1C11的腹水（1:200稀释）进行反应（37°C，2h），用TBST洗膜三次，与1:10000稀释的HRP-羊抗鼠IgG作用60min，用TBST洗膜三次，再用TBS洗膜一次，用Super Signal West Pico Trial Kit(购自Thermo scientific)显色。结果显示牛支原体单抗1C11识别牛支原体的约26KD大小的蛋白带，与马血清没有交叉反应。结果见图3 

实施例2： 

一种牛支原体单克隆抗体在检测牛支原体中的应用，其步骤是： 

1、牛支原体多克隆抗体的制备与纯化： 

（1）用实施例1中所述的牛支原体抗原制备的方法获得的牛支原体抗原做免疫原，免疫日本大耳白兔4只，牛支原体抗原1mg/只兔,初次免疫,用弗氏完全佐剂乳化抗原，颈背部皮下多点注射，免疫四次，每次间隔14天。通过心脏采血，于37℃放置1h，于4℃过夜，让血清自然析出。 

（2）将待提取的血清经4℃或室温离心13000r/min 30min，收集上清。 

（3）取20mL上清与等体积的PBS溶液混合，一边搅拌一边缓慢滴加40mL饱和硫酸铵于4℃作用2h或过夜，使蛋白充分沉淀。 

（4）13000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用12mLPBS，再缓慢滴加8mL饱和硫酸铵，并同时搅拌，4℃反应1h。 

（5）13000r/min，4℃离心10min，弃上清，沉淀用13mLPBS溶解沉淀，滴加7mL饱和硫酸铵，4℃反应1h。 

（6）13000r/min，4℃离心10min，弃上清，离心后所得沉淀物用少许PBS溶液（pH 7.4）溶解。 

（7）溶解液用超滤管进行超离，脱盐，浓缩，加甘油-20℃保存备用。 

2、双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测牛支原体 

(1)0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释牛支原体单抗1C11至包被浓度2.5μg/mL,加入酶标板100μL/孔，置4℃过夜，甩干，用PBST洗板3次； 

(2)含5%（m/v）脱脂奶粉的PBST(0.02mol/L pH7.4PBS含0.05%（体积比，下同）Tween-20)封闭200μL/孔，37℃1小时，甩干，用PBST洗板3次； 

(3)加入牛支原体实验室培养物样本，浓度依次为10⁸，5×10⁷，10⁷，5×10⁶，10⁶，5×10⁵，10⁵,5×10⁴，10⁴CFU/100μL的待测样本各100μL/孔，并设阴性对照孔，37℃孵育60分钟； 

(4)以PBST冲洗3次，甩干；将多抗400倍稀释后加入酶标板(100μL/孔)，37℃30分钟； 

(5)以PBST冲洗3次，甩干；加入20000倍稀释的商品化的HRP标记的羊抗兔二抗（Southern Biotech）各100μL/孔，37℃30分钟； 

(6)以PBST冲洗4次，甩干；TMB 底物A液和B液(各50μL/孔)，37℃10分钟 

(7)加入0.25mol/L氢氟酸50μL/孔终止反应,于630nm测吸光度。以终点稀释法确定ELISA灵敏度：阴性样本为PBST，检测灵敏度以样本值OD630值为阴性值2倍的牛支原体样本浓度。 

(8)该结果显示此ELISA方法的敏感度为10⁵CFU（100μL），对应的OD₆₃₀值为0.28（见 表3）。 

表3基于单克隆抗体的夹心ELISA对牛支原体检测的灵敏度 

Claims (3)

1.一种牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：杂交瘤细胞株1C11， CCTCC NO：C201218。

2.利用权利要求1所述的杂交瘤细胞株制备牛支原体单克隆抗体方法，其步骤是：

1）牛支原体抗原的制备： 

牛支原体HB0801株在PPLO培养基37℃培养72 h后，取适量作计数用，剩余用0.2﹪v/v终浓度为的吡咯灭活24h，之后于12000 r／min离心30min收集菌体，再用灭菌PBS洗涤5次，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，于-20℃冻存；

2）小鼠免疫：

   将步骤1）制备的牛支原体抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后颈背部皮下多点注射免疫5只BALB/C 小鼠，分别在二周和四周后用抗原加弗氏不完全佐剂进行两次加强免疫；每次免疫7天后，尾尖采血分离血清，用间接ELISA测其效价，取效价最高的小鼠脾脏进行下一步融合；

3）杂交瘤细胞以及单抗的制备：

    杂交瘤制备：在细胞融合前三天对效价最高的小鼠进行加强免疫，三天后小鼠断颈处死，无菌取脾脏，研碎，静置3min吸取上层细胞液；将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10的数量比混合，用45%v/vPEG 4000介导细胞融合，逐步加入基础培养基稀释PEG，消除PEG的作用来终止融合；将融合细胞加到已有饲养细胞层的96孔培养板中，于37°C CO₂培养箱中培养；细胞培养至覆盖10～20％孔底面积时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆；杂交瘤细胞克隆采用有限稀释法，选取阳性杂交瘤克隆转接于24孔板扩大培养，并做再次克隆化筛选，连续两次克隆率达到100%后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养；

单抗腹水的制备：取BALB/c小鼠，先对小鼠进行腹腔注射弗氏不完全佐剂，一周后将获得的杂交瘤细胞腹腔注射接种到小鼠腹腔内，每只老鼠约1×10⁶个杂交瘤细胞，制备腹水，约10天后可产生腹水，待小鼠腹部隆起较大时，处死小鼠，用注射器将腹水吸出，一般一只小鼠可获5～10mL腹水；    

 4）单抗纯化：含单克隆抗体的腹水用辛酸-硫酸铵法纯化，并用适当体积的pH7.4 PBS重悬沉淀，将悬液装进透析袋中，放入PBS中透析过夜，透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定，即为粗提的目的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在牛支原体检测中的应用。

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