CN110763843B - 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110763843B
CN110763843B CN201911075572.5A CN201911075572A CN110763843B CN 110763843 B CN110763843 B CN 110763843B CN 201911075572 A CN201911075572 A CN 201911075572A CN 110763843 B CN110763843 B CN 110763843B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma bovis
antibody
detection
double
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911075572.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110763843A (zh
Inventor
胡长敏
郭爱珍
陈颖钰
张文劲
杨莉
陈曦
李雨芮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201911075572.5A priority Critical patent/CN110763843B/zh
Publication of CN110763843A publication Critical patent/CN110763843A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110763843B publication Critical patent/CN110763843B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56933—Mycoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。本发明实现了针对牛支原体抗原的特异性检测，且能够检出牛支原体的敏感度为108CFU/mL。通过对样本进行预增菌处理，含低至1CFU/mL的牛支原体样本均可以达到检测敏感度标准。与现有技术相比，本发明具有操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单等优点，可以快速实现大批量样品的检测分析。

Description

一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种用于检测牛支原体的双抗夹心ELISA试剂盒，本发明还涉及一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)为一种能够感染任何年龄牛的致病微生物，可导致患牛严重的呼吸系统疾病、生殖系统疾病、角膜炎、乳腺炎及关节炎等。1961年，牛支原体初次在美国从乳腺炎患牛中分离出来，全球范围内均报道了由牛支原体感染导致奶牛乳房炎而造成经济损失的案例。在我国，牛支原体于2008年首次在湖北地区“疑似牛肺疫”的患牛中被发现，感染率为50％-100％，病死率为10％-50％，给我国养牛业造成巨大经济损失。
现阶段，尚无有效的商品化牛支原体疫苗流通于市场，准确而快速的诊断是高效防控牛支原体病的基础。牛支原体的检测主要依靠病原的分离鉴定。由于牛支原体属于兼性厌氧生物、对分离用培养基营养要求严格、经常受到临床应用抗生素的影响，而且培养周期较长(继代培养通常需72小时以上)，分离特别耗时；在分离后需要开展进一步的生化鉴定或生物学鉴定，不能作为早期快速诊断牛支原体感染的方法。PCR检测方法灵敏度较高，但需要对病料样本进行复杂的处理，且可能会因为污染导致假阳性。此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，无法实现高通量的检测。
目前市场上的牛支原体ELISA试剂盒大多只能检测牛支原体抗体，而且检测特异性和灵敏度很低。因此，开发一种快捷、简便、特异性强、敏感性高的检测方法将为牛支原体的鉴别诊断及疫苗研发质量控制提供有效的保障。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测牛支原体的双抗夹心ELISA试剂盒，本发明还提供一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法。本发明所提供的试剂盒和检测方法对牛支原体的检测具有特异性强、灵敏度高以及操作简便等优点，可以实现大批量样本的快速检测。
为实现第一个目的，本发明提供了一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体。
优选地，所述抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
优选地，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液。
该试剂盒不仅能应用于牛支原体的临床疾病诊断，同时还能应用于非诊断目的牛支原体实验室鉴别和高通量筛选，为疫苗研发提供可靠有效的质量控制保障。
为实现第二个目的，本发明还提供一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，该方法包括以下步骤：
(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体并包被酶标板；
(2)洗涤酶标板，加入封闭液，封闭酶标板；
(3)洗涤酶标板，加入待检样本，进行反应；
(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体稀释后加入酶标板，进行反应；
(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，室温避光显色10min；
(6)加入终止液，混匀后酶标仪测定OD450nm值；
(7)结果判定：测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性；
所述单克隆抗体是抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
优选地，所述牛支原体多克隆抗体的包被浓度为250ng/孔。
优选地，所述封闭液为含5％体积FBS(胎牛血清)的PBS缓冲液。
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体的稀释倍数是1：800体积比。
为了进一步提高样本的最低检测限，所述待检样本在加入前还进行了预增菌处理，处理方法是，将待检样本经0.45μm滤器过滤，以1:10体积比接种于牛支原体PPLO液体培养基，5％CO2、37℃培养36h。
根据本发明的实施例，最佳的一种检测方法是：
(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体，250ng/孔包被酶标板，4℃作用过夜；
(2)洗涤酶标板，加入封闭液，200μL/孔，置37℃孵育60min；
(3)洗涤酶标板，加入待检样本，100μL/孔，置37℃孵育90min；
(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体按1：800体积比稀释，加入酶标板，100μL/孔，置37℃孵育90min；
(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，200μL/孔，室温避光显色10min；
(6)加入终止液，50μL/孔，混匀后酶标仪测定OD450nm值；
(7)结果判定：测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性。
本发明以牛支原体多抗作为捕获抗体，能特异性且广谱的捕获样本中的牛支原体，与采用单抗作为捕获抗体相比，其灵敏度更高、显色背景颜色值更低。本发明以抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体为检测抗体，它不仅与牛支原体具有良好的反应原性，同时也具有很高的特异性，能够与牛支原体包括临床分离株和标准参考株反应，而与无乳支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体及鸡毒支原体等无交叉反应性，因此能提高检测结果的准确性。本发明通过对检测条件进行优化和筛选，最终建立了牛支原体的双抗夹心ELISA检测方法，实现了针对牛支原体抗原的特异性检测，该方法能够检出牛支原体的敏感度为108CFU/mL。通过对样本进行预增菌处理，可以使1CFU/mL的样本达到检测的敏感度标准。与现有技术相比，本发明具有操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单等优点，可以快速实现大批量样品的检测分析。
附图说明：
图1：牛支原体多克隆抗体的Western blot验证。M：Marker；1：牛支原体全菌蛋白；2：rMbovP579蛋白。
图2：SDS-PAGE分析牛支原体多克隆抗体。M：标准蛋白分子量；1：纯化后的多抗；2：纯化前的多抗。
图3：SDS-PAGE分析rMbovP579单抗。M：标准蛋白分子量；1、2：纯化的1A2单抗。
具体实施方式
实施例1试剂盒的制备
1.兔抗牛支原体多克隆抗体的制备
1.1牛支原体免疫动物
选取日本大耳白兔，免疫前采集耳缘静脉血作为阴性对照。每只兔免疫剂量为0.8mg，并与等体积佐剂乳化30min后皮下注射，共免疫4次。第一次为弗氏完全佐剂，后3次为弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔2周。终免后采血用间接ELISA方法测量其效价，当效价达到所需时，行心脏采血收集血清。通过间接ELISA测定牛支原体多克隆抗体效价为100×211。
1.2牛支原体多克隆抗体Western blot分析
将牛支原体全菌蛋白和MbovP579重组蛋白进行SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳，转膜后封闭，一抗用兔抗牛支原体多克隆抗体血清(1：2000倍稀释)，二抗用HPR-羊抗兔IgG(1：5000稀释)。将收集到的多抗血清进行效价测定和Western blot分析，结果显示牛支原体多抗具有良好的反应性(图1)。
2.抗牛支原体MbovP579蛋白单克隆抗体的制备
选取8周龄的雌性Balb/C小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，7天后将培养至对数生长期的杂交瘤细胞1A2(保藏编号为CCTCC NO：C2018219)吹下，离心后用RPMI1640培养基重悬，腹腔注射106个/只，相当于12孔板单孔的细胞量注射一只小鼠。7-10天后待小鼠腹部明显膨大，16号针头收集小鼠腹水，4000rpm离心10min，收集上清，即为含有单克隆抗体的腹水。
3.单抗及多抗的纯化
将小鼠单抗腹水和多抗血清分别与Binding Buffer以1:1的比例混合稀释，使用常州天地人和生物科技有限公司Ab Cap G 4FF Protein G亲和层析柱来进行纯化，具体步骤参考产品说明书。纯化后的蛋白置PBS缓冲液中4℃透析24h，3h换液一次，PEG20000浓缩后使用BCA蛋白测定试剂盒测定抗体浓度。
经SDS-PAGE分析纯化后的抗体。如图2所示，对比纯化前多抗血清，纯化后可见两条链，重链大小为55KDa，轻链大小为25KDa。如图3所示，单抗腹水经纯化后也呈现两条带，无明显杂带。
4.试剂盒的组装
封闭液：含5％体积FBS的PBS缓冲液
稀释液：0.025M碳酸盐缓冲液(pH 9.6，1.6g Na2CO3，2.9g NaHCO3)
洗涤液：含0.05％Tween-20的PBS缓冲液(PBST)
显色液：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)
终止液：2M H2SO4
试剂盒的制备方法如下：
1)包被：按250ng/孔加入稀释的牛支原体多抗，4℃作用过夜，得包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板；
2)封闭：用洗涤液充分洗板3次，最后一次拍干，加入封闭液，200μL/孔，置37℃孵育60min；甩去封闭液，洗涤液洗板扣干，铝箔袋真空包装，得封闭好的包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板；
3)酶标单抗的制备：NaIO4氧化法标记牛支原体MbovP579蛋白单克隆抗体，得辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗；
4)将辣根过氧化物酶标记的牛支原体MbovP579蛋白单克隆抗体单独封装，并与封装好的包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板一起放置包装盒中，即得试剂盒。
实施例2样本检测
1.待检样本预增菌：将待检样本经0.45μm滤器过滤，以1:10体积比接种于牛支原体PPLO液体培养基，置于含5％体积CO2的培养箱，37℃培养36h；
2.将增菌完成样本离心后PBS洗涤3次，加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育90min；
3.甩去样品液，洗涤液洗板3次，加入1：800稀释的辣根过氧化物酶标记的牛支原体MbovP579蛋白单克隆抗体，100μL/孔，37℃孵育90min；
4.甩干孔内溶液，洗板3次，加入显色液，200μL/孔，室温避光显色；
5.加入终止液终止反应，50μL/孔；
6.酶标仪测定OD450值；
7.结果判定：在酶标仪450nm处测OD值，若样品孔OD值大于阴性对照孔的2.1倍，判定阳性，其余孔为阴性。
实施例3检测条件优化
1.捕获抗体包被浓度的优化
牛支原体多抗按照2000ng/孔、1000ng/孔、500ng/孔、250ng/孔、100ng/孔、50ng/孔及25ng/孔包被酶标板，取牛支原体MbovP579蛋白单克隆抗体以梯度稀释作检测抗体，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA检测方法。判定标准为：测定OD450nm值，规定测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性。当牛支原体多抗包被浓度为250ng/孔，P/N值为9.936，且P值为1.354最大，如下表1所示，故选择250ng/孔作为捕获抗体的包被浓度。
表1捕获抗体包被浓度选择表
Figure BDA0002262333010000061
Figure BDA0002262333010000071
2.封闭液种类的优化
按照前述流程建立双抗体夹心ELISA检测方法，分别选取一定浓度的脱脂奶、BSA、FBS及鱼明胶作为封闭液。结果如表2所示，当封闭液为10％FBS时，P/N值最大且N值最小，故最佳封闭液种类为含一定浓度FBS的溶液。
表2封闭液种类选择表
封闭液 5％脱脂奶 1％BSA 10％FBS 1％鱼明胶
P 1.242 0.440 0.576 0.446
N 0.870 0.369 0.204 0.231
P/N 1.429 1.190 2.819 1.931
3.封闭液浓度及封闭时间的优化
以上述确定的捕获抗体包被浓度、封闭液类型，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA检测方法来确定封闭液的浓度及时间。结果如表3所示，5％FBS在37℃封闭60min时，N值最小，此时的P/N值为相对较大，因此选择5％FBS在37℃封闭60min为最佳封闭液浓度及封闭时间。
表3封闭液浓度及封闭时间选择表
Figure BDA0002262333010000072
4.抗原反应时间的优化
以上述确定的捕获抗体包被浓度、封闭液类型、封闭浓度及封闭时间，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA方法来优化抗原最佳反应时间。结果如表4所示，37℃作用时间为90min时具有最大P/N值，且N值接近0.1，故选此条件。
表4抗原最佳反应时间选择表
抗原作用时间 30min 60min 90min 120min
P 0.208 0.232 0.475 0.426
N 0.103 0.113 0.113 0.103
P/N 2.019 2.053 4.206 4.149
5.检测抗体稀释倍数及反应时间的优化
以上述确定的捕获抗体包被浓度、封闭液类型、封闭浓度及封闭时间和抗原最佳反应时间，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA方法来确定检测抗体稀释倍数及最佳反应时间。结果如表5所示，在HRP标记牛支原体单抗以在37℃反应90min时，单抗用量少，N值小于0.1，P/N值较大，故选此条件进行后续实验。
表5 HRP标记牛支原体单抗稀释倍数及反应时间选择表
Figure BDA0002262333010000081
6.TMB底物反应时间的优化
以上述确定的捕获抗体包被浓度、封闭液类型、封闭浓度及封闭时间，抗原最佳反应时间和酶标单抗稀释倍数及最佳反应时间，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA方法来确定底物最佳反应时间。该方法显色底物选择KPL公司的单组份TMB溶液，相较于双组份底物具有背景值低、阴阳值界限大的优点。结果如表6所示，室温避光作用10min时，P/N值最大，且N值接近0.1，故选此条件。
表6 TMB底物反应时间选择表
底物反应时间 5min 10min 15min 20min
P 0.569 0.800 0.989 0.830
N 0.106 0.113 0.143 0.158
P/N 5.385 7.104 6.902 5.266
7.牛支原体双抗体夹心ELISA阴阳性临界值的确定
用作该实验的样品来自同一批牛不同免疫次数后及免疫后不同天数采样所得。规定病原学分离培养和PCR检测同为阳性的样本为阳性，其余为阴性。检测了121份已知背景的临床鼻拭子样本，设置阳性和阴性对照以计算OD450mn的校正值(S-N)/(P-N)。通过流行病学软件分析得到阴阳性临界值为1.112。当Cut-off值为1.112时，该方法的诊断敏感性为100％(95％CI:80.6％～100％)，诊断特异性为94.5％(95％CI:91.0％～96.7％)，曲线下面积AUC为0.958(95％CI:0.934～0.982)。
实施例4检测效果评价
1.检测方法的敏感度
将复苏并扩大培养后的牛支原体计数，按表7中的浓度稀释并进行夹心ELISA实验。培养物的判定标准为：测定OD450nm值，且阳性值/阴性值≥2.1的每毫升培养基中最小支原体的量为该方法的敏感度，结果如表7所示。模拟样品中能够检出牛支原体的敏感度为108CFU/mL。
表7牛支原体双抗夹心ELISA模拟样本检测结果表
牛支原体 10<sup>9</sup> 10<sup>8</sup> 10<sup>7</sup> 10<sup>6</sup> 10<sup>5</sup> 10<sup>4</sup> 10<sup>3</sup> PBS
OD450nm 2.58 0.21 0.11 0.09 0.10 0.11 0.10 0.10
P/N 25.8 2.18 1.1 0.9 1 1.1 1 /
阴阳性(+/-) + + - - - - - -
注：P/N≥2.1为阳性，其余为阴性
2.临床样本的最低检测限
将计数后的牛支原体分别加入到PPLO培养基中，使培养基中牛支原体的含量分别为1CFU/mL、5CFU/mL、10CFU/mL、100CFU/mL、1000CFU/mL，37℃、5％CO2培养36h，离心洗涤后进行牛支原体双抗体夹心ELISA实验。判定标准为：测定OD450nm值，且阳性值/阴性值≥2.1。结果显示所有样本均为阳性，含有低至1CFU/mL的临床样本，经36小时预增菌后，即可以达到牛支原体双抗体夹心ELISA的敏感度标准。
3.牛支原体双抗夹心ELISA检测方法的特异性
将牛支原体HB0801株、牛支原体传代致弱株P150株、无乳支原体标准株PG2株、绵羊肺炎支原体标准株Y98株、鸡毒支原体MG-F株、精氨酸支原体临床分离株、奇异变形杆菌临床分离株、大肠杆菌临床分离株、溶血曼氏杆菌临床分离株、链球菌临床分离株、沙门氏菌临床分离株、金黄色葡萄球菌临床分离株等分别培养36h，开展牛支原体双抗体夹心ELISA检测，并设置阴阳性对照，结果如表8所示，仅牛支原体HB0801株及牛支原体传代致弱株P150株为阳性，其余为阴性。
表8牛支原体双抗夹心ELISA特异性检测结果表
菌株 OD450nm P/N 阴阳性(+/-)
牛支原体HB0801株 0.346 3.392 +
牛支原体传代致弱株P150株 0.667 6.539 +
无乳支原体标准株PG2株 0.093 0.912 -
绵羊肺炎支原体标准株Y98株 0.084 0.824 -
鸡毒支原体MG-F株 0.125 1.225 -
精氨酸支原体临床分离株 0.097 0.951 -
奇异变形杆菌临床分离株 0.091 0.892 -
大肠杆菌临床分离株 0.086 0.843 -
溶血曼氏杆菌临床分离株 0.088 0.863 -
链球菌临床分离株 0.089 0.873 -
沙门氏菌临床分离株 0.096 0.941 -
金黄色葡萄球菌临床分离株 0.105 1.029 -
PBS 0.102 / -
注：P/N≥2.1为阳性，其余为阴性
实施例5临床样本检测
270份临床鼻拭子样本来自实验室进行牛支原体疫苗评价的免疫及攻毒牛，野毒株为牛支原体P1。采集免疫后及攻毒后实验牛的鼻拭子，先在无菌的4mL EP管中加入2mL的无菌生理盐水和0.5mL的PPLO液体培养基，用无菌的棉签浸入EP管中润湿，将牛固定好，让其头部仰起，将棉签插入牛的鼻腔中3～5cm，由深及浅的沿着鼻中隔擦拭，采集后做好标记，放置到4℃冰箱。
将鼻拭子样过0.45μm细菌滤器，以1:10接种于PPLO液体培养基和固体培养基，5％CO2、37℃培养36h。液体培养物进行牛支原体双抗体夹心ELISA检测；固体培养物进行继代分离培养鉴定及PCR检测。
规定PCR与病原分离培养均为阳性的鼻拭子样本背景为阳性，其余为阴性，分别比较牛支原体双抗体夹心ELISA法与PCR法和病原学分离培养的结果。计算PCR法和病原分离培养法与夹心ELISA法的符合率和一致性。
如表9所示，流行病学软件分析得到夹心ELISA与PCR检测结果的总符合率为91.9％(248/270)，阳性符合率为59.3％，阴性符合率为95.5％；一致性Kappa值为0.556(95％CI:0.396～0.715)，按照一致性强度的判定方法，两方法具有中度一致性。
表9牛支原体双抗体夹心ELISA与PCR检测结果比较表
Figure BDA0002262333010000111
如表10所示，流行病学软件分析得到夹心ELISA与病原分离培养结果的总符合率为97.4％(263/270)，阳性符合率为82.1％，阴性符合率为98.6％；一致性Kappa值为0.807(95％CI:0.669～0.946)表明两方法具有高度一致性。
表10牛支原体双抗体夹心ELISA与病原分离培养结果比较表
Figure BDA0002262333010000112
实施例6杂交瘤细胞1A2的筛选
本发明中所涉及的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A2，已于本专利申请的同日申请了另一项中国发明专利，专利名称为“抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体及其应用”。
筛选杂交瘤细胞1A2所使用的免疫原为rMbovP579重组蛋白，该蛋白已在CN107118262A的专利文献中公开，公开日为2017年9月1日。
首先，利用制备的重组蛋白rMbovP579免疫小鼠，取小鼠脾细胞进行细胞融合，利用间接ELISA法筛选融合后的杂交瘤细胞，随后进行三次亚克隆并进一步筛选，获得能稳定分泌高亲合力牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞，将筛选出的三株细胞分别命名为杂交瘤细胞株1A2、4C9和4C11，然后制备、纯化和鉴定单克隆抗体，并采用间接ELISA测定杂交瘤细胞的培养上清效价，结果发现1A2的效价较高且非常稳定，表明1A2细胞状态优于其余两株。
接着，通过Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明，3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体都能与牛支原体临床分离株发生特异性反应，而牛支原体标准株PG45仅与1a2(杂交瘤细胞株1A2、4C9、4C11分泌的单抗分别简称1a2、4c9、4c11)发生明显免疫印迹反应，与其余两株单抗的反应弱或无反应，说明1a2单克隆抗体能更广泛地鉴别牛支原体。
直接ELISA法检测结果也表明，1a2单克隆抗体对rMbovP579蛋白的检测效果显著优于4c9和4c11。
本发明中的杂交瘤细胞株1A2，于2018年11月6日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。

Claims (8)

1.一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，所述抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
2.如权利要求1所述的牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液。
3.权利要求1或2所述的试剂盒在非诊断目的检测牛支原体中的应用。
4.一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体并包被酶标板；
(2)洗涤酶标板，加入封闭液，封闭酶标板；
(3)洗涤酶标板，加入待检样本，进行反应；
(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体稀释后加入酶标板，进行反应；
(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，室温避光显色10min；
(6)加入终止液，混匀后酶标仪测定OD450nm值；
(7)结果判定：测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性，
所述单克隆抗体是抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。
5.如权利要求4所述非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述牛支原体多克隆抗体的包被浓度为250ng/孔。
6.如权利要求4所述非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述封闭液为含5％体积胎牛血清的PBS缓冲液。
7.如权利要求4所述非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体的稀释倍数是1：800体积比。
8.如权利要求4所述非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述待检样本在加入前还进行了预增菌处理，处理方法是，将待检样本经0.45μm滤器过滤，以1:10体积比接种于牛支原体PPLO液体培养基，5％CO2、37℃培养36h。
CN201911075572.5A 2019-11-06 2019-11-06 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用 Active CN110763843B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911075572.5A CN110763843B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911075572.5A CN110763843B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110763843A CN110763843A (zh) 2020-02-07
CN110763843B true CN110763843B (zh) 2020-09-15

Family

ID=69336119

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911075572.5A Active CN110763843B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110763843B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113884674A (zh) * 2021-09-14 2022-01-04 石河子大学 一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用
CN116555201A (zh) * 2023-04-26 2023-08-08 中国农业科学院兰州兽医研究所 特异性结合绵羊肺炎支原体pdhD重组蛋白的单克隆抗体及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509756A (zh) * 2012-06-19 2014-01-15 华中农业大学 一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用
CN107118262A (zh) * 2016-02-24 2017-09-01 华中农业大学 一种牛支原体MbovP579蛋白及其应用
CN108148814A (zh) * 2017-12-15 2018-06-12 东北农业大学 一种用于检测牛轮状病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1350839E (pt) * 2002-04-05 2010-08-12 Pasteur Institut Identificação de regiões rd1 e rd5 associadas a virulência que permitam o desenvolvimento de vacinas melhoradas de m. bovis bcg e m. microti
CN103436496B (zh) * 2013-08-05 2015-08-26 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 抗牛支原体的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用
US10054586B2 (en) * 2014-10-28 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Biomarkers for early diagnosis and differentiation of mycobacterial infection
CN110229919B (zh) * 2019-06-26 2023-07-25 宁夏大学 用于检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103509756A (zh) * 2012-06-19 2014-01-15 华中农业大学 一种牛支原体单克隆抗体及制备方法和应用
CN107118262A (zh) * 2016-02-24 2017-09-01 华中农业大学 一种牛支原体MbovP579蛋白及其应用
CN108148814A (zh) * 2017-12-15 2018-06-12 东北农业大学 一种用于检测牛轮状病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Immunoproteomic Identification of MbovP579, a Promising Diagnostic Biomarker for Serological Detection of Mycoplasma Bovis Infection;Farhan Anwar Khan et al.;《Oncotarget》;20160628;第7卷(第26期);全文 *
Molecular Cloning and Characterization of a Surface-Localized Adhesion Protein in Mycoplasma Bovis Hubei-1 Strain;Xiaohui Zou et al.;《PLoS One.》;20130723;第8卷(第7期);全文 *
牛支原体P48蛋白及其片段的表达、纯化及间接ELISA检测方法的建立;马海彬 等;《中国兽医学报》;20190430;第39卷(第4期);全文 *
牛支原体病学的免疫分析;Farhan Anwar Khan;《万方数据》;20170914;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110763843A (zh) 2020-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107765002B (zh) 一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN102482346B (zh) 对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌特异的抗体及将其用于甲氧西林抗性葡萄球菌的检测方法和试剂盒
CN106834235B (zh) 抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株及其筛选方法和应用
CN113156106B (zh) 一种利用胶体金免疫层析法鉴定银环蛇毒的检测卡、制备方法及其应用
CN110763843B (zh) 一种牛支原体双抗夹心elisa检测试剂盒及其应用
CN106556701A (zh) 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN115112881A (zh) 一种免疫磁珠及其制备方法与应用
CN109852588B (zh) 一种抗罗非鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体及其细胞株和应用
WO2009122714A1 (ja) 肺炎球菌検出方法
CN110967482A (zh) 一种山羊化脓隐秘杆菌感染检测试剂盒及其检测方法
CN108254556B (zh) 一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用
CN108588030B (zh) 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CN102033128A (zh) 迟钝爱德华氏菌快速检测试纸条及快速检测方法与应用
KR102124258B1 (ko) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 황색 포도알균 장독소 b 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
CN109061166B (zh) 一种用于检测牛结核病的ELISpot检测试剂盒
CN110607282B (zh) 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用
CN109266620B (zh) 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CN108531460B (zh) 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
CN113045648A (zh) 一株小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN112574302A (zh) 杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用
CN115902217B (zh) 一种牛副结核病间接elisa检测试剂盒及其应用
CN113122507B (zh) 一种快速检测铜绿假单胞菌的双抗体夹心elisa方法
KR102124257B1 (ko) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 유비저균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주
CN117169499B (zh) 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用
KR102124260B1 (ko) 신속 면역크로마토그래피법을 이용한 콜레라균 진단·탐지 키트 및 이를 위한 특이항체와 항체생산세포주

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant